專利名稱：一種維甲酸誘導(dǎo)蛋白16n端多肽及其抗體的制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種一種維甲酸誘導(dǎo)蛋白16N端多肽及其抗體的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
維甲酸誘導(dǎo)蛋白16 (Retinoic acid induced proteinl6, RAI16)的 NCBI 登錄號為 ΝΡ_073586.5，Swissprot 登錄號為 Q86V87，IPI 號為 ΙΡΙ00654780.2。RAI16 是維甲酸誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白分子，其結(jié)構(gòu)與功能目前尚未清楚。RAI16最初是在維甲酸誘導(dǎo)細(xì)胞分化時分離出來的，而維甲酸具有抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡和促進(jìn)細(xì)胞分化的作用，已被應(yīng)用于急性淋巴細(xì)胞白血病、肺癌及肝癌等多種癌癥的治療(Okuno Μ, KojimaS，Matsushima—Nishiwaki R，Tsurumi H，MutoY，F(xiàn)riedman SLj Moriwaki H.Retinoids incancer chemoprevention.Curr Cancer Drug Targets.2004;4:285-98)。因此，維甲酸誘導(dǎo)蛋白RAI16很可能也參與一系列生理過程，在細(xì)胞增殖、分化、以及細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)有研究表明RAI16 在肝細(xì)胞再生(Wang G, Deng J, Yang J, Zheng JJ, WangHZj Hu Qj Zhang ZMj Chen Cj Wang Dj Li ZP.Analysis on the protein structure andfunction of retinoic acid inducedl6.World J Gastroenterol.2007;15:1342-1346)和促進(jìn)肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展(Wen Wang, Lan-Juan Zhao, Yuan Yang, Ruo-Yu Wang, HaoRen，Ping Zhao，Wei—Ping Zhou, Zhong-Tian Q1.Retinoic acid induced16enhancestumorigenesis and serves as novel tumor marker in hepatocellular carcinoma.Carcinogenesis.20120ct7.[Epub ahead of print])中發(fā)揮重要作用
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種維甲酸誘導(dǎo)蛋白16 (RAI16)N端多肽、相應(yīng)抗體及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的主要技術(shù)方案是，通過免疫實驗特異性檢測RAI16的表達(dá)和天然存在，并建立相應(yīng)體外免疫分析所需基本生物制品的問題，繼而提供的一種特異性針對RAI16N端的合成多肽、相應(yīng)抗體及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明還解決了目前使用的RAI16價格昂貴，制備的抗體成本過高，而且抗體不能同時滿足用于免疫印跡、免疫組織化學(xué)實驗和免疫熒光實驗的問題。本發(fā)明的第一方面，是提供一種維甲酸誘導(dǎo)蛋白16 (RAI16)N端多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示:Cys-Thr-Asp-Glu-Ser-Thr-Pro-Ala-Lys-Lys-Thr-Asp-1le-Pro-Trp-Arg本發(fā)明利用DNAStar軟件分析RAI16N端抗原表位:確定RAI16蛋白N端的40-55位16個氨基酸抗原活性較好。
本發(fā)明的第二方面，是提供一種維甲酸誘導(dǎo)蛋白16 (RAIie)N端多肽的抗體，是將如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列免疫新西蘭大白兔，獲得抗維甲酸誘導(dǎo)蛋白16N端多肽的抗體。本發(fā)明的第三方面，是提供一種維甲酸誘導(dǎo)蛋白16 (RAIie)N端多肽的抗體的制備方法，包括以下步驟:(A)RAI16多肽的合成:多肽自動合成儀合成并純化如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；⑶RAI16多肽與載體蛋白交聯(lián):RAI16多肽與載體蛋白一鑰孔血藍(lán)蛋白(keyholelimpet hemocyanin, KLH)采用戍二醒連接法,然后用pH值為8.5的硼酸緩沖液透析8-12小時，交聯(lián)形成RAI16-KLH;(C)制備兔抗RAI16N端多肽抗體:將乳化后的RAI16-KLH在兔背部皮下注射，并反復(fù)加強免疫，直至抗體效價等于或高于1:64000 ；(D)收集、分離得到含有兔抗RAI16多肽抗體的血清，采用辛酸-硫酸銨法純化RAI16多肽抗體，即得到抗RAI16N端多肽抗體。所述的步驟(B)中，RAI16多肽與鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)采用戊二醛連接法具體為:按重量份數(shù)比將4-6份經(jīng)過純化的RAI16多肽加入到6-8份載體蛋白KLH中，然后均勻、緩慢地加入0.5-1.5份濃度為3g/L的戊二醛溶液，室溫環(huán)境下作用2小時。所述的步驟(C)中，取RAI16-KLH與等體積的完全福氏佐劑充分乳化后在兔背部皮下注射，首次免疫注射后第2周進(jìn)行第一次加強免疫注射，以后每隔兩周加強免疫注射一次，首次免疫注射劑量為1.2mg,每次加強免疫注射劑量為0.6mg ;加強免疫注射RAI16-KLH用不完全福氏佐劑乳化。

所述的步驟⑶中，采用辛酸-硫酸銨法純化RAI16多肽抗體具體為:(a)將含有兔抗RAI16多肽抗體的血清用濃度為60mmol/L、pH值為4.0的醋酸鈉緩沖液稀釋3_4倍，再用濃度為0.lmol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至4.5 ; (b)向步驟(a)的混合液中緩慢加入含量為98.5%的辛酸至混合液中辛酸濃度為25mol/L ； (c)室溫條件下攪拌混合液30min，在4°C、IOOOOg的條件下離心30min，再用濾孔直徑為0.22um的濾膜過濾上清液；(d)向濾液中加入濾液1/10體積的10XPBS，并用濃度為0.lmol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.4，然后緩慢加入預(yù)冷的飽和硫酸銨至濾液中硫酸銨飽和度為45% ； (e)加入硫酸銨的濾液在4°C環(huán)境下靜置8-12h，然后在4°C、3000g的條件下離心30min，棄去上清夜；沉淀用濃度0.0lmol/L、pH值為7.4的PBS緩沖液重懸，透析8-12h。本發(fā)明的第四方面，是提供一種維甲酸誘導(dǎo)蛋白16 (RAI16)N端多肽在制備免疫原中的應(yīng)用。進(jìn)一步地，提供一種維甲酸誘導(dǎo)蛋白16 (RAI16)N端多肽及其抗體在制備預(yù)防和治療性急性淋巴細(xì)胞白血病、肺癌、肝癌等疫苗或診斷試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明中的RAI16N端多肽具有優(yōu)異的親水性結(jié)構(gòu)、柔性區(qū)、抗原指數(shù)及表面概率結(jié)構(gòu)。本發(fā)明制備的抗RAI16N端多肽抗體效價高，特異性好，可與天然人RAI16分子發(fā)生特異結(jié)合反應(yīng)；本發(fā)明抗體制備成本低，而且能夠滿足免疫印跡、免疫組織化學(xué)實驗和免疫熒光實驗的要求，可用于建立體外免疫分析。本發(fā)明制備的抗RAI16N端多肽抗體，為RAI16分子的研究及相關(guān)疾病的研究(如診斷策略的制定、與疾病相關(guān)性分析、流行病學(xué)調(diào)查、預(yù)防和控制)提供一個有力工具，以及在生物醫(yī)學(xué)研究中對靶蛋白的特性、含量的測定、分布情況的分析和蛋白的確證等方面都具有重要意義和價值。


圖1是RAI16蛋白N端氨基酸序列采用DNAstar軟件分析的結(jié)果。圖2是合成的RAI16多肽通過HPLC純化的結(jié)果。圖3是抗RAI16抗體效價測定結(jié)果。圖4是抗RAI16抗體與人肝癌細(xì)胞系H印G2、肝細(xì)胞肝癌組織中RAI16表達(dá)的免疫印記結(jié)果。圖5是抗RAI16抗體用于檢測人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞中RAI16表達(dá)的免疫熒光結(jié)果。圖6是抗RAI16抗體用于檢測正常人多器官組織中RAI16表達(dá)和分布情況的免疫組織化學(xué)結(jié)果其中A為睪丸；B為肺；C為前列腺；D為腎。
具體實施例方式現(xiàn)結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的實施并不僅限于此。實施例1:抗RAI16N端多肽抗體的制備

抗RAI16N端多肽抗體按以下步驟制備:RAI16N端抗原表位的分析:利用DNAStar軟件分析RAI16蛋白N端的氨基酸序列，分析結(jié)果如圖1所示，RAI16蛋白N端的40-55位氨基酸(多肽)具有優(yōu)異的親水性結(jié)構(gòu)、柔性區(qū)、抗原指數(shù)及表面概率結(jié)構(gòu)。確定RAI16蛋白40-55位16個氨基酸作為合成多肽氮基酸序列:Cys-Thr-Asp-Glu-Ser-Thr-Pro-Ala-Lys-Lys-Thr-Asp-1le-Pro-Trp-ArgRAI16多肽的合成:多肽自動合成儀合成，采用常規(guī)C18的RP-HPLC柱進(jìn)行純化，純化后純度為95%，可作為抗原免疫動物，多肽合成及純化質(zhì)譜結(jié)果如圖2所示。RAI16多肽與載體蛋白交聯(lián):RAI16多肽與載體蛋白KLH采用戊二醛連接法，按重量份數(shù)比將4-6份經(jīng)過純化的CW1A2多肽加入到6-8份載體蛋白KLH中，然后均勻、緩慢地加入0.5-1.5份濃度為3g/L的戊二醛溶液,室溫環(huán)境下作用2h，然后用pH值為8.5的硼酸緩沖液透析8-12h，交聯(lián)形成RAI16-KLH ；免疫動物:取RAI16-KLH與等體積的完全福氏佐劑充分乳化后在兔背部皮下注射，注射點為5點，每點注射lOOpg，首次免疫注射后第2周進(jìn)行第一次加強免疫注射，以后每隔兩周加強免疫注射一次，每次加強免疫注射劑量與首次免疫注射劑量相同:加強免疫注射RAI16-KLH用不完全福氏佐劑乳化。反復(fù)加強免疫，直至抗體效價等于、高于1:64000 ；抗體純化:采用頸動脈取血收集含有兔抗RAI16多肽抗體的兔血，得到含有兔抗RAI16多肽抗體的血清，采用辛酸-硫酸銨法純化RAI16多肽抗體:(I)將含有兔抗RAI16多肽抗體的血清用濃度為60mmol/L、pH值為4.0的醋酸鈉緩沖液稀釋3-4倍，再用濃度為0.lmol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至4.5 ;(2)向步驟(I)的混合液中緩慢加入含量為98.5%的辛酸至混合液中辛酸濃度為25mol/L ；(3)室溫條件下攪拌混合液30min，在4°C、IOOOOg的條件下離心30min，再用濾孔直徑為0.22um的濾膜過濾上清液；(4)向濾液中加入濾液1/10體積的10XPBS，并用濃度為0.lmol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.4，然后緩慢加入預(yù)冷的飽和硫酸銨至濾液中硫酸銨飽和度為45% ；(5)加入硫酸銨的濾液在4°C靜置8_12h，然后在4°C、3000g條件了離心30min，棄去上清液，沉淀用濃度0.01mol/L、pH值為7.4的PBS緩沖濃重懸，透析8_12h，即得到抗RAI16多肽抗體。實施例2 -M RAI16N端多肽抗體效價的確定本實施方式采用ELISA檢測抗RAI16N端多肽抗體的效價=ELISA檢測板用濃度為lmg/L的RAI16-BSA包被，每孔lOOul，在4°C條件下孵育8_12h，然后每孔加入200ul濃度為IOOul的牛血清，在37°C的條件下封閉2h，洗滌后加入倍比稀釋的抗RAI16多肽抗體(對照組加入正常兔血清)，37°C條件下孵育60min，3次洗滌后每孔加入1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG100ul，37°C條件下孵育30min，洗滌3次后進(jìn)行TMB顯色，用酶標(biāo)儀測定樣品在A450的吸光值，計算抗體效價，本實施方式抗體效價為1:64000 (如圖3所示)。實施例3 -M RAI16N端多肽抗體用于RAI16蛋白表達(dá)的檢測1、免疫印記法(Western blotting)檢測人肝癌細(xì)胞系H印G2細(xì)胞和肝細(xì)胞癌組織樣本中RAI16的表達(dá)

HepG2細(xì)胞和肝細(xì)胞癌組織蛋白樣本制備:lX107!fepG2細(xì)胞或IOOmg肝細(xì)胞癌組織(HCC，勻漿后)，加入裂解液(50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.5mM EDTA，蛋白酶抑制劑cocktail)在4°C裂解30min,4°C、IOOOOg的條件下離心20min,取上清液蛋白定量、分裝后置于_80°C保存。本實施方式進(jìn)行抗體的免疫印跡分析，采用合成多肽競爭法鑒定抗體的特異性。用5xSDS上樣緩沖液懸浮制備的人IfepG2細(xì)胞或肝細(xì)胞癌組織，95°C加熱lOmin，置于冰上冷卻IOmin后上樣；經(jīng)SDS-PAGE膠分離后，以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)至PVDF膜上；經(jīng)脫脂奶粉封閉(室溫2h)后加入1:1000稀釋的純化后RAI16抗體和1:1000稀釋純化后抗體加等量合成多肽4°C過夜；PBST洗膜3次，然后加入1:2000HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG室溫孵育lh，PBST洗膜3次，之后用化學(xué)發(fā)光劑試劑盒(ECL Plus)處理5min后，于暗室曝光到X光膠片上，顯影、定影。本實施方式抗體免疫印跡結(jié)果如圖4所示，HepG2細(xì)胞和HCC樣本都檢測到明顯條帶，而加入了 RAI16合成多肽的H印G2細(xì)胞樣本未檢測到任何條帶，說明所制備的抗體可特異性的識別人HepG2細(xì)胞以及HCC樣本中的RAI16蛋白。2、免疫熒光法(Immunostaining)檢測人肝癌細(xì)胞系IfepG2細(xì)胞中RAI16的表達(dá)本實施方式進(jìn)行抗體的免疫熒光染色，lX105!fepG2細(xì)胞用20%甲醇_20°C固定20min，PBS洗滌3次，用含有5%BSA的PBST室溫封閉Ih,加入1:1000稀釋的純化后RAI16抗體，室溫孵育lh，以含0.05% Tween-20的PBS洗滌3次，然后加入1:2000FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG室溫孵育lh，PBST洗滌3次，使用細(xì)胞核染料DAPI染色I(xiàn)Omin后置于熒光顯微鏡下觀察。本實施方式抗體免疫印跡結(jié)果如圖5所示，HepG2細(xì)胞胞漿中有綠色熒光信號，說明所制備的抗體可特異性的識別人H印G2細(xì)胞RAI16蛋白，RAI16蛋白主要存在于細(xì)胞胞漿中。3、免疫組織化學(xué)法(Immunohistochemistry)檢測人正常多器官組織樣本中RAI16的表達(dá)本實施方式進(jìn)行抗體的免疫組織化學(xué)染色，取出用丙酮固定的冰凍人正常多器官組織切片，滴加5% BSA，室溫下5% BSA封閉20min，加入1:500稀釋兔抗RAI16多肽抗體，4°C孵育過夜，再用PBS洗片后加入羊抗兔IgG，37°C孵育20min，PBS洗片后進(jìn)行DAB顯色，蘇木素復(fù)染，返藍(lán)后，脫水、透明、封片，鏡檢，放大100倍和400倍拍照記錄結(jié)果。本實施方式抗體免疫組化染色實驗結(jié)果如圖6所示，免疫組化實驗表明，RAI16多肽抗體可與正常人多個器官組織細(xì)胞胞漿中的RAI16蛋白結(jié)合(棕色染色)。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理， 在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。
權(quán)利要求
1.一種維甲酸誘導(dǎo)蛋白16N端多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.—種維甲酸誘導(dǎo)蛋白16N端多肽的抗體，其特征在于，是將如SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列免疫新西蘭大白兔，獲得抗維甲酸誘導(dǎo)蛋白16N端多肽的抗體。
3.—種如權(quán)利要求2所述的維甲酸誘導(dǎo)蛋白16N端多肽的抗體的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: (A)RAI16多肽的合成:多肽自動合成儀合成并純化如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列； ⑶RAI16多肽與載體蛋白交聯(lián):RAI16多肽與載體蛋白一鑰孔血藍(lán)蛋白采用戊二醛連接法，然后用PH值為8.5的硼酸緩沖液透析8-12小時，交聯(lián)形成RAI16-KLH ； (C)制備兔抗RAI16N端多肽抗體:將乳化后的RAI16-KLH在兔背部皮下注射，并反復(fù)加強免疫，直至抗體效價等于或高于1:64000 ； (D)收集、分離得到含有兔抗RAI16多肽抗體的血清，采用辛酸-硫酸銨法純化RAI16多肽抗體，即得到抗RAI16N端多肽抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的維甲酸誘導(dǎo)蛋白16N端多肽的抗體的制備方法，其特征在于，所述的步驟(B)中，RAI16多肽與鑰孔血藍(lán)蛋白采用戊二醛連接法具體為:按重量份數(shù)比將4-6份經(jīng)過純化的RAI16多肽加入到6-8份載體蛋白KLH中，然后均勻、緩慢地加入0.5-1.5份濃度為3g/L的戊二醛溶液，室溫環(huán)境下作用2小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的維甲酸誘導(dǎo)蛋白16N端多肽的抗體的制備方法，其特征在于，所述的步驟(C)中，取RAI16-KLH與等體積的完全福氏佐劑充分乳化后在兔背部皮下注射，首次免疫注射后 第2周進(jìn)行第一次加強免疫注射，以后每隔兩周加強免疫注射一次，首次免疫注射劑量為1.2mg，每次加強免疫注射劑量為0.6mg ;加強免疫注射RAI16-KLH用不完全福氏佐劑乳化。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的維甲酸誘導(dǎo)蛋白16N端多肽的抗體的制備方法，其特征在于，所述的步驟(D)中，采用辛酸-硫酸銨法純化RAI16多肽抗體具體為:(a)將含有兔抗RAI16多肽抗體的血清用濃度為60mmol/L、pH值為4.0的醋酸鈉緩沖液稀釋3_4倍，再用濃度為0.lmol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至4.5 ; (b)向步驟(a)的混合液中緩慢加入含量為98.5%的辛酸至混合液中辛酸濃度為25mol/L ； (c)室溫條件下攪拌混合液30min，在4°C、IOOOOg的條件下離心30min，再用濾孔直徑為0.22um的濾膜過濾上清液；(d)向濾液中加入濾液1/10體積的10XPBS，并用濃度為0.lmol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.4，然后緩慢加入預(yù)冷的飽和硫酸銨至濾液中硫酸銨飽和度為45% ； (e)加入硫酸銨的濾液在4°C環(huán)境下靜置8-12h，然后在4°C、3000g的條件下離心30min，棄去上清夜；沉淀用濃度0.0lmol/L、pH值為7.4的PBS緩沖液重懸，透析8-12h。
7.—種如權(quán)利要求1所述的維甲酸誘導(dǎo)蛋白16N端多肽在制備免疫原中的應(yīng)用。
8.—種如權(quán)利要求1所述的維甲酸誘導(dǎo)蛋白16N端多肽在制備預(yù)防和治療性急性淋巴細(xì)胞白血病、肺癌、肝癌的疫苗或診斷試劑盒中的應(yīng)用。
9.一種如權(quán)利要求2所述的維甲酸誘導(dǎo)蛋白16N端多肽的抗體在制備預(yù)防和治療性急性淋巴細(xì)胞白血病、肺癌、肝癌的疫苗或診斷試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明提供了一種維甲酸誘導(dǎo)蛋白16(RAI16)N端多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，該多肽具有優(yōu)異的親水性結(jié)構(gòu)、柔性區(qū)、抗原指數(shù)及表面概率結(jié)構(gòu)。本發(fā)明還提供了RAI16N端多肽的抗體，及抗體的制備方法，本發(fā)明制備的抗RAI16N端多肽抗體效價高，特異性好，可與天然人RAI16分子發(fā)生特異結(jié)合反應(yīng)。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了RAI16N端多肽及其抗體在制備預(yù)防和治療性急性淋巴細(xì)胞白血病、肺癌、肝癌等疫苗或診斷試劑盒中的應(yīng)用。
文檔編號A61P35/02GK103102392SQ20131003064
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月28日
發(fā)明者王文, 任浩, 許剛, 戚中田 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)