專利名稱：一種針對(duì)轉(zhuǎn)化生子因子βⅡ型受體的核酸適配子納米制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程藥物和藥劑學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種針對(duì)轉(zhuǎn)化生子因子β II 型受體(transforming growth factor- β receptor II , T β R II )的核酸適配子納米制劑 CS (Seq58)-NP (chitosan (Seq58)-nanoparticle)及其制備方法。
背景技術(shù)：
青光眼是一種常見(jiàn)的不可逆性致盲眼病，是人類的第二大致盲性疾病，病理性眼壓升高是其主要特點(diǎn)。 目前臨床上主要使用藥物、激光和手術(shù)治療的方法來(lái)降低眼壓。濾過(guò)性手術(shù)被證明是適合于藥物降眼壓無(wú)效患者的最佳手術(shù)方法。與其它手術(shù)不同，青光眼濾過(guò)術(shù)后并不希望傷口完全修復(fù)，而是形成不完全愈合，以便房水外流，但該手術(shù)失敗率高達(dá)15%-30%，主要原因是濾過(guò)通道瘢痕的形成。針對(duì)青光眼濾過(guò)手術(shù)后瘢痕的形成，目前主要的對(duì)抗手段是術(shù)中、術(shù)后采用抗瘢痕藥物，臨床上應(yīng)用較廣泛的是抗代謝藥絲裂霉素C (mitomycin, MMC)、5_氟尿卩密唳(5-f luorouracil, 5_Fu)等,這類藥物能有效提高青光眼術(shù)后的早期濾過(guò)，但其毒副作用不容忽視，常出現(xiàn)較多的并發(fā)癥，如濾過(guò)泡滲漏、角膜上皮缺損、持續(xù)性低眼壓等。因此，尋找一種療效好、特異性強(qiáng)且毒副作用小的抗瘢痕藥物已成為近年來(lái)青光眼研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，瘢痕化的發(fā)生及發(fā)展與多種致纖維化因子的活性密切相關(guān)，如TGF-β、FOGF、FGF、VEGF 等，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β (transforming growth factor-β , TGF-β )占主要地位[I]，其亞型TGF-β 2在眼部瘢痕疾病的發(fā)生中又起主要作用[2]。TGF-β與其受體TiiRII (轉(zhuǎn)化生子因子β II型受體)結(jié)合作為始動(dòng)環(huán)節(jié)，促使成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為具有收縮功能的肌成纖維細(xì)胞，在瘢痕化的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用[3]。因此，對(duì)抗TGF-β的生物學(xué)作用在減少瘢痕形成及防止組織纖維化中有著極其重要的意義。對(duì)抗TGF-β的現(xiàn)有策略主要包括:(I)干預(yù)配體TGF-β的表達(dá)水平及活性；(2)利用受體拮抗劑阻斷TGF-β與其II型受體Ti3R II的結(jié)合，阻止TGF-β信號(hào)傳入細(xì)胞；(3)干預(yù)TGF-β受體后信號(hào)傳遞途徑。目前已有很多關(guān)于配體TGF-β的特異性抗體[4]、反義寡核苷酸(ASODN)[5]以及小分子干擾RNA (siRNA)[6]的相關(guān)研究，大部分結(jié)果都顯示可減少青光眼濾過(guò)術(shù)后的結(jié)膜瘢痕形成，但在實(shí)際應(yīng)用中各有利弊。單抗對(duì)TGF-β的阻封效果較弱，在體內(nèi)容易被降解且多次用藥有免疫原性；AS0DN和siRNA可以減少TGF-β蛋白的生成，但是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中其組織特異性和穿膜效率差，其應(yīng)用還有待研究。利用受體拮抗劑阻斷TGF- β與其II型受體T β R II的結(jié)合，阻止TGF- β信號(hào)傳入細(xì)胞，不失為一種可以嘗試的方法。本發(fā)明的申請(qǐng)人通過(guò)計(jì)算機(jī)聯(lián)網(wǎng)檢索，僅檢索到2篇關(guān)于TGF-β III型受體核酸適配子的文獻(xiàn)[7，8]，并未檢索到與Τβ R II相關(guān)的抗體及適配子的文獻(xiàn)。同時(shí)，該兩篇關(guān)于TGF-β III型受體核酸適配子的文獻(xiàn)篩選Τβ RIII適配子的目的僅是用作細(xì)胞標(biāo)記物，與抗瘢痕并無(wú)關(guān)系。通過(guò)配體指數(shù)級(jí)富集系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematicevolution of ligands by exponential enrichment, SELEX),從大容量的隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)中篩選出對(duì)靶分子具有高度結(jié)合能力的寡核苷酸，這些寡核苷酸被稱之為核酸適配子(aptamer,又稱適配體)。適配子因其自身獨(dú)特的空間構(gòu)象，能夠與特定的靶分子相結(jié)合，包括蛋白質(zhì)、核酸、小分子有機(jī)物、金屬離子等。核酸適配子由于具有高親和力、高特異性、易體外合成等特點(diǎn)，已在基礎(chǔ)研究、臨床診斷與治療以及新藥研發(fā)等諸多領(lǐng)域展示了廣闊的應(yīng)用前景。因此，本發(fā)明的申請(qǐng)人應(yīng)用SELEX技術(shù)，從大容量的隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)中獲得了高親和力、高特異性的祀向Τβ R II的核酸適配子一Seq58,并通過(guò)作用于人Tenon’s囊成纖維細(xì)胞(HTFs)，證明了 Seq58可阻礙TGF- β與T β R II結(jié)合。但是核酸適配子普遍存在易被核酸酶降解、作用時(shí)效短等缺點(diǎn)[9]?；瘜W(xué)性修飾，例如硫代修飾能夠增強(qiáng)核酸的穩(wěn)定性，但同時(shí)增強(qiáng)了其細(xì)胞毒性及非特異效應(yīng)。因此，選擇一種有效且安全的方法來(lái)保持核酸適配子的生物活性，顯得很有必要。殼聚糖(chitosan)作為一種天然的可生物降解的線性聚合物，來(lái)源豐富，理化性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，因?yàn)槠淞己玫纳锝到庑?、生物相容性、較低的免疫原性，以及突出的大分子粘附能 力，近年被廣泛應(yīng)用于大分子、核酸、蛋白質(zhì)的載體研究中[10]。已有研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖納米化后作為寡核苷酸的載體，可有效保護(hù)寡核苷酸免于被核酸酶所降解。因此，將殼聚糖納米微粒作為核酸適配子Seq58的載體，有望成為保持并延長(zhǎng)Seq58生物活性的一種理想手段。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種針對(duì)轉(zhuǎn)化生子因子β II型受體的核酸適配子納米制劑，即核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)初步評(píng)價(jià)所述核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP對(duì)抗血清核酸酶及緩釋適配子的能力、與細(xì)胞結(jié)合的情況以及其生物活性。本發(fā)明的再一目的是提供所述核酸適配子納米制劑CS(Seq58)-NP的制備方法。本發(fā)明的還一目的是提供所述核酸適配子納米制劑CS(Seq58)-NP的用途。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下措施:本發(fā)明所述針對(duì)轉(zhuǎn)化生子因子β II型受體的核酸適配子納米制劑CS(Seq58)-NP為由殼聚糖和核酸適配子組成的球形微粒，殼聚糖包裹核酸適配子，其中殼聚糖與核酸適配子的摩爾比大于20: I ;所述核酸適配子納米制劑的粒徑為100 300nm，電位為+4 +28mV ;所述核酸適配子為Seq58。優(yōu)選地，本發(fā)明所述核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP中殼聚糖與核酸適配子的摩爾比為20 30: I。優(yōu)選地，本發(fā)明所述核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP中殼聚糖的平均分子量為100000 200000，脫乙酰度>90%。本發(fā)明所述核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP的制備方法，包括如下步驟:(I)核酸適配子的制備將核酸適配子Seq58充分溶解于TE緩沖液中，得lnmol/μ I的核酸適配子溶液，-20°C冷藏備用；(2)殼聚糖溶液的制備
精密稱取平均分子量為100000 200000，脫乙酰度>90%的殼聚糖溶于2%醋酸中，其中醋酸用量按照殼聚糖質(zhì)量:醋酸體積=Ig: 200 300mL計(jì)算,用0.lmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至5 6，加入雙蒸水至殼聚糖的濃度為1.5 2.0mg/ml，用0.22 μ m —次性針頭式濾器過(guò)濾后，置于無(wú)菌小瓶中，4°C冷藏備用，得殼聚糖溶液；(3)核酸適配子納米制劑CS(Seq58)-NP的制備將步驟(I)制備的lnmol/μ I核酸適配子溶液加入到1.0 1.5ml三聚磷酸鈉溶液中，所述三聚磷酸鈉溶液中三聚磷酸鈉的濃度為0.9mg/ml，得混合液；用5號(hào)針頭將該混合液逐滴滴入到2.0 3.5ml步驟(2)制備的殼聚糖溶液中，其中殼聚糖與核酸適配子的摩爾比大于20: 1，滴加速度為40 50滴/min，至溶液出現(xiàn)白色乳光，再向其中滴加0.04 0.06ml Tween-80 (2%, v/v),并加入雙蒸水，定容至6ml,室溫孵育30min,最后用
0.22 μ m —次性針頭式濾器過(guò)濾后，置于無(wú)菌小瓶中，4°C冷藏備用，即得核酸適配子納米制劑 CS(Seq58)_NP。本發(fā)明所述核酸適配子納米制劑CS (Seq58)-NP的生物活性與使用濃度有關(guān)。當(dāng)CS(Seq58)-NP使用濃度大于25nM時(shí)，能夠明顯地抑制成纖維細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)分化。本發(fā)明所述核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP可按本領(lǐng)域已知方法制成對(duì)抗斑痕形成的外用凝膠制劑，所述外用凝膠制劑為透明質(zhì)酸鈉凝膠、殼聚糖凝膠或聚丙烯酸凝膠，所述外用凝膠制劑中核酸適配子納米制劑的濃度為大于25nM。本發(fā)明所述核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP可按本領(lǐng)域已知方法制成對(duì)抗斑痕形成的外用生物膜制劑，所述外用生物膜制劑為透明質(zhì)酸鈉膜、殼聚糖膜或脂質(zhì)體膜，所述外用生物膜制劑中核酸適配子納米制劑的濃度為大于25nM。本發(fā)明所述核酸適配子納米制劑CS(Seq58)-NP可用于制備應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室及臨床的TPR II檢測(cè)試劑盒 。本發(fā)明所述核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP可與藥學(xué)上可以接受的輔料或其它藥物組成組合物。優(yōu)選地，上述所述的組合物為由核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP與緩釋材料組成的組合物。本發(fā)明通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳及體外緩釋的方法評(píng)價(jià)所述核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP對(duì)抗血清核酸酶及緩釋適配子的能力，表明所述核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP能夠?qū)寡宄^(guò)48小時(shí)，CS (Seq58) -NP能夠緩釋核酸適配子Seq58超過(guò)96小時(shí)；接著通過(guò)熒光標(biāo)記CS(Seq58)_NP，及與人tenon’ s囊成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，評(píng)價(jià)CS(Seq58)_NP與細(xì)胞結(jié)合的情況，表明CS (Seq58)-NP能與T β R II特異性結(jié)合；進(jìn)一步對(duì)CS (Seq58) -NP的生物活性研究表明，CS(Seq58)_NP能抑制成纖維細(xì)胞增殖達(dá)35.1% ;在血清存在的情況下，CS(Seq58)-NP能夠明顯抑制人tenon’ s囊成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化超過(guò)36小時(shí)，抑制率達(dá)44.8%，遠(yuǎn)高于未經(jīng)包裹時(shí)的裸核酸適配子Seq58。亦即是說(shuō)，本發(fā)明所述核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP能競(jìng)爭(zhēng)性地抑制TGF-β與其受體Τβ R II結(jié)合，并具有良好的血清穩(wěn)定性及緩釋性，有望成為抗青光眼濾過(guò)術(shù)后瘢痕形成及防治其他纖維化相關(guān)疾病的新型生物工程藥物。本發(fā)明的實(shí)施對(duì)嚴(yán)重危害人類健康的青光眼及其他纖維化相關(guān)疾病的預(yù)防及治療具有重要的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。


圖1為核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP對(duì)抗血清的能力。圖2為核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP的緩釋能力。圖3為熒光標(biāo)記以后的核酸適配子納米制劑CS(Seq58)-NP與細(xì)胞的結(jié)合情況。圖4為核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP抑制成纖維細(xì)胞增殖的能力。圖5為核酸適配子納米制 劑CS (Seq58) -NP抑制成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的能力。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明的發(fā)明內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。應(yīng)理解，本發(fā)明的實(shí)施例只用于說(shuō)明本發(fā)明而非限制本發(fā)明，在不脫離本發(fā)明技術(shù)思想的情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，做出的各種替換和變更，均應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)施例1核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP的制備(I)核酸適配子溶液的制備將上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成的核酸適配子序列Seq58充分溶解于TE緩沖液中，得lnmol/μ I的核酸適配子溶液，_20°C冷藏備用；(2)殼聚糖溶液的制備精密稱取平均分子量為100000 200000，脫乙酰度>90%的殼聚糖溶于2%醋酸中，其中醋酸用量按照殼聚糖質(zhì)量:醋酸體積=Ig: 200 300mL計(jì)算,用0.lmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至5 6，加入雙蒸水至殼聚糖的濃度為1.5 2.0mg/ml，用0.22 μ m —次性針頭式濾器過(guò)濾后，置于無(wú)菌小瓶中，4°C冷藏備用，得殼聚糖溶液； (3)核酸適配子納米制劑CS(Seq58)-NP的制備將步驟(I)制備的lnmol/μ I核酸適配子溶液加入到1.0 1.5ml交聯(lián)劑三聚磷酸鈉溶液中，所述三聚磷酸鈉溶液中三聚磷酸鈉的濃度為0.9mg/ml，得混合液；用5號(hào)針頭將該混合液逐滴滴入到2.0 3.5ml步驟(2)制備的殼聚糖溶液中，其中殼聚糖與核酸適配子的摩爾比分別為1: 1、5: 1、10: 1、20: 1、30: I，滴加速度為40 50滴/min,至溶液出現(xiàn)白色乳光，再向其中滴加0.04 0.06mlTween-80(2%，V/V)，并加入雙蒸水定容至6ml,室溫孵育30min,最后用0.22 μ m—次性針頭式濾器過(guò)濾后,置于無(wú)菌小瓶中，4°C冷藏備用，即得不同殼聚糖:Seq58摩爾比的核酸適配子納米制劑CS(Seq58)-NP。本實(shí)施例制備的核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP為球形微粒，粒徑為100 300nm,電位為 +4 +28mV。實(shí)施例2核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP的血清穩(wěn)定性驗(yàn)證取適量實(shí)施例1制得的各CS(Seq58)_NP，以及未經(jīng)包裹的裸Seq58加入到EP管中，保持各EP管中Seq58含量為0.018nmol，用雙蒸水定容至0.9ml (各管中Seq58終濃度都為20nM);再向各EP管中加入0.1ml胎牛血清，空白對(duì)照組不加血清，每個(gè)殼聚糖:Seq58摩爾比的CS (Seq58) -NP均設(shè)5管；將各EP管置于37° C水浴中，每隔一定時(shí)間段(2小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí))從每組EP管中各取I支EP管，置于65° C水浴IOmin以滅活血清酶的活性，再向其中加入5μ I肝素鈉(1000IU/ml)以解析出CS(Seq58)_NP中的Seq58 ;每組充分混勻后取40 μ I上樣，行聚丙烯酰胺凝膠電泳(15%，含7Μ尿素)，在I X TBE溶液中恒壓200V電泳Ih ;電泳完畢后，將凝膠置于1: 10000的SYBR-Green II染料中染色40min,最后于凝膠成像系統(tǒng)下觀察未被酶解的Seq58條帶。結(jié)果表明，按不同殼聚糖:Seq58摩爾比制備的核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP在血清中的穩(wěn)定性不同，說(shuō)明各組制劑對(duì)抗血清核酸酶的能力各不相同(見(jiàn)圖1)。其中，殼聚糖:Seq58摩爾比為20及30的CS(Seq58)_NP，在經(jīng)過(guò)48小時(shí)的反應(yīng)以后，仍然有一半左右的Seq58未受到血清酶的降解，表明按殼聚糖:Seq58摩爾比20及以上制備出的核酸適配子納米制劑CS (Seq58)-NP具有良好的血清穩(wěn)定性，能保護(hù)適配子Seq58免于核酸酶降解。實(shí)施例3核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP的緩釋能力驗(yàn)證取適量實(shí)施例1制備的各殼聚糖:Seq58摩爾比的CS (Seq58)-NP，加入到EP管中，保持各管中Seq58含量為0.02nmol，用pH=7的PBS定容至Iml ;將各管置于37° C恒溫?fù)u床上，每隔一定時(shí)間段(12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí))取出各管于4° C下離心I小時(shí)(IOOOOrpm),取0.8ml上清液在260nm處測(cè)定吸光度,計(jì)算該時(shí)間段釋放出的Seq58含量，再補(bǔ)加0.8ml PBS緩沖液回EP管，繼續(xù)放回37° C恒溫?fù)u床上，最后計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)累計(jì)釋放Seq58百分率，以累計(jì)釋放Seq58百分率對(duì)時(shí)間作圖。結(jié)果表明，按不同殼聚糖:Seq58摩爾比制備的核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP的緩釋能力各不相同，緩釋時(shí)間大致與殼聚糖的含量成正比(見(jiàn)圖2)。其中，殼聚糖:Seq58摩爾比為20及30的CS(Seq58)_NP，96小時(shí)時(shí)尚未釋放完所有的Seq58，但殼聚糖:Seq58摩爾比為20及30的CS(Seq58)_NP緩釋情況并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明殼聚糖:Seq58摩爾比為20及以上的核酸適配子納米制劑CS (Seq58)-NP具有良好的緩釋能力，能夠緩釋Seq58超過(guò)9 6小時(shí)。本發(fā)明申請(qǐng)人優(yōu)選殼聚糖:Seq58摩爾比為20的CS(Seq58)-NP,因?yàn)闅ぞ厶呛吭龈邥?huì)降低CS(Seq58)_NP的載藥量。實(shí)施例4核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP的細(xì)胞結(jié)合能力驗(yàn)證按實(shí)施例1的方法制備殼聚糖:Seq58摩爾比為20及以上的CS(Seq58)_NP，在交聯(lián)的過(guò)程中加入熒光蛋白FITC，制得熒光標(biāo)記的核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP-FITC ；以亂序的Seq58 (Scrambled Seq58)作為對(duì)照組，也按實(shí)施例1的方法制備出 CS (Sera)-NP-FITC。取第4代人Tenon’ s囊成纖維細(xì)胞(HTFs), I X IO5個(gè)細(xì)胞每孔接種于6孔板，于37° C 二氧化碳孵箱中孵育24小時(shí)；將熒光標(biāo)記的核酸適配子納米制劑CS (Seq58)-NP-FITC及對(duì)照組CS(Scra)-NP-FITC分別加入6孔板中，與細(xì)胞共同孵育2小時(shí)；2小時(shí)后使用PBS于搖床上洗滌三遍，每遍10分鐘，再加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞，封片液封片；最后于激光共聚焦顯微鏡下觀察CS (Seq58) -NP-FITC及CS (Sera) -NP-FITC與細(xì)胞的結(jié)合情況。結(jié)果表明，激光共聚焦顯微鏡下能夠觀察到熒光標(biāo)記的核酸適配子納米制劑CS(Seq58)-NP-FITC呈綠色熒光，并且與細(xì)胞排列相一致；而使用亂序Seq58制備出的CS (Sera) -NP-FITC組幾乎無(wú)熒光信號(hào)(見(jiàn)圖3 )，表明核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP能夠特異性與轉(zhuǎn)化生子因子β II型受體(Ti3R II)結(jié)合。實(shí)施例5核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP抑制成纖維細(xì)胞增殖的能力驗(yàn)證按實(shí)施例1的方法制備殼聚糖:Seq58摩爾比為20及以上的CS (Seq58)-NP。
取第4代人Tenon’ s囊成纖維細(xì)胞(HTFs)，I X IO4個(gè)細(xì)胞每孔接種于96孔板，于37° C 二氧化碳孵箱中孵育24小時(shí)。各孔分別加入濃度為5、10、25、50、100nM的CS (Seq58) -NP,并加入2ng/ml的TGF- β 2，共同刺激細(xì)胞48小時(shí)，對(duì)照組為相應(yīng)濃度的空白殼聚糖CS-NP加入2ng/ml的TGF-β 2，陰性對(duì)照組只加培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照組只加TGF-β 2 ；每組設(shè)3個(gè)副孔，48小時(shí)以后，按MTT試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。最后于酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔在570nm 處的吸光度；細(xì)胞相對(duì)增值率=(Asample-ADMEM/ATCF_02-ADMEM) X 100。結(jié)果表明，核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP能夠明顯抑制成纖維細(xì)胞的增殖，并且與濃度呈正相關(guān)(見(jiàn)圖4)。相比之下空白殼聚糖也具有輕微的抑制成纖維細(xì)胞增殖的能力，但比CS (Seq58) -NP弱很多。當(dāng)核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP使用濃度為25nM，50nM，IOOnM時(shí)，能夠抑制成纖維細(xì)胞的增殖分別達(dá)25.8%，32.4%，35.1%，即當(dāng)核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP使用濃度大于25nM時(shí)，能夠明顯地抑制成纖維細(xì)胞的增殖。實(shí)施例6核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP抑制成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的能力驗(yàn)證按實(shí)施例1的方法制備殼聚糖:Seq58摩爾比為20及以上的CS (Seq58)-NP。取第4代人Tenon’s囊成纖維細(xì)胞(HTFs)，使用含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基于50ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%融合左右，按如下分組刺激細(xì)胞:2ng/ml的TGF- β 2，2ng/ml 的 TGF- β 2+25ηΜ 的 Seq58，以及 2ng/ml 的 TGF- β 2+25ηΜ 的 CS (Seq58) -NP,分別刺激細(xì)胞6小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)，48小時(shí)。刺激結(jié)束以后，裂解細(xì)胞，提取總蛋白，Western Blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中a-SMA (成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白)的表達(dá)情況。結(jié)果表明，在血清存在的情況下，未經(jīng)包裹的裸Seq58僅能抑制TGF-β 2介導(dǎo)的HTFs轉(zhuǎn)分化12小時(shí)左右，而制成核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP以后，能夠抑制TGF-β 2介導(dǎo)的HTFs轉(zhuǎn)分化超過(guò)36小時(shí)，抑制率達(dá)44.8% (見(jiàn)圖5)。實(shí)施例7核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP的用途取本發(fā)明核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP,按本領(lǐng)域常規(guī)方法制成對(duì)抗斑痕形成的透明質(zhì)酸鈉凝膠、殼聚糖凝膠、聚丙烯酸凝膠等外用凝膠制劑，其外用凝膠制劑中核酸適配子納米制劑的濃度為大于25nM。取本發(fā)明核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP,按本領(lǐng)域常規(guī)方法制成對(duì)抗斑痕形成的透明質(zhì)酸鈉膜、殼聚糖膜或脂質(zhì)體膜等外用生物膜制劑，其外用生物膜制劑中核酸適配子納米制劑的濃度為大于25nM。取本發(fā)明核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP按本領(lǐng)域常規(guī)方法制備成應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室及臨床的TPR II檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明核酸適配子納米制劑CS(Seq58)-NP還可與藥學(xué)上可以接受的輔料或其它藥物組成組合物，包括與緩釋材料組成的組合物。參考文獻(xiàn)[I]Grotendorst GR.Connective tissue growth factor: a mediator ofTGF-beta action on fibroblasts.Cytokine Growth Factor Rev, 1997, 8:171 - 179.
[2] Cordeiro MF，Bhattacharya SS，Schultz GS，e tal.TGF-betal，_beta2，and_b eta3in vitro:biphasic effects on Tenoni sfibroblast contraction, proliferation，and migration.1nvest Ophthalmol VisSci，2000，41:756-763.
[3]Tomasek JJ，McRae Jj Owens GK，et al.Regulation of[alpha]-SmoothMuscle Actin Expression in Granulation Tissue Myofibroblasts Is Dependent onthe Intronic CArG Element and the Transforming Growth Factor-[beta]IControlElement.Am J Pathol，2005，166:1343-1351.
[4] Mead AL, et al.Ant1-TGF beta2ant ibody (CAT-152) as a newpost-operative modulator of scarring after experimental glaucoma filtrationsurgery.1nvest Ophthalmol Vis Scij 2002, 43:3332.
[5]Cordeiro MFj et al.Novel antisense oligonucleotides targetingTGF-beta inhibit in vivo scarring and improve surgical outcome.GeneTherapy, 2003，10:59-71.
[6]Li FFj et al.Efficient inhibition of fibroblast proliferation andcollagen expression by ERK2siRNAs.Biochemical and Biophysical Research Communications, 2009，382:259-263.
[7] Ohuchi SP，Ohtsu Tj Nakamura Y.Selection of RNA aptamers againstrecombinant transforming growth factor—beta type III receptor displayed on cellsurface.Biochimiej2006，88:897-904.
[8]Ohuchi SP，Ohtsu T，Nakamura Y.A novel method to generate aptamers against recombinant targets displayed on the cell surface.Nucleic Acids SympSer (Oxf)，2005:351-352.
[9] Urban-Klein Bj Werth Sj Abuharbeid S，et al.RNA1-mediatedgene-targeting through systemic application of polyethylenimine(PEI)-complexedsiRNA in viv0.Gene Therapy，2005，12:461-466.
[10]Katas H，Alpar H0.Development and characterisation of chitosannanoparticles for siRNA delivery.J Control Release，2006，115:216-225.
該專利由國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81170852)、全軍醫(yī)學(xué)科技“十二五”科研項(xiàng)目(CWS11J137)資助。
權(quán)利要求
1.一種針對(duì)轉(zhuǎn)化生子因子β II型受體的核酸適配子納米制劑，其特征在于:所述核酸適配子納米制劑為由殼聚糖和核酸適配子組成的球形微粒，殼聚糖包裹核酸適配子，其中殼聚糖與核酸適配子的摩爾比大于20: I ;所述核酸適配子納米制劑的粒徑為100 300nm,電位為+4 +28mV ;所述核酸適配子為Seq58。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種針對(duì)轉(zhuǎn)化生子因子βII型受體的核酸適配子納米制劑，其特征在于:所述殼聚糖與核酸適配子的摩爾比為20 30: I。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種針對(duì)轉(zhuǎn)化生子因子βII型受體的核酸適配子納米制劑，其特征在于:所述殼聚糖的平均分子量為100000 200000，脫乙酰度>90%。
4.一種制備如權(quán)利要求1所述的針對(duì)轉(zhuǎn)化生子因子β II型受體的核酸適配子納米制劑的方法，包括如下步驟: (1)核酸適配子溶液的制備 將核酸適配子Seq58充分溶解于TE緩沖液中，得lnmol/μ I的核酸適配子溶液，_20°C冷藏備用； (2)殼聚糖溶液的制備 精密稱取平均分子量為100000 200000，脫乙酰度>90%的殼聚糖溶于2%醋酸中，其中醋酸用量按照殼聚 糖質(zhì)量:醋酸體積=Ig: 200 300mL計(jì)算，用0.lmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至5 6，再加入雙蒸水至殼聚糖的濃度為1.5 2.0mg/ml ;用0.22 μ m —次性針頭式濾器過(guò)濾后，置于無(wú)菌小瓶中，4°C冷藏備用，得殼聚糖溶液； (3)核酸適配子納米制劑的制備 將步驟(I)制備的lnmol/μ I核酸適配子溶液加入到1.0 1.5ml三聚磷酸鈉溶液中，所述三聚磷酸鈉溶液中三聚磷酸鈉的濃度為0.9mg/ml，得混合液；用5號(hào)針頭將該混合液逐滴滴入到2.0 3.5ml步驟(2)制備的殼聚糖溶液中，其中殼聚糖與核酸適配子的摩爾比大于20: 1，滴加速度為40 50滴/min，至溶液出現(xiàn)白色乳光，再向其中滴加0.04 0.06ml Tween-80 (2%, v/v),并加入雙蒸水，定容至6ml,室溫孵育30min,最后用0.22 μ m —次性針頭式濾器過(guò)濾后，置于無(wú)菌小瓶中，4°C冷藏備用，即得針對(duì)轉(zhuǎn)化生子因子β II型受體的核酸適配子納米制劑。
5.權(quán)利要求1 3之一所述的針對(duì)轉(zhuǎn)化生子因子βII型受體的核酸適配子納米制劑用于制備對(duì)抗斑痕形成的外用凝膠制劑的用途，其特征在于:所述外用凝膠制劑為透明質(zhì)酸鈉凝膠、殼聚糖凝膠或聚丙烯酸凝膠，所述外用凝膠制劑中針對(duì)轉(zhuǎn)化生子因子β II型受體的核酸適配子納米制劑的濃度為大于25ηΜ。
6.權(quán)利要求1 3之一所述的針對(duì)轉(zhuǎn)化生子因子βII型受體的核酸適配子納米制劑用于制備對(duì)抗斑痕形成的外用生物膜制劑的用途，其特征在于:所述外用生物膜制劑為透明質(zhì)酸鈉膜、殼聚糖膜或脂質(zhì)體膜，所述外用生物膜制劑中針對(duì)轉(zhuǎn)化生子因子β II型受體的核酸適配子納米制劑的濃度為大于25ηΜ。
7.權(quán)利要求1 3之一所述的針對(duì)轉(zhuǎn)化生子因子βII型受體的核酸適配子納米制劑用于制備應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室及臨床的轉(zhuǎn)化生子因子β II型受體檢測(cè)試劑盒的用途。
8.權(quán)利要求1 3之一所述的針對(duì)轉(zhuǎn)化生子因子βII型受體的核酸適配子納米制劑與藥學(xué)上可以接受的輔料或其它藥物組成的組合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的針對(duì)轉(zhuǎn)化生子因子βII型受體的核酸適配子納米制劑與藥學(xué)上可以接受的輔料或其它藥物組 成的組合物，其特征在于:所述組合物由針對(duì)轉(zhuǎn)化生子因子β II型受體的核酸適配子納米制劑與緩釋材料組成。
全文摘要
本發(fā)明提供一種針對(duì)轉(zhuǎn)化生子因子βⅡ型受體的核酸適配子納米制劑。該核酸適配子納米制劑為由殼聚糖和核酸適配子組成的球形微粒，殼聚糖包裹核酸適配子，其中殼聚糖與核酸適配子的摩爾比大于20∶1；所述核酸適配子納米制劑的粒徑為100～300nm，電位為+4～+28mV；所述核酸適配子為Seq58。本發(fā)明還提供所述核酸適配子納米制劑的制備方法。本發(fā)明針對(duì)轉(zhuǎn)化生子因子βⅡ型受體的核酸適配子納米制劑能競(jìng)爭(zhēng)性地抑制TGF-β與其受體TβRⅡ結(jié)合，并具有良好的血清穩(wěn)定性及緩釋性，有望成為抗青光眼濾過(guò)術(shù)后瘢痕形成及防治其他纖維化相關(guān)疾病的新型生物工程藥物。
文檔編號(hào)A61K31/7088GK103230369SQ20131012120
公開(kāi)日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月9日
發(fā)明者謝琳, 陳俠, 李磊, 朱曉燕 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院