用于治療或預(yù)防粘膜相關(guān)疾病的材料的制作方法【專利摘要】本發(fā)明提供一種透明質(zhì)酸組合物用于治療或預(yù)防粘膜相關(guān)病變或疾病，該透明質(zhì)酸組合物包含具有不同平均分子量及不同流變(rheology)、分離(isolation)、組織支架(tissue?scaffold)及降解性(degradation)的透明質(zhì)酸混合物。其劑型運(yùn)用被證實(shí)在治療及預(yù)防粘膜相關(guān)病變或疾病上附著、組織支架及治療時(shí)間之間可取得適當(dāng)?shù)钠胶狻Ｔ撜衬は嚓P(guān)病變或疾病包括結(jié)膜炎、耳炎、過敏性鼻炎、牙齦炎、口腔潰瘍、支氣管炎、胃食管逆流癥（gastroesophageal?reflux?disease，GERD）、食道炎、胃炎、腸炎、消化性潰瘍、發(fā)炎性腸疾（inflammatory?bowel?disease，IBD）、刺激性腸綜合癥（irritable?bowel?syndrome，IBS）、尿道炎、膀胱炎和陰道炎?！緦＠f明】用于治療或預(yù)防粘膜相關(guān)疾病的材料【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明提供一種用于治療及預(yù)防粘膜相關(guān)病變或疾病的透明質(zhì)酸組合物，其中粘膜相關(guān)病變或疾病的癥狀包含潰瘍、發(fā)炎、過敏反應(yīng)及流血?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]透明質(zhì)酸具有不同的英文名詞(hyaluronicacid、hyaluronan、hyaluronate及sodiumhyaluronate),可簡(jiǎn)稱為HA,是一種天然的糖胺聚多糖(glycosaminoglycan),其是由交替的N-乙酰-D-葡萄糖胺(N-acetyl-D-glucosamine)及D-葡萄糖醒酸(glucuronicacid)組成，此雙糖由交替的(6-1,3及(6-1,4糖苷鍵鏈結(jié)。天然的透明質(zhì)酸通常具有高粘滯度，其分子量介于5萬道爾頓(Dalton，Da)至數(shù)百萬道爾頓之間。[0003]天然的透明質(zhì)酸為粘彈性流體，填充于細(xì)胞與膠原蛋白纖維空隙之中且覆蓋在某些表皮組織上。主要用來保護(hù)及潤(rùn)滑細(xì)胞，提供一平臺(tái)來運(yùn)輸調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，穩(wěn)定膠原蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，以及保護(hù)它免于受到機(jī)械性的破壞。透明質(zhì)酸在肌腱、肌腱鞘及粘滑膜表面也是一種主要的潤(rùn)滑劑，此是借由其潤(rùn)滑特性及高吸震能力。透明質(zhì)酸也有助于組織流變力學(xué)(rheologicalmechanics)，運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞增殖(參照Delpech,B.,Girard,N.,Bertrand,P.,CoureI,M.-N.,Chauzy,C.,Delpech,A.,1997.J.1ntern.Med.242,41-48)。并參與一些細(xì)胞表面的受體交互作用(receptorinteraction),特別指主要的受體一0)44。0)44已被廣泛接受為一種淋巴球細(xì)胞活化的標(biāo)記(參照TederP，VandivierRff,JiangD,LiangJ,CohnL,PureE,HensonPM,NoblePW.Science2002;296:155-158)。[0004]近來透明質(zhì)酸常以其鈉鹽形態(tài)應(yīng)用于臨床治療中，主要用于眼科、皮膚科、整形外科、一般外科、關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈治療及化妝品中。含堿金屬離子、堿土金屬離子(例如鎂)、鋁離子、銨離子及經(jīng)取代銨離子的鹽類的透明質(zhì)酸可充作輔助藥物吸收的載體(參照比利時(shí)專利第904，547號(hào))。在透明質(zhì)酸的重金屬鹽類中，銀鹽被用為殺霉菌劑；而金鹽可用以治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(參照PCT專利W087/05517)。[0005]美國(guó)專利第5，888，986號(hào)揭露使用有效濃度透明質(zhì)酸治療膀胱炎的方法及相關(guān)結(jié)構(gòu)，其中透明質(zhì)酸的重量平均分子量(Mw)超過20萬道爾頓。在實(shí)施例中僅運(yùn)用特定重量平均分子量的單一透明質(zhì)酸。例如，利用重量平均分子量65萬道爾頓或190萬道爾頓的透明質(zhì)酸來治療膀胱炎，但特定重量平均分子量的單一透明質(zhì)酸，無法兼顧治療速效及持久的效果。[0006]美國(guó)專利申請(qǐng)案第2005/0080037號(hào)揭露透明質(zhì)酸治療急性和過度扭傷和應(yīng)變，其中透明質(zhì)酸的重量平均分子量?jī)H介于90萬道爾頓至120萬道爾頓間，特定重量平均分子量的單一透明質(zhì)酸無法兼顧治療速效及持久的效果。[0007]美國(guó)專利第7，354，910號(hào)揭露重量平均分子量介于60萬道爾頓至120萬道爾頓間的透明質(zhì)酸能用來治療發(fā)炎性腸疾病(inflammatoryboweldisease,IBD)。然而,僅單一重量平均分子量的透明質(zhì)酸，在其注射入病人的體內(nèi)后，無法兼顧速效及持久的效果，因此在臨床上對(duì)病人而言非常不方便。[0008]歐洲專利第1369119號(hào)揭露了重量平均分子量介于60萬道爾頓至300萬道爾頓間的透明質(zhì)酸能用來治療自體免疫疾病。然而，該專利僅利用具特定重量平均分子量的單一透明質(zhì)酸，而無法兼顧治療速效及持久的效果。[0009]黏膜(mucousmembrane,mucosa)覆蓋在大部分的內(nèi)皮表面,表皮表面,并具有吸收(于腸胃道)及分泌(于腸胃道及呼吸道)功能。粘膜覆蓋在對(duì)外部環(huán)境曝露及內(nèi)部器官的凹陷表面，及伴隨著皮膚覆蓋在身體的一部份:鼻孔、嘴、嘴唇、眼瞼、耳朵、生殖道及肛門。由粘膜及腺體分泌具有粘性的濃厚液體稱為粘液(mucus)，而依據(jù)粘膜在身體的不同部份有不同的稱呼，同時(shí)粘膜未必皆會(huì)分泌粘液。[0010]眼睛:結(jié)膜炎(conjunctivitis)是結(jié)膜發(fā)炎，(結(jié)膜是眼睛的最外層及眼瞼的內(nèi)部表面)最常起因于感染或過敏反應(yīng)(參照RichardsA,May2010.“結(jié)膜炎("Conjunctivitis")”.PediatrRev31(5):196-208)。[0011]耳朵:耳炎(otitis)是人類及其他動(dòng)物耳朵發(fā)炎或感染的一般名詞?？煞譃?外耳炎、中耳炎及內(nèi)耳炎。[0012]過敏性鼻炎:鼻炎是鼻粘膜發(fā)炎，其特征為復(fù)合性癥狀包括以下任一種的結(jié)合:打噴嚏、鼻塞、發(fā)癢及流鼻涕。眼睛、耳朵、鼻竇及喉嚨皆包含在內(nèi)。過敏性鼻炎是鼻炎的最常見起因，同時(shí)影響了20%的族群。過敏性鼻炎并非是威脅性命的疾病，然而會(huì)產(chǎn)生并發(fā)癥且會(huì)明顯影響生活品質(zhì)，間接導(dǎo)致出許多生活花費(fèi)(參照BousquetJetal.“過敏性鼻炎管理手冊(cè)(Allergicrhinitismanagementpocketreference)”2008.Allergy2008Aug;63(8):990-996)。美國(guó)專利申請(qǐng)案第2005/0107330號(hào)揭露一種用來局部治療鼻炎的醫(yī)藥組合物，其包含至少一個(gè)酸性糖胺聚多糖。該發(fā)明亦包含至少一個(gè)適宜局部施用的擬交感藥物或生理上可接受的鹽類或衍生物，其具有對(duì)粘膜的血管收縮或消腫的作用，且其并未揭露或教導(dǎo)結(jié)合兩種不同重量平均分子量的透明質(zhì)酸。[0013]嘴巴:口腔粘膜位于口腔的表皮?？谇粷兪强谇粌?nèi)部的開放性潰瘍，或在少數(shù)例子中，會(huì)造成嘴唇上或口腔周圍的粘膜或表皮的裂開。潰瘍的類型歧異，具有多重相關(guān)的原因:物理性的磨損、酸性水果、感染、其他醫(yī)學(xué)狀態(tài)、給藥方法以及癌癥的(cancerous)和非專一丨I"生進(jìn)程(nonspecificprocesses)。一旦形成,潰瘍可能因發(fā)炎及/或第二次感染而持續(xù)。兩種常見形態(tài)為口腔潰瘍及嘴唇皰疹(coldsores)0嘴唇附近的嘴唇皰疹是由病毒所導(dǎo)致(參照J(rèn).M.Casiglia,etal.,0ctober2006.“口腔潰瘍(Aphthousstomatitis)”.Emedecine)。[0014]支氣管炎:支氣管是用于將氣流從氣管輸送到肺臟的呼吸道。支氣管炎為支氣管的粘膜發(fā)炎，可分為兩種:急性及慢性。每一種都有獨(dú)特的病因、病征及療法。急性支氣管炎經(jīng)常在如感冒或流感的急性病毒疾病進(jìn)程中發(fā)生。慢性支氣管炎最常發(fā)展于吸入性刺激所導(dǎo)致的氣管的再發(fā)性損傷。吸煙是最常見的起因，接著為空氣污染及職業(yè)性暴露刺激源(occupationalexposuretoirritants)(Cohen,JonathanandWilliamPowderly.“感染性疾病(InfectiousDiseases.)”2nded.Mosby(Elsevier),2004.“第三章氣管、支氣管以及囊性纖維化(Chapter33:Bronchitis,Bronchiectasis,andCysticFibrosis)”)。美國(guó)專利申請(qǐng)案第2003/0171332號(hào)揭露一種借由能結(jié)合CD44的多醣(polysaccharide)來治療呼吸道疾病的方法，但只利用單一種透明質(zhì)酸。[0015]腸胃道粘膜:包覆消化腔或管道內(nèi)開放空間的腸胃壁的最內(nèi)層是粘膜。此層是直接與食物團(tuán)接觸，并負(fù)責(zé)吸收、消化及分泌等消化作用的重要過程。[0016]粘膜在每個(gè)消化道器官是高度特殊化的，其在胃中面對(duì)低pH、在小腸中吸收多種不同的物質(zhì)，而同樣在大腸中吸收一定份量的水。為反映出這些器官的不同需求，粘膜的結(jié)構(gòu)能由分泌腺體的套迭(如胃小凹，gastricpits)所組成，或?yàn)榱嗽黾颖砻娣e呈折迭狀(AbrahamL.Kierszenbaum,2002,“組織學(xué)以及細(xì)胞生物學(xué):從導(dǎo)論至病理學(xué)(HistologyandCellBiology:anintroductiontopathology)，，。[0017]消化道粘膜在身體與同時(shí)含有營(yíng)養(yǎng)物及潛在致病性微生物及毒素的消化腔之間形成一道屏障。粘膜的挑戰(zhàn)在于當(dāng)需要將進(jìn)入體內(nèi)的有害分子及有機(jī)體(organisms)強(qiáng)力排開時(shí)，同時(shí)允許有效的傳輸營(yíng)養(yǎng)物穿透表皮入人體內(nèi)。胃及腸粘膜的排除特性稱之為“腸胃道屏障(gastrointestinalbarrier)”。一般而言,毒素及微生物皆能突破單一的表皮細(xì)胞層而毫無阻礙的進(jìn)入體循環(huán)。[0018]胃食道逆流癥(gastroesophagealrefluxdisease,GERD)是一種胃酸從胃逆流至食道所致的慢性癥狀或粘膜損傷，典型的癥狀是心口灼熱。胃食道逆流癥通常是導(dǎo)因于胃與食道間屏障的變化，其包括:下食道括約肌(loweresophagealsphincter)的不正常放松，在正常情況下，該下食道括約肌會(huì)保持胃的頂部呈封閉狀；食道受損始于胃逆流的驅(qū)逐作用；或者橫隔膜!氣(hiatalhernia)。這些變化可能是永久的或暫時(shí)的(參照DeVaultKR,1999.“胃食道逆流癥的診斷與治療的最新指引一美國(guó)胃腸病學(xué)會(huì)的執(zhí)業(yè)參數(shù)委員會(huì)(Updatedguidelinesforthediagnosisandtreatmentofgastroesophagealrefluxdisease.ThePracticeParametersCommitteeoftheAmericanCollegeofGastroenterology)”?AmJGastroentero194(6):1434-42)。[0019]消化性潰瘍(p印ticulcer):消化性潰瘍是一種腸胃道的區(qū)域的潰瘍，其定義為粘膜糜爛等于或大于0.5公分，該區(qū)域通常是酸性的，而因此導(dǎo)致特別疼痛。幾乎70-90%的潰瘍與幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)有關(guān)，該菌呈螺旋狀生活在胃的酸性環(huán)境中。潰瘍也會(huì)因藥物而產(chǎn)生或惡化，例如阿司匹林(aspirin)、氯吡格雷(Plavix)、異丁苯丙酸(ibuprofen)及其他的非留體抗炎劑(non-steroidant1-1nflammatorydrugs,NSAIDs)。[0020]與通常認(rèn)為相反，消化性潰瘍?cè)谑改c比在胃里更易發(fā)生。大約4%的胃潰瘍是起因于惡性腫瘤，且需要多種活組織檢驗(yàn)來排除其是癌癥。十二指腸潰瘍(duodenalulcer)一般而言是良性的。消化性潰瘍是借由發(fā)作部位予以分類:胃(稱為胃潰瘍)、十二指腸(稱為十二指腸潰瘍)、食道(稱為食道潰瘍)、梅克爾氏憩室(Meckel’sDiverticulum,稱為梅克爾氏憩室潰瘍)。[0021]上述實(shí)施例皆代表粘膜相關(guān)病變或疾病但不受限于上述實(shí)施例。所揭露的病變或疾病至今可能用一些不同藥物或治療方法來治療，但這些治療手段大部分是借由高度特別的制造方法所制成的復(fù)雜成份藥物來達(dá)成，而非屬簡(jiǎn)單及安全的治療手段。除了本發(fā)明的發(fā)明人外，并未有先前技術(shù)教導(dǎo)或預(yù)測(cè)結(jié)合兩個(gè)具有不同重量平均分子量的透明質(zhì)酸(LMWHA,低重量平均分子量透明質(zhì)酸；HMWHA，高重量平均分子量透明質(zhì)酸)，而該兩個(gè)透明質(zhì)酸的分子量是以150萬道爾頓來做界限區(qū)分。此代表在本【
技術(shù)領(lǐng)域：
】技術(shù)人員無法借由結(jié)合任何其他現(xiàn)有技術(shù)導(dǎo)出本發(fā)明的混合物應(yīng)用的概念?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0022]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一種用于治療粘膜相關(guān)病變的方法，借由施予受體所需有效治療劑量的透明質(zhì)酸混合物，該混合物包含至少兩個(gè)不同重量平均分子量的透明質(zhì)酸，用以緩和或排除先前提到的問題。[0023]本發(fā)明的目的是使用至少兩個(gè)不同平均分子量的透明質(zhì)酸或藥學(xué)上可接受的鹽以治療粘膜相關(guān)病變或疾病。低重量平均分子量透明質(zhì)酸及高平均重量分子量透明質(zhì)酸具有不同粘性、絕緣功能及降解速度。平均分子量低于150萬道爾頓的透明質(zhì)酸被歸類為低重量平均分子量透明質(zhì)酸(LMWHA)，平均分子量高于150萬道爾頓的透明質(zhì)酸被歸類為高重量平均分子量透明質(zhì)酸(LMWHA)。因此，混合低重量平均分子量透明質(zhì)酸及高平均重量分子量透明質(zhì)酸可形成所需的組合物，其中低重量平均分子量透明質(zhì)酸可快速覆蓋于發(fā)炎表面以治療或預(yù)防粘膜相關(guān)病變或疾病[例如:結(jié)膜炎、耳炎、過敏性鼻炎、牙齦炎、口腔潰瘍、支氣管炎、胃食管逆流癥(gastroesophagealrefluxdisease,GERD)、食道炎、胃炎、腸炎、消化性潰瘍(pepticulcer,PU)、發(fā)炎性腸疾(inflammatoryboweldisease,IBD)、刺激性腸綜合癥(irritablebowelsyndrome,IBS)、尿道炎、膀胱炎和陰道炎。],而高重量平均分子量透明質(zhì)酸可延長(zhǎng)治療效果。因此，治療可迅速且長(zhǎng)效地進(jìn)行。[0024]據(jù)此，本發(fā)明提供一種用于治療或預(yù)防粘膜相關(guān)病變或疾病組合物，該組合物用于哺乳類動(dòng)物或人類，且包含:[0025]有效治療劑量的透明質(zhì)酸混合物(hyaluronicacidmixture,HAmixture),其包括一低重量平均分子量透明質(zhì)酸(LMWHA)及一高重量平均分子量透明質(zhì)酸(HMWHA)，其中低重量平均分子量透明質(zhì)酸是介于5萬至150萬道爾頓之間，高重量平均分子量透明質(zhì)酸是介于150萬至500萬道爾頓之間，低重量平均分子量透明質(zhì)酸與高重量平均分子量透明質(zhì)酸的分子量差距至少50萬道爾頓。低重量平均分子量透明質(zhì)酸與高重量平均分子量透明質(zhì)酸的混合比例為重量比20:80至80:20之間。[0026]本發(fā)明的整體概念首先需理解到透明質(zhì)酸會(huì)被透明質(zhì)酸水解酶(hyaluronidase,HAase)分解。而線狀透明質(zhì)酸(linearHA)(LMWHA)及球狀透明質(zhì)酸(globularHA)(HMWHA)會(huì)被分解成小片段，只有其中球狀透明質(zhì)酸因空間立體結(jié)構(gòu)，而能在降解后補(bǔ)充線狀透明質(zhì)酸，因此有助于治療效果，同時(shí)能延長(zhǎng)作用時(shí)間。減少需不斷補(bǔ)充線狀透明質(zhì)酸的困擾。已知透明質(zhì)酸水解酶的活性能被用來作為發(fā)炎的標(biāo)記。簡(jiǎn)述如下:低及高重量平均分子量的透明質(zhì)酸的混合，被用于產(chǎn)生結(jié)合治療效果且長(zhǎng)時(shí)間作用。因此，較短的透明質(zhì)酸減少后，可不斷地被補(bǔ)充用于持續(xù)的傷口治療或提供一種軟性障壁使組織免于損傷或進(jìn)一步損傷。以下將詳細(xì)描述本發(fā)明的概念。[0027]本發(fā)明所述的用于治療或預(yù)防粘膜相關(guān)病變或疾病的組合物包含有效治療劑量的透明質(zhì)酸混合物，其包含低重量平均分子量透明質(zhì)酸及高重量平均分子量透明質(zhì)酸。低重量平均分子量透明質(zhì)酸是重復(fù)的雙糖單元而形成線狀結(jié)構(gòu)(如圖1所示)。然而，通過透明質(zhì)酸和胺的反應(yīng)的高重量平均分子量透明質(zhì)酸，一般據(jù)信是線狀透明質(zhì)酸高分子的羧基(carboxylicgroup)與二/三/聚胺反應(yīng)形成酰胺鍵(amidelinkage),并同時(shí)形成分子間鍵橋或分子內(nèi)鍵橋(inter-orintra-molecularbridge)。基于此反應(yīng),開始纏繞的透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)會(huì)轉(zhuǎn)形成球狀納米粒子(sphericalnanoparticle)(參照美國(guó)專利第7，879，818號(hào))。不同的分子量有不同的流變、粘附、組織支架的功能及在水溶液中的降解性，因此透明質(zhì)酸混合物能平衡藥物功效及降解速度，以利于治療及預(yù)防粘膜相關(guān)病變或疾病，同時(shí)達(dá)成適宜的及延長(zhǎng)的治療效果。[0028]TranchepainF.等人揭露了透明質(zhì)酸的所以會(huì)有不同的生物功能是基于其分子量。從物理化學(xué)的觀點(diǎn)，借由小牛睪丸透明質(zhì)酸水解酶催化透明質(zhì)酸水解的研究指出，動(dòng)力學(xué)參數(shù)是依賴透明質(zhì)酸鏈的長(zhǎng)度。獲得不同分子量的透明質(zhì)酸的新工藝是借由透明質(zhì)酸水解酶催化透明質(zhì)酸水解(參照TranchepainFetal.，“借由透明質(zhì)酸水解酶水解的一完整系列透明質(zhì)酸片段:借由簡(jiǎn)單高性能液相層析儀研究透明質(zhì)酸質(zhì)量的應(yīng)用(Acompletesetofhyaluronanfragmentsobtainedfromhydrolysiscatalyzedbyhyaluronidase:ApplicationtostudiesofhyaluronanmassdistributionbysimpleHPLCdevices.)”AnalBiochem.2006Janl5;348(2):232-42.)。相似的，同一批研究團(tuán)隊(duì)亦公開了透明質(zhì)酸的所以具有不同的生物功能是強(qiáng)烈依賴其鏈長(zhǎng)。一般認(rèn)為透明質(zhì)酸水解酶催化透明質(zhì)酸水解是參與控制較長(zhǎng)鏈與較短鏈透明質(zhì)酸間的平衡。較短鏈透明質(zhì)酸似乎因太短而無法形成一個(gè)穩(wěn)定的復(fù)合物，而較長(zhǎng)鏈透明質(zhì)酸也在形成復(fù)合物上遭遇困難，這可能是因?yàn)榱Ⅲw構(gòu)造上的阻礙(sterichindrance)。[0029]數(shù)篇報(bào)告闡述透明質(zhì)酸水解酶參與了發(fā)炎反應(yīng)。滑液(Synovialfluid,SF)透明質(zhì)酸水解酶的活性能用來作為滑膜炎癥(Synovialinflammation)的標(biāo)記(參照NagayaHetal.，“評(píng)估風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及骨關(guān)節(jié)炎病人作為關(guān)節(jié)標(biāo)記分子的滑液及血清透明質(zhì)酸水解酶活性(ExaminationofsynovialfluidandserumHAaseactivityasajointmarkerinrheumatoidarthritisandosteoarthritispatients.)，，AnnRheumDis.，1999，58(3):186-8)?透明質(zhì)酸是牙周韌帶(periodontalligament,PDL)的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix)的主要成份,能促進(jìn)其結(jié)構(gòu)及功能的完整。透明質(zhì)酸有助于咀嚼期間牙周韌帶的緩沖效用，同時(shí)在發(fā)炎及傷口愈合上亦占有重要地位。研究指出牙周韌帶纖維母細(xì)胞能釋出透明質(zhì)酸水解酶，并于生理狀態(tài)及發(fā)炎狀態(tài)下，能產(chǎn)生細(xì)胞外透明質(zhì)酸代謝所需的透明質(zhì)酸水解酶的活性(OhnoSetal.，“透明質(zhì)酸水解酶于人類牙周韌帶纖維母細(xì)胞的表現(xiàn)及活性(Expressionandactivityofhyaluronidaseinhumanperiodontalligamentfibroblasts.)，，JPeriodontol.，2002，，73(11):1331-7)。透明質(zhì)酸水解酶作用后產(chǎn)生的較短透明質(zhì)酸片段參與了發(fā)炎反應(yīng)及血管生成(angiogenesis)，然而原生的(native)透明質(zhì)酸卻不會(huì)(TranchepainFetal.,同上述)。`[0030]依據(jù)本發(fā)明的定義，具有重量平均分子量低于150萬道爾頓的透明質(zhì)酸被歸類為低重量平均分子量透明質(zhì)酸(LMWHA)。優(yōu)選的，所述的低重量平均分子量透明質(zhì)酸平均分子量范圍是介于5萬至150萬道爾頓之間。更優(yōu)選的，所述的低重量平均分子量透明質(zhì)酸平均分子量范圍是介于10萬至150萬道爾頓之間。最優(yōu)選的，所述的低重量平均分子量透明質(zhì)酸平均分子量范圍是介于10萬至50萬道爾頓之間。具有重量平均分子量高于150萬道爾頓的透明質(zhì)酸被歸類為高重量平均分子量透明質(zhì)酸(HMWHA)。較優(yōu)選的，所述的高重量平均分子量透明質(zhì)酸平均分子量范圍是介于150萬至500萬道爾頓之間。最優(yōu)選的，所述的高重量平均分子量透明質(zhì)酸平均分子量范圍是介于150萬至250萬道爾頓之間。將組合低重量平均分子量透明質(zhì)酸及高重量平均分子量透明質(zhì)酸的混合物給予至一需要治療的目標(biāo)時(shí)，低重量平均分子量透明質(zhì)酸可快速地覆蓋發(fā)炎部位來治療粘膜相關(guān)病變或疾病，且高重量平均分子量透明質(zhì)酸可延長(zhǎng)治療效果。因此，治療可迅速且長(zhǎng)效地進(jìn)行。透明質(zhì)酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。[0031]透明質(zhì)酸的量化并非僅得以用分子量表示，也可以利用特性粘度(intrinsicviscosity,n)來表示。其與聚合物的分子量直接相關(guān)。借由Mark-Houwink-Sakurada(MHS)方程式表達(dá):[n]=KMa。對(duì)透明質(zhì)酸而言，在0.15M氯化鈉(NaCl)磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffer)、pH7.5、20°C中，K是0.00057，指數(shù)a為0.75(“用以作為生物醫(yī)學(xué)及組織工程醫(yī)藥產(chǎn)品應(yīng)用的起始物的透明質(zhì)酸鑒定及測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)指南(StandardGuideforCharacterizationandTestingofHyaluronanasStartingMaterialsIntendedforUseinBiomedicalandTissueEngineeredMedicalProductApplications)，，，ASTMDesignation:F2347-03)o[0032]本發(fā)明的結(jié)果顯示無論在透明質(zhì)酸水解酶(圖2)或人造胃液(圖3)中，高重量平均分子量透明質(zhì)酸都能持續(xù)補(bǔ)充低重量平均分子量透明質(zhì)酸以保持其長(zhǎng)效。如圖2所示，在透明質(zhì)酸水解酶存在的環(huán)境中，所有三種透明質(zhì)酸滯留時(shí)間(retentiontime)會(huì)隨著降解的增加而明顯增加。如圖3所示，在酸性環(huán)境中，所有三種透明質(zhì)酸的滯留時(shí)間會(huì)隨著降解的增加而緩慢增加。實(shí)驗(yàn)參數(shù)是模擬生理環(huán)境，但真實(shí)的生理環(huán)境卻可能因相當(dāng)復(fù)雜而導(dǎo)致與實(shí)驗(yàn)結(jié)果間有些許的差異。只有透明質(zhì)酸降解的趨勢(shì)卻不會(huì)因此改變，因?yàn)槠涮烊环肿犹卣魇歉咧亓科骄肿恿客该髻|(zhì)酸能補(bǔ)充低重量平均分子量透明質(zhì)酸。[0033]本發(fā)明混合物的另一優(yōu)選的實(shí)施例包含，但不限于:依重量比1:l(w/V)混合高、低重量平均分子量透明質(zhì)酸，混合比例的優(yōu)選實(shí)施例可以依據(jù)臨床需求調(diào)整為重量比20:80至80:20之間。具有較高比例低重量平均分子量的透明質(zhì)酸混合物對(duì)于加速治療更有幫助。相反地，較高比例高重量平均分子量的透明質(zhì)酸混合物能提供較長(zhǎng)的降解時(shí)間而因此延長(zhǎng)治療效果。[0034]如本發(fā)明所使用的用語粘膜包含，但不限于:眼睛的粘膜、耳朵的粘膜、鼻子的粘膜、口腔的粘膜、呼吸道的粘膜、腸胃道的粘膜、尿道的粘膜及生殖道的粘膜。本發(fā)明的粘膜相關(guān)病變或疾病的癥狀是包含潰瘍、發(fā)炎反應(yīng)、過敏反應(yīng)或流血。粘膜相關(guān)病變或疾病的優(yōu)選實(shí)施例包括但不限于:結(jié)膜炎、耳炎、過敏性鼻炎、牙齦炎、口腔潰瘍、支氣管炎、胃食管逆流癥(gastroesophagealrefluxdisease,GERD)、食道炎、胃炎、腸炎、消化性潰瘍(pepticulcer,PU)、發(fā)炎性腸疾(inflammatoryboweldisease,IBD)、刺激性腸綜合癥(irritablebowelsyndrome,IBS)、尿道炎、膀胱炎和陰道炎。腸炎的更優(yōu)選實(shí)施例包括但不限于:急性腸炎、慢性腸炎、感染性腸炎、缺血性腸炎(ischemicenteritis)、放射性腸炎(radioenteritis)及藥物誘發(fā)的腸炎。消化性潰瘍的更優(yōu)選實(shí)施例包括但不限于:胃潰瘍、十二指腸潰瘍、食道潰瘍及梅爾氏憩室潰瘍(Meckel’sDiverticulumulcer)。發(fā)炎性腸疾(IBD)的更優(yōu)選實(shí)施例包括但不限于:克隆氏癥(Crohn’sdisease)及潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis)。刺激性腸綜合癥(IBS)的更優(yōu)選實(shí)施例包括但不限于:腹腔疾病(coeliacdisease)、果糖吸收不良(fructosemalabsorption)、溫和感染、諸如梨形鞭毛蟲癥(giardiasis)的寄生蟲感染、慢性官能性便秘及慢性官能性腹痛。[0035]本發(fā)明結(jié)果顯示，如圖4所示，相同重量平均分子量的透明質(zhì)酸在受傷的結(jié)腸組織中被吸收的程度明顯高于在正常的結(jié)腸組織(P〈0.01)。比較三種不同重量平均分子量的透明質(zhì)酸在受傷的結(jié)腸組織中被吸收的程度，其中由熒光指數(shù)顯示的35萬道爾頓透明質(zhì)酸被受傷結(jié)腸組織所吸收的量，明顯高于另外二個(gè)重量平均分子量透明質(zhì)酸(100萬及200萬道爾頓)。進(jìn)一步言，100萬道爾頓透明質(zhì)酸被正常或受傷結(jié)腸組織所吸收的熒光指數(shù)高于200萬道爾頓透明質(zhì)酸。此結(jié)果解釋了低重量平均分子量透明質(zhì)酸快速散布及覆蓋的效果，其是提供快速的傷口愈合及保護(hù)組織免于進(jìn)一步受傷。結(jié)合上述數(shù)據(jù)，本發(fā)明是提供一種快速及持續(xù)治療或預(yù)防粘膜相關(guān)病變或疾病的方法。[0036]本發(fā)明組合物的另一優(yōu)選實(shí)施例包括加入賦形劑(excipient)使之形成下列適用于各部位或方式的劑型:眼睛、耳朵、口腔、鼻子、呼吸道、腸胃道或局部使用。本發(fā)明口服劑型的更優(yōu)選實(shí)施例是選自下列由固態(tài)劑型、溶液包括但不限于懸浮液、片劑包括但不限于緩釋型片劑、及膠囊包括但不限于腸溶性膠囊(enteric-coatedcapsule)所組成的群組?？诜虘B(tài)劑型的最優(yōu)選實(shí)施例是每日服用50毫克至1000毫克之間的劑量。腸胃道劑型的更優(yōu)選實(shí)施例是選自下列由固態(tài)劑型、灌注液(perfusion)、灌腸劑(enema)、栓劑及包括懸浮液的溶液所組成的群組。局部使用劑型的更優(yōu)選實(shí)施例是選自下列由灌注液、灌腸劑、栓劑、噴劑、吸入劑及點(diǎn)滴所組成的群組。[0037]本發(fā)明的用于治療過敏性鼻炎或支氣管炎的優(yōu)選實(shí)施例是使用本發(fā)明的組合物作為結(jié)合藥物的佐劑(adjuvant),其中藥物包括抗組織胺藥、抗過敏藥、抗充血藥、類固醇或抗氣喘藥。本發(fā)明用于治療腸炎的優(yōu)選實(shí)施例是使用本發(fā)明的組合物作為結(jié)合藥物的佐劑，其中藥物包括抗生素或鎮(zhèn)疫劑(antispasmodic)。本發(fā)明的用于治療消化性潰瘍的優(yōu)選實(shí)施例是使用本發(fā)明的組合物作為結(jié)合藥物的佐劑，其中藥物包括凝血?jiǎng)?coagulant)、抗生素、抗酸劑(antacid)、H2阻斷劑(H2blocker)、鉀氫離子泵阻斷劑(potassiumhydrogenionpumpblocker,PPI)、細(xì)胞保護(hù)劑或粘膜保護(hù)劑。本發(fā)明用于治療發(fā)炎性腸疾的優(yōu)選實(shí)施例是使用本發(fā)明的組合物作為結(jié)合藥物的佐劑，其中藥物包括類固醇、免疫抑制劑(immunosuppressiveagent)、抗生素、5-胺柳酸(5-aminosalicylicacid,5-ASA)及其衍生物或抗發(fā)炎藥。[0038]本發(fā)明闡述了借由不同重量混合比例的透明質(zhì)酸來治療發(fā)炎性腸疾，其是借由大鼠的平均體重變化來作指標(biāo)。如圖5A及5B所示,A組代表高重量平均分子量(HMWHA):低重量平均分子量(LMWHA)的重量混合比例為8:2。B組代表HMWHA=LMWHA的重量混合比例為1:1。C組代表對(duì)照組,其中的透明質(zhì)酸由磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffersaline,PBS)代替。雖然統(tǒng)計(jì)顯著性僅在第5及第6天發(fā)生，但本圖式的重點(diǎn)是在于每一組從第I天至第14天的趨勢(shì)變化。隨著實(shí)驗(yàn)天數(shù)增加，實(shí)驗(yàn)趨勢(shì)顯示A組及B組皆具緩和結(jié)腸炎(屬于炎癥性腸疾病的一種)的效應(yīng)。如圖5A所示，相較對(duì)照組與A、B組的大鼠平均體重變化，經(jīng)過整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程直到第14天，可看出透明質(zhì)酸治療結(jié)腸炎的使用會(huì)導(dǎo)致A、B組的大鼠平均體重持續(xù)高于比對(duì)照組。有意義的是，該趨勢(shì)亦顯示B組一般而言比A組有較優(yōu)選的治療效應(yīng)，代表較高比例的低重量平均分子量透明質(zhì)酸有較優(yōu)選的治療效果。此結(jié)果支持本發(fā)明利用高重量平均分子量透明質(zhì)酸來補(bǔ)充低重量平均分子量透明質(zhì)酸以延長(zhǎng)治療效應(yīng)的概念。[0039]本發(fā)明利用大鼠磨擦鼻子來作為過敏癥狀的指標(biāo)及利用磨擦鼻子次數(shù)的減少來作為改善過敏的指標(biāo)。如圖6所示，結(jié)果顯示在第28天時(shí)，對(duì)照組(僅給予PBS)與透明質(zhì)酸組的結(jié)果具有顯著差異，代表過敏癥狀已被成功的誘發(fā)。雖然第30天時(shí)，結(jié)果并未有統(tǒng)計(jì)上顯著差異，但過敏癥狀在對(duì)照組與A組之間仍然有明顯的減少。因此，改善過敏癥狀的趨勢(shì)可借由給予本發(fā)明透明質(zhì)酸混合物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果高度證實(shí)。[0040]或許本發(fā)明的各個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有些許不同，然而需留意的是由本發(fā)明的概觀趨勢(shì)仍能推導(dǎo)出本發(fā)明的混合物具有改善包括過敏的粘膜相關(guān)病變或疾病的能力。本發(fā)明借由數(shù)個(gè)相關(guān)實(shí)驗(yàn)予以證實(shí)，而為了適當(dāng)?shù)娘@示結(jié)果，本發(fā)明采取較短的實(shí)驗(yàn)時(shí)間。因此在實(shí)際運(yùn)用本發(fā)明概念至動(dòng)物體或人體時(shí)，應(yīng)會(huì)需要比實(shí)驗(yàn)更長(zhǎng)的時(shí)間。基于理論及本發(fā)明的結(jié)果，高重量平均分子量透明質(zhì)酸應(yīng)足以對(duì)體內(nèi)低重量平均分子量透明質(zhì)酸的緊急治療效果提供長(zhǎng)期的輔助，及/或補(bǔ)償。[0041]本發(fā)明用于治療刺激性腸綜合癥(IBS)的優(yōu)選實(shí)施例是使用本發(fā)明的組合物作為結(jié)合藥物的佐劑，其中藥物包括抗過敏藥、鎮(zhèn)疫劑、止灣藥(antidiarrheal)、神經(jīng)組織崩解劑(neurolytic)、鎮(zhèn)定劑(transquilizer)、麻醉鎮(zhèn)痛劑(narcoticanalgesic)、抗憂郁劑(antidepressant)或血清素拮抗劑(serotoninantagonist)。[0042]口服劑型(例如腸溶衣錠，entericcoatingtablet)的優(yōu)選實(shí)施例中，腸溶衣在胃里提供較佳的抗溶解及抗消化的能力。直到抵達(dá)腸道及結(jié)腸時(shí)，腸溶包衣才會(huì)溶解使得透明質(zhì)酸混合物釋放出來形成結(jié)腸發(fā)炎部位(位于升結(jié)腸或橫結(jié)腸的部位)的保護(hù)膜。此目的是為了加速治愈發(fā)炎部位，并借由長(zhǎng)降解速度來延長(zhǎng)治療時(shí)間。[0043]栓劑的優(yōu)選實(shí)施例中，可將含透明質(zhì)酸混合物的栓劑投予至肛門，使得混合物可在直腸溶解并散布至結(jié)腸的其他部位(例如降結(jié)腸)，以在結(jié)腸發(fā)炎部位形成保護(hù)膜，而能達(dá)到加速治療及持續(xù)釋放的效果。[0044]灌注液(例如灌腸劑)的優(yōu)選實(shí)施例中，透明質(zhì)酸混合物在此為主要的活性成份并與賦形劑混合(例如PBS緩沖液)，可直接使用或?qū)⑸鲜鐾该髻|(zhì)酸混合物置于軟管中并注射于結(jié)腸。透明質(zhì)酸混合物將會(huì)灌注入結(jié)腸并擴(kuò)散至結(jié)腸的其他部位(例如降結(jié)腸)，以便形成一于結(jié)腸發(fā)炎部位的保護(hù)膜，進(jìn)而加速治療發(fā)炎部位，并達(dá)到持續(xù)釋放的效果。[0045]本發(fā)明接受治療的目標(biāo)的更優(yōu)選實(shí)施例為哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選的實(shí)施例的目標(biāo)為人類。`[0046]依照以上描述，混合至少兩種藥學(xué)上可接受的不同重量平均分子量的透明質(zhì)酸鹽類后，可達(dá)到快速覆蓋受傷或發(fā)炎表面，同時(shí)縮短治療周期及拉長(zhǎng)降解的時(shí)間以便延長(zhǎng)覆蓋的周期。因此，快速的治療及持續(xù)的釋放效應(yīng)將可同時(shí)達(dá)成。本發(fā)明提供一種較簡(jiǎn)單及安全的方法來治療前述病變或疾病，并可降成本以提供更佳的選擇來幫助相關(guān)病人。[0047]本發(fā)明所提供的僅為最優(yōu)選實(shí)施例，本【
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】技術(shù)人員一般而言皆可運(yùn)用本發(fā)明的構(gòu)想對(duì)本發(fā)明做出轉(zhuǎn)換、修飾及變化。然這些動(dòng)作的核心概念應(yīng)已由本發(fā)明所公開。因此，這些轉(zhuǎn)換、修飾及變化接落入本案申請(qǐng)專利范圍的范疇。本文所述以及附圖公開的皆用作例示說明而非限制?！緦＠綀D】【附圖說明】[0048]圖1是透明質(zhì)酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)式。[0049]圖2是借由凝膠透過層析儀顯示的透明質(zhì)酸滯留時(shí)間；其中縱軸代表在GPC里的滯留時(shí)間，橫軸代表透明質(zhì)酸在透明質(zhì)酸水解酶(HAase)溶液中的降解時(shí)間。[0050]圖3是借由GPC顯示的透明質(zhì)酸滯留時(shí)間，其中縱軸代表在GPC里的滯留時(shí)間，橫軸代表透明質(zhì)酸在人造胃酸(artificialgastricjuice)溶液中的降解時(shí)間。[0051]圖4是借由熒光指數(shù)展現(xiàn)的透明質(zhì)酸在正常及受傷結(jié)腸組織的附著性。[0052]圖5A是透明質(zhì)酸混合物在治療結(jié)腸炎的效果，其是在實(shí)驗(yàn)第I至9天由大鼠的平均體重來展示。[0053]圖5B是透明質(zhì)酸混合物在治療結(jié)腸炎的效果，其是在實(shí)驗(yàn)第I至14天由大鼠的平均體重來展示。[0054]圖6是借由卵白蛋白(IOiig/lOiU/鼻孔)誘發(fā)大鼠磨擦鼻子以觀察透明質(zhì)酸減少大鼠鼻子過敏的效果，第28天時(shí)，透明質(zhì)酸組及對(duì)照組間具有顯著差異Cp〈0.05)?！揪唧w實(shí)施方式】[0055]實(shí)施例1:透明質(zhì)酸于每毫升lU(U/ml)的透明質(zhì)酸水解酶(HAase)中的降解[0056]步驟:[0057]1.將0.25克聞重量平均分子量透明質(zhì)酸鈉粉末(標(biāo)不為HHA,聞重量平均分子量，分子量:2百萬道爾頓，購(gòu)自Freda)及0.25克低重量平均分子量透明質(zhì)酸鈉粉末(標(biāo)不為L(zhǎng)HA,低重量平均分子量,分子量:35萬道爾頓,購(gòu)自Freda)分別加入50毫升磷酸鹽緩沖液中，以形成濃度為0.5%的溶液，接著攪拌6小時(shí)直到粉末完全溶解。[0058]2.將0.05克LHA粉末及0.2克HHA粉末(比例為2:8，中間重量平均分子量，MHA)加進(jìn)50毫升PBS緩沖液中，接著攪拌6小時(shí)直到粉末完全溶解。[0059]3.凝膠透過層析儀(gelpermeationchromatograph,GPC)系統(tǒng)的移動(dòng)相溶液由下列方式制備:(I)將35.49克的磷酸氫二鈉(Na2HPO4)粉末加入450毫升的去離子蒸餾水(deionized-distilledwater,ddwater),在室溫中攪拌30分鐘后以形成0.5體積摩爾濃度(M)Na2HPO4溶液；⑵將18克NaH2PO4粉末加入250毫升的去離子蒸餾水，在室溫中攪拌30分鐘后以形成0.5MNaH2PO4溶液。[0060]4.將透明質(zhì)酸水解酶粉末于4°C加入磷酸鹽緩沖液中，以制備lU/ml透明質(zhì)酸水解酶。[0061]5.將2毫升透明質(zhì)酸樣本、I毫升10U/ml透明質(zhì)酸水解酶及7毫升磷酸鹽緩沖液混合加入于15毫升玻璃管中，劇烈振蕩3分鐘。[0062]6.將該玻璃管放在水浴槽中以50rpm的轉(zhuǎn)速搖晃。分別在15、30、45、60、75、90、105及120分鐘時(shí)各取I毫升的溶液，然后在上述時(shí)間點(diǎn)分別加入I毫升的透明質(zhì)酸水解酶。所述的每一個(gè)I毫升溶液是以0.45微米(ym)孔徑的濾膜過濾。取20微升(Ul)溶液注射入GPC系統(tǒng)中，然后記錄圖譜。[0063]7.GPC系統(tǒng)的狀態(tài)設(shè)定為:⑴管柱:2XGMPffxl(TSK-gel)；⑵移動(dòng)相流動(dòng)速度:每分鐘I毫升(ml/min)；(3)溫度:30°C。[0064]8.所有顯示的數(shù)值是指觀察的平均數(shù)。組織學(xué)指數(shù)(histologicalindex)是利用Studentt檢驗(yàn)(Student，st-test)分析。[0065]結(jié)果:[0066]圖2顯示GPC圖譜的透明質(zhì)酸滯留時(shí)間。縱軸代表在GPC中的滯留時(shí)間，水平軸代表在含有透明質(zhì)酸水解酶溶液中的透明質(zhì)酸的滯留時(shí)間。水平虛線從上到下分別代表200萬、100萬、35萬及1.7萬道爾頓分子量的透明質(zhì)酸滯留時(shí)間。隨著三種透明質(zhì)酸降解的增加，滯留時(shí)間也明顯地隨之增加。歷經(jīng)15分鐘的降解后，HHA及MHA的重量平均分子量降解至大約100萬道爾頓。歷經(jīng)37分鐘的降解后，HHA及MHA的重量平均分子量降解至大約35萬道爾頓。歷經(jīng)90分鐘的降解后，HHA、MHA及LHA的重量平均分子量降解至三者之間沒有明顯差異存在，且皆大于1.7萬道爾頓。[0067]實(shí)施例2:透明質(zhì)酸在0.1當(dāng)量濃度(N)的鹽酸(HCl)中的降解[0068]步驟:[0069]1.LHA,MHA及HHA的制備皆同于實(shí)施例1。[0070]2.GPC系統(tǒng)的移動(dòng)相溶液的制備同于實(shí)施例1。[0071]3.將5.72毫升的17.5NHCl及90毫升的去離子蒸餾水混合并攪拌10分鐘以制備人造胃液(0.1NHCl)作為儲(chǔ)備溶液。[0072]4.在15毫升玻璃管中，將2毫升的HHA、MHA及LHA分別與8毫升人造胃液混合并劇烈攪拌3分鐘。[0073]5.將該玻璃管放在水浴槽中，在37°C下以50rpm的轉(zhuǎn)速搖晃。分別在6、12、24及48小時(shí)各取I毫升的溶液，然后在上述時(shí)間點(diǎn)分別加入I毫升的人造胃液。以0.45微米孔徑的濾膜過濾每一個(gè)I毫升溶液。取20微升溶液注射入GPC系統(tǒng)中，然后記錄圖譜。[0074]6.所有顯示的數(shù)值是指觀察的平均數(shù)。組織學(xué)指數(shù)(histologicalindex)是利用Studentt檢驗(yàn)(Student，st-test)分析。[0075]結(jié)果:[0076]圖3顯示GPC圖譜的透明質(zhì)酸滯留時(shí)間。縱軸代表在GPC中的滯留時(shí)間，水平軸代表在含有人造胃液中的透明質(zhì)酸的滯留時(shí)間。水平虛線從上到下分別代表200萬、100萬、35萬及17萬道爾頓分子量的透明質(zhì)酸滯留時(shí)間。隨著三種透明質(zhì)酸降解的增加，滯留時(shí)間也緩慢地隨之增加。歷經(jīng)7小時(shí)的降解后，HHA及MHA的重量平均分子量降解至大約100萬道爾頓。歷經(jīng)31小時(shí)的降解后，MHA的重量平均分子量降解至大約35萬道爾頓。歷經(jīng)35小時(shí)的降解后，HHA的重量平均分子量也降解至大約35萬道爾頓。上述數(shù)據(jù)皆指出透明質(zhì)酸在人造胃液中是緩慢地降解，而HHA及MHA的重量平均分子量歷經(jīng)6小時(shí)的降解后皆大于100萬道爾頓，而HHA及MHA的重量平均分子量歷經(jīng)24小時(shí)的降解后皆大于35萬道爾頓。[0077]實(shí)施例3:透明質(zhì)酸在結(jié)腸組織的粘附性(透過第三版IVIS圖像系統(tǒng))[0078]步驟:[0079]1.LHA及HHA的制備如同實(shí)施例1。將MHA(分子量:100萬道爾頓，購(gòu)自Freda)加A50毫升的磷酸鹽緩沖液，然后攪拌6小時(shí)直到粉末完全溶解，以便接下來步驟的使用。[0080]2.熒光透明質(zhì)酸(HA-f)由下列方式制備:(1)將0.39克MES游離酸[2_(N_嗎啉)-乙橫酸(2-(N-morpholino)ethanesulfonicacid),購(gòu)自Calbiochem]溶解于100毫升的去離子蒸餾水中。(2)溶液A:將65毫克的胺基熒光(fluoresceinamine)粉末(異構(gòu)物I，購(gòu)自Fluka公司)溶于9毫升95%酒精溶液并避光攪拌10分鐘。(3)溶液B:將359暈克[N-(3-二甲胺基丙基)-N-乙基碳二酸亞胺氣化氧][N-(3-DimethyIaminopropyl)-N-ethylcarbodiimidehydrochloride,EDC](購(gòu)自Sigma)粉末溶于9毫升MES緩沖液，并攪拌10分鐘。(4)溶液C:216毫克N-羥基丁二酰亞胺(N-Hydroxysuccinimde，NHS)粉末(購(gòu)自Sigma)溶于9毫升MES緩沖液，并攪拌10分鐘。(5)將3毫升溶液A緩慢地滴A50毫升0.5%的透明質(zhì)酸溶液，并于避光下攪拌10分鐘。(6)將3毫升B溶液及5毫升C溶液分別滴入步驟(5)的溶液，并于避光下攪拌10分鐘。(7)將0.02MMES緩沖液緩慢地滴入步驟(6)的溶液直到體積達(dá)到100毫升，并于室溫并避光下攪拌24小時(shí)。(8)將反應(yīng)后的產(chǎn)物倒入透析管中(分子量:12000-14000)，以5公升的去離子蒸餾水作為透析液，并于4°C下避光攪拌5天，期間每12小時(shí)換一次透析液，直到透析液中沒有熒光為止。(9)透析后的液體以50毫升塑膠離心管分裝，接著保存在_20°C冰箱隔夜。之后在避光下以冷凍干燥機(jī)干燥。(10)干燥的HA-f粉末保存在-20°C冰箱。(11)將50毫克HA-f粉末緩慢地加入10毫升磷酸鹽緩沖液中，并攪拌6小時(shí)，直到粉末完全溶解。[0081]3.將7-8周大的史-道二氏大鼠(Sprague-Dawley,SD)的結(jié)腸組織切下后，以磷酸鹽緩沖液沖洗，再切成3-4公分長(zhǎng)，最后浸泡在磷酸鹽緩沖液中。[0082]4.受傷的結(jié)腸組織是以牙刷縱向刷20次制備，之后浸泡在磷酸鹽緩沖液中。[0083]5.將正常與受傷的結(jié)腸組織放入12孔培養(yǎng)盤中，每孔分別加入I毫升0.5%HA-f溶液，然后在室溫下?lián)u晃2小時(shí)。過多的HA-f溶液在2小時(shí)后以微吸管吸除，再浸泡至磷酸鹽緩沖液10分鐘后，移除磷酸鹽緩沖液。重復(fù)上述步驟三次。[0084]6.將干凈的結(jié)腸組織的襯膜組織(liningtissue)朝上放置在12孔培養(yǎng)盤中，然后放在IVIS(活體分子影像系統(tǒng)，invivoimagesystem,XEN0GEN公司)的平臺(tái)(dock)上。出廠參數(shù)是設(shè)定為綠突光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP),激發(fā)(excitation)波長(zhǎng)設(shè)定為465納米(nm),而發(fā)射(emission)波長(zhǎng)設(shè)定為500納米,影像再由軟件捕捉。[0085]7.所有顯示的數(shù)值是指觀察的平均數(shù)。組織學(xué)指數(shù)(histologicalindex)是利用Studentt檢驗(yàn)(Student，st-test)分析。[0086]結(jié)果:[0087]圖4顯示熒光指數(shù)的定量及排列結(jié)果。正常結(jié)腸組織的熒光指數(shù)定義為I。其他結(jié)腸組織再依據(jù)定義的數(shù)值作校準(zhǔn)。結(jié)果顯示相同重量平均分子量的透明質(zhì)酸，粘附在受傷的結(jié)腸組織明顯比在正常結(jié)腸組織多(P〈0.01)。比較三種不同重量平均分子量透明質(zhì)酸粘附在受傷結(jié)腸組織的結(jié)果后，被吸`收的35萬道爾頓透明質(zhì)酸的熒光指數(shù)明顯高過其他二種透明質(zhì)酸(200萬與100萬道爾頓)。甚至，不論在正?；蚴軅Y(jié)腸組織中，被吸收的100萬道爾頓透明質(zhì)酸的的熒光指數(shù)高過200萬道爾頓透明質(zhì)酸。[0088]實(shí)施例4:針對(duì)結(jié)腸炎給予或不給予透明質(zhì)酸的大鼠體重變化[0089]步驟:[0090]1.測(cè)試目的:為了評(píng)估以重量比例混合兩種不同重量平均分子量透明質(zhì)酸來治療或預(yù)防結(jié)腸炎的效果，以三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulfonicacid,TNBS)在無特定病原(specific-pathogen-free,SPF)等級(jí)的史-道二氏大鼠中誘發(fā)出結(jié)腸炎。[0091]2.測(cè)試樣本:IBD98，其包含低重量平均分子量(LMWHA)及高重量平均分子量(HMWHA)，其中HMWHA是200萬道爾頓透明質(zhì)酸，LMWHA是35萬道爾頓透明質(zhì)酸，混合比例為8:2(歸類為A組)及1:1(歸類為B組)。溶于磷酸鹽緩沖液中產(chǎn)生0.125%(w/v)濃度的透明質(zhì)酸溶液。[0092]3.方法:(1)測(cè)試目標(biāo):挑選8周大的大鼠，并將其分成三組:A組代表透明質(zhì)酸混合比例8:2;B組代表透明質(zhì)酸混合比例1:1;C組代表以磷酸鹽緩沖液代替透明質(zhì)酸的對(duì)照組。⑵動(dòng)物實(shí)驗(yàn):所有實(shí)驗(yàn)組(A、B組)的大鼠先使其空腹兩天。在實(shí)驗(yàn)第I天，大鼠麻醉后經(jīng)由直腸給予濃度為每毫升50毫克的I毫升三硝基苯磺酸。從第4至第14天，每天將A與B組的大鼠，經(jīng)由直腸分別投予I毫升的兩種IBD98。在第九天，觀察A與B組一半大鼠的體重。在第14天觀察另一半大鼠的體重變化。所有對(duì)照組的大鼠先使其空腹兩天。在實(shí)驗(yàn)第I天，大鼠麻醉后經(jīng)由直腸給予濃度為每毫升50毫克的I毫升三硝基苯磺酸。從第4至第14天，每天經(jīng)由直腸給予I毫升磷酸鹽緩沖液。在第九天，觀察C組一半大鼠的體重。在第14天觀察另一半大鼠的體重變化。[0093]結(jié)果:[0094]1.發(fā)炎指標(biāo):本發(fā)明利用平均體重的變化來觀察結(jié)腸炎(IBD)改善的結(jié)果。對(duì)于確認(rèn)治療結(jié)果而言，體重的變化是一種較方便且直接的指標(biāo)。[0095]2.觀察A組與B組的趨勢(shì)可發(fā)現(xiàn)，如圖5A及圖5B所示，從第I天至第14天代表發(fā)炎癥腸疾(IBD)的結(jié)腸炎，在兩組皆有緩和的結(jié)果。觀察對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的平均體重變化可發(fā)現(xiàn)，如圖5B所示，透過給予透明質(zhì)酸結(jié)腸炎的治療效果會(huì)使實(shí)驗(yàn)組的平均體重，在全部實(shí)驗(yàn)期間即使直到第14天，皆保持的比對(duì)照組的平均體重來得高。[0096]實(shí)施例5:透明質(zhì)酸對(duì)過敏性疾病的治療效果[0097]步驟:[0098]1.測(cè)試目的:在無特定病原等級(jí)的史-道二氏大鼠中誘導(dǎo)出過敏性疾病，在此為過敏性鼻炎。[0099]2.測(cè)試樣本:IBD98，其包含低重量平均分子量及高重量平均分子量，其中HMWHA是200萬道爾頓透明質(zhì)酸，LMffHA是35萬道爾頓透明質(zhì)酸，混合比例為1:1，溶于磷酸鹽緩沖液中產(chǎn)生0.125%(w/v)濃度的透明質(zhì)酸溶液。[0100]3.方法:⑴測(cè)試目標(biāo):挑選8周大的大鼠9只，隨機(jī)分類為二組:由4只大鼠組成的對(duì)照組(磷酸鹽緩沖液)及由5只大鼠組成的實(shí)驗(yàn)組(透明質(zhì)酸)。(2)動(dòng)物實(shí)驗(yàn):從實(shí)驗(yàn)第I天至第7天,每天通過腹腔內(nèi)注射(intra-peritoneally,IP)內(nèi)含I毫克卵白蛋白(ovalbumin)及10毫克明帆(alum)的生理鹽水。從第8天至第13天只做觀察。從第14天至第27天，每天將內(nèi)含卵白蛋白的鹽水)10ug/10uI/每個(gè)鼻孔)利用微量移液管(micropipette)滴入大鼠的兩側(cè)鼻孔。經(jīng)過誘發(fā)過敏的抗原反應(yīng)后，透明質(zhì)酸對(duì)鼻子上癥狀的治療效果分別在第28天及第30天做評(píng)估。在滴入卵白蛋白的I小時(shí)前，大鼠先滴入透明質(zhì)酸溶液或磷酸鹽緩沖液(25iil/每個(gè)鼻孔)。在內(nèi)含卵白蛋白的鹽水(IOiig/10iil/每個(gè)鼻孔)滴入兩側(cè)的鼻孔后，大鼠被放置在觀察籠里(I只大鼠/每籠)，且其30分鐘過程中磨擦鼻子的次數(shù)被計(jì)數(shù)。磨擦鼻子的頻率是以每30分鐘磨擦鼻子的次數(shù)計(jì)算。[0101]結(jié)果:[0102]1.過敏改善指標(biāo):本發(fā)明利用大鼠磨擦鼻子的次數(shù)來做為過敏癥狀改善的指標(biāo)。[0103]2.如圖6所示，透明質(zhì)酸樣本對(duì)于抗原誘發(fā)的鼻子癥狀的治療效果。因卵白蛋白所誘發(fā)的平均磨擦鼻子頻率，在第28天是56.25±16.1次/30分鐘，在第30天是70.0±41.3次/30分鐘。與對(duì)照組比較起來，實(shí)驗(yàn)組磨擦鼻子的頻率在第28天有統(tǒng)計(jì)意義的顯著減少，然而在第30天，仍然有明顯的減少?！緳?quán)利要求】1.一種用于治療或預(yù)防粘膜相關(guān)病變或疾病的組合物，其包含治療有效劑量的透明質(zhì)酸混合物，該透明質(zhì)酸混合物包含低重量平均分子量透明質(zhì)酸(LMWHA)及高重量平均分子量透明質(zhì)酸(HMWHA)，其中低重量平均分子量透明質(zhì)酸的重量平均分子量是介于5萬道爾頓至150萬道爾頓之間，高重量平均分子量透明質(zhì)酸的重量平均分子量是介于150萬道爾頓至500萬道爾頓之間，其中低重量平均分子量透明質(zhì)酸與高重量平均分子量透明質(zhì)酸的重量平均分子量之間間隔至少50萬道爾頓，同時(shí)低重量平均分子量透明質(zhì)酸與高重量平均分子量透明質(zhì)酸的重量混合比例為20:80至80:20。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中低重量平均分子量透明質(zhì)酸的重量平均分子量是介于10萬道爾頓至150萬道爾頓之間。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中低重量平均分子量透明質(zhì)酸的重量平均分子量是介于10萬道爾頓至50萬道爾頓之間。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中高重量平均分子量透明質(zhì)酸的重量平均分子量是介于150萬道爾頓至350萬道爾頓之間。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中高重量平均分子量透明質(zhì)酸的重量平均分子量是介于150萬道爾頓至250萬道爾頓之間。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中低重量平均分子量透明質(zhì)酸與高重量平均分子量透明質(zhì)酸的重量混合比例是1:1。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中該治療有效劑量是介于0.05毫克/毫升至50暈克/毫升之間。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中該治療有效劑量是介于0.05毫克/毫升至5毫克/毫升之間。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中粘膜相關(guān)病變或疾病的癥狀包含潰瘍、發(fā)炎、過敏反應(yīng)或流血。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中粘膜是眼睛的粘膜、耳朵的粘膜、鼻子的粘膜、口腔的粘膜、呼吸道的粘膜、腸胃道的粘膜、尿道的粘膜或生殖道的粘膜。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中粘膜相關(guān)病變或疾病是結(jié)膜炎、耳炎、過敏性鼻炎、牙齦炎、口腔潰瘍、支氣管炎、胃食管逆流癥、食道炎、胃炎、腸炎、消化性潰瘍、發(fā)炎性腸疾、刺激性腸綜合癥、尿道炎、膀胱炎或陰道炎。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中腸炎是急性腸炎、慢性腸炎、感染性腸炎、缺血性腸炎、放射性腸炎或藥物誘發(fā)的腸炎。13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中消化性潰瘍是胃潰瘍、十二指腸潰瘍、食道潰瘍或梅爾氏憩室潰瘍。14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中發(fā)炎性腸疾是克隆氏癥或潰瘍性結(jié)腸炎。15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中刺激性腸綜合癥是腹腔疾病、果糖吸收不良、溫和感染、諸如梨形鞭毛蟲癥的寄生蟲感染、慢性官能性便秘、腹瀉或慢性官能性腹痛。16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中該組合物進(jìn)一步包含賦形劑，該賦形劑是用于將組合物調(diào)配成適用于眼睛、耳朵、口腔、鼻子、呼吸道、腸胃道或局部使用的劑型。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其中適用于口腔的劑型是選自下列由固態(tài)劑型、溶液包括懸浮液、片劑包括緩釋型片劑及膠囊所組成的群組。18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其中適用于腸胃道的劑型是選自下列由固態(tài)劑型、灌注液、灌腸劑、栓劑及包括懸浮液的溶液所組成的群組。19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其中適用于局部使用的劑型是選自下列由灌注液、灌腸劑、栓劑、噴劑、吸入劑及點(diǎn)滴所組成的群組。20.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中該透明質(zhì)酸組合物是固態(tài)劑型且該治療有效劑量為每天50毫克至1000毫克的透明質(zhì)酸之間。21.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中過敏性鼻炎或支氣管炎是以該組合物作為佐劑結(jié)合藥物進(jìn)行治療，該藥物是抗組織胺藥、抗過敏藥、抗充血藥、類固醇或抗氣喘藥。22.根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其中腸炎是以該組合物作為佐劑結(jié)合藥物進(jìn)行治療，該藥物是抗生素或鎮(zhèn)痙藥。23.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其中消化性潰瘍是以該組合物作為佐劑結(jié)合藥物進(jìn)行治療，該藥物是凝血?jiǎng)?、抗生素、抗酸劑、H2阻斷劑、鉀氫離子泵阻斷劑、細(xì)胞保護(hù)劑或粘月吳保護(hù)劑。24.根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其中發(fā)炎性腸疾是以該組合物作為佐劑結(jié)合藥物進(jìn)行治療，該藥物是類固醇、免疫抑制劑、抗生素、5-胺柳酸及其衍生物或抗發(fā)炎藥。25.根據(jù)權(quán)利要求15所述的組合物，其中刺激性腸綜合癥是以該組合物作為佐劑結(jié)合藥物進(jìn)行治療，該藥物是抗過敏藥、鎮(zhèn)痙劑、止瀉藥、神經(jīng)組織崩解劑、鎮(zhèn)定劑、鎮(zhèn)痛劑、抗憂郁劑或血清素拮抗劑?！疚臋n編號(hào)】A61P37/00GK103702671SQ201280004393【公開日】2014年4月2日申請(qǐng)日期:2012年7月2日優(yōu)先權(quán)日:2011年7月12日【發(fā)明者】林世賢申請(qǐng)人:愛禾公司