專(zhuān)利名稱(chēng)：利用中波紫外線對(duì)離體皮膚消毒的方法及其產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種消毒方法，具體涉及利用中波紫外線對(duì)離體皮膚消毒的方法，還涉及用該方法制得的產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
異體和異種皮膚是臨床上替代自體皮膚治療大面積燒傷的主要敷料，但異種和異體皮膚抗原性強(qiáng)，特別是新鮮皮膚，還帶有大量的菌污染，皮膚移植后的強(qiáng)烈免疫排斥反應(yīng)往往會(huì)導(dǎo)致皮膚過(guò)早的壞死。中波紫外線(UltravioletRadiationB, UVB),是到達(dá)地球表面的紫外線中引起機(jī)體生物學(xué)效應(yīng)的主要光譜，波長(zhǎng)280-320nm。 經(jīng)研究表明311nm的窄譜中波紫外線(NB-UVB)在治療銀屑病具良好單一性，紅斑反應(yīng)、色素沉著輕微，且療效可靠，可產(chǎn)生最佳治療效果，單純NB-UVB照射治療銀屑病有效率可達(dá)73. 3%，而290-300nm波長(zhǎng)的UVB可致皮膚灼傷(紅斑效應(yīng)和角質(zhì)形成細(xì)胞壞死)，而無(wú)治療作用。目前，利用中波紫外線對(duì)離體皮膚消毒還處理空白，如何在降低離體皮膚免疫原性的同時(shí)，帶菌量少，又可保持離體皮膚活性較高。是皮膚移植中亟待解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供利用中波紫外線對(duì)離體皮膚消毒的方法，操作簡(jiǎn)單方便，條件易于控制，對(duì)離體皮膚活性影響較小，并能有效控制離體皮膚的帶菌量和降低免疫原性。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，技術(shù)方案為
利用中波紫外線對(duì)離體皮膚消毒的方法，將離體皮膚用電壓為18(T240V，照射劑量為10(T400J/cm2的中波紫外線照射。優(yōu)選的，所述離體皮膚置于溫度為(T25°C，濕度為40-70%的環(huán)境下。更優(yōu)選的，所述離體皮膚置于溫度為25°C，濕度為60%環(huán)境下，用電壓為220V，照射劑量為300J/cm的中波紫外線照射。更優(yōu)選的，波紫外線照射前還包括離體皮膚預(yù)處理，具體為將離體皮膚制成厚度為I. Omm的材料。本發(fā)明中離體皮膚可以選用臨床上可接受的皮膚，優(yōu)選的離體皮膚為離體豬皮，具有來(lái)源廣泛，成本低的特點(diǎn)。本發(fā)明的目的之二在于提供由中波紫外線對(duì)離體皮膚消毒制備的離體皮膚，其免疫原性低，帶菌量少，皮膚活性高。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，技術(shù)方案為
所述利用中波紫外線對(duì)離體皮膚消毒的方法制備的離體皮膚。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明公開(kāi)的利用中波紫外線對(duì)離體皮膚消毒的方法，操作簡(jiǎn)單，條件易于控制，對(duì)離體皮膚活性影響較小，并且制得的離體皮膚帶菌量少，免疫原性低，能用于臨床上替代自體皮膚治療大面積燒傷的敷料，具有廣泛的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式以下將參照實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。一、消毒方法
利用中波紫外線對(duì)立體豬皮進(jìn)行消毒的方法，具體步驟如下
A制皮
取新鮮豬皮，然后制成厚度為O. 8-1. Omm的離體豬皮，切塊，備用；
B照射
將步驟A處理的離體豬皮放置于中波紫外線(UVB)恒溫箱，并保持豬皮與UVB燈管的 距離小于20cm，按照表I設(shè)計(jì)的正交試驗(yàn)對(duì)豬皮進(jìn)行處理，得消毒豬皮。取新鮮豬皮，未經(jīng)UVB處理皮為陰性對(duì)照，以25kGYCo~60照射為陽(yáng)性對(duì)照。25kGYCo~60表示用25kGY鈷-60的劑量，在輻射加工過(guò)程中，受照物質(zhì)單位質(zhì)量所吸收的能量，國(guó)際單位定義為戈瑞(Gy)，I戈瑞表示I千克(Kg)物質(zhì)吸收I焦耳(J)能量，I Gy = I J/ Kg ;輻射加工中常用千戈瑞(KGy)表示吸收劑量。表I.正交實(shí)驗(yàn)法UVB照射豬皮因素與水平表
因素一
I,壓I 溫度(-ο；) MS. (%)照射_重(J/cm)
1__180__O__40__IOO_
2__200__5__BO__200_
3__220__15__60__300_
4丨 240 I 25 I 70 I400
備注V—電壓；T一溫度；S—濕度；Z—照射劑量處理后測(cè)定皮膚各指標(biāo)，分別為UVB對(duì)皮膚表皮細(xì)胞刺激淋巴細(xì)胞增殖抑制率(YZL)；UVB照射對(duì)皮膚LC數(shù)量下降百分率(LC)5UVB對(duì)皮膚帶菌量細(xì)菌下降百分率(XJ)和UVB照射后的皮膚活性百分率(HX)。二、淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) I)淋巴細(xì)胞的分離
將淋巴細(xì)胞分離液(購(gòu)自上海研拓生物科技有限公司)與健康人全血按體積比為1:1先后加入離心管，在溫度為25°c、轉(zhuǎn)速為3000rpm條件下離心20分鐘；吸取中間層淋巴細(xì)胞層，并用淋巴細(xì)胞分離液清洗3次，然后進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%CS-RPMI1640調(diào)整細(xì)胞濃度至IXlO6 cells/ml。2)表皮細(xì)胞的分離
將消毒豬皮剪成O. 3cmX 2cm皮條，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 25%的胰蛋白酶(胰蛋白酶與消毒豬皮的體積比為5 :1)，置于4°C冰箱中消化15小時(shí)，用鑷子輕輕揭下表皮。將表皮剪碎在溫度為37°C條件下，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 25%胰蛋白酶搖床中熱消化O. 5小時(shí)，加入相當(dāng)于消化液1/10體積的血清終止消化，在轉(zhuǎn)速為IOOOrpm條件下離心5分鐘，然后進(jìn)行活細(xì)胞細(xì)胞計(jì)數(shù)，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% CS-RPMI 1640調(diào)整細(xì)胞濃度至I X IO6 cells/mL。3)制板
在96孔板中每孔加入IXlO5 cells淋巴細(xì)胞和I X IO4Cells表皮細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，空白組單獨(dú)加入IXio5 cells淋巴細(xì)胞，對(duì)照組加相同數(shù)量的未經(jīng)UVB處理離體豬皮分離的I X IO4ceIls表皮細(xì)胞和I X IO5 cells淋巴細(xì)胞，其余用培養(yǎng)液補(bǔ)足，每組做5個(gè)復(fù)孔。加液完畢，移96孔板在溫度為37°C，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2孵育50小時(shí)，然后在轉(zhuǎn)速為IOOOrpm條件下離心5分鐘，棄液加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 05%氯丁膠新型交聯(lián)劑(MTT) 100 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，培養(yǎng)結(jié)束后，棄液加入150 μ L 二甲基亞砜(DMSO)，吹打均勻，待紫色結(jié)晶完全溶解，置96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板于酶聯(lián)反應(yīng)檢測(cè)儀在波長(zhǎng)為570nm處測(cè)定OD值。根據(jù)如下公式計(jì)算抑制率抑制率=1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值/對(duì)照組OD值-空白組OD值)X 100%,結(jié)果如表2所示。三、ATP酶染色朗格漢細(xì)胞(LC)
按照上述方法分離消毒豬皮的表皮為實(shí)驗(yàn)組，并以未經(jīng)UVB處理的離體豬皮分離表皮作為對(duì)照組。
I) ATP 酶染色
將分離下來(lái)的表皮分別放入含30g/L的Tris和29g/L的馬來(lái)酸緩沖液中展開(kāi)(包括實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組)，洗滌3次，每次洗滌10分鐘；放入含12. 8g/L的二甲腫酸和40g/L的福爾馬林的固定液中，在溫度為4°C條件下固定20分鐘；將固定好的表皮放入含O. 45g/L ATP二鈉和2. Og/L硝酸鉛的孵育液中，在溫度為37°C條件下孵育40分鐘；孵育后用濃度為O. Imol/L的Tris-馬來(lái)酸緩沖液(pH5. 0-8. 5)洗滌3次，每次清洗10分鐘；然后在含llg/L的硫化銨中顯色20分鐘；再用自來(lái)水沖洗10分鐘。將真皮面向上展平在載玻片上，用甘油明膠封固后，在光鏡放大100倍下觀察ATP酶染色陽(yáng)性的樹(shù)突狀細(xì)胞(朗格漢細(xì)胞)的大小和分布，并顯微攝影。2)表皮單位面積LC數(shù)量的測(cè)定
在光鏡放大100倍下，隨機(jī)選10視野，用目鏡網(wǎng)格測(cè)微器計(jì)算每mm2面積內(nèi)ATP酶染色陽(yáng)性樹(shù)突狀細(xì)胞(朗格漢細(xì)胞)數(shù)量，UVB照射對(duì)皮膚LC數(shù)量下降百分率=(對(duì)照組LC數(shù)量-實(shí)驗(yàn)組LC數(shù)量)/對(duì)照組LC數(shù)量X 100%,結(jié)果如表2所示。四、帶菌量檢測(cè) I)消毒豬皮處理
將消毒豬皮加入滅菌生理鹽水，其中消毒豬皮的重量與生理鹽水的體積比為I :2，然后將消毒豬皮培養(yǎng)皿用眼科剪將皮片剪成糊狀。2)菌培養(yǎng)
以金黃色葡萄球菌和白色念珠菌為陽(yáng)性對(duì)照，以生理鹽水為陰性對(duì)照，具體方法參照國(guó)家藥典委員會(huì)主編.中華人民共和國(guó)藥典三部.2005年版，附錄73-84。在滅菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒成培養(yǎng)平板上接種100 μ L消毒豬皮勻漿液，每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)。然后在溫度為30°C條件下培養(yǎng)48小時(shí)，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。用以下公式計(jì)算消毒豬皮的帶菌量，cfu/g=菌落個(gè)數(shù)/(皮片重gXlOOyL/加入生理鹽水的量yL)。UVB對(duì)皮膚帶菌量細(xì)菌下降百分率=(陽(yáng)性對(duì)照組cfu/g-實(shí)驗(yàn)組cfu/g) /陽(yáng)性對(duì)照組cfu/gX 100%,結(jié)果如表2所示。表2、UVB照射豬皮條件正交實(shí)驗(yàn)法試驗(yàn)的結(jié)果
~ If \τ |5 Y \yzl (%) \lc (%) \xj (%) ψχ (%)
~T80"~40 Too" I 0. 281 ~0. 1472099~O. 182168~ O. 9022 | 80 |5 |50|200 \2 |θ. 538|θ· 30253 |θ· 565851 |θ. 91權(quán)利要求
1.利用中波紫外線對(duì)離體皮膚消毒的方法，其特征在于將離體皮膚用電壓為180 240V，照射劑量為10(T400J/cm2的中波紫外線照射。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述利用中波紫外線對(duì)離體皮膚消毒的方法，其特征在于所述離體皮膚置于溫度為(T25°C，濕度為40-70%的環(huán)境下。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述利用中波紫外線對(duì)離體皮膚消毒的方法，其特征在于所述離體皮膚置于溫度為25°C，濕度為60%環(huán)境下，用電壓為220V，照射劑量為300J/cm的中波紫外線照射。
4.根據(jù)權(quán)利1-3任一項(xiàng)所述利用中波紫外線對(duì)離體皮膚消毒的方法，其特征在于中波紫外線照射前還包括離體皮膚預(yù)處理，具體為將離體皮膚制成厚度為O. 8-1. Omm的材料。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述利用中波紫外線對(duì)離體皮膚消毒的方法，其特征在于所述離體皮膚為離體豬皮。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述利用中波紫外線對(duì)離體皮膚消毒的方法制備的離體皮膚。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了利用中波紫外線對(duì)離體皮膚消毒的方法，具體為，將離體皮膚用電壓為180~240V，照射劑量為100~400J/cm的中波紫外線照射，其方法簡(jiǎn)單，條件可控，消毒后的皮膚活性高，帶菌量少，并且抗原性強(qiáng)，制備的消毒皮膚能夠用于替代自體皮膚治療大面積燒傷的敷料。
文檔編號(hào)A61L2/10GK102716505SQ201210217819
公開(kāi)日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月28日
發(fā)明者劉宇, 商海濤, 曾本華, 王勇, 郭科男, 魏泓 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)