鰩血管生成抑制因子1的適配子k16及其篩選方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種鰩血管生成抑制因子1適配 子及其篩選方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近些年來(lái)，寡核苷酸適配子作為抗體分子的前景性替代分子，其研究較為引人注 目。寡核苷酸適配子是由SELEX技術(shù)（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment)生物文庫(kù)技術(shù)篩選獲得的，該技術(shù)的原理就是利用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建人工 合成的單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)，其隨機(jī)序列長(zhǎng)度在20-100個(gè)堿基左右。利用單鏈寡核苷酸 分子構(gòu)像靈活多變的特性，將隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)與靶分子相互作用，保留以空間構(gòu)像與靶 分子結(jié)合的寡核苷酸，經(jīng)反復(fù)擴(kuò)增、篩選數(shù)個(gè)循環(huán)，即可使與該靶子特異結(jié)合的寡核苷酸序 列得到富集，最終獲得多種靶分子的特異寡核苷酸適配子，即aptamer。利用SELEX技術(shù)篩選 獲得的aptamer識(shí)別分子的模式與蛋白抗體類似，但與蛋白類抗體相比，核酸類配基具有更 多的優(yōu)越性，如不受免疫條件和免疫原性限制，可體外人工合成，變性與復(fù)性可逆，可修飾 并有利于長(zhǎng)期保存和室溫運(yùn)輸?shù)?。更重要的是，aptamer比抗體具有更高的特異性，甚至能 識(shí)別單抗不能區(qū)分的蛋白質(zhì)分子。而且aptamer的靶分子非常廣泛，小至染料分子，大至完 整的病毒顆粒和細(xì)菌病原體，甚至完整的細(xì)胞也可以通過消減SELEX技術(shù)篩選出高親和力 的寡核苷酸適配子。
[0003] 鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)以下簡(jiǎn)稱鰩功能區(qū)，鰩血管生成抑制因子1是我們首 次從南海海域一種鰩組織中分離出來(lái)的蛋白質(zhì)（分子量42KD)。研究結(jié)果顯示:鰩血管生成 抑制因子1顯著抑制雞胚絨毛尿囊膜本身的及人鼻咽癌細(xì)胞誘導(dǎo)的雞胚絨毛尿囊膜血管生 成;無(wú)論是腹腔注射還是灌胃都顯著抑制裸小鼠 Lewis肺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，減少腫瘤組織微 血管密度，下調(diào)促血管生成因子VEGF的表達(dá);對(duì)裸小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞的轉(zhuǎn)移也有強(qiáng)抑制 作用；下調(diào)促轉(zhuǎn)移因子CD44v6和ErBb2的表達(dá)；與5-氟尿嘧啶（5-FU)聯(lián)合應(yīng)用時(shí)效果更顯 著。鰩血管生成抑制因子1的作用靶點(diǎn)與美國(guó)基因技術(shù)研究所開發(fā)出的抗癌新藥Avastin不 同。Avastin是基因工程產(chǎn)品，是VEGF的抗體，其作用靶點(diǎn)是VEGF;鰩血管生成抑制因子1是 天然產(chǎn)物，它不僅作用于VEGF，還作用于bFGF和TOGF。因此，針對(duì)鰩血管生成抑制因子1功能 區(qū)進(jìn)行特異性的鑒別和篩選是本領(lǐng)域一貫的追求。
[0004] 基于以上考慮，本發(fā)明以鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)蛋白為目的靶蛋白，采用 SELEX技術(shù)獲得了 10條鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)蛋白特異的aptamer，組合應(yīng)用能夠迅 速、敏感、特異的檢測(cè)到鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)蛋白。由于單鏈DNA寡核苷酸適配子性 能穩(wěn)定、合成方便且廉價(jià)、經(jīng)修飾后可直接用于熒光或化學(xué)發(fā)光、發(fā)色方法檢測(cè)靶綁帶，因 此操作簡(jiǎn)單、直接。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供不僅具有檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性高于抗體等特點(diǎn)，而 且制備方法容易、制備周期較短的一組能識(shí)別鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)蛋白的寡核苷 酸序列及其制備方法。
[0006] 所述能識(shí)別鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)蛋白的寡核苷酸序列，包括SEQ ID No.2-11，且采用其中的一條寡核苷酸序列就能完成對(duì)鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)蛋白的 識(shí)別檢測(cè)；
[0007] 所述一組能識(shí)別鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)蛋白的寡核苷酸序列的制備方法包 括以下步驟：
[0008] 1、合成用于篩選的ssDNA寡核苷酸文庫(kù)（5CTCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC--
[0009] N35--GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3')，其中N35為35個(gè)隨機(jī)寡核苷酸；
[0010] 2、將寡核苷酸文庫(kù)分別與鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)蛋白混合后進(jìn)行SELEX篩 選，獲得適配子富集文庫(kù)；
[0011] 3、SELEX篩選完成后，對(duì)獲得的適配子富集文庫(kù)進(jìn)行克隆測(cè)序；
[0012] 4、選擇測(cè)序結(jié)果中出現(xiàn)的高拷貝SSDNA，進(jìn)行親和特異性的驗(yàn)證，篩選獲得能識(shí)別 鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)蛋白的寡核苷酸序列。
【具體實(shí)施方式】 [0013] 實(shí)施例1
[0014] 1、鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)蛋白的制備
[0015] 采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的酵母重組表達(dá)的方式獲得具有與鰩血管生成抑制因 子1功能區(qū)蛋白相同生物活性的鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)蛋白，該蛋白序列如SEQ ID NO: 1所示;蛋白溶液的濃度為15mg/m 1。
[0016] 2、文庫(kù)和引物的合成
[0017] 2.1、合成用于篩選的ssDNA寡核苷酸文庫(kù)G'-TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC--
[0018] N35--GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3')，其中N35為35個(gè)隨機(jī)寡核苷酸；
[0019] 引物PI :TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC;
[0020] 引物 P2: CCCTCTGGGGTCTCCCTCTTGTGC。
[0021] 2.2、適配子的SELEX篩選，具體方法如下：
[0022] 2.2.1 ssDNA與鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)蛋白的結(jié)合、分離，具體方法如下： [0023] 取100μΜ的ssDNA寡核苷酸文庫(kù)4yL，用2X結(jié)合緩沖液稀釋至100μ1，95Γ變性 5min，冰浴lOmin后加入100μΙ鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)蛋白，搖床結(jié)合30min，再 6000rpm離心5min，棄上清，然后用1 X結(jié)合緩沖液洗沉淀，棄上清;在沉淀中再加入1 X結(jié)合 緩沖液1〇〇此，96 °C加熱5min，然后15000rpm離心10min，取上清液，對(duì)沉淀再次加熱并離心， 合并上清液，則可分離得到與鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)蛋白有親和力的ssDNA次級(jí)文 庫(kù);所述2 X結(jié)合緩沖液為20 X結(jié)合緩沖液用雙蒸水稀釋10倍后的溶液，所述1 X結(jié)合緩沖 液為20 X結(jié)合緩沖液用雙蒸水稀釋20倍后的溶液;所述20 X結(jié)合緩沖液配方為1M NaCl、 50mM KCl、500mM Tris-HCl、10mM MgC12、pH 7.4。
[0024] 2.2.2ssDNA與鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)蛋白的結(jié)合、分離，具體方法如下：
[0025] 將步驟2.2.1分離得到的能與鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)蛋白結(jié)合的ssDNA，再 與100μΙ鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)蛋白搖床結(jié)合30min，后續(xù)步驟同步驟2.2.1，則可分 離到與鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)蛋白都有親和力的ssDNA次級(jí)文庫(kù)。
[0026] 2 · 2 · 3不對(duì)稱PCR擴(kuò)增ssDNA，具體方法如下：
[0027]對(duì)步驟2.2.2分離獲得的ssDNA次級(jí)文庫(kù)進(jìn)行不對(duì)稱PCR擴(kuò)增，總體積為25μ1的不 對(duì)稱PCR擴(kuò)增體系為：10 X PCR緩沖液:2μ1; Ρ1 (10μΜ): ΙμL;Ρ2(0 · 2μΜ): ΙμL; dNTP(各2 · 5mM): 0 · 4μ1 ;MgCl2(25mM): 1 · 2μ1; ssDNA模板（0 · 2yg/yl): 2μ1; Taq DNA聚合酶（5ιι/μ1): 0 · 2μ1; (1(1!120:17.2以1;?〇?反應(yīng)參數(shù):94°(：預(yù)變性41^11，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)94°(：變性308,58°(：退火 30s，72°C 延伸 20s，最后 72°C 延伸 7min;
[0028] 2 · 2 · 4親和力的測(cè)定，具體方法如下：
[0029] 2.2.4.1擴(kuò)增：用帶有地高辛標(biāo)記的引物P1不對(duì)稱PCR擴(kuò)增篩選出來(lái)的ssDNA次級(jí) 文庫(kù)，擴(kuò)增條件和參數(shù)與步驟2.2.3的不對(duì)稱PCR擴(kuò)增體系和參數(shù)相同；
[0030] 2.2.4.2與蛋白結(jié)合:取步驟2.2.4.1擴(kuò)增所得的PCR產(chǎn)物100yL，95 °C變性5min，冰 浴10min后加入100yL蛋白中，充分混合，在室溫下結(jié)合30min，然后6000rpm離心，分離蛋白 與上清液，蛋白中包含有與蛋白中結(jié)合的帶地高辛標(biāo)記的ssDNA，上清液中是未結(jié)合的 ssDNA，同時(shí)做一不加 ssDNA的空白，即用2X結(jié)合緩沖液代替PCR產(chǎn)物，同樣進(jìn)行上述操作；
[0031] 2.2.4.3洗滌:將蛋白用1 X結(jié)合緩沖液500yL洗滌1次，6000rpm離心，棄上清，取蛋 白；
[0032] 2.2.4.4與酶標(biāo)兔抗地高辛抗體結(jié)合:在蛋白中加入10(^1^1:90(^85稀釋的過量 的酶標(biāo)兔抗地高辛抗體，充分混合后，反應(yīng)l〇min，使之與蛋白中的地高辛標(biāo)記的ssDNA結(jié) 合；
[0033] 所述TBS為0.5M Tris-NaCl溶液，配制方法為：先水溶8.5~9g NaCl，再加1^8_ HC1 (0 · 5M、pH7 · 6)溶液 100ml，最后加水定容至 1L;0 · 5M Tris-HCl(pH7 ·6，100ml)溶液配制 方法:稱取Tris 6.06g，加入雙蒸水40ml溶解，滴加濃HC1調(diào)pH至7.6，定容至100ml。
[0034] 2.2.4.5洗滌:6000rpm離心，去上清，再用1 X結(jié)合緩沖液500yL洗滌3次，得蛋白；
[0035] 2.2.4.6TMB(四甲基聯(lián)苯胺）顯色：加入400yL雙蒸水重懸蛋白，再加入200yL TMB 顯色液，避光顯色l〇min后，以2mol/L H2S04200yL終止反應(yīng)，測(cè)定450nm處的吸光值0D450， 該值即反映與菌結(jié)合的ssDNA的親和力，即0D結(jié)合，空白同樣進(jìn)行上述步驟2.2.4.3， 2.2.4.4,2.2.4.5和2.2.4.6,得到空白相應(yīng)的吸光度0D空白；
[0036]所述TMB顯色液使用常規(guī)的配制方法配制。
[0037] 2.2.4.7測(cè)定PCR產(chǎn)物中DNA的摩爾濃度:取步驟2.2.4.1擴(kuò)增所得的PCR產(chǎn)物，以已 知濃度梯度的初始ssDNA文庫(kù)為標(biāo)準(zhǔn)品，用Bandscan軟件作為圖像分析軟件，采用溴化乙錠 瓊脂糖凝膠電泳法定量測(cè)定PCR產(chǎn)物中的DNA含量，獲得相應(yīng)DNA的摩爾濃度，進(jìn)而可以計(jì)算 出100yL PCR產(chǎn)物中的DNA摩爾數(shù)。
[0038] 2.2.4.8計(jì)算相應(yīng)文庫(kù)的親和力：
[0039]
[0040] 2.3重復(fù)篩選，具體方法為：以每一輪不對(duì)稱PCR的產(chǎn)物作為下一輪的篩選文庫(kù)，重 復(fù)上述SELEX篩選步驟2.2,直到親和力不再上升為止，最后經(jīng)過16輪的篩選得到ssDNA的適 配子富集文庫(kù)。經(jīng)不對(duì)稱PCR擴(kuò)增后，條件同前面的步驟，克隆并測(cè)序，得到拷貝數(shù)最高的20 個(gè)有效的ssDNA，將20個(gè)適配子分別進(jìn)行親和特異性驗(yàn)證，得到10個(gè)對(duì)鰩血管生成抑制因子 1功能區(qū)蛋白有較好親和特異性的寡核苷酸序列(適配子），具體序列如下：
[0041]
[0043] 親和力具體數(shù)據(jù)如下：
[0044]
[0045] 2.4、分析20條適配子的特異性和親和性
[0046] 熒光標(biāo)記的適配子序列與鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)蛋白孵育，進(jìn)行流式細(xì)胞 分析檢測(cè)，其中10條序列顯示了高熒光強(qiáng)度，使用GraphPad Prism5.0軟件針對(duì)飽和曲線做 非線性回歸曲線，分別對(duì)10條高親和性適配子序列采用相同的實(shí)驗(yàn)操作，得到了每條是配 置的Kd值：
[0047]
'[0048]其中K20的Kd值最小，說(shuō)明與靶蛋白可以快速結(jié)合并且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定不易分離。 '
[0049] 采用DNAMAN軟件構(gòu)建了 10條適配子的二級(jí)結(jié)構(gòu)并計(jì)算了他們的最小自由能，其結(jié) 構(gòu)最小自由能也都較小，結(jié)構(gòu)也相對(duì)穩(wěn)定。
[0050] 2.5適配子特異性分析
[0051] 分別采用BSA、人血紅蛋白、鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)蛋白與10條適配子進(jìn)行 特異性檢測(cè)，經(jīng)過結(jié)合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這10條序列都不與BSA或人血紅蛋白相結(jié)合，而只與鰩血 管生成抑制因子1功能區(qū)蛋白結(jié)合保持較高的特異性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于適配子篩選的鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)蛋白，其序列為SEQ ID NO: 1所 不。2. -種識(shí)別鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)蛋白的寡核苷酸序列，其特征在于其序列為 SEQIDNo.8**。3. 權(quán)利要求2所示的寡核苷酸序列用于篩選鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)蛋白的應(yīng)用。
【專利摘要】一組能識(shí)別鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)蛋白的適配子及其制備方法。寡核苷酸序列包括SEQ？ID？No.2～11，其分別具有較高的親和特異性，可以用于鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)蛋白的檢測(cè)。
【IPC分類】C07K14/46, C12N15/115, G01N33/68
【公開號(hào)】CN105646695
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】張壘, 張勇
【申請(qǐng)人】張勇
【公開日】2016年6月8日
【申請(qǐng)日】2014年6月6日