一種具有促神經(jīng)干細(xì)胞增殖活性的黃連解毒湯有效成分組藥物,其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一組具有促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖活性的新型組分藥物。該藥物是在“復(fù)方有效成分組”理論指導(dǎo)下，從經(jīng)典方劑黃連解毒湯中獲得的，能夠顯著促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，改善疾病模型神經(jīng)功能缺損癥狀，對腦卒中神經(jīng)病變及神經(jīng)退行性病變?nèi)绨柎暮Ｄ　⑴两鹕喜〉燃膊【哂兄委熥饔?，與以往黃連解毒湯活性成分研究比較具有創(chuàng)新性，具有成分明確、質(zhì)量可控、減毒增效的特點(diǎn)，應(yīng)用前景廣。本發(fā)明藥物可以應(yīng)用于食品、藥品和保健品領(lǐng)域。
【專利說明】一種具有促神經(jīng)干細(xì)胞增殖活性的黃連解毒湯有效成分組 藥物，其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種黃連解毒湯有效成分組藥物，特別是涉及該藥物的促神經(jīng)干細(xì)胞 增殖活性。屬于藥品、食品和保健品領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)元損傷可以形成腦水腫以及細(xì)胞凋亡，是導(dǎo)致腦中風(fēng)、阿爾茨海默病、帕金森 氏病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要原因之一。當(dāng)神經(jīng)組織受損時(shí)不僅使原有神經(jīng)細(xì)胞減少、活力 降低而需要神經(jīng)干細(xì)胞的替代修復(fù)，同時(shí)會導(dǎo)致內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞活性也受到影響。神經(jīng) 干細(xì)胞起源于多潛能干細(xì)胞，由于在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中保留下來的自我更新以及多分化 潛能的特點(diǎn)，使神經(jīng)干細(xì)胞成為治療神經(jīng)系統(tǒng)類疾病比較理想的細(xì)胞供體。因此，調(diào)控內(nèi)源 性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化與神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療關(guān)系密切。
[0003] 民族藥物是我國傳統(tǒng)藥物的重要組成部分，其資源豐富，特色鮮明，理論獨(dú)到，凝 結(jié)了數(shù)千年來勞動人民與大自然搏斗及疾病抗?fàn)幍臒o數(shù)寶貴經(jīng)驗(yàn)，卻未被外界認(rèn)識，尚處 于原始、落后的狀態(tài)，亟待發(fā)掘和保護(hù)。黃連解毒湯作為一種傳統(tǒng)藥物，有著悠久的應(yīng)用歷 史，具有強(qiáng)心、抗菌、抗過敏、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒等多種藥理作用。隨著近年來對其成分 研究的深入，黃連解毒湯已經(jīng)為神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種重大疾病的治療帶來希望，黃連解毒 湯中含有系列神經(jīng)保護(hù)活性成分，仍然有一些成分沒有分離成功。黃連解毒湯粗提物的抗 氧化功能強(qiáng)，清除自由基能力優(yōu)于依達(dá)拉奉，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0004] 黃連解毒湯載于《肘后方》卷二等中藥經(jīng)典古籍，組方為黃連（9克）、黃芩（6克）、 黃柏出克）及桅子（9克），該方臨床和研究較多，尚未有關(guān)于其有效成分組促神經(jīng)干細(xì)胞 方面的報(bào)道。"有效成分組"是指復(fù)方中與治療目的密切相關(guān)的活性成分的總和，是傳統(tǒng)復(fù) 方現(xiàn)代化的重要指導(dǎo)理論之一。黃連解毒湯有效成分組（HLECG)是在"復(fù)方有效成分組"理 論指導(dǎo)下從經(jīng)典方劑黃連解毒湯中獲得的"組分中藥"，由小檗堿、西紅花苷、漢黃芩素、桅 子苷組成，成分清楚，質(zhì)量可控。通過采用體外實(shí)驗(yàn)及整體實(shí)驗(yàn)對HLECG影響神經(jīng)干細(xì)胞的 作用進(jìn)行了研究，研究HLECG對腦卒中神經(jīng)病變的作用和機(jī)制，有利于臨床的開發(fā)應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種組分藥物HLECG，其具有促神經(jīng)干細(xì)胞增殖的活性，具 有廣泛的應(yīng)用前景。
[0006] 本組分藥物來自于對黃連解毒湯各部分提取物，將體外篩選抗氧化活性良好的提 取物進(jìn)行整合。通過建立大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系，制備氧糖剝奪/復(fù)供模型，研究 本藥物對損傷后的體外培養(yǎng)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞促增殖作用。不同劑量HLECG對抗缺氧后神經(jīng) 干細(xì)胞損傷及促增殖的研究結(jié)果如附圖2所示，研究結(jié)果表明HLECG有明顯的神經(jīng)干細(xì)胞 促進(jìn)增殖和抵抗缺糖缺氧損傷的作用。采用雙側(cè)頸總動脈夾閉法建立昆明小鼠全腦缺血再 灌注模型，研究HLECG對腦缺血小鼠的行為功能恢復(fù)情況以及腦組織病理改變，同時(shí)應(yīng)用 神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記蛋白Nestin免疫組化對HLECG影響神經(jīng)干細(xì)胞在體增殖進(jìn)行研究，附圖 4所示實(shí)驗(yàn)結(jié)果如顯示HLECG具有改善卒中后肢體運(yùn)動功能障礙及降低腦組織結(jié)構(gòu)紊亂等 缺血樣改變的效果，證明其神經(jīng)保護(hù)作用。由于神經(jīng)干細(xì)胞增殖不足是多種疾病發(fā)生發(fā)展 的重要原因，因此綜上所述組分藥物HLECG具有廣泛的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0007] 附圖為HLECG對體外培養(yǎng)大鼠缺血缺氧在灌注模型神經(jīng)干細(xì)胞的影響及小鼠全 腦缺血模型大腦病理影響圖，小鼠平衡轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。 其中，圖1是原代培養(yǎng)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果圖； 圖2是HLECG影響神經(jīng)干細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖； 圖3是HLECG對全腦缺血小鼠行為學(xué)功能影響圖； 圖4是HLECG對全腦缺血小鼠腦組織Nestin表達(dá)的影響圖。

【具體實(shí)施方式】
[0008] 實(shí)施實(shí)例1本發(fā)明組分藥物體外促神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力的研究 [0009] 1實(shí)驗(yàn)材料
[0010] 1. 1實(shí)驗(yàn)動物
[0011] 一日齡新生Wistar大鼠，SPF級，由北京維通利華有限公司代購，許可證編號： SCXK (京）2006-0008。
[0012] 1.2儀器和試劑
[0013] 超凈工作臺（北京醫(yī)療設(shè)備廠，中國），C02培養(yǎng)箱（CB150，Binder，德國），三氣培 養(yǎng)箱（HERAcelll50, Thermo,美國），臺式低溫高速離心機(jī)（5804R，Eppendorf，德國），倒置 熒光顯微鏡（IX-8, Olympus，日本），純凈水機(jī)（MILLI-Q，Millipore，美國），多功能自動讀 板儀（Flexstation3，Molecular Devices，美國），流式細(xì)胞儀（FACSCalibur，BD，美國）； DMEM/F12培養(yǎng)基、神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)添加劑B27(Gibco公司，美國），重組牛堿性成纖維生長 因子bFGF (珠海億勝生物制藥有限公司），青霉素、鏈霉素（華北制藥股份有限公司），胎牛 血清（浙江天航生物科技有限公司），Triton X-100 (Amresco公司，美國），Map-2兔抗鼠一 抗、Nestin兔抗鼠一抗（Sigma公司，美國），F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗兔二抗（北京中衫金橋生物技 術(shù)有限公司），NaCl (天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司），Na2HPO4 · 12H20、碳酸氫鈉、Na2S204、 95%乙醇、K 2HPO4 (分析純，北京化工廠），KCl (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），MTT (Amresco 公司，美國），DMSO(Sigma公司，美國），CFDA-SE試劑盒（碧云天公司），HLECG(實(shí)驗(yàn)室自 制）。
[0014] 2實(shí)驗(yàn)方法
[0015] 2.1細(xì)胞培養(yǎng)
[0016] 取一日齡新生SD大鼠，以75%乙醇浸泡滅菌，置于無菌工作臺中冰上操作，取出 大腦置于4°C PBS中，剝離血管和腦膜。取皮層置盛有4°C PBS液的平皿中，洗3次，以減少 紅細(xì)胞、上皮細(xì)胞等雜細(xì)胞。冰上操作，在青霉素小瓶中將腦皮層組織剪成泥狀，加培養(yǎng)基 2ml，用火焰拋光的膠頭滴管（5mlUml、0. 2ml)各吹打5次，靜置2min，200目篩過濾取上清 移入另一個(gè)離心管中配平，1000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C，離心5分鐘。棄上清，加入DMEM/F12完全培 養(yǎng)基，輕輕吹打成細(xì)胞懸液。取50 μ 1細(xì)胞懸液加入到50 μ 10. 4%臺盼藍(lán)染液中，2min后計(jì) 數(shù)拒染的活細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，按5X105cellS/ml的濃度接種于25cm 2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。置 于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)。于第3-4天半換液，5-7天可見典型的干細(xì)胞克隆球， 并進(jìn)行傳代，以2xl0 5cells/ml接種。
[0017] 2. 2神經(jīng)干細(xì)胞鑒定
[0018] 2. 2. INestin免疫熒光鑒定神經(jīng)干細(xì)胞
[0019] Nestin蛋白為神經(jīng)干細(xì)胞特異性表面標(biāo)記蛋白，利用免疫熒光技術(shù)，以兔抗鼠 Nestin-抗和FITC標(biāo)記二抗鑒定神經(jīng)干細(xì)胞。離心收集體2. 2. 1中克隆球，接種到預(yù)先置 入鋪有多聚賴氨酸蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，每孔內(nèi)加入Iml神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基。將24孔培 養(yǎng)板放入的371：、5%0) 2培養(yǎng)箱中，貼壁2h后取出，吸去培養(yǎng)基，每孔加入1 : 150稀釋的 兔抗Nestin多抗200 μ 1，，4°C冰箱過夜，次日吸去一抗，用PBS清洗3遍后，加入1 : 100 稀釋的結(jié)合有FITC的山羊抗兔二抗，避光、室溫下輕輕振搖2h，用PBS清洗3遍后，甘油磷 酸緩沖液封片，熒光顯微鏡（激發(fā)光波長為495nm，吸收光波長為520nm)下觀察Nestin陽 性免疫熒光標(biāo)記克隆球的情況。
[0020] 2. 2. 2自我增殖能力的鑒定
[0021] 培養(yǎng)后第3、5、7天在倒置顯微鏡下觀察，選取5個(gè)不同視野，對神經(jīng)球計(jì)數(shù)及直徑 測量分析，記錄神經(jīng)球個(gè)數(shù)及直徑變化。
[0022] 2. 3神經(jīng)干細(xì)胞0GD/R損傷模型的建立
[0023] 收集傳代3次的克隆球，用胰酶消化合并吹打法分散制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整密度 為I X IO6接種于96孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)第2天，細(xì)胞呈貼壁未發(fā)生分化狀態(tài)時(shí)用于模型制備。 三氣培養(yǎng)箱通入氮?dú)?，降低氧含量?%，培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞中吸出原培養(yǎng)基，每孔加入 100 μ 1無糖Earle' s平衡鹽溶液替代，放入三氣培養(yǎng)箱中缺糖缺氧培養(yǎng)6h，吸棄Earle' s 液換以培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后對細(xì)胞進(jìn)行活力測定。
[0024] 2. 4實(shí)驗(yàn)分組
[0025] 1)正常對照組（Contrl):進(jìn)行正常培養(yǎng)，在制備0GD/R模型時(shí)同步換以含2% B27 和 50ng bFGF 的 Earle' s 液。
[0026] 2)缺糖缺氧再灌注損傷組（0GD/R):方法見2. 2. 2. 1。
[0027] 3)陽性對照組（Rgl):加入終濃度為20 μ gl/L的Rg-I，其他處理同模型組。
[0028] 4) HLECG高劑量組（H):加入終濃度為50 μ g/Ι的HLECG，其他處理同模型組。
[0029] 5) HLECG中劑量組（M):加入終濃度為25 μ gl/Ι的HLECG，其他處理同（2)組。
[0030] 6) HLECG低劑量組（L):加入終濃度為12. 5 μ g/Ι的HLECG，其他處理同（2)組。
[0031] 2. 5 -般形態(tài)學(xué)觀察
[0032] 造模24h后，將培養(yǎng)的細(xì)胞置于倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)變化，并對各組細(xì)胞形 態(tài)變化情況進(jìn)行適時(shí)的顯微攝像系統(tǒng)采集。
[0033] 2. 6熒光標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞
[0034] 采用活體熒光染料羧基熒光素乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯（CFDA-SE)染色，來檢測 HLECG對神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力的影響。CFDA-SE是一種穩(wěn)定的活體細(xì)胞增殖檢測用熒光探 針，不影響細(xì)胞生長分化，并能夠隨著細(xì)胞增殖分裂平均分布到兩個(gè)子代細(xì)胞中，近年來被 廣泛應(yīng)用
[0035] 用CFDA-SE細(xì)胞標(biāo)記液稀釋CFDA SE儲存液（1000X)至2X。取2 μ I CFDA SE儲存 液（IOOOX)至ImlCFDA SE細(xì)胞標(biāo)記液中，混勻后即為CFDA-SE儲存液（2X)。加入ImlCFDA SE儲存液（2X)混勻，37°C孵育10分鐘，加入約IOml分化培養(yǎng)基，室溫下顛倒混勻，離心去 上清，用IOml神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌2次，調(diào)整密度集中于24孔板中，置于37°C，5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0036] 2. 7流式細(xì)胞儀檢測增殖能力
[0037] 神經(jīng)干細(xì)胞的增殖周期的平均時(shí)間約為22. 8± I. Oh。因此我們選取染色第1天、 第3天及第7天作為觀測時(shí)間點(diǎn)。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測神經(jīng)干細(xì)胞在HLECG的作同下熒光 強(qiáng)度的變化，并應(yīng)用CELL Quest軟件分析后者對神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響程度。
[0038] 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0039] 3. 1形態(tài)學(xué)觀察鑒定
[0040] 3. I. 1原代培養(yǎng)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察和鑒定結(jié)果
[0041] 利用倒置相差顯微鏡觀察，常規(guī)培養(yǎng)至第7天，可見典型克隆球，由幾十個(gè)至數(shù)百 個(gè)細(xì)胞組成，呈球形懸浮生長（圖1A)。傳代3次后的克隆球，邊界清晰，球內(nèi)細(xì)胞形態(tài)規(guī) 貝1J、大小一致，無突起生長，直徑約為100 μ m(圖1B)。經(jīng)免疫熒光染色后顯示各克隆球內(nèi)細(xì) 胞呈nestin強(qiáng)陽性。
[0042] 3. 1. 2增殖能力檢測
[0043] 經(jīng)顯微鏡觀察計(jì)數(shù)得到，神經(jīng)干細(xì)胞克隆球的個(gè)數(shù)以及平均直徑均隨著時(shí)間而增 力口，具有顯著差異。
[0044] 表1神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)不同天數(shù)的神經(jīng)球個(gè)數(shù)與平均直徑比較(n=5, [±s)
[0045]

【權(quán)利要求】
1. 一種具有促神經(jīng)干細(xì)胞增殖活性的黃連解毒湯有效成分組藥物，其特征在于，該藥 物組成為： 小檗堿5-40份漢黃苳素4-35份桅子苷6-50份 西紅花苷1-5份。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物，其特征在于，其組成為： 小檗堿10-25份漢黃芩素10-25份桅子苷10-25份 西紅花苷3-4份。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1、2所述藥物，其特征在于，該藥物具有體外促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的 活性。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1、2所述藥物，其特征在于，該藥物具有促進(jìn)腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的 能力。
5. 權(quán)利要求1、2的所述藥物在制備治療神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力不足的藥物中的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求1、2所述藥物在制備治療神經(jīng)元缺失引起的阿爾茨海默病藥物中的應(yīng)用。
7. 權(quán)利要求1、2所述藥物在制備治療神經(jīng)元缺失引起的帕金森病藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K31/4375GK104337825SQ201310315168
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月25日
【發(fā)明者】劉慶山, 李旭, 莊述娟 申請人:劉慶山