一種疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種疫苗組合物，該疫苗組合物包含有免疫量的SIV、Mhp、APP抗原和獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體。該疫苗組合物免疫程序簡(jiǎn)單，能有效防治SIV、Mhp、APP的單獨(dú)感染或混合感染。在發(fā)生混合感染時(shí)，其免疫效果明顯超過分別注射單苗。該疫苗組合物副反應(yīng)小，免疫期長(zhǎng)，耗時(shí)少費(fèi)力少，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，免疫成本低廉，實(shí)用性強(qiáng)。CCTCC NO：M 20122302012.06.13CCTCC NO：V2012332012.08.13CCTCC NO：M 20114582011.12.09
【專利說明】一種疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種疫苗組合物。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬流感（Swine influenza，SI)是由豬流感病毒（SIV)引起的一種急性、熱性和 高度接觸性呼吸道傳染病，以突然發(fā)病、咳嗽、呼吸困難、發(fā)熱和衰竭，以及隨后的迅速恢復(fù) 或死亡為特征。各品種、性別和年齡的豬均能感染、發(fā)病率高，豬群爆發(fā)流感時(shí)，發(fā)病率可達(dá) 100%。豬流感典型的臨床癥狀為流鼻涕、咳嗽和呼吸困難，伴有發(fā)熱、嗜睡以及隨之而來的 厭食和消瘦等。SIV在單獨(dú)感染情況下很少引起死亡，而與PRRSV、PCV2及Mhp混合感染時(shí)， 會(huì)顯著增加上述疾病的損害程度和病死率。另外，SIV也是豬呼吸道疾病綜合征的主要病 原。SIV與其它病原體共感染或繼發(fā)感染所造成的損害已成為制約當(dāng)前豬場(chǎng)經(jīng)濟(jì)效益的主 要原因之一。
[0003] 豬氣喘病又稱豬支原體肺炎或豬地方性流行性肺炎，是由豬肺炎支原體 (Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)引起的一種接觸性慢性呼吸道傳染病，普遍存在于世界 各地。患病豬主要表現(xiàn)為咳嗽和氣喘，生長(zhǎng)遲緩，飼料轉(zhuǎn)化率低，體溫基本正常。解剖時(shí)以肺 部病變?yōu)橹鳎纫詢煞涡娜~，中間葉和尖葉出現(xiàn)胰樣變和肉樣變?yōu)槠涮卣鳌０l(fā)病率高，死亡 率低。近年的研究發(fā)現(xiàn)，豬肺炎支原體與豬繁殖呼吸綜合癥病毒和其它病原混合感染，使其 感染的重要性進(jìn)一步提高。到目前為止，該病仍是造成養(yǎng)豬經(jīng)濟(jì)損失最重要的疾病之一。
[0004] 豬肺炎支原體對(duì)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)條件要求非?？量?，在一般的培養(yǎng)基中很難生長(zhǎng)， 是動(dòng)物支原體中較難培養(yǎng)的一種。該疾病通過咳嗽產(chǎn)生的飛沫以及與感染或恢復(fù)期的病 原攜帶豬直接接觸而傳播。感染動(dòng)物和未感染動(dòng)物混居導(dǎo)致早期和頻繁的再感染。感染通 常開始于攜帶病原的母豬產(chǎn)胎時(shí)感染小豬。由于豬群集中管理技術(shù)的影響，感染在生命后 期才變得明顯。當(dāng)斷乳后把豬集中起來時(shí)，通常還可發(fā)現(xiàn)其它感染。在六周齡或更大的豬 中常常觀察到明顯的疾病。感染豬的生長(zhǎng)速度和飼料轉(zhuǎn)化率顯著降低。使用抗生素治療貴 并且需要長(zhǎng)期使用。同時(shí)再感染也是一個(gè)問題。目前疫苗是避免感染及其影響的最有效方 法。
[0005] 豬傳染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumonia，PCP)，是由胸膜肺炎 放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的豬的一種高度傳染性呼吸道疾 病。該病在世界范圍內(nèi)分布廣泛，常呈地方性流行，造成持續(xù)的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了世界 養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。豬傳染性胸膜肺炎主要是由感染豬直接傳染給易感豬群的，能感染任 何年齡的豬只，1?4月齡最易感，APP最主要的傳播方式是通過感染豬呼出的小液滴進(jìn)行 的，這些小液滴隨著氣流漂移，當(dāng)距離較近的易感豬呼入或直接接觸到小液滴時(shí)就容易發(fā) 病。豬傳染性胸膜肺炎與豬傳染性萎縮性鼻炎和豬氣喘病一起成為當(dāng)今大型養(yǎng)豬場(chǎng)的三大 呼吸道傳染病。該病以急性出血和慢性纖維素性胸膜肺炎為特征，目前在多數(shù)工廠化的養(yǎng) 豬國家均有發(fā)生。本病主要通過飛沫傳播，也可通過接觸傳染。該病造成的豬只死亡、生長(zhǎng) 緩慢、飼料報(bào)酬降低及藥物防治費(fèi)用的增加，給世界各地的養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
[0006] 在臨床上，常見Mhp和SIV混合感染，而兩者均可以降低豬體的抵抗力，在協(xié)同 其它細(xì)菌繼發(fā)感染時(shí)會(huì)帶來較大的損失（趙東升等，豬肺炎支原體與其它病原的相互作 用，養(yǎng)豬，2008,（5) :66-68)。Mhp和APP的感染具有一定的協(xié)同作用，二者共同感染對(duì)肺 部造成的損傷比病原單獨(dú)感染要嚴(yán)重（Caruso J P，Ross R F. Am Journal Veterinarian Research[J], 1990, 51 :227-231.)。
[0007] 在使用疫苗防治這3種疾病時(shí)，單苗多次注射會(huì)引發(fā)應(yīng)激和安全問題，預(yù)防效果 質(zhì)量下降。因此，本領(lǐng)域需要能產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答以同時(shí)抵抗SIV、Mhp、APP感染的疫苗， 減少所述感染的發(fā)生率和/或減輕所述感染的嚴(yán)重性，或預(yù)防與所述感染有關(guān)的臨床表 現(xiàn)。此外，聯(lián)合疫苗不僅方便、多效、低成本，與單一疫苗相比，還可以減少疫苗接種次數(shù)，避 免因漏種而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐熱，其生產(chǎn)、運(yùn)輸、存貯、銷售乃至全部 使用過程均需在較低溫度下進(jìn)行，即所謂的"冷鏈"，這種環(huán)環(huán)相扣的冷鏈運(yùn)作，費(fèi)用極高， 使疫苗成本居高不下，而使用聯(lián)合疫苗，則可以大大降低冷鏈運(yùn)作的費(fèi)用，因此具有顯著的 優(yōu)越性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種含有SIV、Mhp、APP抗原的疫苗組合物 及其制備方法，該疫苗組合物免疫程序簡(jiǎn)單，能有效防治SIV、Mhp、APP的單獨(dú)感染或混合 感染。在發(fā)生混合感染時(shí)，其免疫效果明顯超過分別注射單苗。該疫苗組合物副反應(yīng)小，免 疫期長(zhǎng)，耗時(shí)少費(fèi)力少，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，免疫成本低廉，實(shí)用性強(qiáng)。
[0009] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物包含有免疫 量的SIV、Mhp、APP抗原和獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體。
[0010] SIV抗原是指，包含至少一種在對(duì)豬給藥后能誘導(dǎo)、刺激或增強(qiáng)抗豬流感的免疫應(yīng) 答的抗原的任何組合物。優(yōu)選地，所述抗豬流感抗原為滅活的、改良的活的或減毒的SIV，含 SIV的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，或含SIV的免疫原性氨基酸序列的多肽；更優(yōu)選地 SIV抗原是滅活的SIV。
[0011] Mhp抗原是指，包含至少一種在對(duì)豬給藥后能誘導(dǎo)、刺激或增強(qiáng)抗支原體肺炎的免 疫應(yīng)答的抗原的任何組合物。優(yōu)選地，所述抗豬支原體肺炎抗原為滅活的、改良的活的或減 毒的Mhp，含Mhp的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，或含豬肺炎支原體的免疫原性氨基酸 序列的多肽；更優(yōu)選地Mhp抗原是滅活的Mhp。
[0012] APP抗原是指，包含至少一種在對(duì)豬給藥后能誘導(dǎo)、刺激或增強(qiáng)抗傳染性胸膜肺炎 的免疫應(yīng)答的抗原的任何組合物。優(yōu)選地，所述抗傳染性胸膜肺炎抗原為滅活的、改良的活 的或減毒的APP，含APP的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，或含APP的免疫原性氨基酸序 列的多肽；優(yōu)選滅活的APP。
[0013] 優(yōu)選地，所述SIV抗原是滅活的SIV全病毒抗原，所述Mhp抗原是滅活的Mhp全菌 抗原，所述APP抗原是滅活的APP全菌抗原。
[0014] 所述SIV抗原可以是滅活的HlNl亞型和H3N2亞型
[0015] 更優(yōu)選地，所述SIV抗原是滅活的SIV HlNl ZJS株全病毒抗原，所述Mhp抗原是滅 活的Mhp HN0613株全支原體抗原，所述APP抗原是滅活的APP血清1型LC株全菌抗原。
[0016] 所述Mhp抗原可以是滅活的J株或HN0613株。
[0017] 所述豬流感病毒（HlNl 亞型）ZJS 株（Swine inf luenza virus (HlNl subtype) strain ZJS)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO :V201233,保藏日期為 2012年8月13日，保藏地址為中國武漢?武漢大學(xué)。
[0018] SIV抗原還可以用以下毒株來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的：如本實(shí)驗(yàn)室分離的H3N2 WX株 (保藏號(hào)為CGMCC NO :V201234)、專利文件CN102747045A中的SIV HlNl TJ株（保藏號(hào)為 CGMCC NO :V201107)、專利文件 CN102166352A 中的 SIV HlNlLN 株（保藏號(hào)為 CGMCC NO : 4141)、SIV H3N2HLJ株（保藏號(hào)為 CGMCC N0:4142);專利文件CN102899294A 中的 SIV HlNl Nanjing 株（保藏號(hào)為 CCTCC NO :V201218);專利文件 CN102586196A 中的 SIV HlNlShanxi 株（保藏號(hào)為CGMCC NO :5323);專利文件CN102766604A中的SIV H1N2(保藏號(hào)為CCTCC NO ：V201223)〇
[0019] 所述豬肺炎支原體 HN0613 (Mycoplasma hyopneumoniae strain HN0613)，保藏于 中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO :M2012230,保藏日期為2012年6月13日， 保藏地址為中國武漢?武漢大學(xué)。
[0020] 還可以用以下Mhp抗原來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的：如勃林格殷格翰公司的Ingelvac? M.hyo(J株）；哈藥集團(tuán)公司的Respisure和RespisureOne (P-5722-3株）；美國先靈德雅 的Myco Silencer? (J株）；西班牙海博萊生物大藥廠的MYPRAVAC SUIS(J株）；美國普 泰克公司的MycoGarcKP株）；美國輝瑞公司的RespiFend MH(P-5722-3株）；梅里亞動(dòng)物保 健公司的豬克喘（BQ14株）。
[0021] 所述胸膜肺炎放線桿菌血清1型LC株（Actinobacillus Pleuropneumoniae Serotypelstrain LC，APP-1)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO: M2011458,保藏日期為2011年12月9日，保藏地址為中國武漢?武漢大學(xué)。
[0022] 還可以用以下APP抗原來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的：如本實(shí)驗(yàn)室分離的APP血清5型YC株 (保藏編號(hào)為：CCTCC NO :M2011459)、血清 7 型 YS 株（保藏編號(hào)為：CCTCC NO :M2011460); 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的豬傳染性胸膜肺炎三價(jià)滅活疫苗（1、2、7型）中的疫苗株；專利文件 CN102058880中的傳染性胸膜肺炎放線桿菌HT株（豬傳染性胸膜肺炎HT株的分離、鑒定與 定型試驗(yàn)，中國動(dòng)物檢疫，1999,16 (2) :7?9)、SZ株（保藏編號(hào)為CGMCC NO :4215)、DY株 (保藏編號(hào)為CGMCC NO :4216)。
[0023] 更優(yōu)選地，所述SIV抗原為滅活前IO6?IO8EID 5ciAil，所述Mhp抗原為滅活前IO8? IokiMhdceAiI,所述 APP 抗原為滅活前 ?ο8 ?io1(lCFU/mi。
[0024] MHDCE =豬肺炎支原體DNA細(xì)胞等同物，S卩IMHDCE相當(dāng)于1個(gè)豬肺炎支原體。
[0025] 進(jìn)一步優(yōu)選，所述SIV抗原為滅活前107EID5(l/ml，所述Mhp抗原為滅活前IO 9? 2X 109MHDCE/ml，所述 APP 抗原為滅活前 IO9 ?2X 109CFU/ml。
[0026] 優(yōu)選地，所述獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體包括防腐劑、稀釋劑、佐劑；所述佐劑為 IOwt % ?60wt %。
[0027] 更優(yōu)選地，所述防腐劑包括硫柳汞；所述稀釋劑包括PBS溶液；所述佐劑為氫 氧化鋁膠、礦物油、卡波姆、GelOU蜂膠、ISA206、ISA760VG，優(yōu)選卡波姆、GelOl、ISA206、 ISA760VG ;更優(yōu)選卡波姆、GelOl ;最優(yōu)選GelOl。
[0028] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種制備所述疫苗組合物的方法，所述方法包括：1) 培養(yǎng)增殖SIV病毒，滅活；2)培養(yǎng)增殖Mhp支原體，滅活；3)培養(yǎng)增殖APP菌體，滅活；4)按 比例配制混合抗原液，添加獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體，混勻。
[0029] 本發(fā)明提供了一種根據(jù)本發(fā)明所述疫苗組合物的制備方法，包括配苗步驟：將抗 原與獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體混合制得抗豬流感、支原體肺炎、傳染性胸膜肺炎的疫苗組合 物，其中，所述抗原包括SIV、Mhp、APP抗原。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明方法，所述方法還包括在配苗步驟之前的抗原準(zhǔn)備步驟，包括制備抗 原，或者通過其他方法獲得抗原，如直接購置抗原。優(yōu)選制備抗原，包括分別培養(yǎng)SIV、Mhp、 APP，并分別進(jìn)行濃縮、滅活，獲得SIV、Mhp、APP抗原。
[0031] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種制備所述疫苗組合物的方法，所述制備方法包括：分別 培養(yǎng)所述SIV H1N1ZJS株，所述Mhp HN0613株，所述APP型1型LC株；濃縮并測(cè)定含量，分 別滅活；按比例配制，混勻乳化。
[0032] 本發(fā)明的再一目的在于提供所述的疫苗組合物在制備預(yù)防和治療豬流感、支原體 肺炎、傳染性胸膜肺炎的藥物中的應(yīng)用。
[0033] 本發(fā)明的又一目的在于提供所述的疫苗組合物在制備預(yù)防和治療豬呼吸道綜合 征的藥物中的應(yīng)用。
[0034] 本發(fā)明的所述疫苗組合物中的3種抗原在一定含量范圍內(nèi)不僅均能保留各自成 分的免疫效力，沒有相互干擾，更有相互免疫促進(jìn)作用，組合疫苗比單苗效果更佳。疫苗組 合物針對(duì)混合感染效果比單苗或二聯(lián)苗要好。

【具體實(shí)施方式】
[0035] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述更 為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn) 行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0036] 本發(fā)明實(shí)施例中以SIV H1N1ZJS株、Mhp HN0613株、APPl型LC株為例說明本發(fā) 明。
[0037] 實(shí)施例1、SIV、Mhp、APP抗原的制備
[0038] 1.菌（毒）株的來源
[0039] SIV H1N1ZJS株，系本實(shí)驗(yàn)室分離保存，保藏號(hào)為CCTCC NO :V201233,保藏日期為 2012年9月11日。
[0040] Mhp HN0613株，本實(shí)驗(yàn)室分離保存，保藏號(hào)為CCTCC N0:M2012230,保藏日期為 2012年6月13日。
[0041] APPl型LC株，本實(shí)驗(yàn)室分離保存，保藏號(hào)為CCTCC NO :M2011458,保藏日期為2011 年12月9日。
[0042] 2.疫苗半成品的制備及檢驗(yàn)
[0043] 2. 1生產(chǎn)用種子的制備
[0044] 2. I. 1豬流感病毒
[0045] 將SIV H1N1ZJS株接種SPF雞胚進(jìn)行傳代，收獲尿囊液作為病毒液，第一代為Fl 依次傳至F3,取F3代尿囊液用1 %雞紅細(xì)胞進(jìn)行病毒血凝滴度測(cè)定。其HA效價(jià)> 81og2。 取F3代尿囊液作為生產(chǎn)用種毒。
[0046] 2. I. 2豬肺炎支原體：
[0047] 一級(jí)種子的繁殖
[0048] 將Mhp HN0613株凍干菌種用液體培養(yǎng)基稀釋，劃線接種于固體培養(yǎng)基平皿上， 置37°C培養(yǎng)7d，選擇生長(zhǎng)良好的菌落，接種于固體培養(yǎng)基斜面上，37°C培養(yǎng)7d，作為一級(jí)種 子。
[0049] 二級(jí)種子的繁殖
[0050] 取少量液體培養(yǎng)基洗一級(jí)種子的斜面培養(yǎng)物，接種于液體培養(yǎng)基大管中，置37°C 培養(yǎng)7d，經(jīng)檢驗(yàn)純粹后作為二級(jí)種子。
[0051] 液體培養(yǎng)基的配方（按1065ml計(jì)）：牛心浸出液300ml，ddH20360ml，校正pH值 到7. 4,121 °C滅菌15分鐘。再加入下列過濾除菌的成份：Hank's平衡鹽溶液（IOX) 40ml， 0.25%酚紅IOml馬血清200ml，5%水解乳蛋白100ml，25%酵母浸出液20ml，10000IU/ml 青霉素 IOml，I %醋酸鉈溶液25ml。
[0052] 固體培養(yǎng)基的配方：在液體培養(yǎng)基中加入15g Noble Agar(純化瓊脂）即可。
[0053] 2. 1. 3豬胸膜肺炎放線桿菌：
[0054] 一級(jí)種子的繁殖
[0055] 將LC、YC、YS株凍干菌種分別劃線接種于TSA(大豆酪蛋白瓊脂）平板，在5? 10% C02條件下37°C培養(yǎng)16h，挑取典型菌落劃線再接種于TSA平板，繼續(xù)培養(yǎng)16?18h， 平板菌落作為一級(jí)種子。
[0056] 二級(jí)種子的繁殖
[0057] 從一級(jí)種子TSA平板上挑取典型單菌落，接種TSB(胰蛋白胨大豆肉湯）培養(yǎng)基， 37°C震蕩培養(yǎng)10h，經(jīng)純檢合格，即為二級(jí)種子。
[0058] TSB培養(yǎng)基：胰蛋白胨I. 7g，酵母粉0· 6g，大豆胨0· 5g，葡萄糖0· 25g，NaClO. 5g， K2HP04 · 3H200. 328g 溶于 IOOmL 水中，調(diào) pH 至 7· 6,115 ?121°C高壓滅菌 15min。使用前 加入終濃度為10 μ g/ml的NAD。
[0059] TSA平板：在TSB液體培養(yǎng)基中加入I. 5%的瓊脂粉，115?121°C高壓蒸汽滅菌 30min，待溫度冷到50°C時(shí)加入終濃度為10μ g/ml的NAD，鋪制成平板，約15ml/塊。
[0060] 2. 2制苗用菌液的制備
[0061] 2. 2.1豬流感病毒：
[0062] 將SIV H1N1ZJS株生產(chǎn)用種毒用滅菌生理鹽水作KT4稀釋后，接種非免疫雞胚， 0.21111/胚，置33?351：、60%?65%相對(duì)濕度孵育7211，棄去2411內(nèi)死胚，2411后死胚隨時(shí) 取出置2?8°C，72h后全部取出置2?8°C不少于12h。收獲尿囊液無雜菌檢驗(yàn)合格后，置 2?8°C保存?zhèn)溆谩?br> [0063] 2. 2. 2豬肺炎支原體：
[0064] 將液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的Mhp二級(jí)種子液按10% (v/v)接種于液體培養(yǎng)基中。37°C下 培養(yǎng)3-6日，培養(yǎng)物下降0.5個(gè)pH值以上，純粹檢驗(yàn)合格后，再以同樣的方式擴(kuò)大培養(yǎng)（繼 代次不超過6代）。培養(yǎng)物經(jīng)純粹檢驗(yàn)合格后置2?8°C保存?zhèn)溆谩?br> [0065] 2. 2. 3豬胸膜肺炎放線桿菌：
[0066] 將TSB預(yù)熱至37°C左右，按1?5%接種二級(jí)種子液，37°C搖床培養(yǎng)8?9h，轉(zhuǎn)速 為200rpm，收獲菌液經(jīng)純粹檢驗(yàn)合格后，置2?8 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0067] 2. 3含量測(cè)定
[0068] 2. 3. 1豬流感病毒：
[0069] 取病毒液按《中華人民共和國獸藥典》（2010版）附錄方法進(jìn)行EID5tl測(cè)定。
[0070] 2. 3. 2豬肺炎支原體：
[0071] 用PCR方法對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行計(jì)數(shù)。10倍比稀釋所檢培養(yǎng)物，然后做PCR，PCR檢出的最 低限量為3 X KT3 μ g (相當(dāng)于1000左右個(gè)菌體），按稀釋的倍數(shù)算出菌體數(shù)（沈青春，譚青 松，王琴，等.PCR方法測(cè)定Mhp培養(yǎng)物菌數(shù)[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006, 28(1) :55-57)。
[0072] 2. 3. 3豬胸膜肺炎放線桿菌：
[0073] 取培養(yǎng)菌液按《中華人民共和國獸藥典》（2010版）附錄方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。
[0074] 2. 4濃縮和含量測(cè)定
[0075] 2. 4. 1將SIV H1N1ZJS株病毒液用密理博（Millipore公司）膜包（分子截留量為 IOOKda道爾頓）進(jìn)行濃縮后，測(cè)定EID5。。
[0076] 2. 4. 2將Mhp HN0613株菌液用密理博（Millipore公司）膜包（分子截留量為 IOOOKda道爾頓）進(jìn)行濃縮，菌體計(jì)數(shù)。
[0077] 2. 4. 3將APP型1型LC株菌液離心，棄去上清獲得菌泥，加無菌PBS懸浮，活菌計(jì) 數(shù)。
[0078] 2. 5 滅活
[0079] 分別取合格的SIV HIN1ZJS株、Mhp HN0613株、APP型1型LC株培養(yǎng)液，按培養(yǎng)液 體積總量緩慢加入終濃度為〇. 2%的甲醛溶液（v/v)，放37°C滅活，其間每隔3-4小時(shí)振搖 一次，24小時(shí)后取出，進(jìn)行滅活檢驗(yàn)和無菌檢驗(yàn)，結(jié)果無菌生長(zhǎng)。
[0080] 表1制備的濃縮抗原及含量
[0081]

【權(quán)利要求】
1. 一種疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物包含有免疫量的SIV、Mhp、APP抗原和獸醫(yī) 學(xué)上可接受的載體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其中，所述SIV抗原是滅活的SIV全病毒抗原， 所述Mhp抗原是滅活的Mhp全支原體抗原，所述APP抗原是滅活的APP全菌抗原。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗組合物，其中，所述SIV抗原是滅活的SIV H1N1ZJS株 全病毒抗原，所述Mhp抗原是滅活的Mhp HN0613株全支原體抗原，所述APP抗原是滅活的 APP血清1型LC株全菌抗原。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗組合物，其中，所述SIV抗原為滅活前106?108EID5Q/ ml，所述Mhp抗原為滅活前108?101QMHDCE/ml，所述APP抗原為滅活前10 8?101(lCFU/ml。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗組合物，其中，所述SIV抗原為滅活前107EID5(l/ml，所述 Mhp抗原為滅活前109?2X 109MHDCE/ml，所述APP抗原為滅活前109?2X 109CFU/ml。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其中，所述獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體包括防腐劑、 稀釋劑、佐劑；所述佐劑為l〇wt%?60wt%。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗組合物，其中，所述防腐劑包括硫柳汞；所述稀釋劑包括 PBS溶液；所述佐劑為氫氧化鋁膠、礦物油、卡波姆、GelOl、蜂膠、ISA206、ISA760VG，優(yōu)選卡 波姆、GelOl、ISA206、ISA760VG ;更優(yōu)選卡波姆、GelOl ;最優(yōu)選 GelOl。
8. -種制備權(quán)利要求1所述疫苗組合物的方法，所述方法包括： 1) 培養(yǎng)增殖SIV病毒，滅活； 2) 培養(yǎng)增殖Mhp支原體，滅活； 3) 培養(yǎng)增殖APP菌體，滅活； 4) 按比例配制混合抗原液，添加獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體，混勻。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1?7所述的疫苗組合物在制備預(yù)防和治療豬流感、支原體肺炎、傳染 性胸膜肺炎的藥物中的應(yīng)用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1?7所述的疫苗組合物在制備預(yù)防和治療豬呼吸道綜合征的藥物 中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P11/00GK104338128SQ201310330866
【公開日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2013年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月31日
【發(fā)明者】張?jiān)S科, 孫進(jìn)忠, 田克恭 申請(qǐng)人:普萊柯生物工程股份有限公司