專利名稱：含細(xì)胞的可流動(dòng)組合物的最小侵入性給藥的材料和方法
含細(xì)胞的可流動(dòng)組合物的最小侵入性給藥的材料和方法
本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2005年12月6日、申請(qǐng)?zhí)枮?00580042372. X、題為“含細(xì)胞的可流動(dòng)組合物的最小侵入性給藥的材料和方法”的專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
相關(guān)申請(qǐng)日期
根據(jù)美國(guó)法典35章節(jié)119(e)，2005年12月6日提交的本非臨時(shí)專利申請(qǐng)要求2004年12月8日提交的臨時(shí)專利申請(qǐng)U. S. S. N. 60/634, 155，2005年3月21日提交的臨時(shí)專利申請(qǐng)U. S. S. N. 60/663, 859，2005年5月19日提交的臨時(shí)專利申請(qǐng)U. S. S. N. 60/682，054，以及_提交的臨時(shí)專利申請(qǐng)U. S. S. N. 60/的優(yōu)先權(quán)；并且根據(jù)美國(guó)法典35章節(jié)120，363和/或365，要求與本申請(qǐng)同一天提交的共同待決的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US_(也稱作代理機(jī)構(gòu)案號(hào)ELV-002PC)，以及與本申請(qǐng)同一天提交的共同待決的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US_(也稱作代理機(jī)構(gòu)案號(hào)ELV-008PC)的優(yōu)先權(quán)；上述每一個(gè)專利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容均弓I入本文作為參考。
發(fā)明背景
心血管疾病每年在全世界造成超過(guò)5億人死亡，在美國(guó)造成I百萬(wàn)人死亡。在美國(guó)，每年大約完成150萬(wàn)次手術(shù)以試圖減輕因這些疾病自發(fā)引起的阻塞性動(dòng)脈病變。可提到的這些手術(shù)的幾個(gè)包括球囊血管成形術(shù)和激光血管成形術(shù)、斑塊旋切術(shù)、血管內(nèi)支架術(shù)和旁路移植術(shù)等。血管成形術(shù)、血管旁路移植術(shù)甚至器官移植術(shù)的長(zhǎng)期效果由于在這些程序之后促進(jìn)了動(dòng)脈病的發(fā)生而受到限制。內(nèi)膜完整性的缺失、閉塞性血栓癥及導(dǎo)致內(nèi)膜增生的平滑肌細(xì)胞痙攣、遷移和增殖是這類動(dòng)脈病的典型代表。例如，再狹窄導(dǎo)致這些患者中的20-50%發(fā)生阻塞性動(dòng)脈病變。在冠狀動(dòng)脈成形術(shù)后的3-6個(gè)月內(nèi)，超過(guò)三分之一的患者需要額外的介入術(shù)、另一次血管成形術(shù)甚至旁路手術(shù)。斑塊旋切術(shù)裝置也不佳，隨著接受這種手術(shù)的患者人數(shù)增加，再狹窄發(fā)生的比率從10%攀升到了 47%。血管內(nèi)支架的使用在這一點(diǎn)上同樣有些令人失望。近來(lái)的一項(xiàng)研究報(bào)道，在支架插入后的最初幾天內(nèi)，除大約5%的患者發(fā)生急性并發(fā)癥，如突然關(guān)閉外，再狹窄發(fā)生的比率為35%。
在接受血管旁路手術(shù)的患者中觀察到了類似的問(wèn)題。隱靜脈主動(dòng)脈-冠狀動(dòng)脈插入移植術(shù)的平均壽命僅為7年。所有這類移植物中有10%在手術(shù)后的最初幾周內(nèi)閉塞。在 I年和5年期間，分別有20%和30%的移植物發(fā)生閉塞。受同樣病理學(xué)支配的透析患者的動(dòng)靜脈瘺限制了血液透析的效果。
促進(jìn)的動(dòng)脈病如再狹窄的特點(diǎn)是大量的平滑肌細(xì)胞增殖以及由這些細(xì)胞產(chǎn)生的大量細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。目前已變得顯而易見(jiàn)的是，自體動(dòng)脈粥樣硬化和機(jī)械性介入術(shù)之后促進(jìn)的動(dòng)脈病之間共有一個(gè)共同的初始病理學(xué)事件，即，內(nèi)皮細(xì)胞完整性和功能的缺失。
內(nèi)皮單層沿著動(dòng)脈壁排列，并且作為血管生理的雙重生物調(diào)節(jié)者起作用。內(nèi)皮通過(guò)在循環(huán)血液和動(dòng)脈壁之間形成連續(xù)的、選擇性可滲透的非凝血酶原屏障，為血管提供結(jié)構(gòu)的完整性。然而，已逐漸認(rèn)識(shí)到的是，內(nèi)皮也產(chǎn)生和供給能控制血流量、血管松緊狀態(tài) (vessel tone)、閉塞性血栓癥、血小板活化、粘附和聚集、白細(xì)胞粘附、單核細(xì)胞滲透及平滑肌細(xì)胞遷移和增殖的產(chǎn)物。由于平滑肌細(xì)胞有絲分裂原普遍存在于動(dòng)脈壁中，是完整內(nèi)皮的存在使正常血管維持在了靜止?fàn)顟B(tài)。在內(nèi)皮受損或移除后，由內(nèi)皮分泌的化合物也同樣地被移除，并開(kāi)始發(fā)生一系列事件，從而導(dǎo)致了失控的平滑肌細(xì)胞增殖和遷移引發(fā)的阻塞性動(dòng)脈病變。
目前用于治療心血管疾病的許多臨床介入術(shù)，包括冠狀動(dòng)脈成形術(shù)、冠狀動(dòng)脈內(nèi)支架置入術(shù)和斑塊旋切術(shù)，可以采用非侵入性閉合性手術(shù)方法完成。這些非侵入性血管內(nèi)介入術(shù)策略應(yīng)該伴有同樣具有最小侵入性的遞送治療性材料至血管介入部位以治療因此受損或患病的靶內(nèi)皮的血管內(nèi)模式。
此外，目前向血管內(nèi)遞送治療性材料的方法依賴于將材料施于血管的內(nèi)腔表面。 然而，由于與循環(huán)血液的接觸限制了活性的效力和持續(xù)時(shí)間，向內(nèi)腔表面施予治療性材料或試劑僅能對(duì)受損或患病靶內(nèi)皮提供暫時(shí)的效果。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供向位于受損或患病內(nèi)腔內(nèi)皮部位，或與該部位相鄰，或在該部位附近的腔外或血管周圍部位非侵入性地或者最小侵入性地遞送細(xì)胞治療性制劑， 并隨之減少閉塞性血栓癥、再狹窄、內(nèi)膜增生及其它與血管介入或心血管疾病相關(guān)的臨床后遺癥的發(fā)生的材料和方法。
發(fā)明概述
本發(fā)明利用了這樣的發(fā)現(xiàn)移植于可植入性可流動(dòng)組合物之中、之上或之內(nèi)的細(xì)胞可以設(shè)計(jì)用于多種最小侵入性遞送模式，例如，在管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)腔外表面，或在該外表面的相鄰位置，或在該外表面附近進(jìn)行血管內(nèi)給藥和血管周圍沉積，所述的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)例如但不限于血管。在管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)的外表面，或外表面之上，或外表面周圍的最小侵入性遞送也包括在本發(fā)明中。在血管的情況下，本發(fā)明的材料和方法適于治療和控制與血管介入或心血管疾病相關(guān)的臨床后遺癥。
一方面，本發(fā)明是治療管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)內(nèi)腔的受損或患病部位的可流動(dòng)組合物， 其中的可流動(dòng)組合物包括生物相容性基質(zhì)和細(xì)胞，并且其中的可流動(dòng)組合物的量是可以有效治療受損或患病部位的量。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)是血管。根據(jù)一些實(shí)施方案，可流動(dòng)組合物以有效減少受損或患病部位的例如平滑肌細(xì)胞增殖、閉塞性血栓癥、內(nèi)膜增生、再狹窄、急性或慢性炎癥或血管舒張等的量提供。對(duì)于本發(fā)明的目的，可流動(dòng)組合物是指可以用注入或注入型遞送裝置例如但不限于針、注射器或?qū)Ч苁┯璧慕M合物。其它采用擠壓、噴射或排出的遞送裝置也包括在本發(fā)明中。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，可流動(dòng)組合物的細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞或具有內(nèi)皮細(xì)胞樣表型的細(xì)胞。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，所述細(xì)胞是兩種或兩種以上細(xì)胞類型的共培養(yǎng)物。這兩種或兩種以上細(xì)胞類型選自內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞和心肌細(xì)胞。適用于本發(fā)明的細(xì)胞制品可以獲自單一供體或者多個(gè)供體。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，生物相容性基質(zhì)是凝膠、泡沫或懸浮液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物相容性基質(zhì)包括微粒或微載體。在某些實(shí)施方案中，微?；蛭⑤d體進(jìn)一步包括明膠、膠原蛋白、纖連蛋白、纖維蛋白、層粘連蛋白或附著肽。一個(gè)例示性的附著肽是序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的肽。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，微粒或微載體的直徑為約20微米至約500微米，優(yōu)選直徑為約200微米。
在另一個(gè)實(shí)施 方案中，可流動(dòng)組合物進(jìn)一步包括載體流體。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，可流動(dòng)組合物是形狀保持不變的，從而允許從業(yè)者在必要的程度上控制向指定的特定沉積部位的沉積。
另一方面，本發(fā)明是治療管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)內(nèi)腔的受損或患病部位的方法。該方法包括使位于管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)內(nèi)腔的受損或患病部位，或與該部位相鄰，或在該部位附近的管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)的腔外表面與可流動(dòng)組合物接觸的步驟。本文中的非腔(也稱作腔外)表面可以是血管的外表面或血管周圍的表面。對(duì)于本發(fā)明的目的，非腔或腔外部位是除了腔的內(nèi)表面之外的任何部位。在血管的情況下，例如，腔外或外腔部位可以在血管的外膜、中膜或內(nèi)膜中；在非血管管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)的情況下，相應(yīng)的非腔部位都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，通過(guò)穿過(guò)或透過(guò)管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)的內(nèi)壁，然后在位于受損或患病部位，或與該部位相鄰，或在該部位附近的管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)的外表面沉積可流動(dòng)組合物來(lái)完成遞送。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本方法進(jìn)一步包括在管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)的腔外表面鑒定沉積可流動(dòng)組合物的部位的步驟。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，該鑒定步驟發(fā)生在該穿過(guò)或透過(guò)步驟之前，或者與該穿過(guò)或透過(guò)步驟同時(shí)發(fā)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，該鑒定步驟通過(guò)成像完成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該鑒定步驟通過(guò)觸診完成。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)經(jīng)經(jīng)皮給藥進(jìn)入血管周隙，然后在受損或患病部位，或與該部位相鄰，或在該部位附近的管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)的外表面上沉積可流動(dòng)組合物來(lái)完成遞送。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，該方法進(jìn)一步包括在管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)的外表面鑒定沉積可流動(dòng)組合物的部位的步驟。該鑒定步驟可以發(fā)生在該進(jìn)入步驟之前，或者與該進(jìn)入步驟同時(shí)發(fā)生。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，該鑒定步驟通過(guò)成像完成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該鑒定步驟通過(guò)觸診完成。
根據(jù)本方法的各種實(shí)施方案，管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)的外表面是非腔表面或者占據(jù)在本文別處所述的血管周隙。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)是血管。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，血管包括支架。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，被治療的管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)是非血管結(jié)構(gòu)，例如但不限于輸卵管。
附圖簡(jiǎn)述


圖1是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)例證性實(shí)施方案的典型細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
發(fā)明詳述
正如本文所解釋的那樣，本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)基于細(xì)胞的療法可以用于治療、 緩解、控制和/或減少與血管介入或心血管疾病相關(guān)的臨床后遺癥，尤其是閉塞性血栓癥、 再狹窄、內(nèi)膜增生、炎癥和血管舒張的進(jìn)展。本發(fā)明進(jìn)一步受益于另一發(fā)現(xiàn)，即，迄今為止尚無(wú)記載的可流動(dòng)組合物，例如微粒制劑，能提供鋪滿的活力充足的細(xì)胞群，該組合物包括移植于生物相容性基質(zhì)例如可植入性微粒材料之中、之上或之內(nèi)的細(xì)胞，并且該組合物可以采用最小侵入性給藥模式例如閉合性程序中的血管內(nèi)遞送或局部經(jīng)皮遞送有效給藥，而不降低臨床效果或者可植入性可流動(dòng)組合物的移植細(xì)胞的存活率。下面列出的教示對(duì)制造和使用本發(fā)明的材料和方法提供了充分的指導(dǎo)，并進(jìn)一步對(duì)確定適當(dāng)?shù)挠糜跍y(cè)試、測(cè)量和監(jiān)控本發(fā)明的材料和方法的性能的標(biāo)準(zhǔn)和受試者提供了充分的指導(dǎo)。
因此，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出來(lái)用于臨床上控制血管介入或心血管疾病的基于細(xì)胞的療法。 本發(fā)明的例示性實(shí)施方案包括適用于本文所述治療范例的生物相容性基質(zhì)和細(xì)胞。尤其是，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，可植入性可流動(dòng)組合物包括生物相容性基質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮樣細(xì)胞 。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，可植入性可流動(dòng)組合物包括內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮樣細(xì)胞， 優(yōu)選人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和微粒型生物相容性基質(zhì)。
本發(fā)明的可植入性可流動(dòng)組合物包括移植于生物相容性基質(zhì)之上、之中和/或之內(nèi)的細(xì)胞。移植的意思是指經(jīng)細(xì)胞對(duì)細(xì)胞和/或細(xì)胞對(duì)基質(zhì)的相互作用牢固地附著，以使細(xì)胞能承受住本文公開(kāi)的制備性操作的苛刻條件。如本文別處解釋的那樣，可植入性可流動(dòng)組合物的一個(gè)有效實(shí)施方案包括具有優(yōu)選表型的近鋪滿細(xì)胞群、鋪滿細(xì)胞群或鋪滿后細(xì)胞群。理所當(dāng)然的是，在制備性操作期間，可植入性可流動(dòng)組合物的實(shí)施方案很可能脫落細(xì)胞和/或某些細(xì)胞不象其它細(xì)胞那樣牢固地附著。所有必需的條件是，可植入性可流動(dòng)組合物包括的細(xì)胞應(yīng)符合本文所述功能或表型的標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明的可植入性可流動(dòng)組合物根據(jù)組織工程學(xué)原理開(kāi)發(fā)，并代表了滿足上述臨床需求的新方法。本發(fā)明的可植入性可流動(dòng)組合物的獨(dú)特之處在于，移植于生物相容性基質(zhì)之上、之中和/或之內(nèi)的活細(xì)胞可以在生理反饋控制下向管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)提供處于生理比例的基于多種細(xì)胞的產(chǎn)物。如本文別處所述的那樣，適用于可植入性可流動(dòng)組合物的細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮樣細(xì)胞。由這些細(xì)胞進(jìn)行的多種化合物的局部遞送及生理動(dòng)力學(xué)給藥對(duì)負(fù)責(zé)維持功能性腔內(nèi)皮的過(guò)程提供了更有效的調(diào)節(jié)。重要的是，例如本發(fā)明的可植入性可流動(dòng)組合物中的內(nèi)皮細(xì)胞由于其優(yōu)選置于非腔或腔外部位而避免了血管內(nèi)腔中的侵蝕性血流的破壞。
當(dāng)本發(fā)明的可植入性可流動(dòng)組合物以包裹、沉積或其它方式與位于受損或患病靶腔，或與該靶腔相鄰，或在該靶腔附近的腔外或非腔部位接觸時(shí)，其用于重建內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。 即當(dāng)腔外給藥時(shí)，本發(fā)明的可植入性可流動(dòng)組合物可以提供模擬支持性生理環(huán)境，并有助于促進(jìn)功能性內(nèi)腔的生長(zhǎng)。如本文預(yù)期的那樣，管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)是具有內(nèi)腔表面和腔外表面的結(jié)構(gòu)。在某些結(jié)構(gòu)中，內(nèi)腔表面是內(nèi)皮細(xì)胞層；在另外一些結(jié)構(gòu)中，內(nèi)腔表面是非內(nèi)皮細(xì)胞層。此外，對(duì)于本發(fā)明的目的，如本文別處描述的那樣，腔外或非腔表面可以是但不限于是管狀結(jié)構(gòu)的外表面。
例如，內(nèi)皮細(xì)胞可以釋放多種試劑，這些試劑聯(lián)合起來(lái)可以抑制或緩解與血管介入或心血管疾病后的急性并發(fā)癥相關(guān)的不良生理事件。如本文例示的那樣，重演正常生理的組合物和使用方法以及給藥可以增強(qiáng)內(nèi)皮的功能性，并提高該腔內(nèi)皮的長(zhǎng)期通暢率。通常地，治療包括在受損或患病靶內(nèi)皮處，或在該靶內(nèi)皮相鄰位置，或在該靶內(nèi)皮附近，例如， 在目標(biāo)血管結(jié)構(gòu)腔外面的血管周隙沉積本 發(fā)明的可植入性可流動(dòng)組合物。當(dāng)沉積或以其它方式接觸受損、受創(chuàng)或患病血管時(shí)，可植入性可流動(dòng)組合物的細(xì)胞可以向目標(biāo)血管結(jié)構(gòu)，例如血管內(nèi)的底層平滑肌細(xì)胞提高生長(zhǎng)調(diào)節(jié)性化合物。雖然在血管外面，但本發(fā)明的可植入性可流動(dòng)組合物提供了來(lái)自于細(xì)胞的多種調(diào)節(jié)性化合物的有效供應(yīng)，同時(shí)卻避免了產(chǎn)生血管內(nèi)腔中的血流的機(jī)械作用。
用本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案治療受損或患病血管可以促進(jìn)正?；蚪；謴?fù)和正常生理。相比之下，在缺乏用本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案治療的情況下，正常生理的恢復(fù)受到破壞，例如，在血管介入或心血管疾病之后，自體內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞可以以極快或失控的速度異常生長(zhǎng)。因此，如本文預(yù)期的那樣，采用本發(fā)明的可植入性可流動(dòng)組合物的治療將產(chǎn)生血管介入或心血管疾病部位的自體組織的正?；蚪；謴?fù),例如,足以維持正?；蚪Ｑ芡〞陈省?br> 本發(fā)明的可植入性可流動(dòng)組合物可以以多種構(gòu)型置于被治療血管結(jié)構(gòu)中。血管可以全部或部分接觸；例如，本發(fā)明的可植入性可流動(dòng)組合物可以沿圓周方向或以弧形應(yīng)用于血管。血管僅需要與一定量的足以改善血管結(jié)構(gòu)的功能性的可植入性可流動(dòng)組合物接觸。
對(duì)于本發(fā)明的目的，接觸是指直接或間接地如與本文別處所定義的腔外或非腔表面相互作用。在某些優(yōu)選實(shí)施方案的情況下，實(shí)際的物理接觸不是效力所必需的。在其它實(shí)施方案中，實(shí)際的物理接觸是優(yōu)選的。所有實(shí)施本發(fā)明所必需的條件是，在受損或患病部位，或在該部位的相鄰位置，或在該部位的附近的腔外或非腔部位沉積可以有效治療受損或患病部位的量的可植入性材料。在某些疾病或損傷的情況下，患病或受損部位可以在臨床上表現(xiàn)于內(nèi)腔表面。在其它疾病或損傷的情況下，患病或受損部位可以在臨床上表現(xiàn)于腔外或非腔表面。在一些疾病或損傷中，患病或受損部位可以在臨床上表現(xiàn)于內(nèi)腔表面和腔外或非腔表面。本發(fā)明可以有效治療任何一種前述臨床表現(xiàn)。
本發(fā)明的可植入性可流動(dòng)組合物的實(shí)施方案可以應(yīng)用于任何需要介入治療以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)。如本文預(yù)期的那樣，管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)是具有內(nèi)腔表面和腔外或非腔表面的結(jié)構(gòu)。對(duì)于本發(fā)明的目的，腔外表面可以是但不限于管狀結(jié)構(gòu)的外表面。 在某些管狀結(jié)構(gòu)中，內(nèi)腔表面是內(nèi)皮細(xì)胞層；在某些其它結(jié)構(gòu)中，內(nèi)腔表面是非內(nèi)皮細(xì)胞層。本發(fā)明可以有效治療襯有內(nèi)皮細(xì)胞或襯有非內(nèi)皮細(xì)胞的管狀結(jié)構(gòu)。
管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)包括血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、胃腸道系統(tǒng)、肺系、呼吸系統(tǒng)以及腦和脊髓的腦室系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)。管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)的代表性例子包括動(dòng)脈和靜脈、淚管、氣管、支氣管、細(xì)支氣管、鼻道(包括鼻竇)及其它氣道、咽鼓管、外耳道、□腔、食道、胃、十二指腸、小腸、大腸、膽道、輸尿管、膀胱、尿道、輸卵管、子宮、陰道及其它女性生殖道的通道、輸精管及其它男性生殖道的通道、血管鞘以及腦和脊髓的腦室系統(tǒng)(腦脊液)。對(duì)于本發(fā)明的目的，管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)可以是天然或非天然的，例如但不限于手術(shù)產(chǎn)生的吻合口。
受損或患病內(nèi)皮在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，可以用本發(fā)明治療的導(dǎo)致血管損傷的血管介入包括但不限于血管成形術(shù)、斑塊旋切術(shù)、血管支架(包括裸金屬支架和藥物洗脫支架)、血管旁路手術(shù)(包括動(dòng)脈旁路移植術(shù)和外周動(dòng)脈旁路移植術(shù))、器官移植、動(dòng)靜脈瘺及其它血管吻合口形成術(shù)、動(dòng)靜脈、外周及其它移植成形術(shù)，以及隨后發(fā)生的血管入口相關(guān)損傷，包括進(jìn)入血管透析期間獲得的針刺傷或其它介入治療。每種介入均對(duì)血管腔的內(nèi)皮細(xì)胞襯里產(chǎn)生一定程度的損傷。反之，受損血管腔經(jīng)歷級(jí)聯(lián)生化事件，從而導(dǎo)致多種臨床可鑒定的后遺癥，包括但不限于閉塞性血栓癥、再狹窄、內(nèi)膜增生、急性和慢性炎癥、平滑肌細(xì)胞增殖、血管重塑、血管舒張和易損斑塊病變的形成。
血栓癥或閉塞性血栓癥與血小板的粘附、聚集和機(jī)化有關(guān)；閉塞性血栓癥通常與機(jī)化血栓相關(guān)。血栓癥的特征在于血栓區(qū)域中的血流缺失。內(nèi)皮或內(nèi)皮樣細(xì)胞釋放的抗血栓化合物包括，但不限于硫酸乙酰肝素蛋白多糖、前列環(huán)素和一氧化氮。用本發(fā)明的可植入性可流動(dòng)組合物治療可以提高被治療血管的通暢率。
狹窄、再狹窄、內(nèi)膜增·生和平滑肌細(xì)胞增殖的特征在于與平滑肌細(xì)胞在腔內(nèi)旺盛生長(zhǎng)相關(guān)的血管腔的阻塞性病變。內(nèi)皮或內(nèi)皮樣細(xì)胞向腔區(qū)域內(nèi)釋放抑制平滑肌細(xì)胞增殖的化合物。例示性的由內(nèi)皮或內(nèi)皮樣細(xì)胞產(chǎn)生的治療性化合物包括，但不限于硫酸乙酰肝素、TGF-β和一氧化氮。狹窄、再狹窄、內(nèi)膜增生和平滑肌細(xì)胞增殖通過(guò)例如血管造影術(shù)、 血管內(nèi)超聲或其它超聲技術(shù)鑒定。用本發(fā)明的可植入性可流動(dòng)組合物治療可以減小狹窄百分率、閉塞程度和/或提高與被治療血管相關(guān)的通暢率。
炎癥與炎癥細(xì)胞的募集、粘附和滲透有關(guān)，炎癥細(xì)胞包括但不限于粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。此外，血管通透性的增加導(dǎo)致體液、免疫球蛋白、補(bǔ)體及其它血液蛋白在損傷部位的鄰近組織中的局部積聚，其反過(guò)來(lái)誘導(dǎo)與循環(huán)單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的表面結(jié)合的粘附分子的表達(dá)，大大增加噬菌細(xì)胞遷移穿過(guò)腔表面并進(jìn)入鄰近組織的速度?；罨?，這些細(xì)胞可以釋放水解酶、細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子。在炎癥的慢性進(jìn)展期，受損部位變成有纖維帽包被的，該纖維帽覆蓋在脂核和壞死組織上。內(nèi)皮或內(nèi)皮樣細(xì)胞向腔區(qū)域內(nèi)釋放可以減少炎癥反應(yīng)的抗炎化合物。用本發(fā)明的可植入性可流動(dòng)組合物治療可以抑制炎癥細(xì)胞的活性和/或積聚，因此減少了生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生和分泌，并減少了巨噬細(xì)胞的局部血管滲透，從而預(yù)防、減少或緩解血管損傷部位的急性炎癥反應(yīng)。急性炎癥反應(yīng)的緩解或預(yù)防可以中斷導(dǎo)致慢性炎癥的事件，從而使最終的腔損害和/或血管功能障礙最小化。另外，慢性發(fā)炎組織的緩解或康復(fù)可以減低長(zhǎng)期風(fēng)險(xiǎn)例如血管疾病(包括但不限于易損斑塊或動(dòng)脈粥樣硬化)發(fā)作的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)血管疾病的進(jìn)一步討論公開(kāi)于與本申請(qǐng)同一天提交的共同待決的申請(qǐng)PCT/US_(代理機(jī)構(gòu)案號(hào)ELV-008PC)中，其全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考，所述血管疾病包括但不限于易損斑塊和動(dòng)脈粥樣硬化。
此外，可以用本發(fā)明治療的自發(fā)性心血管疾病包括但不限于如急性和慢性炎癥、 閉塞性血栓癥、內(nèi)膜增生、再狹窄、平滑肌細(xì)胞增殖、血管舒張、負(fù)性血管重塑、血管結(jié)構(gòu)腔內(nèi)的易損斑塊病變以及各種不穩(wěn)定性動(dòng)脈綜合征等。其它可以用本發(fā)明治療的易損血管病癥包括任何與需求量相比血液供應(yīng)量不足的局部缺血、氧不足或損傷狀態(tài)。易損血管病癥可以由任何負(fù)性影響血液供應(yīng)的損傷或修復(fù)產(chǎn)生。例示性的易損病癥包括不穩(wěn)定性動(dòng)脈綜合征，例如局部缺血、不穩(wěn)定性心絞痛(包括范圍從運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)型心絞痛到靜息型心絞痛的不穩(wěn)定性范圍)、主動(dòng)脈缺血、外周缺血(包括范圍從間歇性跛行到壞疽的病癥范圍)、腸缺血和腎缺血等。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，在第一次血管介入，例如血管成形術(shù)、支架置入術(shù)或吻合術(shù)的同時(shí)采用本發(fā)明的可植入性可流動(dòng)組合物治療受損或患病靶內(nèi)皮。這種治療可以減小由血管介入導(dǎo)致的損傷，例如血管成形術(shù)導(dǎo)致的內(nèi)皮裸露。根據(jù)其它實(shí)施方案，可植入性可流動(dòng)組合物被施用于拯救血管介入之后受損或患病的靶內(nèi)皮以及與介入相關(guān)的臨床動(dòng)脈病，包括但不限于例如再狹窄或閉塞性血栓癥的發(fā)展。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，在給予可植入性可流動(dòng)組合物之前、同時(shí)和/或之后給予了額外的治療劑。例如，可以給予預(yù)防或減少血液凝塊形成、血小板聚集或其它類似阻塞物的試劑。例示性的試劑包括，例如硫酸乙酰肝素和TGF-β。根據(jù)植入的適應(yīng)癥，還可以向可植入性可流動(dòng)組合物中加入其它細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子，包括促進(jìn)再內(nèi)皮化的VEGF 以及促進(jìn)血管完整的b-FGF。其它類型的治療劑包括但不限于抗增殖劑和抗腫瘤劑。例子包括雷帕霉素、紫杉醇和E2F Decoy試劑。任何前述試劑均可以局部或全身給藥；如果為局部給藥，某些試劑可以包含在可植入性可流動(dòng)組合物內(nèi)。
細(xì)胞來(lái)源:如本文描述的那樣，本發(fā)明的可植入性可流動(dòng)組合物包括細(xì)胞。細(xì)胞可以是同種異體的、異種的或自體的。在某些實(shí)施方案中，活細(xì)胞的來(lái)源可以得自適當(dāng)?shù)墓w或多個(gè)供體。在某些其它實(shí)施方案中，細(xì)胞的來(lái)源可以得自尸體或細(xì)胞庫(kù)。
在一個(gè)目前優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞。在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中， 這些內(nèi)皮細(xì)胞獲自血管組織，優(yōu)選但不限于動(dòng)脈組織。如下文例示的那樣，一種適 用的血管內(nèi)皮細(xì)胞類型是主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。另一種適用的血管內(nèi)皮細(xì)胞類型是臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。又一種適用的血管內(nèi)皮細(xì)胞類型是冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。其它適用于本發(fā)明的血管內(nèi)皮細(xì)胞類型包括肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和髂動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。
在另一個(gè)目前優(yōu)選的實(shí)施方案中，適宜的內(nèi)皮細(xì)胞可以獲自非血管組織。非血管組織可以得自任何本文別處所述的管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)，或者可以得自任何非血管組織或器官。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，內(nèi)皮細(xì)胞可以得自內(nèi)皮祖細(xì)胞或干細(xì)胞；在另一個(gè)實(shí)施方案中，內(nèi)皮細(xì)胞通?？梢缘米宰婕?xì)胞或干細(xì)胞。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞可以是得自血管或非血管組織或器官的同種異體、異種或自體的非內(nèi)皮細(xì)胞。本發(fā)明還包括前述經(jīng)基因改造、基因修飾或基因工程制造的任何細(xì)胞。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，將兩種或兩種以上類型的細(xì)胞共培養(yǎng)，以制備本發(fā)明的組合物。例如，將第一種細(xì)胞導(dǎo)入生物相容性可植入性材料中，并培養(yǎng)至鋪滿。第一種細(xì)胞類型包括，例如平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的組合、其它任何需要的適于產(chǎn)生有助于內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境的細(xì)胞類型或需要的細(xì)胞類型的組合。一旦第一種細(xì)胞類型達(dá)到鋪滿狀態(tài)，則將第二種細(xì)胞類型接種在位于生物相容性可植入性材料之中、之上或之內(nèi)的第一種鋪滿細(xì)胞類型上，并培養(yǎng)至第一種細(xì)胞類型和第二種細(xì)胞類型均達(dá)到鋪滿狀態(tài)。第二種細(xì)胞類型包括，例如內(nèi)皮細(xì)胞或其它任何需要的細(xì)胞類型或細(xì)胞類型的組合。第一和第二種細(xì)胞類型可能包括得自兩個(gè)或兩個(gè)以上不同供體或來(lái)源的相同的細(xì)胞類型。第一和第二種細(xì)胞類型可以逐步導(dǎo)入，或者作為單一的混合物導(dǎo)入。也可以改變細(xì)胞的密度，從而對(duì)于AV移植將平滑肌細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的比例變?yōu)榧s2:1，對(duì)于外周旁路術(shù)將比例變?yōu)榧s1:1，或者其它適合其它臨床應(yīng)用的比例。
為預(yù)防有過(guò)度增殖傾向的平滑肌細(xì)胞或其它細(xì)胞類型的過(guò)度增殖，可以修改培養(yǎng)程序。例如，在第一種細(xì)胞類型鋪滿之后，在導(dǎo)入第二種細(xì)胞類型之前，可以先將培養(yǎng)物用適于第二種細(xì)胞類型的附著因子覆蓋。例示性的附著因子包括用明膠覆蓋培養(yǎng)物，以提高內(nèi)皮細(xì)胞的附著性。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，在第二種細(xì)胞類型培養(yǎng)期間，向培養(yǎng)基中加入肝素可以減少第一種細(xì)胞類型的增殖，并優(yōu)化需要的第一種細(xì)胞類型與第二種細(xì)胞類型的比例。例如，在平滑肌細(xì)胞初始生長(zhǎng)之后，可以給予肝素以控制平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而達(dá)到較大的內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)平滑肌細(xì)胞的比例。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，首先通過(guò)將平滑肌細(xì)胞接種至生物相容性基質(zhì)以產(chǎn)生血管結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生共培養(yǎng)物。一旦平滑肌細(xì)胞達(dá)到鋪滿狀態(tài)，則將內(nèi)皮細(xì)胞接種于可植入性材料上培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞上，以產(chǎn)生模擬血管。該實(shí)施方案可以根據(jù)本文所述方法施用于例如AV移植或外周旁路移植，以促進(jìn)假體移植材料的整合。
所有本發(fā)明的組合物的細(xì)胞所必需的條件是顯示一種或多種優(yōu)選表型或功能特性。如本文前面描述的那樣，本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)具有易鑒定表型的細(xì)胞當(dāng)與優(yōu)選生物相容性基質(zhì)(在本文別處描述)聯(lián)合時(shí)，其可以促進(jìn)、修復(fù)和/或以其它方式調(diào)節(jié)與治療受損或患病靶血管內(nèi)皮或另一管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)的受損或患病靶腔相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞生理和/ 或腔內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。
對(duì)于本發(fā)明的目的，本發(fā)明的一種優(yōu)選易鑒定的典型細(xì)胞表型是通過(guò)下文所述體外分析法測(cè)量，能抑制或以其它方式干擾平滑肌細(xì)胞增殖的表型。本文稱之為抑制性表型。
由本發(fā)明的組合物的細(xì)胞顯示的其它易鑒定表型是抗血栓或能抑制血小板粘附和聚集的表型。抗血栓活性可以用下文所述體外硫酸乙酰肝素分析法和/或體外血小板聚集分析法測(cè)定。
在本發(fā)明的典型有效實(shí)施方案中，細(xì)胞需要顯示的表型不超過(guò)前述表型中的一種。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞可以顯示一種以上前述表型。
雖然前述表型各自代表一種功能性內(nèi)皮細(xì)胞，例如但不限于血管內(nèi)皮細(xì)胞，但顯示這種(這些)表型的非內(nèi)皮細(xì)胞從本發(fā)明的目的考慮，認(rèn)為是內(nèi)皮樣細(xì)胞，因此適用于本發(fā)明。本文也將內(nèi)皮樣細(xì)胞稱作內(nèi)皮細(xì)胞的功能性類似物，或內(nèi)皮細(xì)胞的功能性模擬物。因此，僅為舉例說(shuō)明目的，適用于本文中公開(kāi)的材料和方法的細(xì)胞還包括產(chǎn)生內(nèi)皮樣細(xì)胞的干細(xì)胞或祖細(xì)胞；起源為非內(nèi)皮細(xì)胞但在功能表現(xiàn)上類似于經(jīng)本文所述參數(shù)判定的內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞；任何起源的經(jīng)工程改造或以其它方式修飾后，經(jīng)本文所述參數(shù)判定具有內(nèi)皮樣功能性的細(xì)胞。
通常地,當(dāng)存在于鋪滿、近鋪滿或鋪滿后細(xì)胞群,并與優(yōu)選生物相容性基質(zhì)如本文所述的那些聯(lián)合時(shí)，本發(fā)明的細(xì)胞顯示出一種或多種上述表型。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解的是，鋪滿、近鋪滿或鋪滿后細(xì)胞群可以通過(guò)多種技術(shù)容易地鑒定，其中最常用并被廣泛公認(rèn)的技術(shù)是直接顯微觀察。其它技術(shù)包括采用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)，例如但不限于血細(xì)胞計(jì)數(shù)器或庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器來(lái)評(píng)估每單位表面積的細(xì)胞數(shù)。
此外，對(duì)于本發(fā)明的目的，內(nèi)皮樣細(xì)胞包括但不限于用本文所述參數(shù)測(cè)量時(shí)，在功能和表型上仿效或模擬近鋪滿、鋪滿及鋪滿后內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞。
因此，利用下文所述詳細(xì)說(shuō)明和指導(dǎo)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將了解如何制造、使用、測(cè)試和鑒定本文公開(kāi)的可植入性可流動(dòng)組合物的有效實(shí)施方案。那就是，本文公開(kāi)的教示提供了所有制造和使用本發(fā)明的可植入性可流動(dòng)組合物所必需的條件。此外，本文公開(kāi)的教示提供了所有有效鑒定、制造和使用含有等同細(xì)胞的有效組合物所必需的條件。最后， 所有必需的條件是，依照本文公開(kāi)的方法這些等同體可以有效治療、控制、調(diào)節(jié)或緩解腔損傷或疾病，例如作為非限制性例子的與血管介入或心血管疾病相關(guān)的腔損傷或疾病。如熟練從業(yè)者將了解的那樣，本發(fā)明的組合物的等同實(shí)施方案可以僅采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)和本文提供的教示來(lái)鑒定。
在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的可植入性可流動(dòng)組合物的內(nèi)皮細(xì)胞分離自人尸體供體的主動(dòng)脈。每批細(xì)胞均可以得自單個(gè)或多個(gè)供體。每批細(xì)胞均廣泛測(cè)試其內(nèi)皮細(xì)胞純度、生物學(xué)功能、細(xì)菌、真菌、已知人病原體及其它外來(lái)試劑的存在。將細(xì)胞用公知技術(shù)冷凍保存和庫(kù)存，待以后培養(yǎng)擴(kuò)展，隨后制成可植入性組合物。
細(xì)胞制備:如上所述，適宜的細(xì)胞可以獲自各種組織類型和細(xì)胞類型。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，用于可植入性可流動(dòng)組合物的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞分離自尸體供體的主動(dòng)脈。 在另外的實(shí)施方案中，豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(CellApplications, San Die`go, CA)通過(guò)與分離人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞類似的程序從正常豬主動(dòng)脈中分離。每批細(xì)胞均可以得自單個(gè)或多個(gè)供體，然后廣泛測(cè)試其內(nèi)皮細(xì)胞存活率、純度、生物學(xué)功能、支原體、細(xì)菌、真菌、酵母菌、已知人病原體及其它外來(lái)試劑的存在。用公知技術(shù)將細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)、鑒定和冷凍保存，以形成第3至第6代的工作細(xì)胞庫(kù)，待以后培養(yǎng)擴(kuò)展，隨后制成生物相容性可植入性組合物。
人或豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞在每瓶加入內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)介質(zhì)約15ml的預(yù)處理的T-75瓶中制備。人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(Endothelial Growth Media, EGM-2, Cambrex Biosciences 公司，East Rutherford,新澤西)中制備。EGM-2 由內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(EndothelialBasal Media, EBM-2, Cambrex Biosciences 公司)和含有 2%FBS的EGM-2SingleQuots組成。豬細(xì)胞在加有5%FBS和50 μ g/ml慶大霉素的EBM-2中制備。將培養(yǎng)瓶置于孵化器中，在約37° C、5%C02/95%空氣及濕度90%的條件下保持最少 30分鐘。將一瓶或兩瓶細(xì)胞從-160° C至-140° C冰箱中取出，在約37° C下解凍。每瓶解凍后的細(xì)胞以優(yōu)選約3 X IO3個(gè)細(xì)胞/cm3，但不小于1. O X IO3個(gè)/cm3且不大于7. O X IO3 個(gè)/cm3的密度接種至兩個(gè)T-75瓶中；然后將含有細(xì)胞的培養(yǎng)瓶放回孵化器中。約8-24小時(shí)后，除去培養(yǎng)基(spent media),并替換以新鮮培養(yǎng)基。此后,每2_3天更換一次培養(yǎng)基, 直至細(xì)胞達(dá)到優(yōu)選約85-100%，但不小于60%且不大于100%的鋪滿度。當(dāng)可植入性可流動(dòng)組合物打算用于臨床時(shí)，僅無(wú)抗生素培養(yǎng)基可以用于人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的解凍后培養(yǎng)及本發(fā)明的可植入性可流動(dòng)組合物的生產(chǎn)。
然后除去內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基，細(xì)胞單層用IOmlHEPES緩沖鹽水(HEPES)沖洗。除去HEPES，加入2ml胰島素以使細(xì)胞從T-75瓶壁上脫離。當(dāng)脫離發(fā)生后，加入3ml胰島素中和溶液(TNS)以終止酶反應(yīng)。另外加入5ml HEPES，細(xì)胞用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。將細(xì)胞懸浮液離心，在人細(xì)胞的情況下，用無(wú)抗生素EGM-2調(diào)節(jié)密度至約1. 75 X IO6個(gè)細(xì)胞/ml，或在豬細(xì)胞的情況下，用加有5%FBS和50 μ g/ml慶大霉素的EBM-2調(diào)節(jié)密度至約1. 50 X IO6個(gè)細(xì)胞 /ml。
生物相容性基質(zhì):根據(jù)本發(fā)明，可植入性可流動(dòng)組合物的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包括形式為凝膠、泡沫、懸浮液、微載體、微囊、可流動(dòng)纖維結(jié)構(gòu)或其它可流動(dòng)材料的生物相容性基質(zhì)。生物相容性基質(zhì)允許細(xì)胞生長(zhǎng)并附著至基質(zhì)、在其上或基質(zhì)內(nèi)。當(dāng)植入例如血管的外表面時(shí)，生物相容性基質(zhì)可以在其被生物侵蝕之前停留在植入部位約7-90天，優(yōu)選至少約7-14天,更優(yōu)選至少約14-28天,最優(yōu)選至少約28-90天。
對(duì)于本發(fā)明的目的，可流動(dòng)組合物是指可以用注入或注入型遞送裝置例如但不限于針、注射器或?qū)Ч芙o藥的組合物。其它采用擠壓、噴射或排出的遞送裝置也包括在本發(fā)明中。任何用于注入型遞送裝置的非固體形式的生物相容性基質(zhì)均包括在本發(fā)明中，其中的裝置能通過(guò)順著血管內(nèi)部長(zhǎng)度行進(jìn)而實(shí)施血管內(nèi)給藥或局部經(jīng)皮給藥。優(yōu)選的可流動(dòng)組合物是形狀保持不變的。如本文預(yù)期的那樣，含有移植入可流動(dòng)微?；|(zhì)的細(xì)胞的可植入性可流動(dòng)組合物，被設(shè)計(jì)用于任何注射用遞送裝置，該裝置包括內(nèi)徑范圍為22號(hào)標(biāo)準(zhǔn)尺寸至 26號(hào)標(biāo)準(zhǔn)尺寸，長(zhǎng)度范圍為約1至20mm的針。優(yōu)選注射用遞送裝置能遞送約50mg、在約I 至約3ml介質(zhì)中含有約I百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的可植入性微粒材料。
根據(jù)本發(fā)明的一般優(yōu)選實(shí)施方案，可流動(dòng)組合物包括生物相容性微?；|(zhì)，例如得自豬皮I父的廣品Gelfoam 微粒、Gelfoam 粉末或粉狀GelfoamR (Pfizer Inc.公司， 紐約，紐約州)(以下稱“Gelfoam微?！?。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，生物相容性微粒材料是 Cytodex-3(AmershamBiosciences公司，Piscataway,新澤西)微載體，其由與交聯(lián)葡聚糖基質(zhì)結(jié)合的變性膠原蛋白組成。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，生物相容性可植入性微粒基質(zhì)包括改良藻酸鹽微粒；生物相容性聚合體如通過(guò)水解降解的合成聚合體，例如多羥酸如聚乳酸、聚乙二醇酸及其共聚物；聚原酸酯(polyorthoesters);聚酐；蛋白質(zhì)如明膠、膠原蛋白、纖維蛋白膠；或碳水化合物或多糖，例如纖維素和衍生化纖維素、殼聚糖、藻酸鹽或其組合物。生物相容性基質(zhì)是能在可流動(dòng)組合物給藥后的數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月的時(shí)間里逐漸消失的材料。 降解的速率取決于選定的生物相容性基質(zhì)，并且降解的速率可以根據(jù)治療和臨床情況的性質(zhì)進(jìn)行調(diào)整。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，可植入性微?；|(zhì)可以是改良微?；|(zhì)?？梢詫?duì)可植入性微?；|(zhì)的改良進(jìn)行選擇，以優(yōu)化和/或控制細(xì)胞與可植入性微?；|(zhì)結(jié)合時(shí)細(xì)胞的功能，所述細(xì)胞包括上文所述細(xì)胞的表型(例如，抑制性表型)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，對(duì)可植入性微粒基質(zhì)的改良包括用附著因子或粘附肽涂覆微粒，該附著因子或粘附肽可以增強(qiáng)細(xì)胞抑制平滑肌細(xì)胞增殖、減少炎癥、增加硫酸乙酰肝素的產(chǎn)生、增加前列環(huán)素的產(chǎn)生和/或增加TGF-h的產(chǎn)生的能力。例示性的附著因子包括，例如纖連蛋白、纖維蛋白膠和采用標(biāo)準(zhǔn)水性碳二亞胺化學(xué)共價(jià)結(jié)合的細(xì)胞粘附配體(包括例如RGD)。其它細(xì)胞粘附配體包括具有細(xì)胞粘附鑒定序列的肽，包括但不限于RGDY、REDVY, GRGDF, GPDSGR、GRGDY和REDV。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，可植入性微?；|(zhì)是除Gelfoam之外的微粒。其它例示性微?；|(zhì)包括，例如纖維蛋白膠、藻酸鹽、聚苯乙烯磺酸鈉微載體、膠原蛋白涂層葡聚糖微載體、PLA/PGA和pHEMA/MMA共聚物(每個(gè)共聚物的聚合體比例在1_100%之間)。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，這些其它微粒基質(zhì)經(jīng)改良后包括上文所述附著因子或粘附肽。例示性附著因子包括，例如明膠、膠原蛋白、纖連蛋白、纖維蛋白膠和采用標(biāo)準(zhǔn)水性碳二亞胺化學(xué)共價(jià)結(jié)合的細(xì)胞粘附配體(包括RGD)。其它細(xì)胞粘附配體包括具有細(xì)胞粘附鑒定序列的肽，包括但不限于 RGDY、REDVY, GRGDF, GPDSGR, GRGDY 和 REDV。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，可植入性微?；|(zhì)經(jīng)物理改良以促進(jìn)細(xì)胞附著。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，使可植入性微粒基質(zhì)交聯(lián)以增強(qiáng)其機(jī)械特性，并促進(jìn)其細(xì)胞附著和生長(zhǎng)特性。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，藻酸鹽微粒先用硫酸鈣進(jìn)行第一次交聯(lián)，然后用氯化鈣進(jìn)行第二次交聯(lián)， 最后按常規(guī)方案進(jìn)行。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，在細(xì)胞培養(yǎng)之前將肝素或硫酸乙酰肝素的來(lái)源，例如肝素-瓊脂糖加入基質(zhì)內(nèi)。
包括生物相容性微?；|(zhì)的可植入性可流動(dòng)組合物優(yōu)選用內(nèi)徑為22號(hào)標(biāo)準(zhǔn)尺寸至26號(hào)標(biāo)準(zhǔn)尺寸的針進(jìn)行遞送。因此，形成這樣的基質(zhì)的微粒優(yōu)選具有能通過(guò)本文所定義的適當(dāng)針孔的直徑。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，這樣的基質(zhì)的微粒的直徑為約20 μ m至約 1000 μ m,優(yōu)選直徑為約100 μ m至約500 μ m,最優(yōu)選直徑為約200 μ m。
優(yōu)選微粒基質(zhì)的各個(gè)微粒應(yīng)至少有I個(gè)粘附至其表面的細(xì)胞，優(yōu)選多于I個(gè)細(xì)胞。 因此，每個(gè)微粒的直徑應(yīng)大于選定的細(xì)胞類型的伸展直徑。例如，內(nèi)皮細(xì)胞的伸展直徑約為 18 μ m，為支持每個(gè)微粒上可以附著多于I個(gè)的內(nèi)皮細(xì)胞，各微粒的直徑應(yīng)至少為20 μ m。
優(yōu)詵培養(yǎng)管:在本文的某些實(shí)施方案中，將約50_60mg的Gelfoam微粒置于帶有O.2 μ m過(guò)濾帽的單個(gè)50mL培養(yǎng)管(Evergreen公司，洛杉肌,加利福尼亞)中。為減少培養(yǎng)基更換期間損失的微粒數(shù)，可以對(duì)培養(yǎng)管進(jìn)行改良，例如，在培養(yǎng)管的帽區(qū)或內(nèi)部加入濾膜， 以預(yù)防微粒在去除培養(yǎng)基時(shí)被排出或其它非預(yù)期地去除；向培養(yǎng)管中加入能通過(guò)培養(yǎng)基但不能通過(guò)微粒的隔膜，以形成各部分間通過(guò)流體連通的分離的培養(yǎng)基部分和微粒部分；或者在培養(yǎng)管底部加入可以 在不擾亂顆粒的條件下打開(kāi)并放出培養(yǎng)基的噴嘴。
細(xì)胞接種入可植入性材料:在細(xì)胞接種之前，向微粒中加入70%乙醇，然后用PBS 或HEPES沖洗數(shù)次。然后微粒在無(wú)抗生素EGM-2中，在約37° C、5%C02/95%空氣的條件下再水合12至24小時(shí)。然后將約50-60mg微粒的等分試樣從其再水合容器中取出，置于單個(gè)組織培養(yǎng)皿中。微粒等分試樣以每mg微粒2X IO3至2X IO4個(gè)細(xì)胞的優(yōu)選密度接種。將細(xì)胞-基質(zhì)混合物吸上吸下數(shù)次，以形成均一的懸浮液。然后培養(yǎng)管在37° C、5%C02、90% 濕度的條件下定期攪拌孵育3-4小時(shí)，以促進(jìn)細(xì)胞附著。隨后向每管中加入另外9mL EGM-2 (最終培養(yǎng)基體積為10mL)，得到最終微粒體積比為約5mg微粒/mL培養(yǎng)基。
此后，每2-3天更換一次培養(yǎng)基，直至細(xì)胞達(dá)到鋪滿狀態(tài)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞優(yōu)選傳代6次，但可以使用傳代次數(shù)更少或更多的細(xì)胞。
細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和鋪滿:分別在第3或4天、6或7天、9或10天及12或13天或者上述時(shí)間左右，取出可植入性可流動(dòng)組合物樣品進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，評(píng)價(jià)細(xì)胞存活率，建立細(xì)胞生長(zhǎng)曲線并分析，以評(píng)定細(xì)胞的生長(zhǎng)特征，并確定是否達(dá)到近鋪滿、鋪滿或鋪滿后。含有豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞移植物的可植入性可流動(dòng)組合物的制劑，其代表性的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。在該實(shí)施例中，可植入性材料的形式是微粒。通常地，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員了解在早、中、晚時(shí)間點(diǎn)時(shí)可接受的細(xì)胞生長(zhǎng)指標(biāo)，例如在早期時(shí)間點(diǎn)(對(duì)于圖1而言，約為第3-10天)觀察到細(xì)胞數(shù)的增長(zhǎng)，然后是近鋪滿相(對(duì)于圖1而言，約為第10-13天)，接著是細(xì)胞達(dá)到鋪滿后細(xì)胞數(shù)的穩(wěn)定期(對(duì)于圖1而言，約為第13-15天)以及細(xì)胞鋪滿后細(xì)胞數(shù)的維持期(對(duì)于圖1 而言，約為第15-17天)。對(duì)于本發(fā)明的目的，優(yōu)選在穩(wěn)定期內(nèi)至少72小時(shí)的細(xì)胞群。
細(xì)胞計(jì)數(shù)通過(guò)將可植入性可流動(dòng)組合物等分試樣用O. 8mg/ml膠原蛋白酶在胰島素-EDTA中的溶液(適用于Gelfoam微粒)，或者葡聚糖酶和胰島素-EDTA的溶液(適用于 Cytodex-3微粒)完全分解來(lái)完成。測(cè)量已分解的可植入性可流動(dòng)組合物的體積后，已知體積的細(xì)胞懸浮液用O. 4%臺(tái)盼藍(lán)稀釋(細(xì)胞對(duì)苔盼藍(lán)的比為4:1)，并用臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)定存活率?；罴?xì)胞、失活細(xì)胞及總細(xì)胞用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。以活細(xì)胞數(shù)對(duì)培養(yǎng)的天數(shù)作圖建立生長(zhǎng)曲線。達(dá)到鋪滿后，細(xì)胞被運(yùn)輸，用于移植。
對(duì)于本發(fā)明的目的，將鋪滿定義為每mg生物相容性微粒中至少存在約8X IO3個(gè)細(xì)胞，優(yōu)選每等分試樣50-70mg微粒中存在總細(xì)胞數(shù)約7 X IO5至約IX IO6個(gè)，且其存活率優(yōu)選至少約90%但不低于約80%。細(xì)胞存活率優(yōu)選至少為約90%但不低于約80%。如果細(xì)胞在12 或13天后未鋪滿，則更換培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育一天。持續(xù)該過(guò)程，直至達(dá)到鋪滿，或者直至接種后約14天。如果經(jīng)過(guò)程檢查后確定細(xì)胞已鋪滿，則進(jìn)行最后的培養(yǎng)基更換。最后的培養(yǎng)基更換用無(wú)酚紅且無(wú)抗生素的EGM-2進(jìn)行。培養(yǎng)基更換后，立即將培養(yǎng)管安上無(wú)菌塞密封帽用于運(yùn)輸。
功能性評(píng)價(jià)對(duì)于本文所述本發(fā)明的目的，可植入性可流動(dòng)組合物在移植之前進(jìn)一步對(duì)功能性標(biāo)記進(jìn)行測(cè)試。例如，在培養(yǎng)期間收集條件培養(yǎng)基，以確定由培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的硫酸乙酰肝素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子P1 (TGF-D、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(b-FGF)和一氧化氮的水平。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，當(dāng)總細(xì)胞數(shù)為至少約2X IO3個(gè)細(xì)胞/cm3，優(yōu)選至少約8 X IO3個(gè)細(xì)胞/cm3，且活細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為至少約80-90%，優(yōu)選大于等于90%，最優(yōu)選至少約90%時(shí)，可植入性可流動(dòng)組合物可以用于本文所述目的。條件培養(yǎng)基中的硫酸乙酰肝素為至少約O. 5-1. O μ g/106個(gè)細(xì)胞/天，優(yōu)選至少約1. O μ g/106個(gè)細(xì)胞/天。條件培養(yǎng)基中的TGF-β !為至少約200-300picog/ml/天,優(yōu)選至少約300picog/ml/天；條件培養(yǎng)基中的 b-FGF 低于約 200picog/ml,優(yōu)選不超過(guò)約 400picog/ml。
硫酸乙酰肝素的水平可采用常規(guī)二甲基亞甲基藍(lán)-硫酸軟骨素裂解酶ABC消化光度法進(jìn)行定量?？偭蛩峄前肪厶?GAG)水平用二甲基亞甲基藍(lán)(DMB)染料結(jié)合法測(cè)定，該方法通過(guò)用收集培養(yǎng)基(collection media)稀釋已知量的純硫酸軟骨素得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,然后將未知樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較。在加入DMB顯色劑之前，將條件培養(yǎng)基的其它樣品與硫酸軟骨素裂解酶ABC混合，以分解軟骨素和硫酸皮膚素。所有吸光值均在混有GAG標(biāo)準(zhǔn)品的DMB染料的最大吸收波長(zhǎng)——一般為515-525nm左右測(cè)定。通過(guò)用條件培養(yǎng)基樣品中的總硫酸化糖胺聚糖濃度減去軟骨素和硫酸皮膚素的濃度，計(jì)算每IO6個(gè)細(xì)胞每天的硫酸乙酰肝素水平。硫酸軟骨素裂解酶ABC的活性通過(guò)分解純硫酸軟骨素樣品來(lái)確證。如果分解的純硫酸軟骨素低于100%，則適當(dāng)校正條件培養(yǎng)基樣品。硫酸乙酰肝素的水平還可以用單克隆抗體采用ELISA法進(jìn)行定量。
TGF- β !和b-FGF的水平采用ELISA法，用單克隆抗體或多克隆抗體，優(yōu)選多克隆抗體進(jìn)行定量。收集培養(yǎng)基(collection media)對(duì)照同樣用ELISA法進(jìn)行定量，并適當(dāng)校正樣品在培養(yǎng)基對(duì)照中的TGF-β i和b-FGF水平。
—氧化氮(NO)水平用標(biāo)準(zhǔn)Griess反應(yīng)法定量。一氧化氮的瞬變及揮發(fā)性使其不適合于大多數(shù)檢測(cè)方法。然而，一氧化氮的兩個(gè)穩(wěn)定的降解產(chǎn)物——三氧化氮(NO3)和二氧化氮(NO2)可以用常規(guī)光度法檢測(cè)。Griess反應(yīng)法在硝酸還原酶存在下將三氧化氮經(jīng)酶法轉(zhuǎn)化為二氧化氮。二氧化氮以吸收約540nm范圍處的可見(jiàn)光的有色偶氮染料產(chǎn)物的形式， 經(jīng)比色法檢測(cè)。系統(tǒng)中存在的一氧化氮的水平通過(guò)將所有三氧化氮轉(zhuǎn)化為二氧化氮，測(cè)定未知樣品中的二氧化氮總濃度，然后將得到的二氧化氮濃度與用已知量的三氧化氮轉(zhuǎn)化為二氧化氮后產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較。
前述優(yōu)選抑制性表型用上述硫酸乙酰肝素、TGF- β pNO和/或b-FGF的定量分析， 以及下面的平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)和血栓抑制率的體外定量分析進(jìn)行評(píng)定。對(duì)于本發(fā)明的目的， 當(dāng)一種或多種這些另外的體外分析證明，可植入性可流動(dòng)組合物顯示出優(yōu)選的抑制性表型時(shí)，該可植入性可流動(dòng)組合物可以準(zhǔn)備用于移植。
為體外評(píng)價(jià)對(duì)平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制，測(cè)定了與培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的抑制值。 將豬或人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞稀疏接種于24孔組織培養(yǎng)板中的平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中 (SmGM-2, Cambrex BioScience公司)。使細(xì)胞附著24小時(shí)。然后將該培養(yǎng)基用含有O. 2%FBS 的平滑肌細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(SmBM)替換，培養(yǎng)48-72小時(shí)，使細(xì)胞生長(zhǎng)停滯。將鋪滿后內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物用SMC生長(zhǎng)培養(yǎng)基按1:1稀釋兩次，制成條件培養(yǎng)基，并將其加至平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)物中。每次試驗(yàn)均包括抑制平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)的陽(yáng)性對(duì)照，例如肝素。3-4天后，用Coulter 計(jì)數(shù)器對(duì)每份樣品中的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。通過(guò)比較臨加入條件培養(yǎng)基之前和暴露于條件培養(yǎng)基及對(duì)照培養(yǎng)基(標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)培養(yǎng)基，加入或不加入生長(zhǎng)因子)下3-4天后的每孔平滑肌細(xì)胞數(shù)，確定條件培養(yǎng)基對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖的作用。將與條件培養(yǎng)基樣品相關(guān)的抑制值與陽(yáng)性對(duì)照相關(guān)的抑制值進(jìn)行比較。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，如果條件培養(yǎng)基的抑制率達(dá)到肝素對(duì)照的抑制率的約20%，則認(rèn)為該可植入性可流動(dòng)組合物具有抑制性。
為體外評(píng)價(jià)對(duì)血栓的抑制率，測(cè)定了與培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的硫酸乙酰肝素的水平。硫酸乙酰肝素具有抗增殖和抗血栓性能。采用上文詳細(xì)描述過(guò)的常規(guī)二甲基亞甲基藍(lán)-硫酸軟骨素裂解酶ABC光度法或ELISA法，計(jì)算每IO6個(gè)細(xì)胞的硫酸乙酰肝素濃度。當(dāng)條件培養(yǎng)基中的硫酸乙酰肝素為至少約0. 5-1. 0mg/ 106個(gè)細(xì)胞/天，優(yōu)選至少約1. 0mg/106 個(gè)細(xì)胞/天時(shí)，該可植入性可流動(dòng)組合物可以用于本文所述目的。
另一個(gè)評(píng)價(jià)血栓抑制率的方法包括在體外測(cè)定對(duì)與富血小板血漿相關(guān)的血小板聚集的抑制值。在室溫下向豬血液樣品中加入檸檬酸鈉，得到豬血漿。檸檬酸鈉血漿在溫和轉(zhuǎn)速下離心，以使紅細(xì)胞和白細(xì)胞成團(tuán)，留下血小板懸浮在血漿中。用鋪滿后內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物制備條件培養(yǎng)基，并加至富血小板血漿等分試樣中。向血漿中加入血小板聚集劑(激動(dòng)劑)作為對(duì)照。血小板激動(dòng)劑一般包括花生四烯酸(arachidonate)、ADP、膠原蛋白、腎上腺素、瑞斯西丁素(ristocetin,可獲自Sigma-Aldrich Co.公司，圣路易，密蘇里州)。另一份未加入血小板激動(dòng)劑或條件培養(yǎng)基的血漿等分試樣用來(lái)測(cè)定基線自發(fā)血小板聚集。每次試驗(yàn)還包括抑制血小板聚集的陽(yáng)性對(duì)照。例示性的陽(yáng)性對(duì)照包括阿司匹林、肝素、abciximab (ReoPrO , Eli Lilly公司，印第安納波利斯，印第安納州)、替羅非班(Aggrastat*，Merck&Co.，Inc.公司，Whitehouse Station,新澤西州)或埃替非巴肽 Untegrilin1S Mi llennium Pharmaceuticals, Inc.公司，劍橋,麻薩諸塞州)。然后用聚集儀測(cè)量所有測(cè)試條件下得到的血小板聚集。聚集儀通過(guò)監(jiān)測(cè)光密度來(lái)測(cè)量血小板聚集。當(dāng)血小板聚集，則有更多光線可以通過(guò)樣品。聚集儀報(bào)道的結(jié)果以血小板聚集速率的函數(shù)“血小板聚集單位”表示。加入激動(dòng)劑后6分鐘時(shí)測(cè)定最大聚集。通過(guò)比較富血小板血漿在加入條件培養(yǎng)基之前的基線血小板聚集和暴露于條件培養(yǎng)基之后及陽(yáng)性對(duì)照的血小板聚集， 確定條件培養(yǎng)基對(duì)血小板聚集的作用。結(jié)果以基線的百分?jǐn)?shù)表示。將與條件培養(yǎng)基樣品相關(guān)的抑制值與陽(yáng)性對(duì)照相關(guān)的抑制值進(jìn)行比較。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，當(dāng)條件培養(yǎng)基的抑制率為陽(yáng)性對(duì)照的抑制率的約20%時(shí)，則可認(rèn)為該可植入性可流動(dòng)組合物具有抑制性。
運(yùn)輸容器培養(yǎng)基更換后，立即將可植入性可流動(dòng)組合物包裝以用于運(yùn)輸。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，在可植入性材料上培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)使用的同一培養(yǎng)管被安上無(wú)菌塞密封帽用于運(yùn)輸。為降低在最后的沖洗期間微粒和/或細(xì)胞傾析的風(fēng)險(xiǎn)，可以對(duì)運(yùn)輸容器進(jìn)行改良以使其包括，例如，具有能通過(guò)培養(yǎng)基和沖洗溶液，但不能傾析出顆粒和/或細(xì)胞的孔徑的過(guò)濾器或其它捕獲裝置。
如果可植入性可流動(dòng)組合物在含血清培養(yǎng)基中運(yùn)輸，則在臨移植前沖洗可植入性可流動(dòng)組合物，優(yōu)選在培養(yǎng)管內(nèi)沖洗。然后從運(yùn)輸容器中除去過(guò)濾器或其它捕獲裝置，將細(xì)胞移植微粒吸入注射器中用于遞送。排出注射器中多余的沖洗溶液，將針、導(dǎo)管或其它遞送裝置連接至注射器，用于向治療部位的遞送。然后根據(jù)例如下文所述例示性給藥方法中的一種，將可流動(dòng)組合物遞送至患者。如果可植入性可流動(dòng)組合物在無(wú)血清培養(yǎng)基中運(yùn)輸，則在臨床場(chǎng)所無(wú)需進(jìn)行最后的沖洗程序。
根據(jù)另一個(gè)備選的實(shí)施方案，將可植入性可流動(dòng)組合物從培養(yǎng)管吸至注射器中， 加入l-20ml培養(yǎng)基，或足夠體積的培養(yǎng)基一起運(yùn)輸和貯藏，給注射器加帽密封，在密封的注射器中運(yùn)輸該材料。在植入部位，多余的培養(yǎng)基從注射器中排出。然后將針、導(dǎo)管或其它遞送裝置連·接至注射器，用于向治療部位的遞送。根據(jù)該實(shí)施方案，可流動(dòng)組合物直接從運(yùn)輸注射器中遞送至患者。
本發(fā)明的可植入性組合物可在最終產(chǎn)物容器中供應(yīng)，包括例如經(jīng)濾帽改良的50ml 或60ml密封組織培養(yǎng)容器或預(yù)載注射器，所述最終產(chǎn)物容器均優(yōu)選含有約50-60mg微粒材料，在每等份約45-60ml，優(yōu)選約50ml的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中植入的內(nèi)皮細(xì)胞總數(shù)為約 7 X IO5至約I X IO6個(gè)。每個(gè)患者接受的總細(xì)胞數(shù)優(yōu)選為約0. 6 X 104-12 X IO4個(gè)細(xì)胞/kg體重,但不小于2 X IO3個(gè)細(xì)胞/kg體重并不大于2 X IO5個(gè)細(xì)胞/kg體重。
如本文預(yù)期的那樣，本發(fā)明的材料包括細(xì)胞，優(yōu)選血管內(nèi)皮細(xì)胞；在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞優(yōu)選存活率為約90%，優(yōu)選密度為約1.4X104-2.1 X IO4個(gè)細(xì)胞/mg微粒；當(dāng)鋪滿或近鋪滿時(shí)，所述細(xì)胞產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基所包含的肝素為至少約O. 5-1. 0mg/106 個(gè)細(xì)胞/天，優(yōu)選至少約1.0mg/106個(gè)細(xì)胞/天。條件培養(yǎng)基中的TGF-P1為至少約 200-300picog/ml/天，優(yōu)選至少約300picog/ml/天；條件培養(yǎng)基中的b_FGF低于約 200picog/ml,優(yōu)選不大于約 400picog/ml。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，在給藥之前向可流動(dòng)組合物中加入一種或多種另外的物質(zhì)。這些物質(zhì)包括但不限于抗炎劑、糖胺聚糖、前列腺素、前列腺素類、細(xì)胞因子包括但不限于TGF和VEGF、血管緊張素及相關(guān)化合物、酪氨酸激酶抑制劑、免疫抑制劑、維生素、糖皮質(zhì)激素、抗氧化劑、自由基清除劑、肽類激素、血管生成因子及血管生成抑制因子。
載述:根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，可植入性可流動(dòng)組合物可任選包括載體流體。優(yōu)選的載體流體是使給藥更加方便的細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)室模擬的可植入性可流動(dòng)組合物的給藥顯示，載體不是處理可流動(dòng)組合物時(shí)保持細(xì)胞完整性的必要條件。意外的是，如本文所述的細(xì)胞制劑中可以沒(méi)有載體或其它通常用來(lái)保護(hù)細(xì)胞完整性的試劑，或通常用來(lái)改善處理和減少由剪切力導(dǎo)致的非固體或可流動(dòng)制劑分裂的試劑。
然而，載體可以在例如，細(xì)胞培養(yǎng)期間，包括排出條件培養(yǎng)基，導(dǎo)入新的培養(yǎng)基時(shí)， 在運(yùn)輸前處理可植入性可流動(dòng)組合物，將該材料吸入遞送用注射器時(shí)，和/或?qū)⒃摬牧蠌淖⑸淦髦信懦霾⒃摬牧线f送至血管周隙或其它靶部位時(shí)，用于提高細(xì)胞在可流動(dòng)組合物中的流動(dòng)性和存活率。
載體可以在細(xì)胞培養(yǎng)程序的不同時(shí)間點(diǎn)導(dǎo)入可植入性材料中。例如，在細(xì)胞培養(yǎng)程序中，載體可以在微粒水合(細(xì)胞接種前)時(shí)、即將進(jìn)行細(xì)胞接種前或在進(jìn)行細(xì)胞接種時(shí)加入微粒基質(zhì)，和/或在預(yù)定的培養(yǎng)基更換時(shí)以增量方式加入。通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)早期引入載體，可以將那些可能受到不良影響的細(xì)胞棄去，剩下的細(xì)胞可以增殖以維持足夠的細(xì)胞群。
此外，載體可以在細(xì)胞達(dá)到鋪滿或近鋪滿，進(jìn)行最后的培養(yǎng)基更換時(shí)，及即將進(jìn)行移植前引入。然而，觀察到在臨給藥之前加入未稀釋的甘油載體可能導(dǎo)致細(xì)胞休克，從而使細(xì)胞完全窒息而降低預(yù)期的細(xì)胞存活率和低于可接受水平的效能?；谶@些觀察結(jié)果，向可流動(dòng)組合物中一次性全部加入高粘性載體流體如甘油有可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不良影響,并且應(yīng)該避免。
為評(píng)價(jià)其它候選載體流體的功效，采用高微粒對(duì)載體比進(jìn)行初步試驗(yàn)，以測(cè)定達(dá)到預(yù)期效果時(shí)所需載體的最小量。評(píng)價(jià)的預(yù)期效果包括，例如改善處理和提`高組合物的流動(dòng)性并維持細(xì)胞的存活率和效力。此外，還進(jìn)行研究以測(cè)試在不影響細(xì)胞存活率或功能的條件下將平面型的可植入性組合物轉(zhuǎn)化為可植入微粒型可流動(dòng)組合物的能力(參見(jiàn)共同待決的申請(qǐng)PCT/US_，也稱作ELV-002PC，其全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考)。例如，最初的測(cè)試溶液中，50mg微粒僅含有約O. 1-1%的載體溶液。該濃度以增量方式增加至最大值為 50mg微粒中含約10%的載體。
隨后進(jìn)行的試驗(yàn)中，載體流體從微粒水合或細(xì)胞接種時(shí)開(kāi)始，在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中增量式地加入，這樣就使得當(dāng)可植入性可流動(dòng)組合物中的細(xì)胞達(dá)到鋪滿并準(zhǔn)備運(yùn)輸和/或施予患者時(shí)，可植入性材料中的載體流體的濃度已經(jīng)從早期細(xì)胞附著時(shí)可接受的載體流體對(duì)微粒的較低比例增加到了較高的理想比例。例如，根據(jù)例示性方案，在初始水合和隨后的每次培養(yǎng)基更換時(shí)，將O. 1%的載體溶液加入到微粒材料中，直到獲得最終濃度為1%的載體溶液。我們認(rèn)為，雖然在每次引入載體流體時(shí)都會(huì)有一些細(xì)胞流失，但大多數(shù)細(xì)胞卻混入經(jīng)載體處理的可植入性可流動(dòng)組合物中，并能在該環(huán)境下生長(zhǎng)至鋪滿或近鋪滿。
載體包括但不限于稀甘油、藻酸鹽(優(yōu)選約1%的藻酸鹽溶液)、葡聚糖或右旋糖(優(yōu)選約1-10%的葡聚糖或右旋糖溶液)、其它糖包括例如葡萄糖、蔗糖和果糖、淀粉(優(yōu)選約6% 的羥乙基淀粉溶液)、明膠(優(yōu)選約1-2%的明膠溶液)、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基、內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、其它細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基或中性緩沖鹽。其它本文未詳細(xì)說(shuō)明的溶液百分比范圍也包括在內(nèi)。載體的改變部分依賴于所用生物相容性基質(zhì)的類型、移植到材料上的細(xì)胞類型以及為遞送選定的給藥模式。例如，用于初始水合和隨后的培養(yǎng)基更換的細(xì)胞培養(yǎng)基，根據(jù)選定的載體可以包括以體積計(jì)約O. 5%至約10%的載體流體。通常地，選定的載體應(yīng)該在所用劑量和濃度下無(wú)細(xì)胞毒性，并且具有充分的通透性，以允許空氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流入(以支持細(xì)胞生長(zhǎng))和流出(以排出細(xì)胞廢產(chǎn)物)可植入性組合物。
未稀釋的甘油載體對(duì)細(xì)胞存活率的影響豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞接種于lOOmg Gelfoam微粒上，并增殖至鋪滿。收集微粒型可流動(dòng)組合物，并將其置于50ml試管中與3ml 未稀釋的甘油等分試樣混合，然后將其置于連接有24、26或27號(hào)針的注射器中。所有注射器中的內(nèi)容物通過(guò)連接的針緩慢排出，收集于50ml試管中。所有活細(xì)胞中僅有0-5%的細(xì)胞在排出后存活(95-100%的細(xì)胞死亡)，與未加入甘油的相同試驗(yàn)具有86-93%的細(xì)胞存活率相比，顯然表明了該載體流體在未稀釋的情況下作為單劑量向鋪滿細(xì)胞加入時(shí)對(duì)細(xì)胞存活率的有害影響。目前尚未確定使用該載體流體是否有利于維持細(xì)胞單層的鋪滿。
平面型材料的擠壓和修飾:根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，在細(xì)胞已完全移植入可植入性組合物并達(dá)到鋪滿后，對(duì)固體、半固體或大直徑組合物進(jìn)行修飾，以形成能通過(guò)注射用遞送裝置遞送的微粒。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，細(xì)胞如上文詳細(xì)描述的那樣在載體流體存在下培養(yǎng)， 以維持材料修飾期間細(xì)胞的鋪滿和完整性。
根據(jù)修飾方法的一個(gè)實(shí)施方案，一旦細(xì)胞在平面型可植入性組合物上達(dá)到鋪滿， 則將組合物轉(zhuǎn)移至注射器。為適應(yīng)該平面形式，注射器可以不帶針或者帶有大孔針。注射器將彈性平面形式吸上來(lái)，然后，在壓力下，植入細(xì)胞的組合物通過(guò)注射器口排出，形成非平面的可流動(dòng)組合物。為了獲得優(yōu)選粒徑，可能需要多次從注射器中通過(guò)。例如，材料可以先通過(guò)沒(méi)有針的注射器，然后通過(guò)大孔針，接著通過(guò)更小孔的針，直至材料達(dá)到預(yù)期的粒徑和流動(dòng)性。多次通過(guò)和對(duì)粒徑的增量修飾可以有利地減少在這樣的材料修飾期間對(duì)細(xì)胞的傷害量，并保持細(xì)胞的鋪滿度。
手術(shù)密封劑在某些其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的可流動(dòng)組合物通常還可以另外尤其作為吻合口密封劑，或者外科密封劑。在這樣一個(gè)雙重目的的實(shí)施方案中，當(dāng)與管狀結(jié)構(gòu)的外表面接觸，或者以弧形應(yīng)用于外表面，或者沿圓周方向使用時(shí)，組合物還可以有效密封兩個(gè)或多個(gè)管狀結(jié)構(gòu)的接合點(diǎn)，或者密封管狀結(jié)構(gòu)中的孔洞。這樣的密封劑可以消除進(jìn)行縫合的需要，所述縫合可例如進(jìn)一步損害血管組織并促使腔內(nèi)皮損傷。這樣的密封劑還可以在吻合口附近提供額外的穩(wěn)定性，從而增強(qiáng)任何縫合修補(bǔ)的效果。所有必需的條件是，該雙重目的組合物的密封型功能或特性不干擾或削弱細(xì)胞的預(yù)期表型及該組合物的基于細(xì)胞的功能性的同時(shí)表 達(dá)。
對(duì)于某些密封劑實(shí)施方案的目的，可流動(dòng)組合物包括生物相容性底物，該底物自身包括具有密封劑特性，同時(shí)還具有支撐內(nèi)皮或內(nèi)皮樣細(xì)胞群所需要的特性的成分，例如但不限于纖維蛋白網(wǎng)。同樣地，生物相容性底物本身可以同時(shí)具有密封劑特性和支撐細(xì)胞群所需要的特性。在其它實(shí)施方案的情況下，密封劑的功能性可以至少部分地由細(xì)胞提供。 例如，預(yù)期與組合物結(jié)合的細(xì)胞產(chǎn)生能修飾底物的物質(zhì)，從而使底物獲得密封劑特性，同時(shí)還顯示/維持其必需的細(xì)胞功能性。某些細(xì)胞可以自然產(chǎn)生該類物質(zhì)，而其它細(xì)胞可以通過(guò)改造后產(chǎn)生該類物質(zhì)。
可植入性可流動(dòng)組合物的保存期:包括鋪滿、近鋪滿或鋪滿后細(xì)胞群的可植入性可流動(dòng)組合物可以在室溫下維持穩(wěn)定和存活狀態(tài)至少兩周。這類可植入性可流動(dòng)組合物優(yōu)選在約45-60ml，更優(yōu)選約50ml的含有或不含額外的FBS的運(yùn)輸培養(yǎng)基中保存。運(yùn)輸培養(yǎng)基包括不含酚紅的EGM-2培養(yǎng)基。運(yùn)輸培養(yǎng)基中可以加入FBS，直至達(dá)到FBS以體積計(jì)約為 10%，或者FBS總濃度為約12%。然而，由于在移植之前，F(xiàn)BS必須從可植入性可流動(dòng)組合物中去除，因此優(yōu)選限制運(yùn)輸培養(yǎng)基中使用的FBS的量，以減少移植前需要的沖洗時(shí)間。
可植入性可流動(dòng)組合物的冷凍保存:包括鋪滿、近鋪滿或鋪滿后細(xì)胞群的可植入性可流動(dòng)組合物可以冷凍保存以貯藏和/或運(yùn)輸至臨床機(jī)構(gòu)，而在最后的解凍后不減小其臨床效力或完整性?？芍踩胄钥闪鲃?dòng)組合物優(yōu)選在15ml冷凍管(Malgene'Nalge Nunc Int' I公司，羅切斯特，紐約州)中，在含有約5ml CryoStor CS-10溶液(BioLifeSolutions 公司，Oswego，紐約州)、約10%DMS0、約2_8%葡聚糖和約50_75%FBS的溶液中冷凍保存。將冷凍管置于冷異丙醇水浴，轉(zhuǎn)移至_80°C冰箱中4小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移至液氮(-150至-165°C) 中。
然后將冷凍保存的可植入性可流動(dòng)組合物的等分試樣在室溫下緩慢解凍約15min，接著在室溫水浴中再解凍約15分鐘。然后將材料用約15ml洗滌用培養(yǎng)基 (washmedia)洗漆約3次。洗漆用培養(yǎng)基包括含或不含50 μ g/ml慶大霉素的無(wú)酹紅EBM。 最初兩次沖洗程序在室溫下進(jìn)行約5分鐘。最后一次沖洗程序在37° C、5%C02下進(jìn)行約30 分鐘。
在解凍和沖洗程序之后，使冷凍保存的材料在約IOml的恢復(fù)液中休眠約48小時(shí)。 對(duì)于豬內(nèi)皮細(xì)胞，恢復(fù)液是37°C下在5%C02中的加有5%FBS和50 μ g/ml慶大霉素的EBM-2。 對(duì)于人內(nèi)皮細(xì)胞，恢復(fù)液是無(wú)抗生素EGM-2。進(jìn)一步的解凍后調(diào)節(jié)可以在使用和/或包裝用于貯藏或運(yùn)輸之前進(jìn)行至少另外的24小時(shí)。
在遞送裝置中的裝載和攝取:如上文詳細(xì)描述的那樣，可流動(dòng)組合物的等分試樣在培養(yǎng)管或注射器中，在約45-60ml,優(yōu)選約50ml的含或不含血清的運(yùn)輸培養(yǎng)基中包裝和運(yùn)輸，在不更換培養(yǎng)基的條件下支持細(xì)胞達(dá)14天。移植之前，傾析出多余的培養(yǎng)基，并且， 如果運(yùn)輸培養(yǎng)基中存在血清，則將可植入性可流 動(dòng)組合物漂洗數(shù)次，以除去所有殘留的血清。由于某些可植入性可流動(dòng)組合物的微粒形式的制劑易于分散，并因此失去細(xì)胞鋪滿狀態(tài)，所以，在最后的沖洗程序中，該組合物應(yīng)保留在運(yùn)輸容器內(nèi)。此外，對(duì)運(yùn)輸容器的改良優(yōu)選能在操作中維持可植入性可流動(dòng)組合物的完整性的改良，所述改良包括但不限于過(guò)濾器和/或單獨(dú)的培養(yǎng)隔間。
在沖洗可植入性可流動(dòng)組合物數(shù)次之后，保留約l_3ml的沖洗液在可植入性可流動(dòng)組合物的頂部，以有利于將該材料攝取至遞送裝置例如注射器中。然后操作遞送裝置，將可植入性可流動(dòng)組合物吸入遞送裝置中，操作時(shí)盡量小心，使鋪滿細(xì)胞層的破壞最小化。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，使用材料的裝載裝置，例如在運(yùn)輸容器開(kāi)口和遞送用注射器之間的漏斗形接口，使材料在轉(zhuǎn)移至遞送裝置的過(guò)程中細(xì)胞破碎減少。在材料轉(zhuǎn)移至遞送裝置之后， 從遞送裝置中排出部分剩余液體約1ml，以準(zhǔn)備好遞送裝置，填滿空隙體積。在遞送至患者的可植入性可流動(dòng)組合物中大約剩有0_2ml的沖洗液。現(xiàn)在準(zhǔn)備將可植入性可流動(dòng)組合物遞送至治療部位。
通過(guò)針:為證明本發(fā)明的實(shí)用性，一個(gè)優(yōu)選微粒型可植入性可流動(dòng)組合物(植入 Gelfoam微粒的HAE)通過(guò)了 22號(hào)針孔(內(nèi)徑=O. 016英寸)。此外，其它優(yōu)選組合物(植入 Gelfoam微粒的PAE)能通過(guò)的針孔的針的范圍是約21號(hào)針(內(nèi)徑=O. 019英寸)至28號(hào)針(內(nèi)徑=O. 007英寸)。
如下表I所示，本發(fā)明的實(shí)施方案可以在對(duì)通過(guò)針的細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)、存活率或功能性無(wú)不良影響的條件下，通過(guò)內(nèi)徑在這些范圍內(nèi)的針。令人意外的是，細(xì)胞制劑可以在不影響或損害鋪滿狀態(tài)或功能性的條件下攝取并從范圍為21號(hào)(內(nèi)徑=O. 019英寸)至30號(hào) (內(nèi)徑=O. 006英寸)，優(yōu)選24號(hào)(內(nèi)徑=O. 012英寸)的針孔中流出。同樣令人意外的是， 細(xì)胞在通過(guò)針之后，僅以細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基作為載體流體的條件下表現(xiàn)非常好。
如下文所述，細(xì)胞與微?；|(zhì)混合，并增殖至鋪滿。鋪滿后3天，將得到的可流動(dòng)組合物通過(guò)內(nèi)徑范圍為約O. 007英寸至約O. 018英寸的無(wú)菌針，收集，在內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基-2 (EGM-2)中恢復(fù)48小時(shí)?；謴?fù)期過(guò)后，使培養(yǎng)基條件化24小時(shí)。然后對(duì)通過(guò)后細(xì)胞的條件培養(yǎng)基進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)通過(guò)后的條件培養(yǎng)基評(píng)價(jià)其產(chǎn)物堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (b-FGF)、硫酸乙酰肝素(HS)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子P1 (TGF-P1)的可接受的水平。此外，進(jìn)行平滑肌細(xì)胞試驗(yàn)以顯示培養(yǎng)基對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖的抑制作用。將通過(guò)針的組合物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與沒(méi)有通過(guò)針的樣品進(jìn)行比較。
表I
通討22號(hào)針
權(quán)利要求
1.用于治療管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)內(nèi)腔上的受損或患病部位的可流動(dòng)性組合物，其中所述可 流動(dòng)性組合物包括生物相容性基質(zhì)和細(xì)胞，并且其中所述可流動(dòng)性組合物以有效治療所述 受損或患病部位的量通過(guò)經(jīng)皮注射遞送至所述受損或患病部位或與該部位相鄰或在該部 位附近的腔外表面。
2.權(quán)利要求1的可流動(dòng)性組合物，其中所述細(xì)胞具有內(nèi)皮樣表型。
3.權(quán)利要求1的可流動(dòng)性組合物，其中所述細(xì)胞是兩種或更多種選自下述細(xì)胞的共培 養(yǎng)物內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞和心肌細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1的可流動(dòng)性組合物，其中的可流動(dòng)性組合物是保持形狀的。
5.權(quán)利要求1的可流動(dòng)性組合物，其中的生物相容性基質(zhì)包括微?；蛭⑤d體。
6.權(quán)利要求5的可流動(dòng)性組合物，其中的微?；蛭⑤d體進(jìn)一步包括明膠、膠原蛋白、纖 連蛋白、纖維蛋白、層粘連蛋白或附著肽。
7.權(quán)利要求6的可流動(dòng)性組合物，其中的附著肽包括序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸 (RGD)的肽。
8.權(quán)利要求5的可流動(dòng)性組合物，其中的微?；蛭⑤d體的直徑為約20微米至約500微米。
9 權(quán)利要求5的可流動(dòng)性組合物，其中的微粒或微載體的直徑為約200微米。
10.權(quán)利要求1的可流動(dòng)性組合物，其進(jìn)一步包括選自下述的適當(dāng)載體流體藻酸鹽、 糖溶液、淀粉溶液、明膠、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基、內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基、其 它生長(zhǎng)培養(yǎng)基或中性緩沖鹽。
11.權(quán)利要求1的可流動(dòng)性組合物，其中所述有效量減少受損或患病部位的平滑肌細(xì) 胞的增殖。
12.權(quán)利要求1的可流動(dòng)性組合物，其中所述有效量減輕受損或患病部位的閉塞性血栓。
13.權(quán)利要求1的可流動(dòng)性組合物，其中所述有效量減少受損或患病部位的內(nèi)膜增生。
14.權(quán)利要求1的可流動(dòng)性組合物，其中所述有效量減輕受損或患病部位的狹窄或再狹窄。
15.權(quán)利要求1的可流動(dòng)性組合物，其中所述有效量減輕受損或患病部位的急性炎癥。
16.權(quán)利要求1的可流動(dòng)性組合物，其中所述有效量減輕受損或患病部位的慢性炎癥。
17.權(quán)利要求1的可流動(dòng)性組合物，其中所述有效量減輕受損或患病部位的血管舒張或血管痙攣。
18.權(quán)利要求1的可流動(dòng)性組合物，其中所述管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)是血管。
19.生物相容性基質(zhì)和細(xì)胞在制備治療管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)內(nèi)腔上的受損或患病部位的可 流動(dòng)性組合物中的應(yīng)用，其中所述可流動(dòng)性組合物將通過(guò)經(jīng)皮注射被遞送至所述管狀解剖 學(xué)結(jié)構(gòu)的受損或患病部位或與該部位相鄰或在該部位附近的所述管狀解剖結(jié)構(gòu)的腔外表 面并且與所述述管狀解剖結(jié)構(gòu)的腔外表面接觸，并且其中所述可流動(dòng)性組合物的量是有效 治療受損或患病部位的量。
20.權(quán)利要求19的應(yīng)用，其中通過(guò)穿過(guò)或透過(guò)所述管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)的內(nèi)壁，將可流動(dòng) 性組合物沉積在所述受損或患病部位或與該部位相鄰或在該部位附近處的所述管狀解剖 學(xué)結(jié)構(gòu)的外表面上。
21.權(quán)利要求20的應(yīng)用，其中將鑒定所述可流動(dòng)性組合物在所述管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)的外 表面上沉積的部位。
22.權(quán)利要求21的應(yīng)用，其中在所述穿過(guò)或透過(guò)所述管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)的內(nèi)壁之前，或 者與穿過(guò)或透過(guò)所述管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)的內(nèi)壁同時(shí)鑒定所述可流動(dòng)性組合物的沉積部位。
23.權(quán)利要求21的應(yīng)用，其中通過(guò)成像鑒定所述部位。
24.權(quán)利要求21的應(yīng)用，其中通過(guò)觸診鑒定所述部位。
25.權(quán)利要求19的應(yīng)用，其中通過(guò)經(jīng)皮給藥進(jìn)入血管周隙，將可流動(dòng)性組合物沉積在 受損或患病部位或與該部位相鄰或在該部位附近的所述管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)的外表面上。
26.權(quán)利要求25的應(yīng)用，其中鑒定可流動(dòng)性組合物沉積在所述管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)的外表 面的部位。
27.權(quán)利要求26的應(yīng)用，其中在經(jīng)皮給藥進(jìn)入血管周隙之前或者同時(shí)，鑒定可流動(dòng)性 組合物的沉積部位。
28.權(quán)利要求26的應(yīng)用，其中通過(guò)成像鑒定所述部位。
29.權(quán)利要求26的應(yīng)用，其中通過(guò)觸診鑒定所述部位。
30.權(quán)利要求19的應(yīng)用，其中所述管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)的外表面是非腔表面。
31.權(quán)利要求19的應(yīng)用，其中所述管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)的外表面占據(jù)血管周隙。
32.權(quán)利要求19的應(yīng)用，其中所述管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)是血管。
33.權(quán)利要求32的應(yīng)用，其中所述血管包括支架。
34.權(quán)利要求33的應(yīng)用，其中所述受損或患病部位在所述支架附近。
35.權(quán)利要求19的應(yīng)用，其中所述可流動(dòng)性組合物的有效量減少受損或患病部位的平 滑肌細(xì)胞的增殖。
36.權(quán)利要求19的應(yīng)用，其中所述可流動(dòng)性組合物的有效量減輕受損或患病部位的閉塞性血栓。
37.權(quán)利要求19的應(yīng)用，其中所述可流動(dòng)性組合物的有效量減輕受損或患病部位的內(nèi)膜增生。
38.權(quán)利要求19的應(yīng)用，其中所述可流動(dòng)性組合物的有效量減輕受損或患病部位的狹窄或再狹窄。
39.權(quán)利要求19的應(yīng)用，其中所述可流動(dòng)性組合物的有效量減輕受損或患病部位的急 性炎癥。
40.權(quán)利要求19的應(yīng)用，其中所述可流動(dòng)性組合物的有效量減輕受損或患病部位的慢 性炎癥。
41.權(quán)利要求19的應(yīng)用，其中所述可流動(dòng)性組合物的有效量減輕受損或患病部位的血 管舒張或血管痙攣。
42.權(quán)利要求19的應(yīng)用，其中所述管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)選自淚管、氣管、支氣管、細(xì)支氣 管、鼻道、鼻竇、氣道、咽鼓管、外耳道、口腔、食道、胃、十二指腸、小腸、大腸、膽道、輸尿管、 膀胱、尿道、輸卵管、子宮、陰道及其它女性生殖道的通道和輸精管及其它男性生殖道的通 道。
43.權(quán)利要求1的可流動(dòng)性組合物，其中所述細(xì)胞選自鋪滿的細(xì)胞群；接近鋪滿的細(xì) 胞群；鋪滿后的細(xì)胞群；以及具有前述表型的任一種的細(xì)胞群。
44.權(quán)利要求1的可流動(dòng)性組合物，其中所述組合物是通過(guò)最小侵入性閉合性手術(shù)方法遞送的。
45.權(quán)利要求1的可流動(dòng)性組合物，其中所述組合物是通過(guò)穿過(guò)或透過(guò)所述管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)的內(nèi)壁遞送的。
46.權(quán)利要求1的可流動(dòng)性組合物，其中所述管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)是天然結(jié)構(gòu)或手術(shù)產(chǎn)生的吻合口。
47.用于治療管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)內(nèi)腔的受損或患病部位的可流動(dòng)性組合物，其中所述可流動(dòng)性組合物包括生物相容性基質(zhì)、細(xì)胞以及合適的載體流體，并且所述可流動(dòng)性組合物的量是有效治療受損或患病部位的量。
48.權(quán)利要求47的可流動(dòng)性組合物，其中所述載體流體選自藻酸鹽、糖溶液、淀粉溶液、明膠、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基、內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、其它細(xì)胞生長(zhǎng)介質(zhì)或中性緩沖鹽。
49.權(quán)利要求1、19和47所述的可流動(dòng)性組合物，其中所述細(xì)胞是非內(nèi)皮細(xì)胞，所述非內(nèi)皮細(xì)胞為源自血管或非血管組織或器官而在功能上如同內(nèi)皮細(xì)胞或具有內(nèi)皮細(xì)胞樣表型的同種異體、異種或自體細(xì)胞。
50.權(quán)利要求1、19和47所述的可流動(dòng)性組合物，其中所述細(xì)胞被基因改造、基因修飾或基因工程化以在功能上如同內(nèi)皮細(xì) 胞或具有內(nèi)皮細(xì)胞樣表型。
51.權(quán)利要求1、19和47所述的可流動(dòng)性組合物，其中所述細(xì)胞當(dāng)與生物相容性基質(zhì)聯(lián)合時(shí)顯示一種或多種優(yōu)選的易鑒定表型或功能特性，其可以促進(jìn)、修復(fù)和/或以其它方式調(diào)節(jié)與治療受損或患病靶血管內(nèi)皮或另一管狀解剖學(xué)結(jié)構(gòu)的受損或患病靶腔相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞生理和/或腔內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。
52.權(quán)利要求51所述的可流動(dòng)性組合物，其中由所述細(xì)胞所顯示的優(yōu)選的易鑒定表型是抑制或以其它方式干擾平滑肌細(xì)胞增殖的能力。
53.權(quán)利要求51所述的可流動(dòng)性組合物，其中由所述細(xì)胞所顯示的優(yōu)選的易鑒定表型是它們抗血栓或能抑制血小板粘附和聚集。
54.權(quán)利要求1、19和47所述的可流動(dòng)性組合物，其中所述細(xì)胞不需要顯示一種以上優(yōu)選的易鑒定表型。
55.權(quán)利要求1、19和47所述的可流動(dòng)性組合物，其中所述細(xì)胞顯示一種以上優(yōu)選的易鑒定表型。
56.權(quán)利要求2、19和47所述的可流動(dòng)性組合物，其中所述表型是抑制性表型。
全文摘要
本發(fā)明為含細(xì)胞的可流動(dòng)組合物的最小侵入性給藥的材料和方法。本發(fā)明的公開(kāi)基于這樣的發(fā)現(xiàn)基于細(xì)胞的療法可以用于治療、緩解、控制和/或減少與血管介入或心血管疾病相關(guān)的臨床后遺癥，尤其是閉塞性血栓癥、再狹窄、內(nèi)膜增生、炎癥和血管舒張的進(jìn)展。本發(fā)明進(jìn)一步受益于另一發(fā)現(xiàn)，即，迄今為止尚未記載的可植入性可流動(dòng)性組合物能提供鋪滿的活力充足的細(xì)胞群，其可以通過(guò)最小侵入性手術(shù)方法有效給藥而不降低臨床效果或細(xì)胞的存活率。本公開(kāi)的發(fā)明可以用于治療血管結(jié)構(gòu)和非血管管狀結(jié)構(gòu)如輸卵管。
文檔編號(hào)A61L27/38GK103055350SQ201210448869
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2005年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月8日
發(fā)明者海倫·瑪麗·紐金特, 埃拉澤爾·埃德?tīng)柭? 史蒂夫·博林格 申請(qǐng)人:夏爾再生醫(yī)學(xué)公司