一種cd34+細胞的生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種CD34+細胞的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的方法以臍帶來源的間充質干細胞作為起始材料，在CD34抗體存在條件下經(jīng)傳代培養(yǎng)，間充質干細胞被誘導成為CD34+細胞。采用本發(fā)明的方法，能夠以相對簡便的方式生產(chǎn)大量CD34+細胞，用于治療肢體動脈狹窄閉塞或糖尿病引起的下肢動脈病變。
【專利說明】-種CD34+細胞的生產(chǎn)方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及細胞生物學領域；更具體而言，涉及一種以臍帶源間充質干細胞為起 始材料生產(chǎn)⑶34+細胞的方法。

【背景技術】
[0002] 外周動脈病變（peripheral arterial disease, PAD),尤其是下肢動脈病變往往 由動脈硬化閉塞癥和血栓閉塞性脈管炎導致的肢體動脈狹窄閉塞和糖尿病所引起。PAD主 要體現(xiàn)為嚴重的肢體缺血，尤其是下肢缺血。
[0003] 目前，臨床上對于遠端流出道通暢者，常以介入支架和外科手術治療。PAD患者常 表現(xiàn)為兩種情況：
[0004] (1)管腔狹窄早期：主要表現(xiàn)為以行走時出現(xiàn)疼痛為特征的間歇性跛行；
[0005] (2)隨著狹窄的加重，可出現(xiàn)靜息痛，甚至喪失行走能力和伴隨組織壞死與潰瘍發(fā) 生為特點的危重肢體缺血（critical limb ischaemia, CLI)。
[0006] CLI的預后極差，5年生存率僅為50%或更低。CLI的治療不僅僅是緩解癥狀、改 善受累肢體的功能和防止截肢，還要防止全身動脈粥樣硬化（atherosclerosis, AS)的進 展，以預防心腦血管事件發(fā)生。目前主要的治療手段為：控制高血糖、高血壓、血脂異常；去 除危險因素，如吸煙；強制性運動鍛煉；抗血小板藥物和擴血管藥物；以及循環(huán)重建手術， 如外科手術(如旁路移植術或動脈內膜切除術)、血管內介入技術(如支架置入或球囊擴張 術)。
[0007] 經(jīng)過上述治療后，約40%的CLI患者仍不能改善預后。對于這部分患者來說，截肢 目前被認為是挽救生命所做出的最后治療選擇。但截肢后的總死亡率大約為25%-50% ;截 肢術圍手術期的死亡率為5%-20% ;二次截肢率大約為30%。到目前為止，CLI的治療選擇仍 然有限，大約40%的患者不符合進行循環(huán)重建的指征，或進行循環(huán)重建不能得到有益的反 應。對于這些"沒有其它治療選擇"的患者，藥物治療對延緩病情進展和預防截肢的作用十 分有限。
[0008] 因此，探索缺血肢體血液循環(huán)重建的新治療策略對于減少患者截肢和提高患者生 活質量具有非常重要的臨床意義。這促使研究者將研究重點轉向尋求具有分化潛能的干細 胞移植治療PAD，研究者們希望在病變局部能夠使干細胞被誘導為血管上皮細胞來修復損 壞的血管。
[0009] 基礎研究發(fā)現(xiàn)，能分化為血管內皮細胞的干細胞類型有血管內皮祖細胞 (endothelial progenitor cell, EPCs)、骨髓源性單核細胞（bone marrow mononuclear cell，BMMNC)和外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMNC)。但這些 干細胞受組織來源的限制，提取和擴增的數(shù)量有限。致使這種療法目前尚處于臨床前研究 階段。
[0010] 實驗證明，人⑶34+細胞（⑶34是成熟血管的標志物）可以緩解CLI的癥狀、改善 受累肢體的功能和防止截肢。但由于其在臍帶沃爾通氏膠（Wharton's jelly)中含量僅為 5%-10%左右，因此，如何高效地生產(chǎn)該細胞就成為其能否獲得廣泛應用的重要前提。
[0011] 截至目前，對臍帶血中⑶34+細胞的分離通常采取Ficoll分離法、羥乙基淀粉 分離法和明膠自然沉降分離法，并在隨后用免疫磁珠吸附法(MACS)進一步純化所獲得的 CD34+細胞以獲得符合要求的CD34+細胞。上述方法直接從人臍帶血中分離并純化原代 CD34+細胞，鑒于人臍帶血的供應量有限，利用上述方法所能獲取的CD34+細胞的數(shù)量也極 其有限。
[0012] 因此，本領域仍然需要一種能夠以相對簡便的方法從人臍帶生產(chǎn)大量CD34+細胞 的方法。


【發(fā)明內容】

[0013] 本發(fā)明的一方面，提供一種⑶34+細胞的生產(chǎn)方法，其包括步驟：
[0014] (a)提供臍帶來源的間充質干細胞；
[0015] (b)對間充質干細胞進行原代培養(yǎng)；
[0016] (c)對間充質干細胞進行傳代培養(yǎng)；
[0017] (d)在傳代培養(yǎng)過程中，向培養(yǎng)基中加入誘導劑對間充質干細胞進行誘導；
[0018] (e)獲得 CD34+細胞。
[0019] 本領域技術人員理解，可以采用本領域任何適合方式來提供臍帶來源的間充質干 細胞。例如，在一些實施方式中，將臍帶組織進行酶解之后得到臍帶來源的間充質干細胞。
[0020] 本領域技術人員理解，可以采用本領域任何適合方式和任何適合的培養(yǎng)基對間充 質干細胞進行原代培養(yǎng)。在一些實施方式中，采用貼壁的培養(yǎng)方式對間充質干細胞進行原 代培養(yǎng)。在一些實施方式中，在補充有胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中對間充質干細胞進行 原代培養(yǎng)。經(jīng)原代培養(yǎng)的間充質干細胞稱為P1代。在本發(fā)明的上下文中，原代培養(yǎng)是指直 接從機體取下細胞、組織和器官后立即進行的首次培養(yǎng)。
[0021] 在一些實施方式中，可以采用本領域任何適合方式和任何適合的培養(yǎng)基對間充質 干細胞進行傳代培養(yǎng)。在一些實施方式中，采用貼壁的培養(yǎng)方式對間充質干細胞進行傳代 培養(yǎng)。在一些實施方式中，在補充有人血漿的RPMI1640培養(yǎng)液中對間充質干細胞進行傳代 培養(yǎng)。
[0022] 在傳代培養(yǎng)過程中，向培養(yǎng)基中加入誘導劑對間充質干細胞進行誘導。在一個優(yōu) 選的實施方式中，從第5次傳代培養(yǎng)起，向傳代培養(yǎng)基中加入誘導劑將間充質干細胞誘導 成⑶34+細胞。
[0023] 在一些實施方式中，誘導劑為⑶34抗體。⑶34抗體可以是單克隆抗體，也可以是 多克隆抗體。CD34抗體可以是鼠源、兔源、豬源、牛源、羊源、馬源、狗源的；優(yōu)選鼠源、兔源、 馬源；最優(yōu)選鼠源或兔源。在一個優(yōu)選的實施方式中，CD34抗體是鼠單克隆抗體。
[0024] 在一些實施方式中，⑶34抗體在傳代培養(yǎng)基中的終濃度為O.Olymol/L至 1 μ mol/L ;優(yōu)選 0· 1 μ mol/L 至 1 μ mol/L ;最優(yōu)選 0· 1 μ mol/L。
[0025] 與不含⑶34抗體的培養(yǎng)條件下，間充質干細胞表達非成熟血管標志物⑶105,不 表達成熟血管內皮細胞標記物⑶34 ;而在⑶34抗體存在條件下，間充質干細胞被誘導表達 ⑶34,成為⑶34陽性（+ )細胞。
[0026] 在一些實施方式中，自加入誘導劑后，對間充質干細胞傳代培養(yǎng)2至15次；優(yōu)選5 至7次；最優(yōu)選5次。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種細胞制品，其包括根據(jù)本發(fā)明的方法所生產(chǎn)的 ⑶34+細胞和可藥用載體。
[0028] 本發(fā)明的細胞制品可以根據(jù)本領域常規(guī)方法胃腸外施用。目前臨床應用中細胞制 品的施用途徑包括但不限于局部注射移植、循環(huán)注射移植。根據(jù)本發(fā)明的細胞制品可以制 備成任何適合施用的形式。例如制備成適合通過微量泵將含有CD34+細胞的細胞制品泵入 目標區(qū)域的形式；或者制備成適合通過穿刺針將將含有CD34+細胞的細胞制品注入目標區(qū) 域的形式。根據(jù)移植方式、治療目的的不同，本領域技術人員可以確定自行選擇適當?shù)目伤?用載體。在一些實施方式中，可藥用載體是生理鹽水。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供含有根據(jù)本發(fā)明方法所生產(chǎn)的CD34+細胞的細胞制 品在緩解或改善血管病變的藥物中的用途。
[0030] 所述血管病變?yōu)橹w動脈狹窄閉塞或糖尿病引起的外周動脈病變（peripheral arterial disease, PAD);優(yōu)選肢體動脈狹窄閉塞或糖尿病引起的下肢動脈病變。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1A.免疫組化結果（⑶34蛋白：紅色熒光；⑶105蛋白：綠色熒光)，無⑶34抗體 孵育hUC-MSCs，7天的CD105蛋白表達。
[0032] 圖1B.免疫組化結果（⑶34蛋白：紅色熒光；⑶105蛋白：綠色熒光)，0.01 μ mol/L CD34抗體孵育hUC-MSCs7天的CD105蛋白表達。
[0033] 圖1C.免疫組化結果（CD34蛋白：紅色熒光；CD105蛋白：綠色熒光)，0. lymol/L CD34抗體孵育hUC-MSCs7天的CD105和CD34蛋白表達。
[0034] 圖1D.免疫組化結果（⑶34蛋白：紅色熒光；⑶105蛋白：綠色熒光)，1 μ mol/L CD34抗體孵育hUC-MSCs7天的CD105和CD34蛋白表達。
[0035] 圖1E.免疫組化結果（⑶34蛋白：紅色熒光；⑶105蛋白：綠色熒光)，無⑶34抗體 孵育hUC-MSCsl4天的CD105蛋白表達。
[0036] 圖1F.免疫組化結果（⑶34蛋白：紅色熒光；⑶105蛋白：綠色熒光)，0.01 μ mol/L CD34抗體孵育hUC-MSCsl4天的CD105和CD34蛋白表達。
[0037] 圖1G.免疫組化結果（CD34蛋白：紅色熒光；CD105蛋白：綠色熒光)，0. lymol/L CD34抗體孵育hUC-MSCsl4天的CD105和CD34蛋白表達。
[0038] 圖1H.免疫組化結果（⑶34蛋白：紅色熒光；⑶105蛋白：綠色熒光)，1 μ mol/L CD34抗體孵育hUC-MSCsl4天的CD105和CD34蛋白表達。（圖2A至圖2H中標尺為50. Ομπι)。
[0039] 圖2.免疫組化結果：⑶105和⑶34蛋白共表達的細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比。
[0040] 圖3.人臍帶源間充質干細胞（hUC-MSCs)經(jīng)傳代培養(yǎng)所得的Ρ5代細胞（CD105蛋 白：綠色熒光)。

【具體實施方式】
[0041] 以下結合附圖，通過實施例進一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。以下提 供了本發(fā)明實施方式中所使用的具體材料及其來源。但是，應當理解的是，這些僅僅是示例 性的，并不意圖限制本發(fā)明，與如下試劑和儀器的類型、型號、品質、性質或功能相同或相似 的材料均可以用于實施本發(fā)明。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī) 方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0042] 材料
[0043] 人臍帶：吉林省四平市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科的孕婦簽署知情同意書之后，自愿提供；
[0044] RPMI1640 培養(yǎng)液購自 GENMED，GMS12049. 2A ;
[0045] 人AB血漿購自北京紅十字血液中心；
[0046] 注射用重組人白細胞介素-2,國藥準字S10970016 ;
[0047] LG-DMEM 培養(yǎng)液購自 Gibco ;
[0048] 完全培養(yǎng)液購自Gibco ;
[0049] 0)34抗體為鼠抗人⑶34單克隆抗體，購自cell signal ;
[0050] 兔抗人 CD105 抗體購自 Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA。
[0051] 實施例1、人臍帶樣本的預處理
[0052] 在無菌條件下，取正常足月生產(chǎn)的近胎兒段臍帶；
[0053] 用含100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的PBS充分洗滌，去除殘余血漬；
[0054] 將臍帶等分為0. 5cm的臍帶段，仔細剔除動靜脈后，取50mL離心管盛裝臍帶段，1 段/離心管；
[0055] 在離心管中，將臍帶段剪成大小約為ImmXImmX 1mm的碎片，剪碎過程中滴加 LG-DMEM培養(yǎng)液保持組織濕潤；
[0056] 用含100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的PBS (pH7. 2)洗滌2次后備用。
[0057] 實施例2、酶解
[0058] 將實施例1中獲得的臍帶碎片，用混合酶液（0. 1% I型膠原酶、0. 1%胰酶、0. 1%透 明質酸酶、〇. 1%DNA酶、0. 02%EDTA ;%表示質量濃度百分比），在37°C下消化2h ;
[0059] 消化后，以離心力400g，溫度4±2°C，離心15分鐘；
[0060] 棄去混合酶液，獲得臍帶來源的單個細胞。
[0061] 實施例3、細胞的原代培養(yǎng)
[0062] 將實施例2處理所得的細胞，按1 X 106細胞/ml的密度，接種到T-25培養(yǎng)瓶中， 在20ml補充有10% (v/v)胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37°C、5%C02 (v/v)、95%濕 度的培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)3天；
[0063] 3天后第1次換液，去除未貼壁的細胞；
[0064] 以后每48h更換培養(yǎng)液。
[0065] 實施例4、細胞的傳代培養(yǎng)
[0066] 倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)，待細胞長滿至培養(yǎng)瓶底的80%左右，棄去培養(yǎng)液；
[0067] PBS (ρΗ7· 2)漂洗1次后，加0· 25%胰蛋白酶-EDTA，在37°C下消化約2min ;
[0068] 輕輕拍打瓶壁促進細胞從瓶底脫離，然后加入含10% (v/v)人AB血漿的RPMI1640 培養(yǎng)液終止消化；
[0069] 收集吹打后所得細胞，以1000g離心10min，棄上清；
[0070] 用含10% (v/v)人AB血漿的RPMI1640培養(yǎng)液重懸，按照1 : 2的比例進行傳代 接種，置于37°C、5% (v/v) C02、95%濕度的培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)；
[0071 ] 每2天更換培養(yǎng)液1次；
[0072] 待細胞增殖并覆蓋瓶底80%左右時，用同樣方法傳代，傳代4次后，獲得P5代細 胞。
[0073] 實施例5、誘導條件下的傳代培養(yǎng)
[0074] 倒置顯微鏡下觀察P5代細胞的形態(tài)，待長滿至培養(yǎng)瓶底的80%左右，棄去培養(yǎng) 液；
[0075] PBS (ρΗ7· 2)漂洗1次后，加0· 25%胰蛋白酶-EDTA，在37°C下消化約2min ;
[0076] 輕輕拍打瓶壁促進細胞從瓶底脫離，然后加入含10% (v/v)人AB血漿的RPMI1640 培養(yǎng)液終止消化；
[0077] 收集吹打后所得細胞，以1000g離心lOmin，棄上清；
[0078] 用含10% (v/v)人AB血漿和0. 1 μ mol/L CD34抗體的RPMI1640培養(yǎng)液重懸，按 照1 : 2的比例進行傳代接種，置于37°C、5% (v/v)C02、95%濕度的培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)；
[0079] 每2天更換培養(yǎng)液1次；
[0080] 待細胞增殖并覆蓋瓶底80%左右時，用同樣方法傳代，最多可以傳代15次。
[0081] 實施例6、⑶34+細胞的收集
[0082] 待傳代培養(yǎng)的細胞增殖并覆蓋瓶底80%左右時，棄去培養(yǎng)液；
[0083] PBS (ρΗ7· 2)漂洗1次后，加0· 25%胰蛋白酶-EDTA，在37°C下消化約2min ;
[0084] 輕輕拍打瓶壁促進細胞從瓶底脫離，然后終止消化；
[0085] 吹打后所得細胞以l〇〇〇g離心l〇min，棄上清；
[0086] 收集細胞。
[0087] 實施例7、臍帶源間充質干細胞向CD34+細胞分化的細胞增殖活性分析（MTT法）
[0088] 1.檢測步驟：
[0089] 將實施例4培養(yǎng)的P5代細胞用0. 25%的胰酶消化，300 X g離心10分鐘；
[0090] PBS (ρΗ7· 2)清洗 2 次，棄上清；
[0091] 用完全培養(yǎng)液調整細胞濃度，接種于96孔板，每孔90 μ L，使細胞數(shù)為每孔1 X 105 個；
[0092] 設空白組、對照組、用藥組(其中用藥組分別加入0· 01 μ mol/L、0. 1 μ mol/L、 1 μ mol/L⑶34抗體；對照組不加⑶34抗體；空白組不加⑶34抗體只加培養(yǎng)液）；
[0093] 每組復種12孔，在37°C、5% (v/v)的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h ;
[0094] 每孔加20 μ L MTT溶液，4h后每孔加100 μ L10%SDS，18h后用酶標儀測定570nm處 吸光度值(A值)。
[0095] 細胞增殖率=(各實驗組A值-對照組A值）/對照組A值X 100%。
[0096] 2.結果：
[0097] 與對照組相比，hUC-MSCs與CD34抗體孵育（0· 1 μ mol/L或1 μ mol/L) 96h后，分 別增殖了 52. 3%和28. 1%。
[0098] 表1. CD34抗體對hUC_MSCs96小時增殖的影響
[0099]

【權利要求】
1. 一種⑶34+細胞的生產(chǎn)方法，其包括步驟： a) 提供臍帶來源的間充質干細胞； b) 對間充質干細胞進行原代培養(yǎng)； c) 對間充質干細胞進行傳代培養(yǎng)； d) 在傳代培養(yǎng)過程中，向傳代培養(yǎng)基中加入誘導劑對間充質干細胞進行誘導； e) 獲得⑶34+細胞。
2. 根據(jù)權利要求1所述的CD34+細胞的生產(chǎn)方法，其中所述的誘導劑為CD34抗體。
3. 根據(jù)權利要求1所述的CD34+細胞的生產(chǎn)方法，其中所述傳代培養(yǎng)基是含人血漿的 RPMI1640培養(yǎng)液。
4. 根據(jù)權利要求2所述的CD34+細胞的生產(chǎn)方法，其中所述CD34抗體在傳代培養(yǎng)基 中的終濃度為 〇. 01 U mol/L 至 1 μ mol/L ;優(yōu)選 0. 1 μ mol/L 至 1 μ mol/L ;最優(yōu)選 0. 1 μ mol/ L ;所述CD34抗體是單克隆抗體或多克隆抗體；所述CD34抗體是鼠源、兔源、豬源、牛源、羊 源、馬源或狗源的；優(yōu)選鼠源、兔源或馬源；最優(yōu)選鼠源或兔源。
5. 根據(jù)權利要求1所述的CD34+細胞的生產(chǎn)方法，自加入誘導劑后，對間充質干細胞傳 代培養(yǎng)2至15次；優(yōu)選5至7次；最優(yōu)選5次。
6. 根據(jù)權利要求1所述的CD34+細胞的生產(chǎn)方法，在所述步驟d)中，從第5次傳代培 養(yǎng)起，向培養(yǎng)基中加入CD34抗體。
7. -種細胞制品，其包括： 根據(jù)權利要求1所述方法生產(chǎn)的CD34+細胞；和 可藥用載體。
8. 根據(jù)權利要求7所述的細胞制品在制備緩解或改善血管病變的藥物中的用途。
9. 根據(jù)權利要求8所述的用途，其中所述血管病變?yōu)橹w動脈狹窄閉塞或糖尿病引起 的外周動脈病變。
10. 根據(jù)權利要求9所述的用途，其中所述外周動脈病變?yōu)橄轮珓用}病變。
【文檔編號】A61K35/44GK104120104SQ201310302280
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年7月17日 優(yōu)先權日:2013年7月17日
【發(fā)明者】唐立峰 申請人:吉林省拓華生物科技有限公司