專利名稱：一種靈芝孢子油中抗腫瘤組合物及其制備方法
一種靈芝孢子油中抗腫瘤組合物及其制備方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于天然藥物化學(xué)及中藥學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種靈芝孢子油中抗腫瘤組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
靈芝，為多孔菌科真菌靈芝的子實(shí)體。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，后列入《本草綱目》， 被列為上品，味甘性平，扶正固本。具有抗腫瘤，免疫調(diào)節(jié)，抗氧化，抗放射線損傷及化療藥損傷，改善睡眠，強(qiáng)心降壓，鎮(zhèn)咳平喘的作用。
靈芝孢子粉，為靈芝子實(shí)體生長(zhǎng)成熟期所產(chǎn)生的生殖細(xì)胞靈芝孢子的集合。含有脂肪酸類，留醇類，三萜類，生物堿類，內(nèi)酯，蛋白質(zhì)和氨基酸，糖肽以及無(wú)機(jī)鹽，現(xiàn)代藥理研究表明靈芝孢子粉的抗腫瘤的作用抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分化，抑制腫瘤內(nèi)血管生成，同時(shí)通過(guò)增強(qiáng)人體的免疫力達(dá)到抗腫瘤的功能。
靈芝孢子油是由破壁靈芝孢子粉中通過(guò)超臨界C02提取提出的天然成分，富集了靈芝孢子粉中的靈芝三萜類、脂肪酸類、麥角留醇類成分，抗腫瘤活性成分比靈芝孢子粉更高，具有調(diào)節(jié)血脂，增強(qiáng)免疫，抗腫瘤等多方面作用。
但是靈芝孢子油的成分復(fù)雜，哪些成分具有更大的抗腫瘤的生物活性在目前還不十分明確，仍然是學(xué)術(shù)界研究的熱點(diǎn)。靈芝孢子油的成分大部分為已知的各種脂肪酸及甘油三酯，其中真正起抗腫瘤作用的成分尚不明確。而有關(guān)于靈芝孢子油的抗腫瘤活性應(yīng)用多是將靈芝孢子油與其他中藥或中成藥相混合。
中國(guó)專利200610086075.1 一種富含萜類的靈芝孢子油類制劑加工方法采用膜分離的方法收集特定分子量的孢子油以提高有效成分含量，其總?cè)萍兌饶芴岣逫倍但是并未提供具體的抗腫瘤活性數(shù)據(jù)。
中國(guó)專利申請(qǐng)20110168831. 6 一種提高靈芝孢子油抗腫瘤功效的加工方法采用超聲離心靜置的方法分離特定層的孢子油以提高抗腫瘤活性，新孢子油得率為26 27%，劑量為160mg/kg時(shí)，該新孢子油對(duì)小鼠肉瘤的抑瘤率為55. 57%，對(duì)小鼠胸腔積液中原代腫瘤的抑 瘤率為56. 06%。但是該新孢子油的抗腫瘤功效的成分并未提及。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種靈芝孢子油中抗腫瘤組合物及其制備方法，該組合物具有良好的抗腫瘤功效。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)的一種靈芝孢子油中抗腫瘤組合物及其制備方法，它包括以下步驟1.1.將V升的靈芝孢子油加入容積大于5V升的分液容器內(nèi)，再依次加入O. 1-1. OV 升的石油醚或乙酸乙酯(分析純)、0. 1-1. OV升的無(wú)水乙醇或甲醇(分析純)和O. 5-1. OV升純凈水(18ΜΩ. cm)；1. 2.將分液容器固定在全自動(dòng)液液萃取器內(nèi)，進(jìn)行提取O. 5小時(shí)；1. 3.靜置O. 5小時(shí)后分層，分離下層溶液；1.4.將下層溶液進(jìn)行旋蒸濃縮，用甲醇定容至O.OlV升；1. 5 將上述這O. OlV升濃縮液用O. 02-0. 025V升大孔樹脂攪拌，揮干甲醇，再裝入O.25-0. 6V升的大孔樹脂柱進(jìn)行分離；1.6用體積為大孔樹脂柱2-3倍的純凈水、50%乙醇及濃度大等于75%乙醇進(jìn)行梯度洗脫；1.7收集濃度大等于75%乙醇的洗脫液；1.8 將洗脫液經(jīng)冷凍干燥，真空度為20Pa，凍結(jié)溫度為-20°C，捕水器溫度為_50°C， 得到抗腫瘤組合物。
本發(fā)明所指的石油醚或乙酸乙酯、無(wú)水乙醇或甲醇為分析純。
或它包括以下步驟2.1.將V升的靈芝孢子油加入容積大于5V升的分液容器內(nèi)，再依次加入O. 1-1. OV 升的石油醚或乙酸乙酯(分析純)、0. 1-1. OV升的無(wú)水乙醇或甲醇(分析純)和O. 5-1. OV升純凈水(18ΜΩ. cm)；2.2.將分液容器固定在全自動(dòng)液液萃取器內(nèi)，進(jìn)行提取O. 5小時(shí)；2.3.靜置O. 5小時(shí)后分層，分離下層溶液；2.4.將下層溶液進(jìn)行旋蒸濃縮，用甲醇定容至O.OlV升；2.5將上述這O. 01 V升濃縮液用O. 02-0. 025 V升聚酰胺樹脂攪拌，揮干甲醇，再裝入O. 25-0. 6 V升的聚酰胺樹脂柱進(jìn)行分離；2.6用體積為聚酰胺樹脂柱2-3倍的純凈水、50%乙醇及濃度大等于85%乙醇進(jìn)行梯度洗脫；2.7收集濃度大等于85%乙醇的洗脫液；2.8 將洗脫液經(jīng)冷凍干燥，真空度為20Pa，凍結(jié)溫度為-20°C，捕水器溫度為_50°C， 得到抗腫瘤組合物。
按上述方法制備所得的組合物通過(guò)高效液相色譜儀(HPLC)的指紋圖譜的測(cè)定，有主要4個(gè)成分具有良好的抗腫瘤功效。通過(guò)本發(fā)明得到的組合物，對(duì)小鼠的前列腺癌細(xì)胞 RM-1的半抑制率IC50是2. 19 (μ g/mL)，對(duì)小鼠肺腺癌細(xì)胞LA795是4. 49，對(duì)小鼠淋巴白血病細(xì)胞L1210是5. 47，(IC50小于10為有效)。該組合物對(duì)荷有前列腺觀_1癌腫瘤的小鼠，用量110mg/kg時(shí)，對(duì)小鼠抑瘤率為56. 9%，有好的抑瘤效果。


圖1為抗腫瘤組合物的HPLC指紋圖譜具體實(shí)施方式
下面結(jié)合視圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述，下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)的技術(shù)人員更理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
本發(fā)明所述純凈水的電阻率大等于18ΜΩ . cm。
一種靈芝孢子油 中抗腫瘤組合物及其制備方法，它包括以下步驟1.1.將V升的靈芝孢子油加入容積大于5V升的分液容器內(nèi)，再依次加入O. 1-1. OV 升的石油醚或乙酸乙酯(分析純)、0. 1-1. OV升的無(wú)水乙醇或甲醇(分析純)和O. 5-1. OV升純凈水(18ΜΩ. cm)；1.2.將分液容器固定在全自動(dòng)液液萃取器內(nèi)，進(jìn)行提取O. 5小時(shí)；1.3.靜置O. 5小時(shí)后分層，分離下層溶液；1.4.將下層溶液進(jìn)行旋蒸濃縮，用甲醇定容至O. OlV升；1.5 將上述這O. OlV升濃縮液用O. 02-0. 025V升大孔樹脂攪拌，揮干甲醇，再裝入 O. 25-0. 6V升的大孔樹脂柱進(jìn)行分離；1.6用體積為大孔樹脂柱2-3倍的純凈水、50%乙醇及濃度大等于75%乙醇進(jìn)行梯度洗脫；1.7收集濃度大等于75%乙醇的洗脫液；1.8 將洗脫液經(jīng)冷凍干燥，真空度為20Pa，凍結(jié)溫度為-20°C，捕水器溫度為_50°C， 得到抗腫瘤組合物。
實(shí)施例1 :1.將200mL的靈芝孢子油加入IOOOmL分液容器內(nèi)，再依次加入200mL的石油醚、IOOmL 的無(wú)水乙醇和IOOmL純凈水，總液體體積為600mL ；2.將分液容器固定在全自動(dòng)液液萃取器內(nèi)，進(jìn)行提取O.5小時(shí)；3.靜置O.5小時(shí)后分層，分離下層溶液；4.將下層溶液進(jìn)行旋蒸濃縮，用甲醇定容至2mL;5.將這2mL濃縮液用5mL大孔樹脂(HZ816)攪拌，揮干，再加入到50mL的大孔樹脂柱 (HZ816)進(jìn)行分尚；6.用體積為大孔樹脂柱2倍(IOOmL)純凈水和體積為大孔樹脂柱2倍(IOOmL)50%乙醇、體積為大孔樹脂柱3倍(150mL) 75%乙醇進(jìn)行梯度洗脫；7.收集75%的乙醇洗脫液；8.將洗脫液進(jìn)行冷凍干燥，真空度為20Pa,凍結(jié)溫度為為_20°C,捕水器溫度為_50°C, 得到抗腫瘤組合物，得率為O. 47%。
實(shí)施例21.將200mL的靈芝孢子油加入IOOOmL分液漏斗內(nèi)，再依次加入IOOmL的石油醚、200mL 的甲醇和200mL純凈水，總液體體積為700mL ；2.將分液漏斗固定在全自動(dòng)液液萃取器內(nèi)，進(jìn)行提取O.5小時(shí)；3.靜置O.5小時(shí)后分層，分離下層溶液；4.將下層溶液進(jìn)行旋蒸濃縮，用甲醇定容至2mL;5.將這2mL濃縮液用5mL大孔樹 脂(HZ816)攪拌，揮干，再加入到IOOmL的大孔樹脂柱(HZ816)進(jìn)行分尚；6.用體積為大孔樹脂柱2倍(200mL)純凈水和體積為大孔樹脂柱3倍(300mL)50%乙醇、體積為大孔樹脂柱3倍(300mL) 85%乙醇梯度洗脫；7.收集85%的乙醇洗脫液；8.將洗脫液進(jìn)行冷凍干燥，真空度為20Pa,凍結(jié)溫度為為_20°C,捕水器溫度為_50°C, 得到抗腫瘤組合物，得率為O. 55%.制作組合物的另一種方法它包括以下步驟2.1.將V升的靈芝孢子油加入容積大于5V升的分液容器內(nèi)，再依次加入O. 1-1. OV 升的石油醚或乙酸乙酯(分析純)、0. 1-1. OV升的無(wú)水乙醇或甲醇(分析純)和O. 5-1. OV升純凈水(18ΜΩ. cm)；2.2.將分液容器固定在全自動(dòng)液液萃取器內(nèi)，進(jìn)行提取O. 5小時(shí)；2.3.靜置O. 5小時(shí)后分層，分離下層溶液；2.4.將下層溶液進(jìn)行旋蒸濃縮，用甲醇定容至O. OlV升；2.5將上述這O. 01 V升濃縮液用O. 02-0. 025 V升聚酰胺樹脂攪拌，揮干甲醇，再裝入O. 25-0. 6 V升的聚酰胺樹脂柱進(jìn)行分離；2.6用體積為聚酰胺樹脂柱2-3倍的純凈水、50%乙醇及濃度大等于85%乙醇進(jìn)行梯度洗脫；2.7收集濃度大等于85%乙醇的洗脫液；2.8 將洗脫液經(jīng)冷凍干燥，真空度為20Pa，凍結(jié)溫度為_20°C，捕水器溫度為_50°C， 得到抗腫瘤組合物。
實(shí)施例31.將200mL的靈芝孢子油加入IOOOmL分液漏斗內(nèi)，再依次加入IOOmL的乙酸乙酯、 2OOmL的無(wú)水乙醇和150mL純凈水，總液體體積為650mL ；2.將分液漏斗固定在全自動(dòng)液液萃取器內(nèi)，進(jìn)行提取O.5小時(shí)；3.靜置O.5小時(shí)后分層，分離下層溶液；4.將下層溶液進(jìn)行旋蒸濃縮，用甲醇定容至2mL;5.將這2mL濃縮液用5mL聚酰胺樹脂攪拌，揮干，再加入到IOOmL的聚酰胺樹脂柱進(jìn)行分離；6.用體積為聚酰胺樹脂柱2-3倍(200-300mL)的純凈水、250mL50%的乙醇和300mL95% 的乙醇梯度洗脫；7.收集95%的乙醇洗脫液；8.將洗脫液進(jìn)行冷凍干燥，真空度為20Pa，凍結(jié)溫度為_20°C，捕水器溫度為_50°C，得到抗腫瘤組合物，得率為O. 60%ο
我們對(duì)制得的組合物進(jìn)行檢測(cè)和動(dòng)物試驗(yàn)該組合物的高效液相色譜(HPLC)的指紋圖譜的測(cè)定方法1.儀器與試藥島津LC-20A，甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純)，甲酸(色譜純)，純凈水(18ΜΩ. cm)。
2.色譜條件流動(dòng)相甲醇-乙腈-O. 04%甲酸水溶液；柱子0DS_3, 5 μ mX 4. 6mmX 250mm ;流速2mL/min ；波長(zhǎng)278nm ；柱溫40 °C ；進(jìn)樣 L 20 μ L0
3.指紋圖譜鑒定如圖1所示，靈芝孢子油的組合物有主要4個(gè)成分，具有良好的抗腫瘤功效。
以下通過(guò)實(shí)驗(yàn)例對(duì)本發(fā)明方法的效果做進(jìn)一步闡述。根據(jù)化學(xué)藥物臨床前指導(dǎo)原則IC50提取物在30 μ g/mL之內(nèi)，合成物在10 μ g/mL之內(nèi)為抑瘤有效。
實(shí)驗(yàn)例1:該組合物對(duì)小鼠腫瘤細(xì)胞增殖的抑制效果實(shí)驗(yàn)材料按照本專利的實(shí)施例1方法制備得到組合物實(shí)驗(yàn)方法制備小鼠前列腺癌細(xì)胞RlTl，小鼠肺腺癌細(xì)胞LA795，小鼠淋巴細(xì)胞白血病 L1210細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中每孔細(xì)胞濃度為RlTl =10000/孔，LA795 :1500/孔， L1210 :2X IO5/孔，共90 μ L。放置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)；加入不同濃度的組合物O.5 μ g/mL, O. 5 μ g/mL, 2. 5 μ g/mL, 10 μ g/mL, 20 μ g/mL, 40 μ g/mL, 80 μ g/mL 各 10 μ L ;在溶劑對(duì)照組中加入乙酸乙酯(分析純)10 μ L ;將96孔板放置于37°C培養(yǎng)箱孵育72小時(shí)；每孔加入10 μ L的CCK-8孵育2小時(shí)，測(cè)定450nm吸光度。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果用半抑制率IC5tl (即某種藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡50%的濃度)來(lái)表示， 表1.組合物對(duì)不同癌細(xì)胞的半抑制
權(quán)利要求
1. 一種靈芝孢子油中抗腫瘤組合物及其制備方法，其特征在于它包括以下步驟1.1.將V升的靈芝孢子油加入容積大于5V升的分液容器內(nèi)，再依次加入O. 1-1. OV升的石油醚或乙酸乙酯、O. 1-1. OV升的無(wú)水乙醇或甲醇和O. 5-1. OV升純凈水；1.2.將分液容器固定在全自動(dòng)液液萃取器內(nèi)，進(jìn)行提取O. 5小時(shí)；靜置O. 5小時(shí)后分層，分離下層溶液；1.4.將下層溶液進(jìn)行旋蒸濃縮，用甲醇定容至O.OlV升；1.5 將上述這O. OlV升濃縮液用O. 02-0. 025V升大孔樹脂攪拌，揮干甲醇，再裝入 O. 25-0. 6V升的大孔樹脂柱進(jìn)行分離；1.6用體積為大孔樹脂柱2-3倍的純凈水、50%乙醇及濃度大等于75%乙醇進(jìn)行梯度洗脫；1.7收集濃度大等于75%乙醇的洗脫液；1.8 將洗脫液經(jīng)冷凍干燥，真空度為20Pa，凍結(jié)溫度為-20°C，捕水器溫度為_50°C， 得到抗腫瘤組合物。
2.一種靈芝孢子油中抗腫瘤組合物及其制備方法，其特征在于它包括以下步驟2.1.將V升的靈芝孢子油加入容積大于5V升的分液容器內(nèi)，再依次加入O. 1-1. OV升的石油醚或乙酸乙酯、O. 1-1. OV升的無(wú)水乙醇或甲醇和O. 5-1. OV升純凈水；2.2.將分液容器固定在全自動(dòng)液液萃取器內(nèi)，進(jìn)行提取O. 5小時(shí)；靜置O. 5小時(shí)后分層，分離下層溶液；2.4.將下層溶液進(jìn)行旋蒸濃縮，用甲醇定容至O.OlV升；2.5將上述這O. 01 V升濃縮液用O. 02-0. 025 V升聚酰胺樹脂攪拌，揮干甲醇，再裝入O. 25-0. 6 V升的聚酰胺樹脂柱進(jìn)行分離；2.6用體積為聚酰胺樹脂柱2-3倍的純凈水、50%乙醇及濃度大等于85%乙醇進(jìn)行梯度洗脫；2.7收集濃度大等于85%乙醇的洗脫液；2.8 將洗脫液經(jīng)冷凍干燥，真空度為20Pa，凍結(jié)溫度為_20°C，捕水器溫度為_50°C， 得到抗腫瘤組合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的靈芝孢子油中抗腫瘤組合物及其制備方法，其特征在于， 所述純凈水的電阻率大等于18ΜΩ. cm。
全文摘要
本發(fā)明公開一種靈芝孢子油中抗腫瘤組合物及其制備方法，該方法是將破壁靈芝孢子粉提取得到靈芝孢子油，在加入石油醚，乙醇等有機(jī)溶劑和純凈水進(jìn)行提取，提取得到的下層溶液進(jìn)行濃縮，濃縮液使用大孔樹脂柱等進(jìn)行柱分離，用純凈水、50%乙醇及濃度大等于75%乙醇進(jìn)行梯度洗脫；收集最后一次洗脫液經(jīng)冷凍干燥后得到抗腫瘤組合物。通過(guò)本發(fā)明得到的組合物能抑制體外及體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，抑瘤率達(dá)到56.3%以上。
文檔編號(hào)A61K36/074GK103054910SQ201310043010
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2013年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月4日
發(fā)明者李曄, 姚渭溪, 周巖飛, 朱忠敏, 李衛(wèi)東 申請(qǐng)人:福建仙芝樓生物科技有限公司