水母發(fā)光蛋白用于減少缺血導(dǎo)致的神經(jīng)損傷的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了基于水母發(fā)光蛋白的組合物和用于預(yù)處理對象的神經(jīng)元以減少腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷的方法。方法包括向?qū)ο蟮纳窠?jīng)元給予水母發(fā)光蛋白的步驟，其中相比未給予所述水母發(fā)光蛋白的神經(jīng)元，所述水母發(fā)光蛋白能夠引發(fā)細(xì)胞因子表達水平的改變，減少腦缺血所導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷。本文描述了多種制劑，包括可注射劑。
【專利說明】水母發(fā)光蛋白用于減少缺血導(dǎo)致的神經(jīng)損傷
[0001] 相關(guān)申請的交叉參考
[0002] 本申請要求2011年11月15日提交的美國專利號61/559,816,其通過引用全文納 入本文以用于所有目的。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明涉及用于減少缺血導(dǎo)致的神經(jīng)損傷的組合物和方法。具體而言，本發(fā)明涉 及水母發(fā)光蛋白及其在減少對象中腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)損傷過程中的用途。

【背景技術(shù)】
[0004] 根據(jù)美國心臟病協(xié)會，美國境內(nèi)每40秒就有一人罹患中風(fēng)。目前，食品與藥物管 理局僅批準(zhǔn)了一項針對中風(fēng)的治療藥物，重組組織纖溶酶原激活劑（rTPA)。雖然rTPA幫助 了許多人，但其仍存在有害的副作用，如出血。
[0005] 缺血期間，神經(jīng)元的細(xì)胞內(nèi)鈣離子過量。雖然細(xì)胞內(nèi)鈣離子對于正常神經(jīng)元功能 是必需的，但過多的鈣離子會引發(fā)一系列事件，包括最嚴(yán)重時可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。存在數(shù)種機 制，能夠使神經(jīng)元限制或控制胞質(zhì)鈣離子水平，其中包括鈣結(jié)合蛋白（CaBP)。有報道指出， 使用CaBP鈣結(jié)合素 D-28k進行治療能夠降低缺血的有害影響。不幸的是，目前缺乏避免缺 血導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡的替代療法，而且相應(yīng)地，仍需要可用于治療缺血對神經(jīng)元的有害影 響的全新療法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本文中，發(fā)明人證明水母發(fā)光蛋白在向神經(jīng)元提供缺血性保護中的用途。相應(yīng)地， 本發(fā)明在第一方面中包括一種預(yù)處理對象（優(yōu)選人類）中神經(jīng)元以減少腦缺血所導(dǎo)致的神 經(jīng)元損傷的方法。該方法包括向?qū)ο蟮纳窠?jīng)元給予水母發(fā)光蛋白的步驟，其中所述水母發(fā) 光蛋白能夠啟動神經(jīng)元中細(xì)胞因子表達水平的改變，減少腦缺血所導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷。
[0007] 優(yōu)選的給藥途徑是向?qū)ο笞⑸洌瑑?yōu)選海馬區(qū)內(nèi)注射。
[0008] 在某些實施方式中，所述神經(jīng)元損傷減少的效果從給予水母發(fā)光蛋白的時間點開 始持續(xù)至少24小時。在其他實施方式中，所述神經(jīng)元損傷減少的效果從給予水母發(fā)光蛋白 的時間點開始持續(xù)至少48小時。
[0009] 在其他方面，本發(fā)明涉及水母發(fā)光蛋白在制造藥物中的用途，該藥物用于預(yù)處理 對象的神經(jīng)元以減少腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷。
[0010] 本發(fā)明還包括用于預(yù)處理對象的神經(jīng)元以減少腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷的組合 物。此類組合物包括：（a)治療有效劑量的水母發(fā)光蛋白，用于預(yù)處理對象的神經(jīng)元以減少 腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷；以及（b)藥學(xué)上可接受的運載體。優(yōu)選的組合物配制為可注射 劑。
[0011] 在另一方面，本發(fā)明涉及一種用于預(yù)處理對象的神經(jīng)元以減少腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng) 元損傷的試劑盒。該試劑盒包括：(a)治療有效劑量的水母發(fā)光蛋白，用于預(yù)處理對象的神 經(jīng)元以減少腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷；以及（b)遞送裝置，設(shè)計用于向?qū)ο蠼o予特定含量 的水母發(fā)光蛋白。
[0012] 本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點將在閱讀說明、權(quán)利要求和附圖后顯而易見。
[0013] 附圖簡要說明
[0014] 圖1以相對載劑對照百分比的形式描述輸注水母發(fā)光蛋白后IL-IOmRNA水平（A) 的時間依賴性增加。未觀察到β-肌動蛋白mRNA(B)的變化。（水母發(fā)光蛋白縮寫為"AQ")。
[0015] 圖2顯示了（A)AQ對細(xì)胞拯救的劑量依賴作用；(B)缺血前2天給予4% AQ有神 經(jīng)保護作用（注意給予AQ后臺盼藍標(biāo)記的神經(jīng)元的減少）；(C)AQ所提供的神經(jīng)元保護窗； (D)注射入海馬區(qū)后AQ的可用性。
[0016] 圖3描述了給予AQ后（A) IL-IOmRNA的表達；(B) β -肌動蛋白mRNA的表達；以及 (C)顯示多種細(xì)胞因子和趨化因子變化的PCR陣列。
[0017] 圖4描述了 AQ注射后細(xì)胞因子如何發(fā)生顯著變化的示意圖。
[0018] 圖5描述了發(fā)明人檢測的免疫反應(yīng)基因的相互作用示意圖。
[0019] 圖6顯示了（A) AQ注射后急性炎癥反應(yīng)基因的變化；(B) AQ注射后T/B細(xì)胞激活因 子的變化；（C)AQ注射后血管生成/細(xì)胞增殖基因的變化；(D)AQ注射后巨噬細(xì)胞吸引基因 表達模式的變化；(E)AQ注射后鈣調(diào)節(jié)基因的變化；以及（F)AQ注射后基因（按功能分組） 的變化。

【具體實施方式】
[0020] I.概述
[0021] 描述本發(fā)明材料和方法之前，應(yīng)理解，本發(fā)明不限于所述具體方法、方案、材料和 試劑，這些可發(fā)生變化。還應(yīng)理解，本文所用術(shù)語的目的僅是描述【具體實施方式】，不應(yīng)用來 限制本發(fā)明的范圍，所述范圍僅受任何隨后提交的非臨時申請的限制。
[0022] 必須注意到，本文和所附權(quán)利要求書所用的單數(shù)形式"一個"、"一種"和"所述"包 括復(fù)數(shù)含義，除非文中另有明確說明。同樣，術(shù)語"一個"（或"一種一種或多種"和"至 少一種"在本文中可以互換使用。還應(yīng)當(dāng)注意，術(shù)語"包括"、"包含"、和"具有"可以互換使 用。
[0023] 除非另有說明，否則本文所用的所有科技術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通 常理解的含義相同。雖然與本文所述類似或等同的任何方法和材料也能用于實施或測試本 發(fā)明，但在此描述優(yōu)選的方法和材料。本文具體提及的所有出版物和專利都通過引用全文 納入本文用于所有目的，包括描述和公開可與本發(fā)明關(guān)聯(lián)使用的所述出版物報道的化學(xué)物 質(zhì)、設(shè)備、統(tǒng)計分析和方法。本說明書引用的所有參考文獻都應(yīng)看作對本領(lǐng)域技術(shù)水平的指 示。本文中所有內(nèi)容均不應(yīng)解釋為承認(rèn)本發(fā)明不能憑借在先發(fā)明而先于這些公開內(nèi)容。
[0024] II.本發(fā)明
[0025] 本文所用"對象"指的是哺乳動物和非哺乳動物。"哺乳動物"指的是任意的哺乳動 物綱成員，包括但不限于人類、非人靈長類，例如大猩猩和其他猿類和猴類；農(nóng)場動物，例如 牛、馬、綿羊、山羊和豬；家養(yǎng)動物，例如兔、狗和貓；實驗室動物，包含嚙齒動物，例如大鼠、 小鼠和豚鼠；等等。非哺乳動物的示例包括但不限于鳥類等。術(shù)語"對象"不表示特定年齡 或性別。
[0026] 本文所用"給予"或"給藥"包括任何用于將水母發(fā)光蛋白引入體內(nèi)的方法，優(yōu)選 引入對象腦部，更優(yōu)選引入對象的海馬區(qū)。給藥示例包括但不限于口服、經(jīng)鼻、經(jīng)耳、經(jīng)眼、 口頰、舌下、肺部、透皮、經(jīng)粘膜，以及皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、硬外膜外和肌肉內(nèi)注射。
[0027] "治療有效量"指給予對象用于治療紊亂、病征或疾病時，對所述紊亂、病征或疾病 的此類治療足以起效的水母發(fā)光蛋白的用量。"治療有效量"會根據(jù)接受治療的紊亂或病征 或疾病狀態(tài)，接受治療的紊亂或病征或疾病的嚴(yán)重程度，所述對象的年齡和相對健康狀態(tài)， 給藥路徑和方式，主治醫(yī)生或獸醫(yī)從業(yè)者的判斷，和其他因素而變化。
[0028] 就本發(fā)明目的而言，"治療"或"處理"描述了管理和護理患者以用于對抗疾病、病 癥、或紊亂的目的。該術(shù)語包括預(yù)防性治療（即預(yù)防）和緩解性治療。治療包括給予水母發(fā) 光蛋白以防止所述癥狀或并發(fā)癥的發(fā)作，緩解所述癥狀或并發(fā)癥，或消除所述疾病、病癥、 或紊亂。
[0029] 術(shù)語"水母發(fā)光蛋白"指鈣結(jié)合蛋白水母素的脫輔基蛋白部分。水母素由兩個不 同的單元組成，分別是脫輔基蛋白（水母發(fā)光蛋白，分子量約22kDa)和輔基腔腸素（一種 突光素）。水母素是一種從發(fā)光水母（例如多管水母屬，如維多利亞多管水母（Aequorea victoria))和多種其他海洋生物中分離得到的發(fā)光蛋白質(zhì)。其最初由下村修（Osamu Shimomura)從腔腸動物中分離得到。本發(fā)明中使用的水母發(fā)光蛋白可從其天然來源得到， 可通過先前已知的分離和純化方案，或者公知的采用表達系統(tǒng)的重組方法，表達系統(tǒng)利用 如用于水母發(fā)光蛋白異源表達的重組DNA構(gòu)建和遺傳修飾的宿主細(xì)胞。
[0030] 本文所用術(shù)語"細(xì)胞因子"表示由神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細(xì)胞和免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞分 泌的小細(xì)胞信號蛋白質(zhì)分子，屬于細(xì)胞間通信中廣泛使用的一類信號分子。細(xì)胞因子可分 為蛋白質(zhì)、肽段或糖蛋白；相應(yīng)地，術(shù)語"細(xì)胞因子"包括由多種胚胎來源細(xì)胞在全身各處生 成的、種類繁多且各異的調(diào)節(jié)因子。術(shù)語"細(xì)胞因子"包括免疫調(diào)節(jié)因子（如白介素和干擾 素）。
[0031] 本文所用術(shù)語"預(yù)調(diào)節(jié)"表示一種用于產(chǎn)生對供血不足的抵抗、并向體內(nèi)組織提供 氧氣的技術(shù)。在本發(fā)明中，預(yù)調(diào)節(jié)表示在神經(jīng)元中產(chǎn)生對供血不足的抵抗，其測量方法為例 如測定水母發(fā)光蛋白給藥后相比于對照組被拯救的細(xì)胞百分比或數(shù)量。
[0032] 發(fā)明人已經(jīng)顯示，直接注射入背側(cè)海馬區(qū)（dhpc)后，來源于腔腸動物維多利亞多 管水母（Aequoria victoria)的22kD CaBP水母發(fā)光蛋白（AQ)顯著減少了體外缺血型損 傷所導(dǎo)致的細(xì)胞死亡（Detert等，2009 ;2011)。這種細(xì)胞死亡的減少發(fā)生在AQ注射后24 和48小時，而非注射后1小時。有趣的是，AQ蛋白質(zhì)在注射后1小時時存在，在注射后24 小時時顯著減少，而在注射后48小時時幾乎不存在。AQ的作用和其存在之間的相反模式使 發(fā)明人產(chǎn)生疑問，即這一改變是否源于神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)。在更大的和全局性損傷發(fā)生前， 一些形式的缺血預(yù)處理（如小缺血損傷）能減少梗死（Ara等，2010 ;Jones和Bergeron, 2001)。缺血預(yù)處理的保護效果與免疫系統(tǒng)激活相關(guān)（Rehni和Singh，2012 ;Wei等，2012)。 雖然本發(fā)明中未采納任何一種作用機制，但如果AQ是激活細(xì)胞因子，則由某種缺血預(yù)處理 (其中水母發(fā)光蛋白注射引起神經(jīng)保護反應(yīng)）減少細(xì)胞死亡可能部分是源于神經(jīng)免疫調(diào)節(jié) 反應(yīng)。
[0033] 以治療有效量向患者給予水母發(fā)光蛋白?？蓡为毥o予水母發(fā)光蛋白，或者作為藥 學(xué)上可接受組合物的一部分給予。另外，水母發(fā)光蛋白或組合物能立即全部給藥（例如通 過推注），多次給藥（例如通過一系列片劑），或一段時間內(nèi)基本均勻遞送（例如使用透皮 遞送）。再者，活性藥物的劑量可隨著時間而改變?？墒褂盟籴屩苿?、控釋制劑或其組合給 予水母發(fā)光蛋白。術(shù)語"控釋"包含緩釋、延遲釋放和其組合。
[0034] 本發(fā)明的組合物的制備、包裝或出售可批量完成、或作為單個單位劑量、或作為多 種單個單位劑量。如本文所用，"單位劑量"是離散量的組合物，所述組合物包含預(yù)定量的活 性成分。活性成分的量通常等于將給予患者的活性成分的劑量，或者是該劑量的適當(dāng)?shù)囊?部分（例如該劑量的一半或三分之一）。
[0035] 本發(fā)明組合物中活性成分、藥學(xué)上可接受的運載體和任意其他成分的相對量會根 據(jù)所治療患者的本身、體型和病情而變化，并且也根據(jù)所述組合物的給藥途徑而變化。
[0036] 本發(fā)明另一方面涉及包含本發(fā)明組合物和說明材料的試劑盒。說明材料包含公開 文獻、記錄、圖表、或任何其他表達媒介，用于溝通本發(fā)明組合物為了本文所述目的之一用 于人的實用性。說明材料也能描述例如本發(fā)明藥物組合物的合適的劑量。例如，本發(fā)明試 劑盒的說明材料可貼在含有本發(fā)明藥物組合物的容器上，或可與含有所述藥物組合物的容 器一起運送?；蛘?，所述說明材料能與本發(fā)明的容器分開運送，從而所述說明材料和所述藥 物組合物能由接收者配合使用。
[0037] 本發(fā)明也包含含有本發(fā)明組合物的試劑盒和將所述組合物遞送給人的遞送裝 置。作為示例，所述遞送裝置可以是注射器、針頭或劑量測量容器。所述試劑盒還可以包 含本文所述的說明材料。所述試劑盒也包含容器用于分開的組合物，例如分裝瓶（divided bottle)或分裝箔片包裝。容器的其他示例包含注射器、盒、袋等。通常，試劑盒包含分開組 分的給藥的說明。當(dāng)分開的組分優(yōu)選以不同劑型（如口服和胃腸外）給藥、以不同的劑量間 隔給藥，或者當(dāng)處方醫(yī)生需要對組合的個體成分進行滴定時，所述試劑盒形式特別有優(yōu)勢。
[0038] 藥物組合物的胃腸道外給藥包括以對人組織進行物理切開并通過組織切口給予 藥物組合物為特征的任意給藥途徑。因此胃腸道外給藥包含下列方式給予藥物組合物：注 射所述組合物、通過外科切口應(yīng)用所述組合物、通過組織穿透性非手術(shù)傷口應(yīng)用所述組合 物等。具體而言，胃腸道外給藥包含皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、肌內(nèi)或胸骨內(nèi)注射，和靜 脈內(nèi)、動脈內(nèi)或腎臟透析輸注技術(shù)。例如，本發(fā)明組合物能通過腦（通過vPAG)注射、鞘內(nèi) 注射、腹膜內(nèi)注射或血液注射的方式向?qū)ο蠼o藥。
[0039] 適合胃腸道外注射的組合物包含活性成分聯(lián)同藥學(xué)上可接受的運載體（例如生 理學(xué)上可接受的水性或非水性無菌溶液劑、分散劑、懸浮液或乳液），或可以包含重溶成無 菌可注射溶液或分散系所用的無菌粉末。合適的水性或非水性運載體、稀釋劑、溶劑或載劑 的示例包括水、等滲鹽水、乙醇、多元醇（丙二醇、聚乙二醇、甘油等），其合適混合物，甘油 三酯，包含植物油如橄欖油，或可注射的有機酯如油酸乙酯?？删S持合適的流動性，例如通 過使用涂層（如卵磷脂），在分散系的情況中通過保持所需粒度，和/或通過使用表面活性 齊U?？梢赃m于推注給藥或連續(xù)給藥的形式制備、組裝或出售這類制劑。可以單位劑型制備、 組裝或出售可注射制劑，例如在安瓿中、在包含防腐劑的多劑量容器中或者在用于自動注 射或通過醫(yī)師注射的一次使用的裝置中。
[0040] 胃腸道外給藥的制劑包含懸浮液、溶液、油性或水性載劑中的乳液、糊料和可植入 的緩釋制劑或可生物降解的制劑。這類制劑還能包含一種或多種其他成分，包含懸浮劑、穩(wěn) 定劑或分散劑。在胃腸道外給藥制劑的一個實施方式中，所述活性成分以干燥（如粉末或 顆粒）形式提供，用于以適當(dāng)?shù)妮d劑（如無菌無熱原水）重溶后胃腸道外給予重溶組合物。
[0041] 可以無菌可注射水性或油性（乳液）懸浮液或溶液的形式制備、組裝或出售所述 組合物。這種懸浮液或溶液能按照現(xiàn)有技術(shù)制備，并且可以包含除了活性成分以外的其他 成分，例如本文所述分散劑、潤濕劑或懸浮劑?？墒褂梦改c道外可接受的無毒稀釋劑或溶劑 (例如水或1，3-丁二醇）制備這類無菌可注射制劑。其他可接受的稀釋劑和溶劑包含林格 氏（Ringer)溶液、等滲氯化鈉溶液、和不揮發(fā)油（合成的甘油單酯或甘油二酯）。其他可用 的胃腸道外給藥制劑包含微晶形式、脂質(zhì)體制品、或作為生物可降解聚合物體系組分的活 性成分。用于緩釋或植入的組合物可包含藥學(xué)上可接受的聚合材料或疏水性材料，例如乳 液、離子交換樹脂、難溶性聚合物、或者難溶性鹽。
[0042] 本發(fā)明中的組合物也可以含有佐劑，例如防腐劑、潤濕齊?、乳化齊?、和/或分散劑， 包含例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。也可能需要包含等滲劑，如糖、氯化鈉 等?？赏ㄟ^使用能延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁和/或明膠來延長可注射藥物組合物 的吸收。特別地，脂質(zhì)體、膠粒（mysomes)和乳化劑能用于增加本化合物的可溶性，便于遞 送。
[0043] 劑型可以包含固體或可注射的植入物（implant)或存儲物（depot)。在優(yōu)選實施 方式中，所述植入物包含有效量的活性劑和生物可降解聚合物。在優(yōu)選實施方式中，合適的 生物可降解聚合物選自聚天冬氨酸酯、聚谷氨酸鹽/酯、聚（L-丙交酯）、聚（D，L-丙交酯）、 聚（丙交酯-共-乙交酯）、聚（ε-己內(nèi)酯）、聚酐、聚（β-羥基丁酸酯）、聚（原酸酯）和 聚膦腈。在其他實施方式中，所述植入物包含有效量的活性劑和硅橡膠聚合物。所述植入 物提供有效量的釋放。
[0044] 水性或油性溶劑中活性成分的液體溶液能以與液體懸浮液基本相同的方式制備， 主要區(qū)別是活性成分是溶解的，而不是懸浮在溶劑中。本發(fā)明組合物的液體溶液能包含液 體懸浮液中所述的各成分，應(yīng)理解懸浮劑并不必然促進所述活性成分在溶劑中溶解。水性 溶劑包含例如水和等滲鹽。油性溶劑包含例如杏仁油、油性酯（oily ester)、乙醇、植物油 (如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油、分餾植物油）和礦物油如液體石蠟。
[0045] 本發(fā)明的組合物可進一步包含環(huán)糊精組分以例如改善活性藥物組分的水溶性、延 長藥物釋放和提升壓片特性。一般而言，葡萄糖的環(huán)狀結(jié)構(gòu)寡聚體（"環(huán)糊精"）獲自特 定細(xì)菌的淀粉消化。豐度最高的環(huán)糊精是α、β和 Y環(huán)糊精，分別含有6、7和8個葡萄 糖單元。環(huán)糊精的內(nèi)部空腔是疏水的，而該分子暴露在外的表面是親水的。已知環(huán)糊精可 增強活性藥物成分的穩(wěn)定性、水溶性并降低揮發(fā)性。以下為市售環(huán)糊精或其衍生物的一 些示例：α-環(huán)糊精（CAS#:10016-20-3) ; (2-羥丙基）-α-環(huán)糊精（CAS#: 128446-33-3); β -環(huán)糊精（CAS# :7585-39-9) ; 6-0-a -D-葡糖基-β-環(huán)糊精（CAS# :92517-02-7); Y-環(huán)糊精（CAS#:17465-86-0);以及（2-羥丙基）-Y-環(huán)糊精（CAS#:128446-34-4)。特 別有用于配制成遞送載劑用于給予本發(fā)明所述活性劑的環(huán)糊精包括：磺基丁基醚β -環(huán) 糊精（SBE-beta-Q)，可購自塞得制藥公司（CyDex Pharmaceuticals, Inc.)，商標(biāo)名為 CAPTIS0L);以及環(huán)糊精和輕丙基β環(huán)糊精（可購自火箭制藥（Roquette Pharma)，商標(biāo)名 為 KLEPT0SE)。
[0046] 對于非人類動物中的胃腸道外給藥，可以糊料或者顆粒形式制備水母發(fā)光蛋白并 以植入物的形式給藥?？赏ㄟ^在藥學(xué)上可接受的油（例如花生油、芝麻油、玉米油等）中分 散水母發(fā)光蛋白來制備糊料制劑?？赏ㄟ^與稀釋劑（如碳蠟、巴西棕櫚蠟等）混合來制備含 有治療有效量的顆粒，并且能加入潤滑劑（如硬脂酸鎂或硬脂酸鈣）以改善生成顆粒的工 藝。當(dāng)然，應(yīng)認(rèn)識到可以給予動物一個以上顆粒以達到所需的劑量水平。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)也 可以在動物治療期間內(nèi)周期性給予這種植入物，從而在動物體內(nèi)維持合適的活性劑水平。
[0047] 可以每天約0. 01至約100mg/kg范圍的劑量水平向患者給予本發(fā)明的組合物。對 于一名正常成年人，約〇. 01至約l〇〇mg/kg范圍內(nèi)的劑量通常是足夠的，優(yōu)選劑量為每天 0. 1至10mg/kg。但是，常見劑量范圍可以根據(jù)所治療對象的年齡和體重、計劃給藥途徑、所 給藥的特定化合物等因素產(chǎn)生一些變化。受益于本發(fā)明的公開，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠 確定特定患者的劑量范圍和最優(yōu)劑量。還應(yīng)注意，本發(fā)明化合物能用于緩釋制劑、控釋制劑 和延遲釋放制劑，這些也是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。
[0048] 能否將本發(fā)明組合物直接給予到細(xì)胞、到包含該細(xì)胞的組織、與該細(xì)胞接觸的體 液、或所述化合物能擴散或被轉(zhuǎn)運至該細(xì)胞的身體位點，并不是關(guān)鍵。所述組合物以一定量 并通過一定途徑給藥就足夠了，一定量的所述組合物可憑借所述途徑動用細(xì)胞中的脂質(zhì)而 直接或間接到達細(xì)胞。最小量隨著組合物的性質(zhì)而變化。
[0049] 能使用的特定劑量和劑量范圍可取決于眾多因素變化，包括患者需求、待治療的 病癥嚴(yán)重程度以及所給藥的活性成分的藥理學(xué)活性。閱讀本公開，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能 夠確定特定患者的劑量范圍和最優(yōu)劑量。應(yīng)當(dāng)理解，普通熟練的醫(yī)生、牙醫(yī)或獸醫(yī)可以容易 地確定組合物的有效量并開處方，來帶給對象所需的治療。在這種過程中，醫(yī)生或獸醫(yī)可以 例如首先開出相對較低劑量的處方，然后增加劑量，直到獲得適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)。然而，還應(yīng)當(dāng)理 解，針對任何特定人的具體劑量水平取決于各種因素，包括所采用的具體組合物的活性、年 齡、體重、一般健康情況、性別、和人的飲食、給藥時間、給藥途徑、排泄速度、任意藥物組合、 以及待治療疾病的嚴(yán)重程度。
[0050] 在某些實施方式中，以藥學(xué)上可注射劑型配制水母發(fā)光蛋白，包括水母發(fā)光蛋白 聯(lián)同可注射載體系統(tǒng)。本文中使用的可注射和輸注劑量劑型（即胃腸道外劑型）包括但不 限于含有磷脂來包封活性藥物成分的脂質(zhì)體注射劑或脂質(zhì)雙層囊泡。注射包括胃腸道外使 用的無菌制備物。
[0051] 根據(jù)USP的定義有五種不同類型的注射劑：乳液、脂質(zhì)、粉末、溶液和懸浮液。乳液 注射劑包括一種包含用于胃腸道外給藥的無菌無熱源制備物的乳液。用于溶液注射劑的脂 質(zhì)復(fù)合物和粉末為用于重溶以形成胃腸道外使用的溶液的無菌制備物。用于懸浮液注射劑 的粉末為用于重溶以形成胃腸道外使用的懸浮液的無菌制備物。用于脂質(zhì)體懸浮液注射劑 的凍干粉末為供重溶用于胃腸道外使用的無菌冷凍干燥制備物，其制備的方式允許結(jié)合脂 質(zhì)體，如具有磷脂來用于將活性藥物物質(zhì)包封于脂質(zhì)雙層或水性空間內(nèi)的脂質(zhì)雙層囊泡， 從而可在重溶時形成制劑。用于溶液注射劑的凍干粉末為通過凍干（"冷凍干燥"）制備的 用于溶液的劑型，過程涉及在極低壓下從冷凍狀態(tài)的產(chǎn)物中去除水分，隨后加入液體產(chǎn)生 在所有方面均符合注射要求的溶液。用于懸浮液注射劑的凍干粉末為用于胃腸道外使用的 液體制備物，包含懸浮于合適液態(tài)介質(zhì)中的固體，其在所有方面均符合無菌懸浮液的要求， 通過凍干制備用于懸浮液的藥用試劑。溶液注射劑涉及液體制備物，其含有溶解于適合注 射的合適溶劑或可相互混溶的溶劑混合物中的一種或多種藥物物質(zhì)。溶液濃縮注射劑涉及 用于胃腸道外使用的無菌制備物，在加入合適的溶劑后產(chǎn)生在所有方面均符合注射要求的 溶液。懸浮液注射劑涉及（適合注射的）液體制備物，含有分散于液相中的固體粒子，所述 粒子是不溶性的，油相分散于水相中或反之。懸浮液脂質(zhì)體注射劑為（適合注射的）液體 制備物，具有以一定方式分散于水相中的油相，使脂質(zhì)體（脂質(zhì)雙層囊泡，通常含有磷脂來 用于在脂質(zhì)雙層或水性空間內(nèi)包封活性藥物物質(zhì)）形成。懸浮液超聲注射劑為（適合注射 的）液體制備物，含有分散于液相中的固體粒子，從而所述粒子是不溶性的。此外，以氣體 從懸浮液中鼓泡來對該產(chǎn)物進行超聲處理，使得由固體粒子形成微球。
[0052] 胃腸道外運載體系統(tǒng)包括一種或多種藥學(xué)上合適的賦形劑，如溶劑和助溶劑、增 溶劑、濕潤劑、懸浮劑、增稠劑、乳化劑、螯合劑、緩沖液、PH調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑、還原劑、抗微 生物防腐劑、膨脹劑、保護劑、張力調(diào)節(jié)劑和特殊添加劑。
[0053] 按照本發(fā)明的組合物和方法的各種示例性實施方式在下面實施例中描述。提供以 下實施例僅用于說明目的，并非旨在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實際上，本發(fā)明所示和 描述以外的各種變化通過以上描述以及以下的實施例對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見，所述變 化也包括在所附權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
[0054] III.實施例
[0055] 實施例1 :水母發(fā)光蛋白改變IL-10表達水平的時程和有效性。
[0056] 本實施例中，發(fā)明人證明了水母發(fā)光蛋白在增強抗炎細(xì)胞因子IL-10的mRNA表達 中的有效性。預(yù)調(diào)節(jié)是一種通過短暫的非致命缺血事件減弱隨后發(fā)生的更嚴(yán)重缺血損傷所 導(dǎo)致的傷害的現(xiàn)象。與從大腦損傷時產(chǎn)生的反應(yīng)中看到的相比，預(yù)調(diào)節(jié)降低了炎癥調(diào)節(jié)基 因（如IL-I β和IL-6)的表達。IL-10是一種抗炎細(xì)胞因子并且顯示出在給予Ca2+通道 阻斷劑后增加。預(yù)調(diào)節(jié)增加了 IL-10的生成，而IL-10與神經(jīng)保護相關(guān)。其具有神經(jīng)保護 性的一個方式是通過減少TNF-α的生成間接降低IL-6。
[0057] 材料和方法
[0058] 動物。使用了 50只雄性F344成年大鼠（平均年齡=3.4±0.2月）。大鼠生存于 14/10小時的晝/夜循環(huán)中，自由進食和飲水。
[0059] 外科操作。將大鼠麻醉并固定在立體固定裝置上。在無菌條件下，切開頭皮并將 其收至側(cè)面，并使頭部位于前肉和人字縫間之間。使用相對于前肉的立體定位坐標(biāo)（3. 5_ 后部，±2. 6mm橫向，3. Omm垂直），對每個大鼠均使用對準(zhǔn)背側(cè)海馬區(qū)（dhpc)的雙側(cè)不銹 鋼插管。使用不銹鋼螺桿和環(huán)氧基樹脂將插管固定在頭骨上。未對大鼠進行注射時在原位 保留不銹鋼螺帽以防止導(dǎo)管堵塞。
[0060] 藥物。在零Ca2+-aCSF(人工腦脊液）中制備水母發(fā)光蛋白（AQ，0、0.4、1和4%，昆 西生物科學(xué)（Quincy Bioscience)),加入6% DMSO以促進神經(jīng)元吸收。在去頭前1小時、1 天、2天、3天或5天對大鼠的一個大腦半球輸注AQ，另一個大腦半球輸注載劑。給予60秒 的雙側(cè)輸注（每側(cè)〇. 5 μ 1)并使注射插管在原位額外保留2分鐘以確保擴散。切割輸注插 管，使其超出導(dǎo)管〇.5mm。
[0061] 氧氣-葡萄糖耗竭。使用標(biāo)準(zhǔn)方法制備冠狀切片（400 μ m)。在aCSF中進行1小 時切片復(fù)蘇后，通過將切片轉(zhuǎn)移至果糖-CSF (使用果糖代替葡萄糖并使用95% N2 - 5% CO2 代替95% O2 - 5% CO2起泡）中放置5分鐘以誘導(dǎo)體外缺血。隨后將切片放回含0. 2%臺 盼藍的含氧aCSF中，進行30分鐘再灌注。臺盼藍能夠很好地穿透死細(xì)胞并將其染成藍色， 同時活細(xì)胞保持未染色狀態(tài)。使用含氧室溫aCSF清洗切片兩次，隨后使用10%中性緩沖福 爾馬林在冰箱中固定過夜。隨后對切片進行冷凍保護，在低位恒溫器上切片（40 μ m)并裝 片在加膠層（subbed)載玻片上。
[0062] 細(xì)胞計數(shù)。使用奧林巴斯顯微鏡（配備數(shù)碼照相機）10倍放大檢查切片并拍照。 由不知曉實驗條件的實驗員對CAl (約800 μ m部分）中經(jīng)臺盼藍染色的神經(jīng)元進行計數(shù)。 使用Statview (5. 0版；美國北卡羅來納州卡雷的SAS研究院有限公司）進行統(tǒng)計分析。使 用ANOVA評價藥效。星號表示p〈. 05。
[0063] Western印跡。對大鼠雙側(cè)注射4%的AQ，并在以下時間點移除大腦：1小時、1天、 2天或3天。速凍大腦并將其儲存于-80°C。單獨分離出并勻楽dhpc和腹側(cè)海馬區(qū)（vhpc)。 對樣品進行離心并移除上清，使用Bradford蛋白測定試劑盒（伯樂公司（Bio-Rad))進 行測量。標(biāo)準(zhǔn)化蛋白樣品并將其加載至SDS-PAGE(10%)。使用半干轉(zhuǎn)裝置（伯樂公司） 將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。隨后將膜與以下試劑孵育：封閉緩沖液（2小時）、一抗（4°C過 夜；1:5000小鼠抗水母素[開米康公司（Chemicon)]或1:1000兔抗β -肌動蛋白[細(xì)胞 信號傳導(dǎo)技術(shù)公司（Cell Signaling Technology)])和二抗（90分鐘；1:5000羊抗小鼠 [圣克魯斯生物技術(shù)公司（Santa Cruz Biotechnology)]或1:5000羊抗兔[密理博公司 (Millipore)])。隨后清洗膜，將其置于化學(xué)發(fā)光溶液（圣克魯斯生物技術(shù)公司（Santa Cruz Biotechnology))中并暴露于自射線膠片（Hyperfilm MP)。照相并使用NIH Image J軟件 進行密度分析。當(dāng)條帶的光密度值（減去每個泳道的背景）比vhpc條帶的平均值高2個 標(biāo)準(zhǔn)差時，認(rèn)為該條帶是陽性的。
[0064] PCR。對于RT-PCR，對大鼠的一個大腦半球輸注4% AQ，另一個大腦半球輸注載 齊U。輸注后1小時、1天或2天時，取出海馬區(qū)并立即將其置于Trizol中。使用25號針頭 和注射器來勻漿組織，冷凍樣品并將其儲存于_80°C直至提取RNA。使用凱杰公司（Qiagen) RNeasy小試劑盒方案來提取RNA。將分離的RNA溶解于50 μ 1無 RNA酶的水中。根據(jù)260 與280nm處吸光度的比值計算RNA純度，吸光度讀數(shù)在1. 8至2. 1之間的樣品被認(rèn)為是純 RNA。使用凱杰公司（Qiagen) RT2HT First Stand試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄以生成cDNA。IL-10 和β-肌動蛋白的引物購自凱杰公司（Qiagen)并按照凱杰RT2qPCR引物測定來使用。通 過SYBR綠（非特異性DNA染色）的熒光測量cDNA的擴增情況。使用St印One實時PCR系 統(tǒng)和軟件在96孔板中對樣品進行三次重復(fù)實驗。使用管家蛋白β-肌動蛋白的基因表達 作為細(xì)胞因子表達的定量基線。使用Pfaffl法分析基因表達的變化。根據(jù)兩個隨機選擇 樣品的β-肌動蛋白和IL-10的數(shù)值計算引物效率。
[0065] 小結(jié)
[0066] 如圖1所示，輸注水母發(fā)光蛋白后抗炎細(xì)胞因子水平升高。具體而言，IL-IOmRNA 早在輸注后1小時就有升高。各組間未檢測到β_肌動蛋白表達的變化。鑒于公知的抗炎 細(xì)胞因子水平升高和炎癥減少間的關(guān)系，可以得出，在醫(yī)學(xué)相關(guān)的動物模型系統(tǒng)中，水母發(fā) 光蛋白是一種用于減少炎癥的有效試劑，該系統(tǒng)與人體相關(guān)并可立即應(yīng)用。
[0067] 實施例2 :水母發(fā)光蛋白保護大鼠海馬區(qū)的神經(jīng)元免遭缺血損傷并改變其中細(xì)胞 因子mRNA的水平。
[0068] 參見圖2A，發(fā)明人證明，在海馬區(qū)內(nèi)注射水母發(fā)光蛋白（AQ，水母素的CaBP組分） 明顯能夠保護海馬區(qū)神經(jīng)元免遭缺血性細(xì)胞死亡。最初在24小時時可觀察到AQ的神經(jīng)保 護作用，且持續(xù)至48小時（圖2B和2C)。有趣的是，western印記分析表明AQ蛋白水平在 這一時期顯著下降（圖2D)。雖然AQ的神經(jīng)保護作用在48小時時最強，該時間點上相對低 的AQ蛋白量表明其他因子可能在AQ保護神經(jīng)元免遭缺血性細(xì)胞死亡的能力中起作用。 [0069] 一種可能性是給予AQ導(dǎo)致抗炎細(xì)胞因子水平的變化。先前已有報道，抗炎細(xì)胞因 子白介素 IO(IL-IO)能夠在體外保護神經(jīng)元免遭缺氧。為檢驗細(xì)胞因子表達在AQ的神經(jīng) 保護中起作用的假說，在單次海馬區(qū)內(nèi)給予AQ后的不同時間點測量了細(xì)胞因子的mRNA水 平。在12只雄性F344大鼠的背側(cè)海馬區(qū)兩側(cè)插入導(dǎo)管。復(fù)蘇后，單側(cè)注射4% AQ(另一側(cè) 注射載劑，平衡）并在1、24或48小時后取出大腦并切開海馬區(qū)，置于干冰上并勻漿。使用 凱杰公司的RNeasy小試劑盒分離RNA。使用凱杰公司的RT2HT First Strand試劑盒-96 實施反轉(zhuǎn)錄并使用qPCR對IL-10和β-肌動蛋白進行定量。如圖3A所示，經(jīng)AQ處理的大 腦半球內(nèi)的IL-10水平在注射后1小時顯著升高（t (14) = 5. 30, ρ〈. 05)，而24或48小時 后則不然（Ρ>. 05)。AQ處理不影響β -肌動蛋白mRNA的水平（圖3Β)。
[0070] 使用凱杰公司的的RT2Profiler Array進行了細(xì)胞因子和趨化因子的進一步PCR 陣列分析，以評價在這些時間點時其他細(xì)胞因子和趨化因子是否被激活（圖3C)。圖4描述 了說明性結(jié)果并提示給予AQ后多種抗炎細(xì)胞因子和趨化因子的mRNA水平均以時間依賴的 方式變化。
[0071] 圖5描述了發(fā)明人檢測的免疫反應(yīng)基因的相互作用示意圖。相應(yīng)地，發(fā)明人按功 能分析了所測定的基因，圖6顯示（A) AQ注射后急性炎癥反應(yīng)基因的變化；(B) AQ注射后T/ B細(xì)胞激活因子的變化；（C)AQ注射后血管生成/細(xì)胞增殖基因的變化；(D)AQ注射后巨噬 細(xì)胞吸引基因表達模式的變化；(E) AQ注射后鈣調(diào)節(jié)基因的變化；以及（F) AQ注射后按功能 分組基因的變化。表1以表格的形式顯示了該數(shù)據(jù)?？傊@些結(jié)果表明AQ具有神經(jīng)保護 性且該神經(jīng)保護作用涉及神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)機制。
[0072] 小結(jié)
[0073] 該實施例中的數(shù)據(jù)證明水母發(fā)光蛋白的神經(jīng)保護作用是時間依賴的。缺血損傷發(fā) 生前24和48小時而非1小時時，在背側(cè)海馬區(qū)的CAl區(qū)域內(nèi)注射AQ能夠顯著減少細(xì)胞死 亡。有趣的是，AQ的可用性和效果之間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。
[0074] 本數(shù)據(jù)進一步證明水母發(fā)光蛋白的神經(jīng)保護作用可能涉及神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)機制。注 射后IL-10的激活表明免疫系統(tǒng)在其保護作用中起到作用。其他細(xì)胞因子和趨化因子的時 間依賴性激活支持這一假說。
[0075] 表 1
[0076]

【權(quán)利要求】
1. 一種預(yù)處理神經(jīng)元以減少對象中腦缺血所導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷的方法，所述方法包含 向?qū)ο笾械纳窠?jīng)元給予水母發(fā)光蛋白，其特征在于，相比未給予所述水母發(fā)光蛋白的神經(jīng) 元，所述水母發(fā)光蛋白能夠引起細(xì)胞因子表達水平的改變，減少所述對象中腦缺血所導(dǎo)致 的神經(jīng)元損傷。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過注射給予所述水母發(fā)光蛋白。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述注射是海馬區(qū)內(nèi)注射。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述對象是人。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述神經(jīng)元損傷減少的效果從給予所述水 母發(fā)光蛋白的時間點開始持續(xù)至少24小時。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述神經(jīng)元損傷減少的效果從給予水母發(fā) 光蛋白的時間點開始持續(xù)至少48小時。
7. 水母發(fā)光蛋白用于制造藥物的用途，所述藥物用于預(yù)處理對象中的神經(jīng)元以減少腦 缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷。
8. -種水母發(fā)光蛋白，所述蛋白用于預(yù)處理對象中的神經(jīng)元以減少腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng) 元損傷。
9. 一種用于預(yù)處理對象中的神經(jīng)元以減少腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷的組合物，所述組 合物包含： (a) 治療有效劑量的水母發(fā)光蛋白，用于預(yù)處理對象中的神經(jīng)元以減少腦缺血導(dǎo)致的 神經(jīng)元損傷；以及 (b) 藥學(xué)上可接受的運載體。
10. 如權(quán)利要求9所述的組合物，其特征在于，所述組合物配制為可注射劑。
11. 一種用于預(yù)處理對象中的神經(jīng)元以減少腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷的試劑盒，所述 試劑盒包含： (a) 治療有效劑量的水母發(fā)光蛋白，用于預(yù)處理對象中的神經(jīng)元以減少腦缺血導(dǎo)致的 神經(jīng)元損傷；以及 (b) 設(shè)置為向所述對象給予所述量的水母發(fā)光蛋白的遞送裝置。
【文檔編號】A61K38/17GK104244966SQ201280066993
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2012年11月15日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月15日
【發(fā)明者】M·Y·安德伍德, J·R·莫耶 申請人:昆西生物科學(xué)有限公司