專利名稱:2-O-α-L-鼠李糖-4,6,4′-三羥基二苯甲酮作為熱休克蛋白90抑制劑的醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及2-0-a-L-鼠李糖_4,6,4'-三羥基二苯甲酮作為熱休克蛋白90(HSP90)抑制劑的醫(yī)藥用途。
背景技術(shù):
熱休克蛋白90(Heat shock protein,HSP90),又名熱激蛋白90,大量存在于真核細胞中,是一類ATP依賴的分子伴侶,在維持構(gòu)型穩(wěn)定、保持活性和一些蛋白的降解過程中發(fā)揮著重要作用(Pearl LH, Prodromou C. Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery. Annu Rev Biochem,2006,75 :271-294.)。HSP90 在胞漿內(nèi)主要以同源二聚體的形式存在。越來越多的證據(jù)表明,HSP90 二聚體在多種炎癥模型中具有促炎活性(Yeo M,et al. Blockage of HSP 90modulates Helicobacterpylori-induced IL_8 productions through the inactivation of transcriptionalfactors of AP-I and NF- κ B. Biochem Biophys Res Commun 2004;320:816-824;Murata M,et al. Heat shock protein 90 is required for increased DNA bindingactivity of activator protein-1, a heterodimer of Fos/JunD, in rheumatoidsynovial cells under inflammatory stimuli. Int J Mol Med2005 ; 15 (4) :649-653;Hsu HY, et al. Geldanamycin interferes with the 90—kDa heat shock protein,affecting lipopoIysaccharide-mediated interleukin-1 expression and apoptosiswithin macrophages. Mol Pharmacol 2007 ;71 (I) :344-356.)。HSP90 的多種客戶蛋白是在炎癥的信號通路中起重要作用的蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子,包括TAKl、Akt、IKK等(XinYu Liu, et al. HSP90 is required for TAKlstability but not for its activationin the pro-inflammatory signaling pathway. FEBS Lett. 2008 ;582 (29) :4023-4031;Sato S,et al. Modulation of Akt kinase activity by binding to HSP90. Proc NatlAcad Sci USA. 2000 ;97 (20) :10832-10837.)。其中 IKK 活化 NF-κ B 的作用可以被 HSP90抑制劑解除,表明HSP90是IKK活化NF-K B所必需的(Broemer M,eat I. Requirementof Hsp90activity for IkB kinase (IKK)biosynthesis and for constitutive andinducible IKK and NF-κ B activation. Oncogene. 2004 ;23(31) :5378-5386.)。NF-κ B是多種類型細胞中所表達的一種轉(zhuǎn)錄因子家族,是調(diào)節(jié)炎癥應(yīng)答系統(tǒng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,在炎癥及膿毒癥中起到至關(guān)重要的作用。抑制NF-κ B活性,已成為治療炎癥及膿毒癥的新焦點。研究表明,HSP90抑制劑17-丙烯胺基-17-去甲氧基格爾德霉素(17-AAG)具有明顯抗膿毒血癥活性。Chatterjee A發(fā)現(xiàn)17-AAG可以延長LPS誘導(dǎo)的膿毒血癥鼠存活時間,抑制炎癥反應(yīng),減輕肺損傷(Chatterjee A,et al. Heat shock protein90 inhibitors prolong survival, attenuate inflammation, and reduce lung injuryin murine sepsis. Am J Respir Crit Care Med. 2007 ; 176 (7) :667-675.),對其作用機制進行研究發(fā)現(xiàn),17-AAG發(fā)揮作用是通過抑制HSP90 N末端ATP酶活性實現(xiàn)的。N末端是ATP/ADP 的結(jié)合位點,與 HSP90 的功能關(guān)系密切(Prodromou C, Pearl LH. Structure andfunctional relationships of Hsp90. Curr Cancer Drug Targets,2003,3 :301-323.)。ATP/ADP結(jié)合部位起著構(gòu)象轉(zhuǎn)化區(qū)的作用,調(diào)節(jié)HSP90參與的多分子伴侶復(fù)合物的裝配。HSP90是通過形成多分子伴侶復(fù)合物來穩(wěn)定客戶蛋白的構(gòu)象的,若能夠抑制HSP90與促炎因子形成復(fù)合物使其構(gòu)象不穩(wěn)定,則能夠達到抗炎目的。此外,HSP90的客戶蛋白還包括 Raf-I、突 變型 BRaf、IGF-IR、Her2、C-Met,C-Kit、突變型EGFR等,在腫瘤的發(fā)展變化過程中,這些效應(yīng)蛋白均過度表達(PicardD. Heat-shock protein 90, a chaperone for folding and regulation. Cell Mol LifeSci,2002 ;59(10) :1640-1648.)。一系列研究表明,17-AAG在臨床前試驗中對乳腺癌、骨髓瘤、前列腺癌、肺癌、黑色素瘤均表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤作用。目前,17-AAG作為一類新藥已經(jīng)進入三期臨床試驗階段。綜上,設(shè)計或?qū)ふ乙訦SP90為作用靶點的藥物,對炎癥、膿毒血癥、以及腫瘤等疾病的防治,具有積極意義。另一方面,系列親和色譜(YamamotoK, Yamazaki A, Mikio Takeuchi M. Aversatile method of identifying specific binding proteins on affinity resins.Anal Biochem,2006, (352) :15-23.)是一種不受藥物溶解性、配基-蛋白復(fù)合物解離速度的影響,適合于水溶解性較差的化合物的尋找藥物作用靶點的分離純化方法。其原理是配基兩次與柱材上的結(jié)合蛋白作用,對比兩次洗脫液中蛋白條帶差異,確定特異性結(jié)合蛋白(圖I)。目前,已經(jīng)利用該法找到了 FK506的靶蛋白FKBP12、苯磺酰胺基的靶蛋白CA2、氨甲喋呤的靶蛋白二氫葉酸還原酶。是一種用于識別活性成分靶蛋白的常用方法之一。計算機輔助藥物設(shè)計,是一種指基于分子對接的數(shù)據(jù)庫搜索方法,可利用從已建立的大規(guī)模化合物的三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫幾十到幾百萬個化合物中搜尋與靶標生物大分子活性部位或結(jié)合部位相匹配的化合物,也可利用分子對接技術(shù)佐證小分子與靶標蛋白的結(jié)合。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了 2-0-a-L-鼠李糖-4,6,4'-三羥基二苯甲酮(以下簡寫為THBP)作為HSP90抑制劑的用途,其可用于制備治療或預(yù)防與HSP90相關(guān)的疾病,如炎癥藥物。發(fā)明人利用系列親和色譜技術(shù),識別2-0-a-L-鼠李糖_4,6,4'-三羥基二苯甲酮在人單核細胞株THP-I細胞中的特異性結(jié)合的蛋白(圖2),并通過質(zhì)譜鑒定和蛋白免疫印跡技術(shù)鑒定該蛋白為HSP90。隨后利用計算機模擬分子對接軟件G0LD,采用TOB code :3IED模板,初步確定THBP與HSP90的結(jié)合位點位于HSP90的N-末端(圖3,4)。在此基礎(chǔ)上,依據(jù)HSP90抑制劑的活性,采用角叉菜膠致小鼠足趾腫脹和脂多糖(LPS)致小鼠急性肺損傷兩個模型,證實THBP與HSP90抑制劑17-AAG體內(nèi)給藥具有類似活性,提示可作為新類型的HSP90抑制劑,用于防治HSP90介導(dǎo)的炎癥、膿毒血癥、腫瘤等重大疾病,具有廣闊的應(yīng)用前景。以下是具體
發(fā)明內(nèi)容
I基于系列親和色譜技術(shù)識別HSP90為THBP特異性結(jié)合蛋白實驗材料Epoxy-activated sepharoseTM6B(GE Healthcare),氫氧化鈉(南京化學試劑有限公司,AR),甲醇(江蘇漢邦科技有限公司,CR),A8600-4000乙腈(Roe ScientificInc.),高糖DMEM培養(yǎng)基(GIBCO);青霉素,鏈霉素(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司);胰蛋白酶(南京生興生物技術(shù)有限公司);新生牛血清(民海生物);細胞裂解液和BCA蛋白定量試劑盒(碧云天);亮肽素、抑肽酶、胰蛋白酶抑制劑(AMERESC0);溴酚藍(上海生工);β-巰基乙醇(南京大治生物技術(shù)有限公司);其他試劑均購自南京化學試劑廠。THP-I細胞株(人白血病單核細胞株),購自 中國科學院上海生化細胞所。電子分析天平Mettler_ToledoInstr. (Shanghai) Ltd, DSHZ-300 多用途恒溫水浴振蕩器(江蘇太倉市實驗設(shè)備廠),HP-Ol真空泵(江蘇漢邦科技有限公司),Z-323K冷凍離心機(HERMLE,德國)。實驗方法精密稱取3· 53mg THBP 與 O. 0 Epoxy-activated sepharose 6B (EAS-6B)柱材進行水浴震蕩反應(yīng),溫度40°C,水浴振蕩20h,轉(zhuǎn)速110r/min,即得以THBP為配基的親和介質(zhì)。測定其偶聯(lián)率為39%。親和介質(zhì)取出后用pH8. O的IM乙醇胺封閉液浸泡過夜,并用高濃度pH4. O, pH8. O緩沖鹽交替3次沖洗待用。取制備好的THBP-EAS-6B柱材60 μ I與人白血病單核細胞THP-I細胞裂解液稀釋至Iml含量3mg進行孵育,4°C條件下緩慢攪動4h,瞬時離心,將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管,再另加入THBP-EAS-6B 60 μ 1,同上操作。取兩次孵育的柱材部分用定量緩沖液洗滌,加入變性劑煮沸5min,瞬時離心,分別得到上清液X,Y用于10% SDS-P AGE電泳,硝酸銀染色,對得到的凝膠進行掃描。實驗結(jié)果由圖2所示,通過第一次與第二次特異性結(jié)合條帶的灰度值差異性分析,位于85KD與100KD之間的條帶,第一次特異性結(jié)合蛋白條帶的灰度值明顯大于第二次孵育的條帶的灰度值,推斷條帶為THBP的特異性結(jié)合條帶,通過質(zhì)譜鑒定和蛋白免疫印跡技術(shù)鑒定該蛋白為HSP90(圖3)。2基于計算機虛擬分析技術(shù)佐證THBP和HSP90的相互作用實驗方法使用PDB數(shù)據(jù)庫中下載的晶體模板TOB code 3IED,采用GOLD對接程序?qū)嵤┓肿訉印D0錞OB code :3IED中的自帶小分子的三維坐標被用于定義活性區(qū)域,活性位點半徑為10A,范德華力和氫鍵相互作用的退火參數(shù)分別為4和2.5A,其他參數(shù)保持默認值。實驗結(jié)果有文獻表明,許多HSP90抑制劑在N-末端區(qū)域與ATP競爭性結(jié)合(圖4),N-末端區(qū)域是重要的抑制劑結(jié)合位點。本研究結(jié)果如圖5所示,初步確定THBP與HSP90的結(jié)合位點位于HSP90的N-末端,THBP位于HSP90的N-末端的空腔內(nèi),與空腔契合較好。表明THBP與HSP90空腔契合較好,能作為HSP90潛在的抑制劑。3 THBP作為HSP90抑制劑的體內(nèi)活性驗證3. I THBP不同劑量對角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠足趾腫脹的影響實驗方法ICR小鼠50只,雄性,體重20±2g,隨機分為5組,即模型組、THBP I. 25mg/kg,5mg/kg,20mg/kg三組、陽性對照組地塞米松(DEX,5mg/kg)。模型組灌胃給予相應(yīng)體積純凈水,其他各組灌胃給予相應(yīng)藥物,給藥后I小時足底注射4%角叉菜膠,用螺旋測微儀測量各組小鼠注射角叉菜膠后的1、2、3、5、8小時的足厚,并計算腫脹度。腫脹度(%)=(致炎前足厚一致炎后足厚)X 100% /致炎前足厚。實驗結(jié)果由表I可見,THBP 1.25、5、20mg/kg能抑制角叉菜膠所致小鼠足跖腫脹。與對照組相比,在致炎第l、2、3、5、8h時,THBP I. 25mg/kg作用存在顯著或極顯著性差異;在致炎第I、2、8h時,THBP 5mg/kg作用存在顯著性差異或極顯著性差異,在致炎第I、2、3、5、8h時, THBP 20mg/kg作用存在顯著性差異或極顯著性差異。表I THBP對角叉菜膠致小鼠足跖腫脹的影響(l±s,n=10)
劑g ...................................................................................................................腫脹度(%)............................................................................................................
"_(mg/kg)_l_h_2h__3h__5h_8h_
模型 I 26.08±4.97 27.26±6XI5 23/77±6^89 20.80t7.46 15.58±6.52 THBP 1.25 19.82土5.06* 18.67±.98** 18.38±3.16* 15.03±2.85* 10.25士 3.02*
5.0018.84±4.83** 19.49±5.20** 18.58±4.80 15.57±4.08 10.21 士 3.43*
20.0018.69士5.05** 19.35±4.09** 16.88±4.05* 14.42±3.23* 9.45±3.57* DEX 5.00 18.64±3.53** 16.21±4.18** 13.02 士5.37** 10.39±3.52** 4.54士 3.23***P < 0. 05,林P < 0. 01與模型組比較3. 2 THBP與17-AAG單劑量對角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠足趾腫脹的影響實驗方法ICR小鼠40只,雄性,體重20±2g,隨機分為4組,即模型組、THBP I. 25mg/kg組、17-AAG組、陽性對照DEX 1.25mg/kg組。各組給予相應(yīng)藥物后采用同上的方法進行活性觀察。實驗結(jié)果結(jié)果由表2可見,THBP I. 25mg/kg能抑制角叉菜膠所致小鼠足跖腫脹,且在致炎第l、5、8h時,與模型組相比存在顯著性差異;17-AAG I. 25mg/kg也能夠抑制足腫脹,且在致炎第8h時,與模型組作用存在顯著性差異。其中在致炎第Ih時,17-AAG與THBP組相比存在顯著性差異(P < O. 05),提示即THBP比17-AAG起效較快。表2 THBP和17-AAG對角叉菜膠致小鼠足跖腫脹的影響(}±s,n=10)
~~mZ\ 劑量腫脹度(%)
一_(mg/kg)_Ui_2h_3h_5h_8h_
^2438±5l2 2095± 88 Τ24±4Λ02 士 4.94
THBP 1.25 19.88 士5.10* 20.45土5.62 16.43士 S.64 12.98 士4.66* 9.25土 5.23*
17-AAG 1.25 24.44±5.07 21.48i4.34 16.57土4.62 14.44±5.02 9.34土 5.62* DEX 5.00 18,50士 7,41* 17,66 土5.64* 12.07土 4.91** 9.90±4.80** 5.30±3.91***Ρ < O. 05,林P < O. 01與空白對照組比較3. 3 THBP對LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的影響實驗方法ICR小鼠50只,雄性,體重20±2g,隨機分為5組,即空白組、模型組、THBP 5mg/kg, 17-AAG 5mg/kg組、陽性對照DEX 3mg/kg組。除空白組、模型組灌胃給予相應(yīng)體積O. 5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液各組灌胃給予相應(yīng)藥物,Ih后除空白對照外每只小鼠尾靜脈注射30mg/kg的LPS無菌生理鹽水溶液。8h后處死小鼠,取右肺稱取濕重。將右肺置于60°C烘箱24h后稱取干重。記錄并計算肺干濕比。肺干濕比=右肺濕重/右肺干重。實驗結(jié)果由表3可見,模型組與空白組相比,肺濕比明顯增加,存在顯著性差異,提示模型小鼠出現(xiàn)明顯肺水腫。THBP與17-AAG 5mg/kg均可明顯降低小鼠急性肺損傷引發(fā)的肺水腫,經(jīng)統(tǒng)計,與模型組相比,具有極顯著性差異。提示THBP與HSP90抑制劑類似,具有明顯抗肺損傷的活性。表3 THBP對LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的影響(文±s, n=5)
權(quán)利要求
1.2-0- a -L-鼠李糖-4,6,4'-三羥基二苯甲酮作為熱休克蛋白90抑制劑的用途。其中2-0-a-L-鼠李糖_4,6,4'-三羥基二苯甲酮為圖I結(jié)構(gòu)化合物。
2.權(quán)利要求I的用途,2-0-a-L-鼠李糖_4,6,4'-三羥基二苯甲酮可用于制備治療炎癥藥物的用途。
3.權(quán)利要求I的用途,2-0-a-L-鼠李糖_4,6,4'-三羥基二苯甲酮可用于制備治療肺損傷及膿毒血癥的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及2-O-α-L-鼠李糖-4,6,4′-三羥基二苯甲酮作為熱休克蛋白90抑制劑的醫(yī)藥用途,其可用于制備治療或預(yù)防與熱休克蛋白90相關(guān)的疾病的藥物。具體為熱休克蛋白90抑制劑2-O-α-L-鼠李糖-4,6,4′-三羥基二苯甲酮在防治急性炎癥、肺損傷或膿毒血癥的用途。
文檔編號A61P11/00GK102961391SQ20121015127
公開日2013年3月13日 申請日期2012年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月16日
發(fā)明者寇俊萍, 余伯陽, 鹿思思, 呂燕妮, 劉倩 申請人:中國藥科大學