專利名稱：一種抗菌劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域。特別涉及一種抗菌劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
抗生素是用于治療各種細菌感染或抑制致病微生物感染的藥物。重復(fù)使用一種抗生素可能會使致病菌產(chǎn)生耐藥性。目前，人們對抗生素的高使用頻率和高使用劑量使得細菌耐藥性問題越來越突出。為防止和減少致病菌耐藥性的產(chǎn)生，一方面我們應(yīng)堅持合理用
藥，杜絕濫用抗生素，另一方面要不斷改進和研制新的抗菌藥物。抗菌肽是廣泛分布于生物體內(nèi)的一類多肽分子，分子量通常為200(T7000Da左右，由2(Γ60個氨基酸殘基組成?？咕木哂袕V譜抗菌活性，對細菌有很強的殺傷作用，尤其是其對某些耐藥性病原菌的殺滅作用更引起了研究者的關(guān)注。另外，人們還發(fā)現(xiàn)，某些抗菌肽對部分病毒、真菌、原蟲和癌細胞等具有殺滅作用，甚至能提高免疫力、加速傷口愈合等過程。因此，抗菌肽的廣泛的生物學(xué)活性顯示了其在醫(yī)學(xué)上良好的應(yīng)用前景?？咕脑谧匀唤缰袕V泛存在，人們相繼從細菌、真菌、兩棲類、昆蟲、高等植物、哺乳動物乃至人類中發(fā)現(xiàn)并分離獲得了抗菌肽。但目前抗菌肽的提取過程費時、工藝復(fù)雜、費用昂貴、產(chǎn)量低，無法實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，這成為制約抗菌肽進入實際應(yīng)用的最大障礙。因此，開展抗菌肽基因工程研究具有重要意義。目前，已進入臨床應(yīng)用的基因工程藥物多數(shù)是采用原核表達系統(tǒng)生產(chǎn)的，但由于抗菌肽對細菌的殺傷作用，不能用原核表達系統(tǒng)直接表達具有生物活性的抗菌肽。國內(nèi)研究者大量研究表明，利用酵母表達抗菌肽是一條可行的道路，但表達廣率仍有待進一步提聞。芋螺毒素(conotoxin，CTL)是由海洋軟體動物芋螺(CbflM)分泌的一類用于自衛(wèi)和捕食的活性肽類毒素，能特異性地作用于鉀、鈉、鈣等離子通道、細胞膜上的各種神經(jīng)遞質(zhì)和激素的受體，從而干擾細胞或神經(jīng)中的信號傳遞。芋螺毒素分子質(zhì)量小，通常由1(Γ30個氨基酸殘基組成。研究發(fā)現(xiàn)，盡管芋螺毒素種類繁多，序列多變，但它們的信號肽序列卻非常保守。同時，成熟肽中富含半胱氨酸，具有高度保守的二硫鍵骨架。1992年，Eldridge等人在苜猜尺蠖核型多角體病毒californica multiplenucleopolyhedrovirus,AcMNPV)中發(fā)現(xiàn)了一種與芋螺毒素結(jié)構(gòu)非常類似的小分子肽,根據(jù)其保守的結(jié)構(gòu)特點命名為類芋螺毒素(conotoxin-like，CTL)。序列比對發(fā)現(xiàn)，在目前已測序的桿狀病毒中超過三分之一的病毒含有基因。但到目前為止，還沒有研究揭示其在體內(nèi)和體外的任何功能。我們利用PCR技術(shù)從AcMNPV中克隆到ctl基因，進而構(gòu)建重組桿狀病毒，感染離體昆蟲細胞后，發(fā)現(xiàn)胞外產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌、微球菌、短小芽孢桿菌等多種臨床致病菌具有抑制活性，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種抗菌劑及其制備方法。
本發(fā)明公開了一種含有ctl基因、啟動子的中間載體pFastBac-Piel-ctl,它的結(jié)構(gòu)如圖2所示。所述中間載體pFastBac-Piel-ctl是通過下述方法構(gòu)建得到
(1)根據(jù)苜蓿尺蠖核型多角體病毒(AcMNPV)的基因設(shè)計一對引物，以AcMNPV基因組DNA作為模板進行PCR擴增，反應(yīng)條件為94°C 4min ； 94°C 20s, 62°C 30s, 72 V30s, 30個循環(huán)；72°C 7min。瓊脂糖凝膠電泳后進行膠回收，將基因連入pMD18_T形成重組質(zhì)粒pMD18-T_ctl ；
(2)利用SnaBI和BamHI將家蠶核型多角體病毒(BmNPV)的Piel啟動子取代pFastBacl上原有的多角體基因啟動子，得到pFastBacl-Piel ；用BamHI和KpnI切割重組質(zhì)粒pMD18-T-ctl，回收ctl片段，克隆到經(jīng)同樣雙酶切的pFastBacl-Piel，將基因置于Piel啟動子下游，構(gòu)建出中間載體pFastBac-Piel-ctl。本發(fā)明所述抗菌劑，通過以下步驟制備得到
Cl)制備含有類芋螺毒素(Ci7)基因的中間載體PFastBac-Piel-ctl，所述中間載體包括來自家蠶核型多角體病毒(BmNPV)早期啟動子朽W、來自苜蓿尺蠖核型多角體病毒(AcMNPV)的 ctl 基因；
(2)將所述的中間載體轉(zhuǎn)化含桿粒DNA的大腸桿菌DHlOB菌株，經(jīng)轉(zhuǎn)座后，通過藍白斑篩選含有重組桿粒的大腸桿菌，提取含ctl基因的重組桿粒DNA ;用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將所述的重組桿粒DNA轉(zhuǎn)染離體培養(yǎng)的昆蟲細胞，收集含有ctl基因的重組病毒BV粒子的細胞培養(yǎng)液，作為重組病毒的種子液；
(3)以病毒種子液感染大量培養(yǎng)的昆蟲細胞，感染3飛天后，離心收集細胞培養(yǎng)物的上清液，直接作為抗菌劑。昆蟲-桿狀病毒表達系統(tǒng)是基因工程四大表達系統(tǒng)之一，以該系統(tǒng)表達外源蛋白時，產(chǎn)量高。本發(fā)明所用的類芋螺毒素基因(Ci7)來源于桿狀病毒，利用桿狀病毒能感染的昆蟲細胞生產(chǎn)CTL類抗菌劑，有利于表達產(chǎn)物形成具有生物活性的天然結(jié)構(gòu)。此外，桿狀病毒只感染鱗翅目等無脊椎動物，對人畜無害，因此，本發(fā)明生產(chǎn)的抗菌劑具有很高的安全性。


圖I :重組桿狀病毒的構(gòu)建。A :PCR擴增基因；B :中間載體pFastBac-Piel-ctl酶切鑒定；C :重組病毒的PCR鑒定。Ml DL2000 ；Μ2 λ-HindIII ；1 基因的PCR產(chǎn)物；2 =BamHI/KpnI雙酶切；3 =SnaBI/BamHI雙酶切；4 :重組病毒的PCR鑒定；5 :野生型病毒對照。圖2 :中間載體 pFastBac-Piel-ctl 圖譜。圖3 =AcMNPV CTL抑菌實驗。A :金黃色葡萄球菌，B :微球菌，C :短小芽孢桿菌；1 野生型AcMNPV (100 Ug總蛋白)，2 :氨芐青霉素(10 μ g)，3 5 :重組AcMNPV (分別為50，100，150 1^總蛋白)。
具體實施例方式在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體的實施例，并參照數(shù)據(jù)進一步詳細地描述本發(fā)明。這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例一中間載體pFastBac-Piel-ctl的構(gòu)建 UAcMNPV基因組中基因的克隆與鑒定
根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫AcMNPV基因組的中基因序列(Gene ID: 9627745)設(shè)計并合成一對引物(PI : 5 ’ -AGGGGATCCATGCAAATCAAAACTGTAC-3，(SEQ ID NO. I) :P2 :5’ -TGGGGTACCTTGTGGTAAGCAATMTTAAATATG-3’ (SEQ ID NO. 2)，下劃線部分為BamHI 和KpnI 的酶切位點)。以AcMNPV基因組DNA作為模板進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為94°C 4min ； 94°C 20s，62°C 30s, 72 V 30s, 30個循環(huán)；72°C 7min。2%瓊脂糖凝膠電泳(見圖1A)，切膠回收目的片段，直接與PMD18-T (TAKARA公司)16°C過夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5 α菌株，經(jīng)PCR和酶切鑒定出陽性重組質(zhì)粒pMD18-T-ctl，并進行DNA測序鑒定。2、中間載體pFastBac-Piel-ctl的構(gòu)建與鑒定
根據(jù)家蠶核型多角體病毒(BmNPV)基因組的中iel基因啟動子序列設(shè)計并合成一對引物(P3 :5’-TCTTACGTAGATTTGCAGTTCGGGACATAA-3，(SEQ ID NO. 3))(P4 :5，-GTTCAGGATCCTGTCGCCGCCAATGTCA-3’(SEQ ID NO. 4))，下劃線部分為 SnaBI 和 BamHI 的酶切位點。以 BmNPV基因組DNA作為模板進行PCR擴增，擴增條件如上所述，PCR產(chǎn)物經(jīng)SnaBI/BamHI雙酶切后取代中間載體pFastBacl( Invitrogen公司)上原有的多角體基因啟動子,形成具有Piel啟動子的中間載體pFastBacl-Piel。將pMD18-T-ctl用BamHI和KpnI酶切后，回收ctl片段，然后克隆到pFastBacl-Piel的BamHI-KpnI位點，所構(gòu)建的中間載體pFastBac-Piel-ctl的圖譜見圖2。采用雙酶切法鑒定中間載體用SnaBI和BamHI進行雙酶切，可切出一條621bp的啟動子片段；用BamHI和KpnI雙酶切，可切出一條159bp的基因片段(見圖1B)。實施例二重組桿狀病毒的構(gòu)建 I、重組桿狀病毒的構(gòu)建與鑒定
取5 μ L pFastBacl-Piel-ctl轉(zhuǎn)化含有AcMNPV的大腸桿菌DHlOB菌株，或轉(zhuǎn)化含有BmNPV的大腸桿菌DHlOB菌株，轉(zhuǎn)化后涂布于LBac平板，37°C靜止培養(yǎng)24 48 h，使藍斑顯色充分，挑取白色菌落，進一步在LBac平板上劃線純化。將純化的白色菌落接種于LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素、四環(huán)素、慶大霉素)，37°C振蕩培養(yǎng)18 20h，提取重組AcMNPV或BmNPV的 DNA，使用 M13 通用引物(P5 :5’ -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’ (SEQ ID NO. 5) ；P6 5’-AGCGGATAACAATTTCACACGGGA -3’ (SEQ ID NO. 6))進行 PCR 鑒定，擴增大小約為 2. 9kbp(見圖1C)。2、重組桿狀病毒BV粒子的獲得
27°C培養(yǎng)離體的Tn細胞或BmN細胞，每3天更換新鮮培養(yǎng)液一次。使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將重組AcMNPV轉(zhuǎn)染Tn細胞，或?qū)⒅亟MBmNPV轉(zhuǎn)染BmN細胞，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)3飛天，低速離心收集細胞上清液，上清液中含有大量重組病毒的BV粒子，作為重組病毒種子液。實施例三抗菌劑的制備及活性檢測 I、抗囷劑的制備
將上述種子液接種于大量培養(yǎng)的Tn細胞或BmN細胞，感染3飛天后，低速離心，收集上清液，作為抗菌劑。2、抗菌劑活性的檢測采用Bradford法檢測抑菌劑中蛋白質(zhì)的含量，取不同蛋白質(zhì)質(zhì)量的抑菌劑，在LB平板上檢測其對金黃色葡萄球菌、微球菌、短小芽孢桿菌等的抗菌活性，抗菌活性以相對抑制率為指標
相對抑制率=新型抑菌劑的抑菌圈直徑/IOPg氨芐青霉素的抑菌圈直徑X100%
權(quán)利要求
1.一種含有cW基因、啟動子的中間載體pFastBac-Piel-ctl，其特征在于，它的結(jié)構(gòu)如圖2所示，它通過下述步驟構(gòu)建得到 (1)根據(jù)苜蓿尺蠖核型多角體病毒的^7基因設(shè)計引物，以苜蓿尺蠖核型多角體病毒基因組DNA作為模板進行PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及膠回收后，將ctl基因連入PMD18-T，形成含有ctl基因的重組質(zhì)粒pMD18-T-ctl ； (2)利用SnaBI和BamHI將家蠶核型多角體病毒的Piel啟動子取代pFastBacl上原有的多角體基因啟動子，得到pFastBacl-Piel ；用BamHI和KpnI切割重組質(zhì)粒pMD18-T_ctl，回收ctl基因片段，克隆到pFastBacl-Piel，構(gòu)建含有ctl基因的中間載體pFastBac-Piel-ctlo
2.一種抗菌劑，其特征在于通過下述步驟制得 (1)將權(quán)利要求I所述中間載體pFastBac-Piel-ctl轉(zhuǎn)化含桿粒DNA的大腸桿菌DHlOB菌株，經(jīng)轉(zhuǎn)座后，通過藍白斑篩選含有重組桿粒的大腸桿菌，提取含ctl基因的重組桿粒DNA ;用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將所述的重組桿粒DNA轉(zhuǎn)染離體培養(yǎng)的昆蟲細胞，收集含有ctl基因的重組病毒BV粒子的細胞培養(yǎng)液，作為重組病毒的種子液； (2)以病毒種子液感染大量培養(yǎng)的昆蟲細胞，感染3飛天后，離心收集細胞培養(yǎng)物的上清液，得到抗菌劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗菌劑及其制備方法。采用PCR技術(shù)從苜蓿尺蠖核型多角體病毒(AcMNPV)中克隆類芋螺毒素基因(ctl)，構(gòu)建中間載體pFastBac-Pie1-ctl，經(jīng)轉(zhuǎn)座后構(gòu)建含有ctl基因的重組桿狀病毒，感染離體培養(yǎng)的昆蟲細胞，離心收集細胞外表達產(chǎn)物，胞外表達產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌、微球菌、短小芽孢桿菌等多種臨床致病菌具有抑制活性。本發(fā)明借助昆蟲-桿狀病毒表達系統(tǒng)高效表達CTL類抗菌劑，安全性高，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。
文檔編號A61K39/12GK102787138SQ20121027594
公開日2012年11月21日 申請日期2012年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月6日
發(fā)明者何華綱, 曹青, 朱姍穎, 王文兵 申請人:江蘇大學(xué)