專利名稱：抗菌肽lz1和該抗菌肽在制備抗菌藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)中的多肽藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及抗菌肽LZl和該抗菌肽在制備抗菌藥物中的用途。
背景技術(shù)：
自從青霉素等抗生素被發(fā)現(xiàn)以來，針對(duì)細(xì)菌感染性疾病的治療有了根本的改善，抗生素的使用拯救了無數(shù)病人的生命，延長(zhǎng)了人類的平均壽命。但隨著抗生素的大規(guī)模使用或?yàn)E用，尤其是在發(fā)展中國(guó)家，導(dǎo)致了一些抗藥性的細(xì)菌的產(chǎn)生和擴(kuò)散，其中包括一些毒力很強(qiáng)的致病菌，像葡萄球菌與肺炎鏈球菌等。因此，尋找安全有效且不易產(chǎn)生耐藥性質(zhì)的抗菌藥物成為全世界科學(xué)家競(jìng)爭(zhēng)和努力的方向。抗菌肽是當(dāng)生物受到微生物侵入后機(jī)體迅速產(chǎn)生的高效、廣譜的抗菌肽類分子，來參與機(jī)體的免疫反應(yīng)。一般由12到100個(gè)氨基酸組成，大小從幾kDa到十幾kDa不等?？咕淖鳛闄C(jī)體有效的防御分子是廣泛存在的，目前已從微生物、植物、昆蟲、節(jié)肢動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、哺乳動(dòng)物甚至人體內(nèi)鑒定出上千種抗菌肽?？咕脑诤铣蓹C(jī)制、氨基酸組成和作用機(jī)制等方面不同于傳統(tǒng)的微生物(包括細(xì)菌、真菌和鏈霉菌等)產(chǎn)生的抗生素?？咕牟粌H具有廣譜的抗菌活性，其在抗病毒、抗真菌、抗寄生蟲以及抗腫瘤等方面也表現(xiàn)出較高的生物活性?？咕目咕鷻C(jī)理復(fù)雜，但大多數(shù)理論都認(rèn)為其機(jī)制涉及到抗菌肽的陽離子性和疏水性與帶負(fù)電荷的微生物胞膜的作用，抗菌肽和細(xì)菌的細(xì)胞膜接觸后，引起膜通透性改變，或在細(xì)菌細(xì)胞膜上形成跨膜的孔洞，最后導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)容物外泄而死亡。因此，抗菌肽在殺滅細(xì)菌的速度上要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的抗生素，且不像抗生素在低濃度下抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，抗菌肽對(duì)細(xì)菌的作用幾乎都是致死性的?？咕牡陌l(fā)現(xiàn)和快速發(fā)展為開發(fā)新型抗菌肽類抗菌藥物提供了巨大的資源庫，也為解決臨床耐藥菌株的問題提供了極大的可能性，在醫(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、食品工業(yè)等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用前景。隨著人們對(duì)抗菌肽抗菌機(jī)理的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和新的抗菌肽的發(fā)現(xiàn)，人們不僅可以從生物體內(nèi)直接分離純化得到抗菌肽，也可以利用基因工程手段重組得到抗菌肽，又可以直接利用化學(xué)合成手段在短時(shí)間內(nèi)合成大量小分子抗菌肽。天然來源的抗菌肽部分會(huì)因?yàn)榉肿恿枯^大存在免疫原性，抗菌活性低，對(duì)宿主細(xì)胞有細(xì)胞毒作用，或會(huì)引起溶血等方面限制了抗菌肽作為抗菌藥物的推廣應(yīng)用，因此，尋找分子量更小，抗菌活性更強(qiáng)，尤其是不能存在溶血或細(xì)胞毒作用的抗菌肽才是解決抗菌肽作為抗菌藥物推廣的最關(guān)鍵的因素。近幾年來，科學(xué)家們?cè)趯ふ倚滦涂咕牡耐瑫r(shí)也開始致力于對(duì)原有的天然抗菌肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造或重新設(shè)計(jì)，比方說更換某些氨基酸殘基或根據(jù)需要直接設(shè)計(jì)抗菌肽氨基酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)，以期獲得活性更高、更有針對(duì)性同時(shí)對(duì)宿主細(xì)胞無毒害作用的抗菌肽。對(duì)抗菌妝的改造主要集中在Cecropins、Magainins、Defensins 和 cathelicidin家族，尤以對(duì)Cecropin類抗菌肽的改造研究的最多，新型抗菌肽分子設(shè)計(jì)也大多以該類抗菌肽為基礎(chǔ)，該類抗菌肽的結(jié)構(gòu)已很明確，其長(zhǎng)度為33 39個(gè)氨基酸殘基，分子量約為4kDa，肽鏈N端富含親水性氨基酸，特別是堿性氨基酸Lys、Arg等，C端富含疏水性氨基酸Leu、lie、Val等，C末端是酞胺化的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的具有藥用價(jià)值的抗菌肽LZl。本發(fā)明的另一目的在于提供上述抗菌肽在制備抗菌藥物方面的用途?？咕腖Z1，所述的抗菌肽LZl為人工設(shè)計(jì)合成的活性多肽，包含15個(gè)氨基酸殘基，分子量為2228. 77Da，等電點(diǎn)為12. 05，其全序列為纈氨酸-賴氨酸-精氨酸-色氨酸-賴氨酸-賴氨酸-色氨酸-色氨酸-精氨酸-賴氨酸-色氨酸-賴氨酸-賴氨酸-色氨酸-纈氨酸-NH2。優(yōu)選地，所述的全序列的C-端酰胺化。本發(fā)明中的抗菌肽在制備抗菌藥中的用途。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明中的抗菌肽LZl為人工合成，具有分子量小、人工合成方便，殺菌作用強(qiáng)、抗菌譜廣等優(yōu)點(diǎn)，此外抗菌肽LZl還具有極低溶血活性和真核細(xì)胞毒性的特點(diǎn)。


圖I為二倍稀釋法示意圖。圖2抗菌肽LZl的抗菌活性，其中LZl MIC :即抗菌肽LZl的最小抑菌濃度，以上
結(jié)果為三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)平均值。圖3抗菌肽LZl溶血活性分析(人血)，其中LZl :抗菌肽LZl ；NC :生理鹽水，其加樣體積與樣品組相同；PC :Triton X-100，其加樣體積與樣品組相同，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。圖4抗菌肽LZl溶血活性分析(兔血)，其中LZl :抗菌肽LZl ；NC :生理鹽水，其加樣體積與樣品組相同；PC =Triton X-100，其加樣體積與樣品組相同。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。圖5抗菌肽LZl細(xì)胞毒性分析(胚胎腎細(xì)胞HEK)，LZl :抗菌肽LZl ;對(duì)照生理鹽水，其加樣體積與樣品組相同；上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。，
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)的技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例I :抗菌肽LZl的制備I、抗菌肽LZl的化學(xué)合成方法根據(jù)發(fā)明內(nèi)容中所述的氨基酸序列，用自動(dòng)多肽合成儀(433A, Applied Biosystems)合成其全序列,通過HPLC反相柱層析脫鹽純化。II、分子量測(cè)定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-T0F)。III、純化的抗菌肽LZl用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測(cè)定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-T0F)，等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
4
抗菌肽LZl —共包含15個(gè)氨基酸殘基，分子量為2228. 77Da，等電點(diǎn)為12. 05。LZl抗菌肽的全序列如下纈氨酸-賴氨酸-精氨酸-色氨酸-賴氨酸-賴氨酸-色氨酸-色氨酸-精氨酸-賴氨酸-色氨酸-賴氨酸-賴氨酸-色氨酸-纈氨酸-NH2 (C-端酰胺化)。實(shí)施例二 抗菌肽LZl的抗菌實(shí)驗(yàn)最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC):為檢測(cè)不到細(xì)菌生長(zhǎng)的最低樣品濃度。采用二倍稀釋法，如圖1，具體方法如下細(xì)菌接種于Luria-Bertani (LB)固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。待菌落長(zhǎng)出后，用接種環(huán)挑取單菌落轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)箱震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。在紫外分光光度計(jì)上檢測(cè)菌液0D600，根據(jù)10D600=1 X 109CFU/ml將菌液用液體LB培養(yǎng)基稀釋至2X105CFU/ml。在無菌96孔板各孔中預(yù)先加入100 μ I LB液體培養(yǎng)基，然后在第一孔中加入100 μ I稀釋到一定濃度的經(jīng)O. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌的抗菌肽樣品，混勻后取100 μ I加入第2孔，依次倍比稀釋，從第12孔吸出100 μ I棄去，至此二倍濃度梯度樣品即制備好。向各孔中加入已稀釋好的菌液100μ 1，混勻后于37°C緩慢震蕩培養(yǎng)16h，測(cè)定600nm處的光吸收值。結(jié)果計(jì)算取檢測(cè)不到細(xì)菌生長(zhǎng)的孔和與之相鄰的有細(xì)菌生長(zhǎng)的孔樣品濃度之和的平均值作為樣品最小抑菌濃度。此外，痤瘡丙酸桿菌為厭氧菌，培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基為腦心浸液培養(yǎng)基(brainheart infusion BHI),其他條件類似。結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，抗菌肽LZl對(duì)所受試菌種有非常強(qiáng)的殺傷作用，如對(duì)葡萄球菌包括臨床上分離的耐藥菌株的MIC值最低可達(dá)I. 17 μ g/ml,最高也才4. 7 μ g/ml的低濃度,說明抗菌肽LZl在極低濃度下就可抑制葡萄球菌的生長(zhǎng)。同時(shí)，抗菌肽LZl對(duì)幾株包括臨床上分離的白色念球菌也有很好的殺菌效果，最低濃度可達(dá)到I. 17 μ g/ml的濃度。另外，抗菌肽LZl對(duì)兩株痤瘡丙酸桿菌的最小抑菌濃度甚至達(dá)到了 0. 6 μ g/ml，說明抗菌肽LZl對(duì)革蘭氏陽性的桿菌效果尤其顯著。實(shí)施例三抗菌肽LZl的溶血活性實(shí)驗(yàn)兔心臟采血或人靜脈采血，將所采集血液與阿氏液(Alsever Solution，8. Og檸檬酸鈉,0. 55g朽1檬酸,20. 5g glucose, 4. 2g NaCl,加去離子水至1L,調(diào)pH至6. I,高壓滅菌后4°C保存)按I: I比例混合置于離心管中，IOOOrpm離心5min，生理鹽水洗滌至上清液不再呈紅色為止。將上述洗滌好的紅細(xì)胞加生理鹽水稀釋成IO7-IO8濃度的懸浮液。上述稀釋好的紅細(xì)胞懸浮液與溶解于生理鹽水的不同濃度的樣品37°C保溫30min，再于IOOOrpm離心5min,上清液于540nm測(cè)吸收值。陰性對(duì)照使用生理鹽水，陽性對(duì)照使用Triton X-IOO0溶血活性與540nm吸收值成正比。結(jié)果如圖3、圖4所示。由圖3、圖4可知，抗菌肽LZl即使在320 μ g/ml的高濃度下也不會(huì)引起人血和兔血發(fā)生溶血現(xiàn)象。實(shí)施例四抗菌肽LZl的細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)人正常細(xì)胞胚胎腎細(xì)胞HEK 293于含有10%胎牛血清及雙抗(青霉素和鏈霉素各100U/ml)的 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，細(xì)胞用 PBS (NaCl 8. 0g, KCl 0. 2g，Na2HP04 · H2OI. 56g，KH2PO4 O. 20g，加去離子水至1000ml，調(diào)PH值至7. 2)洗三遍后，用O. 25%的胰蛋白酶消化下來，用新鮮DMEM培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1*106個(gè)/ml，以每孔200 μ I的體積鋪96孔板，等細(xì)胞貼壁后，加不同濃度的樣品，在37°C，5%的二氧化碳條件下共培養(yǎng)24 小時(shí)，培養(yǎng)結(jié)束后，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入20 μ I 5mg/ml MTT溶液(用細(xì)胞培養(yǎng)PBS緩沖液配制)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，用移液槍吸出孔中液體，每孔加入100 μ I DMS0，室溫下輕搖10分鐘，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm波長(zhǎng)的光吸收。結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，即使在200 μ g/ml的濃度下抗菌肽LZl對(duì)人正常細(xì)胞胚胎腎細(xì)胞HEK293存在很低的約10%的細(xì)胞毒作用。
權(quán)利要求
1.抗菌肽LZ1，其特征在于所述的抗菌肽LZl為人工設(shè)計(jì)合成的活性多肽，包含15個(gè)氨基酸殘基，分子量為2228. 77Da，等電點(diǎn)為12. 05，其全序列為纈氨酸-賴氨酸-精氨酸-色氨酸-賴氨酸-賴氨酸-色氨酸-色氨酸-精氨酸-賴氨酸-色氨酸-賴氨酸-賴氨酸-色氨酸-纈氨酸-NH2。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種抗菌肽LZ1，其特征在于所述的全序列的C-端酰胺化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)抗菌肽在制備抗菌藥中的用途。
全文摘要
抗菌肽LZ1為人工設(shè)計(jì)合成的活性多肽，包含15個(gè)氨基酸殘基，分子量為2228.77Da，等電點(diǎn)為12.05，其全序列為纈氨酸-賴氨酸-精氨酸-色氨酸-賴氨酸-賴氨酸-色氨酸-色氨酸-精氨酸-賴氨酸-色氨酸-賴氨酸-賴氨酸-色氨酸-纈氨酸-NH2?？咕腖Z1分子量小，殺菌作用強(qiáng)，抗菌譜廣，且基本不具備溶血活性和真核細(xì)胞毒性，是一個(gè)極具應(yīng)用價(jià)值的小分子抗菌肽，加之其人工合成方便，能作為制備抗菌藥的用途。
文檔編號(hào)A61P31/04GK102924574SQ20121042275
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月26日
發(fā)明者賴仞, 張治業(yè) 申請(qǐng)人:蘇州康爾生物醫(yī)藥有限公司, 中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所