專利名稱：mTOR作為標靶在篩選治療尼古丁成癮藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及mTOR作為標靶在篩選治療尼古丁成癮藥物中的應用，屬于醫(yī)藥技術領域。
背景技術：
吸煙有害健康已成為全社會關注的公共衛(wèi)生問題，吸煙會引發(fā)癌癥、心腦血管、呼吸道及消化道疾病等疾病，全世界每年因吸煙死亡的人數達500多萬，與煙草相關的疾病占全球死因第一位。據衛(wèi)生部《2007年中國控制吸煙報告》報道中國是世界上最大的煙草生產國和消費國，煙草生產量占世界總量的三分之一，至2006年末，我國吸煙者達3. 5億，占全球吸煙總人數的三分之一，被動吸煙者5. 4億，每年約有100萬人死于吸煙相關疾病，因吸“二手煙”導致死亡的人數已超過10萬，預計到2020年我國每年將有200萬人死于吸、煙相關疾病。這相當于每Ils就有I人被煙草奪去生命。研究表明，吸煙成癮性物質主要是尼古丁，但是目前市場上缺乏有效的戒煙產品。戒煙難，無有效藥，主要與煙中的尼古丁有關。吸煙成癮其實質是尼古丁依賴，1998年WHO《國際疾病分類(第10版)》已將煙草依賴列為一種慢性病，即屬于精神和行為障礙的煙草依賴綜合征。戒煙是對一種慢性病的治療，本質是戒除對尼古丁的依賴。目前，戒煙主要采用針對尼古丁受體的替代療法(nicotine replacementtherapy, NRT)和對癥治療，現在在中國比較流行的戒煙產品“如煙”就是此類產品，但是根據使用該產品的人群表示，產品的戒煙作用十分有限。目前針對戒煙的有效靶標有限，導致藥物開發(fā)受到限制，尋求戒煙新靶點對于尼古丁成癮治療迫在眉睫。已有的研究表明，尼古丁通過作用于中樞神經系統(tǒng)的中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)產生強烈的獎賞和興奮效應，同時使中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)發(fā)生長期神經可塑性變化Ueuroplasticity)導致強烈的心理渴求及精神依賴和敏化作用。中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)包括腹側被蓋區(qū)(ventral tagmental area, VTA)、伏隔核(nucleus accumbens, NAc)、杏仁核(amygdala, Amg)、前額葉皮層(prefrontal cotex, PFC)、海馬(hippocampus, Hip)等。最新研究報道尼古丁主要激活伏隔核shell (nucleus accumbens shell, Nac shell)和基底外側杏仁核(Basolateral amygdala, BLA),伏隔核shell與藥物獎賞有關，而基底外側杏仁核主要與藥物敏化有關(Dao JM, et al. Neuropsychopharmacology. 2011Jun; 36 (7) :1319-31)。尼古丁作用于中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)的不同靶點，如伏隔核、杏仁核、引起多巴胺釋放異常增加，激活特異性受體及受體后一系列信號轉導通路后，一方面直接激活神經元內功能蛋白發(fā)揮獎賞和敏化效應；另一方面，信號轉導通路中的信號分子通過跨膜轉運進入細胞核，從而對基因的表達進行調控，生成新的蛋白，導致神經發(fā)生結構和功能長期可塑性改變，形成持久穩(wěn)固依賴和敏化。因此，抑制神經發(fā)育過程中異常神經可塑性是尼古丁物質成癮對因治療的關鍵所在，從而針對其研發(fā)新藥有望達到根除煙癮的效果。哺乳動物雷帕霉素革E蛋白(mammalian target of Rapamycin, mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，其參與的信號轉導通路控制的蛋白合成參與了神經可塑性形成(Dash PK, et al. J Neurosci, 2006, 26 (31) : 8048-56. Parsons RG, et al. JNeurosci, 2006, 26 (50) : 12977-83)。但目前是否在尼古丁成癮中起著關鍵的作用以及是否可以作為戒煙藥物作用的靶標未見報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供mTOR作為標靶在篩選治療尼古丁成癮藥物中的應用。本發(fā)明經腹腔注射急、慢性給予大鼠尼古丁 lmg/kg、0. 35mg/kg造模，采用ffestern-blot檢測mTOR激活情況；在此基礎上，注射尼古丁受體抑制劑，觀察對尼古丁激活mTOR活性的影響；且于mTOR活性特異性變化的腦區(qū)給予其抑制劑雷帕霉素，觀察對大鼠條件位置偏愛和敏化形成情的影響。結果可見，急、慢性給藥后增加中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)伏隔核和杏仁體的mTOR活性，于與獎賞相關的腦區(qū)伏隔核shell給予雷帕霉素可抑制大鼠條件位置偏愛的形成，于與敏化相關的腦區(qū)基地外側杏仁體給予雷帕霉素可抑制大鼠敏化的形成。表明mTOR在尼古丁成癮中起著重要的作用，針對其設計藥物有望戒除煙癮。本發(fā)明中所述的哺乳動物雷帕霉素祀蛋白(mammalian target ofRapamycin, mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，雷帕霉素(rapamycin)是其天然的抑制齊U，其信號轉導通路在外周組織中的作用已經比較明確，上游信號如生長因子、營養(yǎng)物質、氨基酸、葡萄糖等激活mTOR激酶，mTOR進一步磷酸化下游靶分子，從而參與細胞周期的調控及基因轉錄后蛋白翻譯的調控，促進細胞的生長(。在中樞神經系統(tǒng)中的作用目前研究的較少，已知mTOR信號轉導通路控制的蛋白合成參與了突觸可塑性的長時程增強及長時程易化的過程，并在空間記憶及恐怖性記憶的形成、鞏固及再鞏固的過程中起重要作用。體外神經元培養(yǎng)研究表明，神經營養(yǎng)因子BDNF、神經遞質谷氨酸、多巴胺可作用于神經細胞激活mTOR激酶,進一步激活下游祀分子核糖體蛋白S6激酶(ribosomal proteinS6 kinases, S6K)和真核細胞翻譯起始因子4E結合蛋白I (the eIF4E_binding protein1，4E-BPI)啟動胞體及樹、軸突中多種蛋白的合成，從而參與細胞的生長及長時程增強等神經可塑性過程。在實驗研究中，多采用P70s6k磷酸化狀態(tài)間接反應mTOR信號轉導通路的激活情況。本發(fā)明為治療尼古丁物質成癮提供了一種針對病因維持治療的靶點，有望從根本上治療尼古丁物質成癮及防止停藥后的復發(fā)。


圖I為尼古丁激活大鼠伏隔核中shell腦區(qū)內p70s6k磷酸化。由圖可見Nicotine組大鼠伏隔核中shell腦區(qū)內p70s6k磷酸化水平明顯高于生理鹽水組，而p70s6k總蛋白的含量兩組水平相當(*代表P〈0. 05 )。圖2為尼古丁激活大鼠BLA腦區(qū)內p70s6k磷酸化。由圖可見Nicotine組大鼠BLA腦區(qū)內p70s6k磷酸化水平明顯高于生理鹽水組，而p70s6k總蛋白的含量兩組水平相當(* 代表 P〈0. 05)。圖3為尼古丁抑制劑Mecamylamine阻斷尼古丁激活大鼠伏隔核中shell腦區(qū)內p70s6k磷酸化。由圖可見Nicotine組大鼠伏隔核中shell腦區(qū)內p70s6k磷酸化水平明顯高于生理鹽水組，Mecamylamine與對照組沒有顯著性差異,而p70s6k總蛋白的含量兩組水平相當代表P〈0. 05)。圖4為尼古丁抑制劑Mecamylamine阻斷尼古丁激活大鼠BLA腦區(qū)內p70s6k磷酸化。由圖可見Nicotine組大鼠BLA腦區(qū)內p70s6k磷酸化水平明顯高于生理鹽水組，Mecamylamine與對照組沒有顯著性差異，而p70s6k總蛋白的含量兩組水平相當(*代表P〈0.05)。圖5為mTOR抑制劑Rapamycin阻斷尼古丁條件位置偏愛的形成(A)和大鼠伏隔核中shell腦區(qū)內p70s6k磷酸化激活(B)。由圖A可見Nicotine組大鼠條件位置偏愛形成，Rapamycin組與對照組沒有顯著性差異；由圖B可見Nicotine組大鼠伏隔核中shell腦區(qū)內p70s6k磷酸化水平明顯高于生理鹽水組，Rapamycin組與對照組沒有顯著性差異，而p70s6k總蛋白的含量兩組水平相當(*代表P〈0. 05)。 圖6為mTOR抑制劑Rapamycin阻斷尼古丁敏化的形成(A)和大鼠BLA腦區(qū)內p70s6k磷酸化激活(B)。由圖A可見Nicotine組大鼠敏化形成，Rapamycin組與對照組沒有顯著性差異；由圖B可見Nicotine組大鼠BLA腦區(qū)內p70s6k磷酸化水平明顯高于生理鹽水組，Rapamycin組與對照組沒有顯著性差異,而p70s6k總蛋白的含量兩組水平相當(*代表 P〈0. 05)。
具體實施例方式下面以實施例對本發(fā)明做進一步的說明，但是不對本發(fā)明的保護范圍構成任何限制。實施例I :尼古丁單次給藥對大鼠中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)伏隔核shell和基底外側杏仁核(Basolateral amygdala, BLA)的p70s6k磷酸化活性的影響p70s6k是mTOR下游激活蛋白，控制蛋白合成的作用，其激活狀態(tài)可反應mTOR的活性。材料與方法藥品及試劑Nicotine sigma-N0267 ;DMS0等試劑均為市售分析純試劑。動物SPF級SD雄性大鼠，體重220_250g。武漢大學動物實驗中心提供，動物合格證號為NO. 00014833，生產許可證號SCXK (鄂)2003-2004。鼠飼料，購于武漢大學實驗動物中心。實驗方法動物分組與處理大鼠隨機分為生理鹽水和尼古丁給藥組。給藥均采用腹腔注射，與給藥后I小時斷頭取腦進行蛋白質活性檢測。動物造模大鼠(n=16)分為2組，分別腹腔注射給于生理鹽水和2. 5mg/kg尼古丁，I小時后斷頭處死，速剝離全腦，速凍后取腦區(qū)伏隔核shell (nucleus accumbensshell, Nacshell)和基底外側杏仁核(Basolateral amygdala, BLA),裂解組織,提取蛋白，變性保存。檢測指標各組大鼠樣本處理后，米用Western blot檢測尼古丁引起p70s6kNAc shell和BLA中磷酸化水平變化。掃描蛋白膠片進行定量分析，得出尼古丁實驗組較對照組的變化比值。實驗結果I.尼古丁單次給藥增加大鼠隔核shell和BLA的p70s6k磷酸化活性大鼠皮下注射尼古丁(lmg/kg)后可引起中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)伏隔核(nucleusaccumbens shell, NAc shell)和 BLA 的 p70s6k 憐酸化水平增高 Ac shell F(I, 49)=9. 525, p<0. 01 ；BLA F (1,49) = 12. 325，p〈0. 01 )，而 p70s6k 總蛋白的含量兩組水平相當，如圖1、2所示。
實施例2 :尼古丁受體拮抗劑對其引起大鼠中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)伏隔核shell和BLA的p70s6k磷酸化活性變化的影響本實施例選擇Mecamylamine作為抗尼古丁作用的拮抗劑，探討Mecamylamine是否可以減弱尼古丁對伏隔核shell的mTOR激活。材料與方法藥品及試劑Mecamylamine sigma-M9020 ；DMS0等試劑均為市售分析純試劑。動物SPF級SD雄性大鼠，體重220_250g。武漢大學動物實驗中心提供，動物合格證號為NO. 00014833，生產許可證號SCXK (鄂)2003-2004。鼠飼料，購于武漢大學實驗動物中心。實驗方法動物分組與處理大鼠隨機分為4組，分別是生理鹽水組、生理鹽水+Mecamylamine組、尼古丁給藥組和Mecamylamine+尼古丁給藥組。給藥均采用腹腔注射。動物造模大鼠(n=32)分為4組，分別預先腹腔注射溶媒、Mecamylamine、溶媒和Mecamylamine, 30min后再分別給予生理鹽水、生理鹽水、尼古丁和尼古丁，1小時后斷頭處死，速剝離全腦，速凍后取腦區(qū)伏隔核shell和BLA，裂解組織，提取蛋白，變性保存。檢測指標各組大鼠樣本處理后，米用Western blot檢測尼古丁引起p70s6kNAc shell和BLA中磷酸化水平變化。掃描蛋白膠片進行定量分析，得出Mecamylamine組相對于尼古丁組變化的比值。實驗結果I.尼古丁受體拮抗劑阻斷尼古丁激活伏隔核shell和BLA的p70s6k磷酸化活性大鼠皮下注射Mecamylamine后可阻斷尼古丁引起中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)伏隔核(nucleus accumbens shell, NAc shell)和 BLA 的 p70s6k 憐酸化水平增高(NAc shell F(3,49)= 16. 152，p〈0. 01 ；BLA F (3,49)= 19. 364，p〈0. 01)，而 p70s6k 總蛋白的含量四組水平相當，如圖3、4所示。實施例3 :伏隔核shell定位注射mTOR抑制劑雷帕霉素對尼古丁條件位置偏愛形成的影響本實施例選擇大鼠條件位置偏愛形成模型作為檢測尼古丁成癮的動物模型和雷帕霉素(Rapamycin)作為抑制尼古丁對mTOR激活效應的制劑,探討Rapamycin是否可以抑制尼古丁對伏隔核shell的mTOR激活并抑制條件位置偏愛的形成(即成癮的形成)。材料與方法
藥品及試劑Mecamylamine sigma-M9020 ；DMS0等試劑均為市售分析純試劑。動物SPF級SD雄性大鼠，體重220_250g。武漢大學動物實驗中心提供，動物合格證號為NO. 00014833，生產許可證號SCXK (鄂)2003-2004。鼠飼料，購于武漢大學實驗動物中心。實驗方法動物分組與處理大鼠隨機分為4組，分別是生理鹽水組、生理鹽水+Rapamycin組、尼古丁給藥組和Rapamycin+尼古丁給藥組。Rapamycin采用核團定位給藥,尼古丁腹腔注射。動物造模大鼠(n=32)分為4組，手術，置套管于伏隔核shell，各組分別預先微注射溶媒、Rapamycin、溶媒和Rapamycin, 30min后再分別腹腔注射生理鹽水、生理鹽水、尼古丁和尼古丁后進行條件位置偏愛訓練，經過4輪訓練后，實驗大鼠分為兩部分，一部分檢測條件位置偏愛的形成情況，另一部分平行檢測伏隔核shell的p70s6k磷酸化活性變化。檢測指標各組大鼠樣本處理后，采用條件位置偏愛檢測尼古丁成癮情況，Western blot檢測尼古丁引起p70s6kNAc shell中磷酸化水平變化。實驗結果I.雷帕霉素定位注射于伏隔核shell抑制尼古丁條件位置偏愛的形成各組大鼠伏隔核shell核團定位給予rapamycin后可阻斷尼古丁引起中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)伏隔核(nucleus accumbens shell,NAc shell)磷酸化水平增高(F (3,49)=12. 182，p〈0. 01)和條件位置偏愛的形成(F (3,49) = 20. 254，p〈0. 01)，如圖 5A、B 所示。
實施例4 =BLA定位注射mTOR抑制劑雷帕霉素對尼古丁敏化形成的影響本實施例選擇大鼠敏化模型作為檢測尼古丁成癮致興奮的動物模型和雷帕霉素(Rapamycin)作為抑制尼古丁對mTOR激活效應的制劑,探討Rapamycin是否可以抑制尼古丁對BLA的mTOR激活并抑制敏化的形成。材料與方法藥品及試劑Mecamylamine sigma-M9020 ；DMS0等試劑均為市售分析純試劑。動物SPF級SD雄性大鼠，體重220_250g。武漢大學動物實驗中心提供，動物合格證號為NO. 00014833，生產許可證號SCXK (鄂)2003-2004。鼠飼料，購于武漢大學實驗動物中心。實驗方法動物分組與處理大鼠隨機分為4組，分別是生理鹽水組、生理鹽水+Rapamycin組、尼古丁給藥組和Rapamycin+尼古丁給藥組。Rapamycin采用核團定位給藥,尼古丁腹腔注射。動物造模大鼠(n=32)分為4組，手術，置套管于BLA，各組分別預先微注射溶媒、Rapamycin、溶媒和Rapamycin, 30min后再分別腹腔注射生理鹽水、生理鹽水、尼古丁和尼古丁后進行敏化訓練，經過5輪訓練后，實驗大鼠分為兩部分，一部分檢測敏化的形成情況，另一部分平行檢測BLA的p70s6k磷酸化活性變化。檢測指標各組大鼠樣本處理后，采用自主活動箱檢測尼古丁致敏化情況，Western blot檢測尼古丁引起p70s6k在BLA中磷酸化水平變化。實驗結果I.帕霉素定位注射于BLA抑制尼古丁敏化的形成各組大鼠BLA核團定位給予rapamycin后可阻斷尼古丁引起中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)BLA磷酸化水平增高(F (3,49) = 19. 367，p〈0. 01)和敏化的形成(F (3,49)=18. 325，p〈0. 01)，如圖 6A、B 所示。實驗結論總之，急性尼古丁給藥可以引起中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)與尼古丁獎賞關鍵腦區(qū)伏隔核(nucleus accumbens, NAc) shell、與尼古丁敏化相關的腦區(qū)基底外側杏仁核 (Basolateral amygdala, BLA)p70s6k磷酸化水平增高,而且此作用可被預先給予尼古丁受體抑制劑所阻斷，說明尼古丁可通過激活mTOR信號轉導通路在中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)起效。微注射mTOR抑制劑于伏隔核shell和基底外側杏仁核可分別抑制尼古丁成癮和敏化的形成，說明mTOR信號分子在尼古丁所致的成癮行為中起著關鍵的作用，針對其設計藥物抑制器活性可達到戒煙的效果。
權利要求
1.mTOR作為標靶在篩選治療尼古丁成癮藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了mTOR作為標靶在篩選治療尼古丁成癮藥物中的應用。在制備治療尼古丁物質成癮藥物作用靶標的作用。本發(fā)明為治療尼古丁物質成癮的成癮性、興奮性的癥狀提供了一種有效的藥物作用靶標，有望從根本上治療尼古丁物質成癮。
文檔編號A61K49/00GK102698293SQ20121021608
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月27日 優(yōu)先權日2012年6月27日
發(fā)明者彭淑嫻, 李艷琴, 林覺, 溫泉, 鄭春明 申請人:武漢大學