雙特異性抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供的雙特異性抗體是由一個完整抗體融合單鏈可變區(qū)片段（scFv）組成的，這兩部分具有不同的抗原或抗原決定簇的特異性，完整抗體部分含有抗體恒定區(qū)或其修飾產(chǎn)物。在特定的實(shí)施方式中，完整抗體部分靶向表皮生長因子受體EGFR，單鏈可變區(qū)片段抗體部分靶向血管內(nèi)皮生長因子VEGF。
【專利說明】雙特異性抗體

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及雙特異性抗體，還涉及所述雙特異性抗體的免疫偶聯(lián)體、制備方法和 含有所述偶聯(lián)體的藥物組合物及其用途。 技術(shù)背景
[0002] 雙特異性抗體（BsAb)或雙特異性單克隆抗體（BsMAb)是由兩種不同的抗體片段 構(gòu)成的一種人工蛋白質(zhì)。由于包含兩種不同的抗原結(jié)合域，一個雙特異性抗體能夠識別和 結(jié)合兩個不同的抗原或兩個不同的抗原表位。在腫瘤免疫治療中，雙特異性抗體能夠同時 結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面受體和細(xì)胞毒性細(xì)胞表面的受體，如CD3,將細(xì)胞毒性細(xì)胞靶向到腫瘤細(xì) 胞，進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞。
[0003] 雙特異性抗體在各方面都面臨著挑戰(zhàn)。首先，他們難以工業(yè)化生產(chǎn)。更重要的是， 這類人工蛋白質(zhì)在體外和體內(nèi)的穩(wěn)定性通常不高。當(dāng)一個蛋白質(zhì)中具有兩個空間上非常接 近的抗原結(jié)合域，這兩個抗原結(jié)合域能否保留彼此的結(jié)合活性是最需要關(guān)注的一個問題。
[0004] 為了克服工業(yè)化生產(chǎn)困難，第一代雙特異性單克隆抗體，也被叫做三功能性抗體， 已經(jīng)開發(fā)出來了。它是由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，每條重鏈和輕鏈都來自于兩個不同的 抗體。兩個Fab區(qū)域靶向兩個抗原。Fc區(qū)域則是由這兩條重鏈共同組成，形成第三個結(jié)合 位點(diǎn)，因此得名三功能性抗體。
[0005] 其他類型的雙特異性抗體也已被設(shè)計(jì)出來用于解決某些特定問題，例如半衰期 短、免疫原性和細(xì)胞因子釋放引起的副作用。這些方法包括只有Fab區(qū)域的化學(xué)偶聯(lián)Fabs， 以及各種類型的二價和三價的單鏈?zhǔn)娇勺儏^(qū)片段（scFvs)，模擬兩個抗體可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的 融合蛋白。
[0006] 在過去的一段時間內(nèi)，其他類型的重組抗體形式也一直在發(fā)展，例如通 過融合一個IgG抗體和單鏈結(jié)構(gòu)域而形成的四價雙特異性抗體(參見Coloma,M. J.等，NatureBiotechl5 (1997) 159-163;W02001/077342 和Morrison,S.L·，Nature Biotech25(2007)1233-1234)。
[0007] 同時其他幾種新的形式也被開發(fā)出來，其中抗體核心結(jié)構(gòu)（IgA、IgD、IgE、 IgG或IgM)不再保留，如二價、三價或四價抗體，小分子抗體，單鏈形式抗體（scFv， Bis-scFv)，它們都能夠綁定兩個或更多的抗原（Holliger,Ρ·等，NatureBiote ch23 (2005) 1126-1136;Fischer,N.,Leger,0.,Pathobiology74 (2007) 3-14;Shen ，J.等，JournalofImmunologicalMethods318(2007)65_74;Wu，C·等，Nature Biotech.25(2007)1290-1297)。
[0008] 所有這些形式都是使用連接子來融合抗體核心部分（IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)和 另一個結(jié)合蛋白（如scFv)，例如融合兩個Fab片段，或者scFvs(Fischer,N.，Leger, 0.，Pat hobiology74 (2007) 3-14)。其中通過維持與天然抗體的高相似性來保留抗體效應(yīng)功能是非 常重要的，比如補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性（⑶C)或抗體依賴細(xì)胞的細(xì)胞毒性（ADCC)，這些都是通 過Fc受體結(jié)合介導(dǎo)的。
[0009] 專利W02007/024715報道了雙可變結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白，該蛋白為多價和多特異性 結(jié)合蛋白。美國專利6897044報道用于制備具有生物活性的抗體二聚體的方法。美國專利 7129330報道至少具有四個通過肽連接子連接的可變結(jié)構(gòu)域的多價F.sub.V抗體。在專利 US2005/0079170中報告二聚體和多聚體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)。美國專利6511663報道了三或四 價單特異性抗原結(jié)合蛋白，其包括3個或4個通過共價鍵連接的Fab片段，該蛋白不是天然 的免疫球蛋白。專利W02006/020258報道了可以在原核和真核細(xì)胞中高效表達(dá)的四價雙特 異性抗體，用于治療和診斷。專利US2005/0163782報道了從兩種類型的多肽二聚體的混合 物中分離或選擇性地合成至少由一個鏈間二硫鍵連接的二聚體和不是至少由一個鏈間二 硫鍵連接二聚體的方法。美國專利5959083報告了四價雙特異性受體。專利W02001/077342 中報道了具有三個或更多抗原結(jié)合位點(diǎn)官能團(tuán)的工程抗體。
[0010] 專利W01997/001580報道了具有多特異性和多價抗原結(jié)合的多肽。專利W01992/004053報道了一種同合物，通過合成交聯(lián)共價連接具有相同的抗原決定簇的IgG 類單克隆抗體制備而成。專利W01991/06305報道了具有高抗原親和力的IgG類低聚化單克 隆抗體，分泌表達(dá)兩個或兩個以上的免疫球蛋白單體，這些單體交聯(lián)在一起以形成四價或 六價的IgG分子。美國專利6350860報道了羊源抗體和工程抗體的構(gòu)建，可以用于治療干 擾素Y活性相關(guān)疾病。專利US2005/0100543報道了雙特異性抗體多價靶向載體的構(gòu)建， 即靶向構(gòu)建的每個分子可以作為兩個或更多的雙特異性抗體的載體。專利W01995/009917 報道了基因工程四價雙特異性抗體。專利W0109254/2007報道了一種穩(wěn)定結(jié)合分子，該分 子具有一個穩(wěn)定的scFv。
[0011] 表皮生長因子受體（epidermalgrowthfactorreceptor;EGFR)是一種由 1186 個氨基酸組成的單鏈跨膜糖蛋白。在多種人實(shí)體瘤中EGFR基因都存在著過度擴(kuò)增和表達(dá)。 多年來的研究結(jié)果顯示，EGFR的這種過度表達(dá)與腫瘤的形成、發(fā)生和發(fā)展有著密切的關(guān)系。 因此，表皮生長因子受體（EGFR)已成為近二十年來最熱門的抗腫瘤藥物開發(fā)靶點(diǎn)之一。
[0012] 針對EGFR靶點(diǎn)有兩類藥物被開發(fā)。一類是針對EGFR胞外區(qū)的單克隆抗體，這一 類藥物以已經(jīng)上市的產(chǎn)品：愛必妥、帕尼單抗、尼妥珠單抗為代表；一類是針對胞內(nèi)酪氨酸 激酶活性區(qū)的小分子激酶抑制劑，這一類藥物以已經(jīng)上市的產(chǎn)品：易瑞沙（Iressa)、吉非 替尼（erlotinib)為代表。這兩類藥物在臨床應(yīng)用中取得不錯的效果，但也存在一個共同 的缺點(diǎn)：部分患者易產(chǎn)生耐藥性或者說EGFR表達(dá)陽性的患者只有一部分受益，并且效果有 限。產(chǎn)生這種耐藥性的原因是部分患者體內(nèi)的KRAS基因發(fā)生突變，這樣，雖然抗體或小分 子抑制劑阻止了EGFR胞內(nèi)酪氨酸激酶的激活，但突變的KRAS蛋白使GTPase-直處于活性 狀態(tài)，持續(xù)激活MAPK信號，產(chǎn)生了不依賴EGFR激活的MPK信號通路。
[0013] 多種疾病的發(fā)病機(jī)制都與血管生成有關(guān)，包括實(shí)體瘤、眼內(nèi)新生血管綜 合征，如增殖性視網(wǎng)膜病或年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD)，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和牛皮癬等 (Folkman，J.等，J.Biol.Chem. 267 (1992) 10931-10934;Klagsbrun，M.等，AnnuRev. Physiol. 53 (1991) 217-239)。血管生成能夠使腫瘤細(xì)胞比正常細(xì)胞獲得更大的生長 優(yōu)勢，實(shí)現(xiàn)自主增殖。人血管內(nèi)皮生長因子（VEGF/VEGF-A)負(fù)責(zé)調(diào)控正常的和非正 常的血管生成以及與腫瘤和眼內(nèi)疾病相關(guān)的新生血管生成（Ferrara,N.等，Endocr. Rev. 18(1997)4-25;Berkman，R.A.等，J.Clin.Invest. 91 (1993) 153-159;Brown，L. F.等,HumanPathol. 26 (1995) 86-91 ;Brown,L.F.等,Cancer Res. 53 (1993) 4727-4735;Mattern,J.等，Brit.J.Cancer. 73 (1996) 931-934;和Dvorak,Η· 等，Am.J.Pathol. 146 (1995) 1029-1039)。
[0014] VEGF是一種同型二聚體的糖蛋白，具有高度特異性的血管內(nèi)皮細(xì)胞的促有絲分裂 活性，負(fù)責(zé)調(diào)控胚胎血管生成以及成年體內(nèi)的血管生成（Carmeliet,P.等，Nature, 380 (199 6) 435-439;Ferrara,Ν·等，Nature, 380 (1996) 439-442;Ferrara和Davis-Smyth,Endocrine Rev.，18 (1997) 4-25)。VEGF發(fā)揮著非常重要的功能，研究顯示在滅活一個VEGF等位基因會 由于脈管生成失敗而導(dǎo)致的胚胎致死（Carmeliet,P.等，Nature, 380 (1996) 435-439;Ferra ra,Ν·等，Nature, 380 (1996) 439-442)。
[0015] VEGF對單核細(xì)胞具有較強(qiáng)的趨化活性，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中可誘導(dǎo)血纖維蛋白溶酶 原活化因子以及纖溶酶原激活物抑制因子，并誘導(dǎo)微血管通透性，因此也被稱為血管通透 因子（VPF)(參見Ferrara,N.等，J.CellularBiochem.，47 (1991) 211-218 和Connolly,J. CellularBiochem. ,47 (1991) 219-223)。VEGF基因通過可變剪切可產(chǎn)生5種異構(gòu)體。
[0016] 在小鼠模型中，抗VEGF的中和抗體能夠抑制多種腫瘤的生長（Kim,I.等，Nature 362(1993)841-844;Warren，S.R.等，丄（：1111.1鮮68七.95(1995) 1789-1797;8〇鄺8^'〇111，？· 等，CancerRes. 56 (1996) 4032-4039;和Melnyk, 0·等，CancerRes. 56 (1996) 921-924)。 W094/10202、W098/45332、W02005/00900 和W000/35956 專利中提及到抗VEGF抗體。人源 化的單克隆抗體貝伐珠單抗(商品名Avastin)是臨床上用于治療腫瘤的抗VEGF單克隆抗 體（TO98/45331)。
[0017] 貝伐珠單抗聯(lián)合氟尿嘧啶為基礎(chǔ)的化療方案，用于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的一線治療。 西妥昔單抗，抗表皮生長因子受體（EGFR)的嵌合型IgGl單克隆抗體，作為單藥治療和聯(lián)合 伊立替康治療伊立替康耐藥患者均有效。由此推測在卡培他濱、奧沙利鉬、貝伐珠單抗聯(lián)合 治療中加入西妥昔單抗，同時阻斷EGFR和VEGF的功能，一線治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（CAIR02 試驗(yàn)）患者會取得較好的療效。
[0018] 然而，西妥昔單抗和貝伐珠單抗兩個封閉抗體聯(lián)合治療組的整體生存期和反應(yīng)率 并沒有改善。西妥昔單抗治療帶有KRAS基因突變腫瘤的患者與西妥昔單抗治療野生型 KRAS腫瘤的患者（Tol，J.等，NEnglJMed. 360(2009)563-572)相比，無進(jìn)展生存期（PFS) 明顯下降。
[0019] 帕尼單抗是全人源抗體，靶向表皮生長因子受體，批準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直 腸癌（mCRC)患者，在另一項(xiàng)試驗(yàn)中，通過添加貝伐珠單抗和化療(奧沙利鉬和伊立替 康）作為第一線治療評估轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌，也得到類似的數(shù)據(jù)。貝伐珠單抗與奧沙利鉬 或伊立替康為基礎(chǔ)的化療聯(lián)合治療中加入帕尼單抗會導(dǎo)致毒性增加，減少PFS。在臨 床實(shí)踐中，這些簡單的藥物組合不推薦用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（Hecht，J.等，JClin Oncol. 27 (2009) 672-680)。因此，通過靶向化學(xué)分子到腫瘤組織，同時阻斷VEGF和EGFR的 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，顯然是一個更好的治療實(shí)體腫瘤的方法。
[0020] 據(jù)報道，同時靶向VEGF和EGFR的人源結(jié)構(gòu)域抗體是以雙靶標(biāo)IgG 抗體分子（DT-IgG抗體）的形式直接作用于兩個抗原（Zhang,H.等，IntJ Cancer. 131 (2012) 956-69)。該DT-IgG抗體如西妥昔單抗一樣有效地抑制EGFR陽性細(xì)胞的 生長，阻止EGFR的激活和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，如貝伐珠單抗一樣有效地中和VEGF。然而，DT-IgG 的形式是以單個結(jié)構(gòu)域?yàn)榛A(chǔ)的，半衰期很短，因此不適合用于治療癌癥。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0021] 一方面，本發(fā)明提供一種雙特異性抗體，其包括一個由兩條輕鏈和兩條重鏈組成 的完整抗體，其特征在于，兩條重鏈與單鏈可變結(jié)構(gòu)域（SCFv)融合，其特征在于，所述完整 的抗體對第一抗原表位或抗原有特異性結(jié)合，而scFv對不同于第一個抗原表位或抗原的 第二個抗原表位或抗原有特異性結(jié)合。
[0022] -方面，完整抗體和/或scFv對腫瘤抗原有特異性結(jié)合。腫瘤抗原選自下列組成， 包括EGFR、Her2、EpCAM、CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD133、CEA、gpA33、Mucins、TAG-72、 CIX、PSMA、folate-結(jié)合蛋白、⑶2、⑶3、GM2、VEGF、VEGFR、Integrin、aVP3、a5Pl、ERBB2、 ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP和Tenascin。
[0023] 在一個實(shí)施例中，提供了一種雙特異性抗體，其包含（a)第一和第二條多肽，每一 個都包括一個免疫球蛋白輕鏈；以及（b)第三和第四條多肽，每一個從N末端到C-末端都 包括，可變區(qū)，恒定區(qū)，和一個單鏈可變結(jié)構(gòu)域（scFv)，其特征在于每個所述第一和第二條 多肽，與來自第三和第四條多肽的N末端可變區(qū)形成抗原結(jié)合位點(diǎn)，能夠特異性識別EGFR; 其特征在于，每一個scFv能夠特異性地識別VEGF。
[0024] 在一個實(shí)施例中，提供了一種雙特異性抗體，其包含（a)第一和第二條多肽，每一 個都包括一個免疫球蛋白輕鏈；以及（b)第三和第四條多肽，每一個從N末端到C-末端 都包括，可變區(qū)，恒定區(qū)，和一個單鏈可變結(jié)構(gòu)域（scFv)，其特征在于每個所述第一和第二 條多肽，與來自第三和第四條多肽的N末端的可變區(qū)形成抗原結(jié)合位點(diǎn)，能夠特異性識別 VEGF的抗原結(jié)合位點(diǎn)；其特征在于，每一個scFv能夠特異性地識別EGFR。
[0025] 在一些方面，第一和第二多肽的氨基酸序列為SEQIDNO: 1或者與SEQIDNO: 1 具有至少90%相似性。在一些方面，第三和第四多肽具有SEQIDNO: 2氨基酸序列或者與 SEQIDNO: 2具有至少90%相似性。
[0026] 在一個實(shí)施例中，提供了一種由兩條輕鏈和兩條長鏈組成的雙特異性抗體，輕鏈 的氨基酸序列為SEQIDNO: 1，長鏈氨基酸序列為SEQIDNO: 2。
[0027] -方面，提供了一個雙特異性抗體，該抗體包含由兩條輕鏈和兩條重鏈組成的完 整抗體，這里的兩條重鏈由IgGl的恒定區(qū)構(gòu)成，并且C末端融合了一個單鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域 scFv，這里完整的抗體具有EGFR特異性，而scFv具有VEGF特異性。
[0028] 在一些方面中，該抗體與類美登素化合物偶聯(lián)，具有式la、Ib或Ic結(jié)構(gòu)，

【權(quán)利要求】
1. 一種雙特異性抗體，其包含： (a)第一和第二條多肽，每一條多肽都包括一個免疫球蛋白輕鏈；以及（b)第三和第 四條多肽，每一條多肽從N末端到C-末端都包括，可變區(qū)，恒定區(qū)，和一個單鏈可變結(jié)構(gòu)域 (scFv), 其特征在于每個所述第一和第二條多肽，與第三和第四條多肽的一個重鏈可變區(qū)形成 特異性地識別EGFR的抗原結(jié)合位點(diǎn)；每一個scFv能夠特異性地識別VEGF。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，第一和第二條多肽具有SEQ ID NO: 1氨基酸序列或者與SEQ ID NO: 1具有至少90%相似性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的抗體，第三和第四條多肽具有SEQ ID N0:2氨基酸序列或者 與SEQ ID NO: 2具有至少90%相似性。
4. 一種雙特異性抗體，由兩條輕鏈和兩條長鏈組成，其中輕鏈的氨基酸序列包含有SEQ ID NO: 1，長鏈氨基酸序列包含有SEQ ID NO: 2。
5. -種雙特異性抗體，該抗體包含由兩條輕鏈和兩條重鏈組成的完整抗體，其中重鏈 的恒定區(qū)與一個單鏈可變結(jié)構(gòu)域（scFv)融合形成一條長鏈，這里完整的抗體具有EGFR特 異性，而一個單鏈可變結(jié)構(gòu)域scFv具有VEGF特異性。
6. 權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的抗體，該抗體與類美登素化合物偶聯(lián)，具有式la、Ib或Ic 結(jié)構(gòu)，

或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物， 其中 X為氫或鹵素； Y選自氫J1-C6烷基、C3-C6環(huán)烷基和C(=0) R5 ; R1 選自 H、OH、OC (=0) R5 和 OR5 基團(tuán)； R2為H或C1-C6烷基； R3 為甲基、-CH2OH 或-CH2OC (=0) R6 ; R4 為-OH 或-SH ; R5為C1-C6烷基或芐基； R6為C1-C6烷基、苯基或芐基； R7為氫或氨基酸側(cè)鏈； R8為氫或者CV6烷基； n 為 0、1、2、3、4、5、6、7 或者 8。 P 為 3、4、5、6、7、8、9 或者 10 ; BsAb為雙特異性抗體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗體，其特征在于，所述類美登素的化合物通過一個連接子 與雙特異性抗體連接，該連接子具有酸穩(wěn)定性，肽酶組織蛋白酶非敏感性，并且不包含二硫 鍵。
8. -種組合物，其含有第一條多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO :1和第二條多肽，其 含有氨基酸序列SEQ ID NO :2。
9. 一種多聚核苷酸，具有編碼SEQ ID NO :2中氨基酸的核苷酸序列或與SEQ ID NO :2 具有至少90%的氨基酸序列一致性。
10. -種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其含有如權(quán)利要求9所述的多聚核苷酸。
11. 權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的抗體在制備治療EGFR陽性的癌癥患者的藥物中的應(yīng) 用。
12. -種雙特異性抗體，其包括一個由兩條輕鏈和兩條重鏈組成的完整抗體，其特征在 于，兩條重鏈與單鏈可變結(jié)構(gòu)域（scFv)融合，其特征在于，所述完整的抗體對第一抗原表位 或抗原有特異性結(jié)合，而scFv對不同于第一個抗原表位或抗原的第二個抗原表位或抗原 有特異性結(jié)合。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的抗體，完整抗體和/或scFv具有腫瘤抗原特異性
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的抗體，所述腫瘤抗原是選自下列組成：EGFR、Her2、EpCAM、 CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD133、CEA、gpA33、Mucins、TAG-72、CIX、PSMA、folate-結(jié) 合蛋白、⑶2、⑶3、GM2、VEGF、VEGFR、Integrin、a VP 3、a 5P 1、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、 EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP 和 Tenascin。
15. -種雙特異性抗體，來自于一個IgG2的第一抗體和一個與第一抗體具有不同的抗 原表位特異性的第二抗體，其包含（a)第一和第二條多肽，每一個都包括一個第一抗體的免 疫球蛋白輕鏈；以及（b)第三和第四條多肽，每一個從N末端到C-末端都包括，第一抗體的 可變區(qū)，一個IgGl的恒定區(qū)，和一個來自第二抗體的單鏈可變結(jié)構(gòu)域（scFv)。
【文檔編號】A61K39/395GK104341504SQ201310340679
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年8月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月6日
【發(fā)明者】吳曉云, 李勝峰, 徐臣超 申請人:百奧泰生物科技(廣州)有限公司