專利名稱：川楝子提取物在制備抗病毒藥物中的應用及其提取方法
川楝子提取物在制備抗病毒藥物中的應用及其提取方法技術(shù)領域
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領域，具體涉及川楝子提取物在制備抗病毒藥物中的應用以及該川楝子提取物的提取方法。
背景技術(shù)：
川楝子又名金鈴子，中藥材，為楝科落葉喬木川楝樹Melia toosendan Sieb. et Zucc.的干燥成熟果實，含川楝素、生物堿、山柰醇、樹脂、鞣質(zhì)等，臨床主要用于治療急性乳腺炎、頭癬等?，F(xiàn)代藥理學研究表明，川楝子中的川楝素具有驅(qū)蟲作用(中國獸藥雜志，2008，42 (3) :28-31)、對呼吸中樞的抑制作用及抗肉毒中毒作用(中草藥雜志， 1982，13(6) : 29-30)，另有文獻報道，川楝子醇提取物具有抗甲型流感病毒HlNl的活性(時珍國醫(yī)國藥，2011，22(8) : 1832-1834)，川楝子的乙酸乙酯提取物具有抗HSV-I病毒的活性 (中藥新藥與臨床藥理，2010，21 (I) :7-10)。
單純皰疫病毒HSV (Herpes simplex virus)屬于皰疫病毒科a病毒亞科,根據(jù)抗原性的差別分為I型和2型(HSV-1和HSV-2)，可引起口唇性皰疹、皰疹性角膜炎、皰疹性皮膚炎、陰部皰疹、卡波西病等，有時也是腦膜炎、腦炎的病因，HSV-I常引起腰部以上感染，尤其眼及口腔部位的感染，HSV-I也能引起生殖器皰疹(10%)。
水皰性口炎病毒VSV (Vesicular stomatitis virus)為彈狀病毒科、水皰病毒屬的成員，為單股負鏈RNA病毒，可引起水皰性口炎等疾病。水皰性口炎是多種哺乳動物的一種急性高度接觸性傳染病。以馬、牛、豬等動物較易感，綿羊和山羊也可感染。人也偶有感染，引起流感樣癥狀，嚴重者可引起腦炎。本病被國際獸疫局(OIE)列為A類疾病，在我國水皰性口炎為外來動物病，國家進出境動物檢疫對象中將VSV列為二類疫病。
流行性感冒病毒，簡稱流感病毒，是一種造成人類及動物患流行性感冒的RNA病毒，在分類學上，流感病毒屬于正黏液病毒科，它會造成急性上呼吸道感染，并借由空氣迅速的傳播，在世界各地常會有周期性的大流行。流行性感冒病毒在免疫力較弱的老人或小孩及一些免疫失調(diào)的病人會引起較嚴重的癥狀，如肺炎或是心肺衰竭等。人類流感病毒根據(jù)其核蛋白的抗原性可分為3類甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒，其中WSN 病毒屬于甲型流感病毒。
MHV68是鼠Y皰疹病毒68，是研究Y皰疹病毒的一個很有價值的動物模型，Y皰疹病毒與一些惡性腫瘤密切相關，如Burkitt’ s淋巴瘤、鼻咽癌、Hodgkin’ s病、器官移植后淋巴組織增生癥及AIDS相關B淋巴瘤。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的申請人在川楝子的研究中意外地發(fā)現(xiàn)應用本發(fā)明的提取方法制備的川楝子提取物在體外可顯著抑制單純皰疹病毒HSV-I，其抑制HSV-I的IC50是背景技術(shù)中提到的川楝子的乙酸乙酯提取物的IC50的1/15，活性大大增強。此外，本發(fā)明的申請人還發(fā)現(xiàn)應用本發(fā)明的提取方法制備的川楝子提取物在體外還可顯著抑制水皰性口炎病毒VSV、流感病毒W(wǎng)SN和鼠皰疹病毒68 (MHV68)。
本發(fā)明的一個目的在于提供一種優(yōu)選的川楝子提取物的提取方法，所述方法包括如下步驟
(a)將川楝子用乙醇回流提取；
(b)用大孔吸附樹脂柱純化。
其中，所述步驟(a)包括將川楝子用509Γ90%乙醇回流提取廣3次，每次廣3小時。所述步驟(b)包括將所述步驟(a)中的提取物過濾后離心，取上清液上大孔吸附樹脂柱，先以蒸餾水洗脫，再以309Γ90%乙醇梯度洗脫，收集洗脫液，洗脫液減壓濃縮、冷凍干燥。
本發(fā)明的另一個目的在于提供應用上述提取方法制備的川楝子提取物。
本發(fā)明的另一個目的在于提供應用上述提取方法制備的川楝子提取物用于制備抗病毒藥物的應用。
特別是，川楝子提取物在制備抗皰疹病毒、水皰性口炎病毒及流感病毒藥物中的應用。
此外，本發(fā)明的目的還在于提供一種藥物組合物，包括治療有效量的所述川楝子提取物及至少一種可藥用載體?！爸委熡行Я俊笔侵改軌蜻_到治療效果的提取物的量。本領域的技術(shù)人員能夠理解“治療有效量”可以隨著給藥的方式、載體的使用以及可能和其他治療劑合用等而有所不同。較佳地，本發(fā)明的藥物組合物含有O. 1-99. 9%重量百分比的作為活性成分的本發(fā)明的川楝子提取物?！翱伤幱幂d體”不會破壞本發(fā)明的川楝子提取物的藥學活性，同時其有效用量，即能發(fā)揮藥物載體作用時的用量對人體無毒。所述可藥用載體包括但不限于軟磷脂、硬脂酸鋁、氧化鋁、離子交換材料、自乳化藥物傳遞系統(tǒng)、吐溫或其他表面活化劑、血清蛋白、緩沖物質(zhì)如磷酸鹽、氨基乙酸、山梨酸、水、鹽、電解質(zhì)如硫酸鹽精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、硅酸鎂、飽和脂肪酸部分甘油酯混合物等。
本發(fā)明的藥物組合物還可包括一種或多種常用的藥物輔料，如粘合劑(如微晶纖維素)、填充劑(如淀粉、葡萄糖、無水乳糖和乳糖珠粒)、崩解劑(如交聯(lián)PVP、交聯(lián)羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、低取代羥丙基纖維素)、潤滑劑(如硬脂酸鎂)以及吸收促進劑、 吸附載體、香味劑、甜味劑、賦形劑、稀釋劑、潤濕劑等。
所述藥物組合物可按本領域常規(guī)方法制備并可以通過腸道或非腸道或局部途徑給藥?？诜苿┌ㄆ瑒㈩w粒劑、懸浮液、膠囊、溶液等，非腸道給藥制劑包括注射液。局部給藥制劑包括霜劑、貼劑、軟膏劑、噴霧劑、凝膠劑等。
所述川楝子提取物以及藥物組合物的給藥途徑可以為口服、舌下、經(jīng)皮、經(jīng)肌肉或皮下、皮膚粘膜、靜脈、尿道、陰道等。
所述川楝子提取物及藥物組合物的用量可根據(jù)給藥途徑、患者的年齡和體重、病癥嚴重程度的不同而不同，其日劑量可以是O. 001 100mg/kg，可以一次或多次給藥。
本發(fā)明進一步提出川楝子提取物或以其為基本活性成分的組合物在預防和治療各種由病毒引起的疾病中的用途，這種由病毒引起的疾病包括口唇性皰疹、皰疹性角膜炎、 皰疹性皮膚炎、生殖器皰疹、卡波西病、腦膜炎、腦炎、水皰性口炎、病毒性感冒等。
本發(fā)明的有益效果在本申請的研究中發(fā)現(xiàn)，應用本發(fā)明的提取方法制備的川楝子提取物對HSV-I、VSV、WSN、MHV68均有較強的抑制作用，說明本發(fā)明的川楝子提取物具有較好的抗病毒作用，可用于制備抗皰疹病毒、水皰性口炎病毒及流感病毒藥物或藥物組合物。
具體實施方式
以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
實施例I、川楝子提取物的制備
取藥材粗粉200g，加10倍量50%的乙醇回流提取I次，Ih/次，過濾。合并濾液， 濾液減壓濃縮至每毫升相當于O. 5g生藥,濃縮液離心(3000r/min, 15min)得上清液,再將上清液加入6倍量的大孔吸附樹脂AB8柱上，上樣流速為4BV/h，先以6倍柱體積蒸餾水洗脫，再依次以6倍柱體積309Γ90%乙醇梯度洗脫，收集洗脫液，加壓濃縮適量，然后減壓冷凍干燥至干，粉碎得川楝子提取物4. 5g。
實施例2、川楝子提取物的制備
取藥材粗粉200g，加10倍量70%的乙醇回流提取3次，2h/次，過濾。合并濾液， 濾液減壓濃縮至每毫升相當于O. 5g生藥,濃縮液離心(3000r/min, 15min)得上清液,再將上清液加入6倍量的大孔吸附樹脂HP-20柱上，上樣流速為6BV/h，先以6倍柱體積蒸餾水洗脫，再依次以6倍柱體積309Γ90%乙醇梯度洗脫，收集洗脫液，加壓濃縮適量，然后減壓冷凍干燥至干，粉碎得川楝子提取物6. 4g。
實施例3、川楝子提取物的制備
取藥材粗粉200g，加10倍量90%的乙醇回流提取2次，3h/次，過濾。合并濾液， 濾液減壓濃縮至每毫升相當于O. 5g生藥,濃縮液離心(3000r/min, 15min)得上清液,再將上清液加入6倍量的大孔吸附樹脂DlOl柱上，上樣流速為5BV/h，先以6倍柱體積蒸餾水洗脫，再依次以6倍柱體積309Γ90%乙醇梯度洗脫，收集洗脫液，加壓濃縮適量，然后減壓冷凍干燥至干，粉碎得川楝子提取物7. 2g。
實施例4、川楝子提取物對HSV-I病毒的抑制作用
實驗材料
細胞非洲綠猴腎細胞(Veix)細胞)，購自中科院細胞庫。
病毒HSV_1_GFP。
受試藥物川楝子提取物(按實施例I方法制備)，溶解于DMSO中，制備得60mg/mL 母液。
實驗方法
Vero細胞按常規(guī)方法培養(yǎng)，次日接種于96孔板，待細胞貼壁后，以HSV-I-GFP病毒感染細胞，3小時后，去除含病毒培養(yǎng)液，以一定濃度的川楝子萜類處理細胞，22小時后熒光顯微鏡下觀察GFP蛋白表達情況。同時以O. 4μ g/mL的阿昔洛韋(ACV)處理細胞作為陽性對照。
實驗結(jié)果如以下表I所示。
表I、川楝子提取物對HSV-I病毒的抑制
權(quán)利要求
1.川楝子提取物的提取方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟(a)將川楝子用乙醇回流提?。?b)用大孔吸附樹脂柱純化。
2.如權(quán)利要求I所述的川楝子提取物的提取方法，其特征在于，所述步驟(a)包括將川楝子用50°/Γ90%乙醇回流提取廣3次，每次廣3小時。
3.如權(quán)利要求I所述的川楝子提取物的提取方法，其特征在于，所述步驟(b)包括將所述步驟(a)中的提取物過濾后離心，取上清液上大孔吸附樹脂柱，先以蒸餾水洗脫，再以 309Γ90%乙醇梯度洗脫，收集洗脫液，洗脫液減壓濃縮、冷凍干燥。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的川楝子提取物的提取方法制備的川楝子提取物。
5.如權(quán)利要求4所述的川楝子提取物在制備抗病毒藥物中的應用。
6.如權(quán)利要求5所述的川楝子提取物在制備抗病毒藥物中的應用，其特征在于，所述病毒包括皰疹病毒、水皰性口炎病毒、流行性感冒病毒。
7.如權(quán)利要求6所述的川楝子提取物在制備抗病毒藥物中的應用，其特征在于，所述皰疫病毒包括HSV-I病毒或鼠Y皰疫病毒68。
8.如權(quán)利要求6所述的川楝子提取物在制備抗病毒藥物中的應用，其特征在于，所述流行性感冒病毒為WSN病毒。
9.一種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包括治療有效量的如權(quán)利要求4所述的川楝子提取物，以及至少一種可藥用載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種川楝子提取物的提取方法，所述方法包括如下步驟(a)將川楝子用乙醇回流提??；(b)用大孔吸附樹脂柱純化。本發(fā)明的川楝子提取物具有較好的抗病毒作用，可用于制備抗皰疹病毒、水皰性口炎病毒及流感病毒藥物或藥物組合物。
文檔編號A61K36/58GK102940686SQ201210389839
公開日2013年2月27日 申請日期2012年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月15日
發(fā)明者王滔, 王永兵, 魏晨, 宗偉英, 肖功勝 申請人:中國科學院上海生命科學研究院湖州營養(yǎng)與健康產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新中心, 湖州申科生物技術(shù)有限公司