專利名稱:魚皮膠原基復(fù)合海綿及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種魚皮膠原基復(fù)合海綿及其制備方法。
背景技術(shù):
膠原蛋白是動物體內(nèi)含量最豐富、分布最廣泛的蛋白質(zhì)。膠原蛋白具有獨特的三螺旋結(jié)構(gòu)、低抗原性、無毒性、良好的生物相容性和生物可降解性等特點,已被廣泛應(yīng)用于組織工程支架材料、止血海綿、藥物控緩釋系統(tǒng)、基因傳遞載體、美容外科等生物醫(yī)用領(lǐng)域。目前,國內(nèi)使用的膠原蛋白主要來自豬和牛的皮膚和跟腱,但隨著瘋牛病和口蹄疫等疾病的發(fā)生,使人們對它們的安全性產(chǎn)生了質(zhì)疑;由于宗教和習(xí)俗等原因,豬來源的膠原蛋白在某些地區(qū)的應(yīng)用受到了限制。因此,迫切需要尋求質(zhì)量和安全性更好的膠原蛋白來源。
我國每年魚鱗魚皮等水產(chǎn)品廢棄物約有40多萬噸,這些水產(chǎn)品廢棄物均含有豐富的膠原蛋白(如皮、骨、鱗等),其氨基酸組成與陸生哺乳動物膠原無明顯差異,且其不存在人畜共患的傳染性疾病,具有極大的開發(fā)和利用價值,但這些廢棄物除小部分被用于生產(chǎn)飼料外,大部分卻被丟棄(Trends in Food Science & Technology, 2008, 19:644-656)。因此,開發(fā)魚皮等水產(chǎn)品廢棄物的利用新途徑,不僅可提高水產(chǎn)品加工的附加值,而且能減少環(huán)境污染,具有良好的經(jīng)濟和社會效益。然而,作為生物醫(yī)用材料,水產(chǎn)膠原與陸生哺乳動物膠原存在共同的缺點,如體內(nèi)降解快,柔韌性差等,限制了其應(yīng)用。殼聚糖是天然多糖中唯一的堿性多糖,具有良好的生物相容性、生物可降解性、抗菌性、無毒性、低免疫原性、吸濕性、柔軟性、促凝血、防粘連等特點,在一定程度上彌補了膠原蛋白的不足之處(Curr. Pharm. Biotechnol. , 2003, 4:303)。此外,價格因素也是制約膠原蛋白類產(chǎn)品規(guī)模進入市場的條件之一。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種魚皮膠原基復(fù)合海綿及其制備方法。由本發(fā)明制備的復(fù)合海綿,可改善膠原海綿易降解等缺點,且其制備過程簡單、價廉易得,克服了現(xiàn)有膠原海綿的一些不足。為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
本發(fā)明提供的一種魚皮膠原基復(fù)合海綿的制備方法,包括以下步驟將魚皮膠原蛋白與殼聚糖溶于體積分數(shù)為2%的乙酸溶液中,攪拌均勻,然后倒入透析袋,用體積分數(shù)為2%的乙酸溶液作為外液透析20-30h,冷凍干燥后添加交聯(lián)劑進行交聯(lián),交聯(lián)產(chǎn)物反復(fù)用蒸餾水沖洗至中性,二次冷凍干燥即得魚皮膠原基復(fù)合海綿。所述魚皮膠原蛋白的制備方法如下
1)魚皮去鱗,剪碎洗凈,于10-30倍原料重的含體積分數(shù)為0.1-1% H2O2的NaOH溶液中攪拌浸泡12-48 h,清水洗至中性;繼續(xù)在異丙醇溶液中攪拌浸泡4 h,清水洗至中性;再在NaCl溶液中攪拌浸泡10 h,離心,去除廢液,即得預(yù)處理的碎魚皮;
2)將預(yù)處理的碎魚皮與去離子水以料液比為1:5-1:10混合,勻漿,加入胃蛋白酶,調(diào)pH至2. 0-4. 0,酶解10-30 h,過濾、濾液低溫離心,取上清液加入體積分數(shù)為2%乙酸溶液,過濾,濾液裝入透析袋,用體積分數(shù)為2%的乙酸溶液作為外液透析24 h,冷凍干燥即得魚皮膠原蛋白。步驟I)所述魚皮為包括鰱魚、草魚、青魚、鳙魚、鯊魚在內(nèi)的加工魚皮副產(chǎn)物。步驟I)所述NaOH溶液的濃度為0. 01-0.1 mol/L,所述異丙醇溶液的體積分數(shù)為5-20%, NaCl溶液的質(zhì)量分數(shù)為1_5%,攪拌浸泡的溫度為0_20°C。步驟2)所述胃蛋白酶占魚皮的質(zhì)量百分數(shù)為2-3%,酶解溫度為4-10°C。所述魚皮膠原蛋白與殼聚糖的質(zhì)量比為90-70:30-10,殼聚糖的脫乙酰度為70-90%o
所述交聯(lián)劑為體積分數(shù)為0. 2-0. 3%的戊二醛或濃度為40-60mM的EDC,交聯(lián)時間為 12-24 ho本發(fā)明還提供了由所述的制備方法制得的魚皮膠原基復(fù)合海綿。以上所采用的透析袋的截留分子量為8000 14000 Da。所述交聯(lián)劑還可以采用甲醛、戊二醛、EDC等。本發(fā)明制備的魚皮膠原基復(fù)合海綿具有I型膠原蛋白特有的三螺旋結(jié)構(gòu),其微觀結(jié)構(gòu)為雙面多孔網(wǎng)狀片層,具有良好的吸濕性(膨脹率為2153%),并顯著改善了膠原海綿的降解性能。在為期7 d的降解時間內(nèi),魚皮膠原基復(fù)合海綿降解率由第I d的31. 43%變?yōu)榈?d的77. 15%。本材料制備過程簡單、價廉易得,是一種較好的生物醫(yī)用材料。
圖1是魚皮膠原蛋白的原子力顯微鏡圖。圖2是魚皮膠原基復(fù)合海綿的場發(fā)射掃描電鏡圖。
具體實施例方式實施例1 :魚皮膠原基復(fù)合海綿的制備
I)稱取50 g剪碎洗凈的鰱魚魚皮,置于1000 mL 0.01 mol/L NaOH溶液中(含I mLH2O2), 4°C攪拌浸泡48 h,清水洗至中性;將洗凈的魚皮置于300 mL蒸餾水和30 mL異丙醇中,4°C攪拌浸泡4 h,清水洗至中性;稱取25. 6 g NaCl溶于1000 mL水中,再將魚皮浸泡在NaCl溶液中10 h,離心,去除廢液,即得預(yù)處理的碎魚皮。2)將上述碎魚皮與500 mL去離子水混合,勻漿15 min,加入1. 5g胃蛋白酶,調(diào)pH至2. 0,10°C酶解10 h后過濾,濾液以8000 r/min低溫離心20 min,取上清液。3)在上清液中加入2%的乙酸溶液,過濾,用體積分數(shù)為2%的乙酸溶液作為外液透析24 h,冷凍干燥即得魚皮膠原蛋白。4)將0. 9g膠原和0.1 g殼聚糖溶于50 mL 2%的乙酸溶液,用體積分數(shù)為2%的乙酸溶液作為外液透析24 h,冷凍干燥;將一次凍干后膠原膜加入40mL 50 mM EDC溶液交聯(lián)24 h,反復(fù)用蒸餾水沖洗至中性,二次冷凍干燥,即得魚皮膠原基復(fù)合海綿。實施例2 :魚皮膠原基復(fù)合海綿的制備
I)稱取50 g剪碎洗凈的鰱魚魚皮,置于1000 mL 0. 01 mol/L NaOH溶液中(含5 mLH2O2), 4°C攪拌浸泡24 h,清水洗至中性;將洗凈的魚皮置于300 mL蒸餾水和30 mL異丙醇中,4°C攪拌浸泡4 h,清水洗至中性;稱取25. 6 g NaCl溶于1000 mL水中,再將魚皮浸泡在NaCl溶液中10 h,離心,去除廢液,即得預(yù)處理的碎魚皮。2)將上述碎魚皮與500 mL去離子水混合,勻漿15 min,加入1. 3 g胃蛋白酶,調(diào)pH至3. 0,6°C酶解20 h后過濾,濾液以8000 r/min低溫離心20 min,取上清液。3)在上清液中加入2%的乙酸溶液,過濾,用體積分數(shù)為2%的乙酸溶液作為外液透析24 h,冷凍干燥即得魚皮膠原蛋白。4)將0. 8 g膠原和0. 2 g殼聚糖溶于50 mL 2%的乙酸溶液,用體積分數(shù)為2%的乙酸溶液作為外液透析24 h,冷凍干燥;將一次凍干后膠原膜加入50 mL 50 mM EDC溶液交聯(lián)18 h,反復(fù)用蒸餾水沖洗至中性,二次冷凍干燥,即得魚皮膠原基復(fù)合海綿。實施例3 :魚皮膠原基復(fù)合海綿的制備 I)稱取50 g剪碎洗凈的鰱魚魚皮,置于1000 mL 0. 01 mol/L NaOH溶液中(含10 mLH202),4°C攪拌浸泡12 h,清水洗至中性;將洗凈的魚皮置于300 mL蒸餾水和30 mL異丙醇中,4°C攪拌浸泡4 h,清水洗至中性;稱取25. 6 g NaCl溶于1000 mL水中,再將魚皮浸泡在NaCl溶液中10 h,離心,去除廢液,即得預(yù)處理的碎魚皮。2)將上述碎魚皮與500 mL去離子水混合,勻漿15 min,加入1. 0 g胃蛋白酶,調(diào)pH至4.0,4°C酶解30 h后過濾,濾液以8000 r/min低溫離心20 min,取上清液。3)在上清液中加入2%的乙酸溶液,過濾,用體積分數(shù)為2%的乙酸溶液作為外液透析24 h,冷凍干燥即得魚皮膠原蛋白。4)將0. 7 g膠原和0. 3 g殼聚糖溶于50 mL 2%的乙酸溶液,用體積分數(shù)為2%的乙酸溶液作為外液透析24 h,冷凍干燥;將一次凍干后膠原膜加入60 mL 50 mM EDC溶液交聯(lián)12 h,反復(fù)用蒸餾水沖洗至中性,二次冷凍干燥,即得魚皮膠原基復(fù)合海綿。實施例4 :魚皮膠原基復(fù)合海綿的吸濕性和降解性實驗
I)吸濕性實驗分別稱取一定量的膠原和膠原-殼聚糖復(fù)合膜(為W1),放于培養(yǎng)皿中加入一定量的水,于37°C下放置24h,分別稱其重量(為W2),膨脹率(%)=(W2 - W1VW1X 100,每個實驗平行做3次,取其平均值,結(jié)果如下
I材料I膠原膠原- 糖復(fù)合膜
j_I_I
IWlD.01;90.014;
III
IWlI1.41770.3267I
I膨脹率(W)丨25272153
從上表可知,膠原和膠原-殼聚糖復(fù)合膜的膨脹率差不多,而膠原的吸水性比較好,所以魚皮膠原基復(fù)合海綿具有良好的吸濕性。2)降解率實驗分別稱取5mg膠原和膠原-殼聚糖復(fù)合膜于5ml離心管中,加入ImlO.1M PBS (pH=7.4)浸泡 lh,在 37°C下加入 0. 05MCaCl2 和 200U 膠原酶,分別放置 IcU3d、5d、7d,然后把離心管放入冰浴中加入0. 2ml0. 25M EDTA使反應(yīng)停止,在4°C、5000r/min下離心15min,取上清液加入3ml 6M HCl于室溫下水解24h,用紫外分光光度計在561nm處測其吸光度,根據(jù)羥脯氨酸標準回歸曲線求出其上清液中羥脯氨酸的濃度,用下面的公式求其降解率
降解率(%) =Mq/MTX 100%Mq:上層液中羥脯氨酸的含量;mg/L
Mt:材料中膠原的質(zhì)量mg
每個實驗平行做3次,取其平均值,結(jié)果如下
權(quán)利要求
1.一種魚皮膠原基復(fù)合海綿的制備方法,其特征在于將魚皮膠原蛋白與殼聚糖溶于體積分數(shù)為2%的乙酸溶液中,攪拌均勻,然后倒入透析袋,用體積分數(shù)為2%的乙酸溶液作為外液透析20-30h,冷凍干燥后添加交聯(lián)劑進行交聯(lián),交聯(lián)產(chǎn)物反復(fù)用蒸餾水沖洗至中性, 二次冷凍干燥即得魚皮膠原基復(fù)合海綿。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚皮膠原基復(fù)合海綿的制備方法,其特征在于所述魚皮膠原蛋白的制備方法如下1)魚皮去鱗,剪碎洗凈,于10-30倍原料重的含體積分數(shù)為O.1-1% H2O2的NaOH溶液中攪拌浸泡12-48 h,清水洗至中性;繼續(xù)在異丙醇溶液中攪拌浸泡4 h,清水洗至中性;再在NaCl溶液中攪拌浸泡10 h,離心,去除廢液,即得預(yù)處理的碎魚皮;2)將預(yù)處理的碎魚皮與去離子水以料液比為1:5-1:10混合,勻漿,加入胃蛋白酶,調(diào) pH至2. 0-4. O,酶解10-30 h,過濾、濾液低溫離心,取上清液加入體積分數(shù)為2%乙酸溶液, 過濾,濾液裝入透析袋,用體積分數(shù)為2%的乙酸溶液作為外液透析24 h,冷凍干燥即得魚皮膠原蛋白。
3.根照權(quán)利要求2所述的魚皮膠原基復(fù)合海綿的制備方法,其特征在于步驟I)所述魚皮為包括鰱魚、草魚、青魚、鳙魚、鯊魚在內(nèi)的加工魚皮副產(chǎn)物。
4.根照權(quán)利要求2所述的魚皮膠原基復(fù)合海綿的制備方法,其特征在于步驟I)所述 NaOH溶液的濃度為O. 01-0.1 mol/L,所述異丙醇溶液的體積分數(shù)為5_20%,NaCl溶液的質(zhì)量分數(shù)為1_5%,攪拌浸泡的溫度為0-20°C。
5.根照權(quán)利要求2所述的魚皮膠原基復(fù)合海綿的制備方法,其特征在于步驟2)所述胃蛋白酶占魚皮的質(zhì)量百分數(shù)為2-3%,酶解溫度為4-10°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚皮膠原基復(fù)合海綿的制備方法,其特征在于所述魚皮膠原蛋白與殼聚糖的質(zhì)量比為90-70:30-10,殼聚糖的脫乙酰度為70-90%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚皮膠原基復(fù)合海綿的制備方法,其特征在于所述交聯(lián)劑為體積分數(shù)為O. 2-0. 3%的戊二醛或濃度為40-60mM的EDC,交聯(lián)時間為12-24 h。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的制備方法制得的魚皮膠原基復(fù)合海綿。
全文摘要
本發(fā)明提供一種魚皮膠原基復(fù)合海綿及其制備方法。它是以魚皮膠原與殼聚糖為原料,冷凍干燥后經(jīng)交聯(lián)再進行二次冷凍干燥制備。由本發(fā)明制備的復(fù)合海綿,可改善膠原海綿易降解等缺點,且其制備過程簡單、價廉易得,克服了現(xiàn)有膠原海綿的一些不足。本發(fā)明制備的魚皮膠原基復(fù)合海綿具有Ⅰ型膠原蛋白特有的三螺旋結(jié)構(gòu),其微觀結(jié)構(gòu)為雙面多孔網(wǎng)狀片層,具有良好的吸濕性,并改善了膠原海綿的降解性,且其制備過程簡單、價廉易得,是一種較好的生物醫(yī)用材料。
文檔編號A61L15/32GK103007336SQ201310012099
公開日2013年4月3日 申請日期2013年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月14日
發(fā)明者張其清, 陳名懋, 郭豪, 王建華, 伍久林 申請人:福建省博特生物科技有限公司