專利名稱：用于遞送編碼免疫原的rna的小脂質(zhì)體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于免疫的RNA非病毒性遞送領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
用于免疫動物的核酸遞送是多年來的目標。已經(jīng)測試了許多方法，包括使用DNA或RNA，使用病毒或非病毒遞送載劑(或者甚至無遞送載劑，以“裸”疫苗形式)，使用復(fù)制型或非復(fù)制型載體，或者使用病毒或非病毒載體。仍需要進一步和改善的核酸疫苗，特別是需要改善的核酸疫苗遞送方法。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明，通過遞送包封在脂質(zhì)體內(nèi)的RNA來實現(xiàn)核酸免疫。所述RNA編碼感興趣的免疫原，并且所述脂質(zhì)體的直徑在60 180nm范圍內(nèi)，理想地在80_160nm范圍內(nèi)。將該尺寸與例如未包封α病毒等長蛋白衣殼的約40nm直徑作比較。RNA(特別是自復(fù)制RNA)在小脂質(zhì)體中有效包封的組合允許有效遞送以引起強免疫反應(yīng)。因此，本發(fā)明提供其內(nèi)包封編碼感興趣免疫原的RNA的脂質(zhì)體，其中，所述脂質(zhì)體的直徑在60 180nm范圍內(nèi)。這些脂質(zhì)體適于體內(nèi)遞送所述RNA至脊椎動物細胞,從而其可用作藥物組合物中的組分以免疫對象抵抗病毒性疾病。本發(fā)明還提供用于制備包含RNA的脂質(zhì)體的方法，所述方法包括以下步驟，使RNA和一種或多種脂質(zhì)混合，所述條件使所述脂質(zhì)形成直徑范圍為60-180nm并且包封所述RNA的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體本發(fā)明使用其內(nèi)包封編碼免疫原的RNA的脂質(zhì)體。因此所述RNA (如在天然病毒中)分離自任何外部介質(zhì)。已發(fā)現(xiàn)包埋在所述脂質(zhì)體中可保護RNA不受RNA酶消化。所述脂質(zhì)體可包括一些外部的RNA(例如在其表面上)，但在所述脂質(zhì)體核心中至少包封一半的RNA(理想上為全部)。在脂質(zhì)體內(nèi)包封不同于，例如參考文獻I中公開的脂質(zhì)/RNA復(fù)合物，其中RNA與預(yù)先形成的脂質(zhì)體混合。水環(huán)境下各種兩親性脂質(zhì)能形成雙分子層以包封含RNA的水性核心形成脂質(zhì)體。這些脂質(zhì)可具有陰離子、陽離子或兩性離子親水頭基。從陰離子磷脂形成脂質(zhì)體可追溯到二十世紀六十年代，而形成陽離子脂質(zhì)體的脂質(zhì)從二十世紀九十年代已開始研究。一些磷脂是陰離子型而其他一些是兩性離子型且其它的是陽離子型。合適磷脂種類包括但不限于:磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油和表I所列的一些有用的磷月旨。有用的陽離子脂質(zhì)包括但不限于:二油 酰-三甲基銨丙烷(DOTAP)、1，2-二硬脂基氧基-N，N- 二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA) ,1,2- 二油氧基-N，N 二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)、I,2-雙氧十八烯-3- 二甲胺丙燒(DOTMA)、I, 2- 二亞油氧基-N, N- 二甲基-3-氨基丙燒(DLinDMA)、1，2- 二亞麻氧基-N，N- 二甲基-3-氨基丙烷(DLenDMA)。兩性脂質(zhì)包括但不限于酸基兩性脂質(zhì)和釀基兩性脂質(zhì)。有用的兩性脂質(zhì)不例是DPPC、D0PC、DSPC、十_■燒基憐酸膽堿、I, 2- 二油酰-Sn-甘油-3-磷酸酰乙醇胺(DOPE)、和1，2- 二植烷酰-sn_甘油-3-磷酸酰乙醇胺(DPyPE)。所述脂質(zhì)可為飽和或不飽和。優(yōu)選使用至少一種非飽和脂質(zhì)來制備脂質(zhì)體。如果非飽和脂質(zhì)有兩個尾部，所述兩個尾部可均為非飽和的，或其可以有一個飽和尾部和一個非飽和尾部。脂質(zhì)的一個尾部中可包含類固醇基團,例如RV05中(也參見圖16A 和 C-K)。因此，在一些實施方式中，本發(fā)明提供具有脂雙層的脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體包封水性核心，其中(i)所述脂質(zhì)體的直徑在60-180nm范圍內(nèi)；并且(ii)所述水性核心包含編碼免疫原的RNA。本發(fā)明的脂質(zhì)體可由單一脂質(zhì)或脂質(zhì)混合物形成?；旌衔锟砂?i)陰離子脂質(zhì)混合物(ii)陽離子脂質(zhì)混合物(iii)兩性脂質(zhì)混合物(iv)陰離子脂質(zhì)和陽離子脂質(zhì)的混合物(V)陰離子脂質(zhì)和兩性脂質(zhì)的混合物(Vi)兩性脂質(zhì)和陽離子脂質(zhì)的混合物或(Vii)陰離子脂質(zhì)、陽離子脂質(zhì)和兩性脂質(zhì)的混合物。相似地，混合物可包括飽和以及不飽和脂質(zhì)。例如，混合 物可包括DSPC (兩性、飽和)、DlinDMA(陽離子型、不飽和)和/或DMPG (陰離子型、飽和)。使用脂質(zhì)混合物時，不是混合物中的所有組成脂質(zhì)需要為兩親性，例如可將一種或多種兩親性脂質(zhì)與膽固醇混合。當發(fā)明的脂質(zhì)體由脂質(zhì)混合物形成時，優(yōu)選那些陽離子脂質(zhì)的比例應(yīng)為脂質(zhì)總量的20-80%，例如30-70%、或40-60%。其余部分可以由例如膽固醇(例如35-50%膽固醇)和/或DMG(任選PEG化)和/或DSPC制備。該混合物在下文使用。這些百分比值是摩爾百分比。脂質(zhì)體可包含兩親性脂質(zhì)，其親水部分經(jīng)PEG化(即通過共價結(jié)合聚乙二醇來修飾)。此修飾可增加穩(wěn)定性并防止所述脂質(zhì)體的非特異性吸收。例如，可使用諸如參考文獻2和3公開的那些技術(shù)將脂質(zhì)與PEG偶聯(lián)。PEG為脂質(zhì)體提供包衣，該包衣可賦予有利的藥代動力學(xué)特性?？墒褂酶鞣N長度的PEG，例如0.5-8kDa。因此，脂質(zhì)體可以由陽離子型脂質(zhì)(例如，DlinDMA, RV05)、兩性離子脂質(zhì)(例如DSPC、DPyPE)、膽固醇和PEG化脂質(zhì)形成。示例中使用DSPC、DlinDMA, PEG-DMPG和膽固醇的混合物，以及數(shù)種其它混合物。脂質(zhì)體通常分為3組:多室囊泡(MLV);小單室囊泡(SUV);和大單室囊泡(LUV)。MLV的各囊泡中具有多種雙層，形成數(shù)個分開的水性隔室。SUV和LUV具有包封水性核心的單一雙層；SUV通常直徑彡50nm，LUV直徑>50nm。本發(fā)明的脂質(zhì)體理想地是直徑范圍為60-180nm并優(yōu)選范圍80-160nm的LUV。所述脂質(zhì)體優(yōu)選基本是球形。若它們不是球形，則術(shù)語“直徑”指脂質(zhì)體的最大截面直徑。本發(fā)明的脂質(zhì)體可以是組合物的一部分，該組合物包含多種脂質(zhì)體并且該多種脂質(zhì)體中的脂質(zhì)體能具有一定范圍的直徑。對于含不同直徑的脂質(zhì)體群的組合物:(i)至少80%數(shù)量的脂質(zhì)體應(yīng)具有60-180nm范圍的直徑,且優(yōu)選范圍80-160nm,以及/或(ii)所述群的平均直徑(通過強度，例如Z均)理想上范圍是60-180nm，且優(yōu)選范圍80_160nm。理想上，脂質(zhì)體尺寸分布(通過強度)只有一個最大值而不是兩個最大值，即，圍繞平均值(模式)分布有單一脂質(zhì)體群。脂質(zhì)體群內(nèi)的直徑應(yīng)理想地具有〈0.2的多分散性指數(shù)，有時〈0.1。參考文獻I的脂質(zhì)體/RNA復(fù)合物預(yù)期具有600-800nm范圍的直徑，并且具有更高的分散性。用于在 脂質(zhì)體懸液中測定平均粒徑和尺寸分布的設(shè)備市售可得。這些設(shè)備通常使用動態(tài)光散射和/或單顆粒光學(xué)感應(yīng)的技術(shù)如獲自PSS公司(ParticleSizingSystems)(美國圣巴巴拉)的Accusizer 和Nicomp 系列儀器,或馬文儀器公司(MalvernInstruments)(英國)的Zetasizer 儀器,或厚利巴公司(Horiba)(日本京都)的粒度分布分析儀(Particle Size Distribution Analyzer instruments)。動態(tài)光散射是測定脂質(zhì)體直徑的優(yōu)選方法。對脂質(zhì)體群而言，用于確定本發(fā)明組合物中脂質(zhì)體平均直徑的優(yōu)選方法是Z均值，S卩，通過動態(tài)光散射(DLS)測量脂質(zhì)體總集合的強度加權(quán)平均水動力尺寸。所述Z均值獲自所測相關(guān)曲線的累積量分析，其中，假定單一粒徑(脂質(zhì)體直徑)并對自相關(guān)函數(shù)應(yīng)用單指數(shù)擬合。所述累積量分析算法不生成分布情況，但是除強度加權(quán)Z均值之夕卜，其還給出多分散指數(shù)。制備合適脂質(zhì)體的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，例如見參考文獻4-6。參考文獻7中描述了一種有用的方法，該方法包括混合(i)脂質(zhì)的乙醇溶液(ii)核酸的水溶液和
(iii)緩沖液，然后混合、平衡、稀釋并純化。本發(fā)明優(yōu)選的脂質(zhì)體可通過該混合方法得到。為獲得具有所需直徑的脂質(zhì)體，可使用以下方法進行混合:將兩股RNA水溶液進料流與一股乙醇脂質(zhì)溶液流在單一的混合區(qū)中合并，其中所有的流速相同，例如在下文所述的微流體通道中。RNA本發(fā)明的脂質(zhì)體包括編碼免疫原的RNA分子(不同于siRNA)。體內(nèi)給予該顆粒后，RNA從所述顆粒中釋放出來并在細胞內(nèi)翻譯以原位提供免疫原。該RNA為+_鏈，并且不需要任何干預(yù)復(fù)制步驟例如逆轉(zhuǎn)錄通過細胞進行翻譯。其還能與免疫細胞表達的TLR7受體結(jié)合，從而啟動佐劑效應(yīng)。優(yōu)選的+_鏈RNA是自復(fù)制RNA。自復(fù)制RNA分子(復(fù)制子)在甚至無任何蛋白下遞送到脊椎動物細胞時，能通過其自身(經(jīng)自身產(chǎn)生的反義拷貝)轉(zhuǎn)錄引起多種子RNA生成。因此自復(fù)制RNA分子通常是+_鏈分子，其遞送到細胞后能直接翻譯，且該翻譯提供RNA依賴性RNA聚合酶，該酶然后從該遞送RNA中生成反義和正義轉(zhuǎn)錄本。因此所遞送RNA引起多種子RNA生成。這些子RNA以及共線亞基因組轉(zhuǎn)錄物可以自身翻譯以提供編碼免疫原的原位表達，或可轉(zhuǎn)錄提供與該遞送RNA同義的其他轉(zhuǎn)錄物，其經(jīng)翻譯提供所述免疫原的原位表達。該轉(zhuǎn)錄序列的總體結(jié)果是所引入復(fù)制子RNA在數(shù)量上大幅擴增，因此編碼的免疫原成為細胞的主要多肽產(chǎn)物。實現(xiàn)自復(fù)制的一種合適系統(tǒng)為使用基于α病毒的RNA復(fù)制子。這些+_鏈復(fù)制子在遞送到細胞后翻譯以得到復(fù)制酶(或復(fù)制酶-轉(zhuǎn)錄酶)。這些復(fù)制酶翻譯為自切割產(chǎn)生復(fù)制復(fù)合物的多聚蛋白，該復(fù)合物形成該+_鏈遞送RNA的基因組--鏈拷貝。這些--鏈轉(zhuǎn)錄本可自我轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生該+_鏈親本RNA的其他拷貝，還產(chǎn)生編碼所述免疫原的亞基因組轉(zhuǎn)錄物。因此所述亞基因組轉(zhuǎn)錄物的翻譯引起所述感染細胞原位表達所述免疫原。合適的α病毒復(fù)制子可使用來自辛德畢斯病毒、西門利克森林病毒、東部馬腦炎病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒等的復(fù)制酶。可使用突變或野生型病毒序列，例如已用于復(fù)制子的VEEV減毒TC83突變體[8]。因此優(yōu)選的自復(fù)制RNA分子編碼⑴可從所述自復(fù)制RNA分子轉(zhuǎn)錄RNA的RNA依賴性RNA聚合酶和(ii)免疫原。所述聚合酶可以是α病毒復(fù)制酶，例如包括一種或多種α病毒蛋白nsPl、nsP2、nsP3和nsP4。盡管除了非結(jié)構(gòu)復(fù)制酶多聚蛋白以外，天然α病毒基因組還編碼結(jié)構(gòu)病毒粒蛋白，但本發(fā)明的自復(fù)制RNA分子優(yōu)選不編碼α病毒結(jié)構(gòu)蛋白。因此優(yōu)選的自復(fù)制RNA可引起細胞中自身基因組RNA拷貝生成，但不引起含RNA的病毒顆粒生成。不能生成這些病毒粒說明自復(fù)制RNA分子不像野生型α病毒，其自身不能以感染形式永存。野生型病毒永存必需的α病毒結(jié)構(gòu)蛋白在本發(fā)明的自復(fù)制RNA中缺失，且其位置被編碼感興趣免疫原的一個或多個基因占據(jù)，從而亞基因組轉(zhuǎn)錄物編碼所述免疫原而不是結(jié)構(gòu)α病毒的病毒粒蛋白。因此本發(fā)明有用的自復(fù)制RNA分子可具有兩個開放閱讀框。第一(5’)開放閱讀框編碼復(fù)制酶；第二(3’)開放閱讀框編碼免疫原。在一些實施方式中，所述RNA可具有額外的(例如，下游)開放閱讀 框以例如編碼其他免疫原(見下文)或編碼輔助多肽。自復(fù)制RNA分子可具有與所編碼復(fù)制酶相容的5’序列。自復(fù)制RNA分子可具有各種長度，但其通常為5000-25000核苷酸長度，如8000-15000核苷酸或9000-12000核苷酸。因此，該RNA比siRNA遞送中所見更長。用于本發(fā)明的一種RNA分子可具有5’帽(例如7-甲基鳥甘)。該帽可增強該RNA的體內(nèi)翻譯。用于本發(fā)明的RNA分子5’核苷酸可具有5’三磷酸基團。在加帽的RNA中其可通過5’ -至-5’橋與7 -甲基鳥苷連接。5’三磷酸可增強RIG-1結(jié)合并因此促進佐劑效應(yīng)。RNA分子可具有3’聚A尾。其還可在3’末端附近包括聚A聚合酶識別序列(如AAUAAA)ο用于本發(fā)明的RNA分子通常為單鏈。單鏈RNA通常能通過結(jié)合TLR7、TLR8、RNA解旋酶和/或PKR而引起佐劑效應(yīng)。以雙鏈形式遞送的RNA(dsRNA)可與TLR3結(jié)合，并且該受體還會被單鏈RNA復(fù)制中或單鏈RNA 二級結(jié)構(gòu)內(nèi)形成的dsRNA觸發(fā)。用于本發(fā)明的RNA分子可通過體外轉(zhuǎn)錄(IVT)方便制備。IVT可使用細菌中質(zhì)粒形式產(chǎn)生和增殖或合成產(chǎn)生(例如通過基因合成和/或聚合酶鏈式反應(yīng)工程改造方法)的(cDNA)模板。例如，DNA依賴性RNA聚合酶(例如噬菌體T7、T3或SP6RNA聚合酶)可用于從DNA模板轉(zhuǎn)錄RNA。合適的加帽和聚A加成反應(yīng)可按需使用(盡管所述復(fù)制子的聚A通常在DNA模板內(nèi)編碼)。這些RNA聚合酶可對轉(zhuǎn)錄的5’核苷酸有嚴格的要求，且在一些實施方式中這些要求必須與所編碼復(fù)制酶的要求匹配，以確保IVT-轉(zhuǎn)錄RNA能有效作為其自身編碼復(fù)制酶的底物發(fā)揮作用。如參考文獻9中所討述，所述自復(fù)制RNA可包括(除了任何5’帽結(jié)構(gòu)以外)一個或多個具有經(jīng)修飾核堿基的核苷酸。因此該RNA可包括:m5C(5-甲基胞苷)、m5U(5_甲基尿苷)、m6A(N6-甲基腺苷)、s2U(2硫脲苷)、Um(2’-0-甲基尿苷)、mlA(l_甲基腺苷)、m2A(2-甲基腺苷)、Am (2，-O-甲基腺苷)、ms2m6A(2_甲硫基-N6-甲基腺苷)、i6A(N6-異戊烯基腺苷)、ms2i6A (2-甲硫基-N6異戊烯基腺苷)、io6A (N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷)、ms2io6A (2-甲硫基-N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷)、g6A (N6-甘氨酰氨甲酰基腺昔)(N6_glycinylcarbamoyladenosine)、t6A(N6_ 蘇氛酸氛甲酸基腺昔)、ms2t6A(2_ 甲基硫-N6-蘇氨酰氨甲?；佘?、m6t6A (N6-甲基-N6-蘇氨酰氨甲酰基腺苷)、hn6A (N6-輕基正繳氨酸氨甲酸基腺苷)(N6-hydroxynorvalylca;rbamoyladenosine)、ms2hn6A(2_ 甲硫基-N6-羥基正纈氨酰氨甲?；佘?、Ar (P) (2’ -O-核糖基腺苷(磷酸))、I (肌苷)、mlKl-甲基肌苷)、m’ Im(l，2’-0-二甲基肌苷)、m3C(3-甲基胞苷)、Cm(2T_0-甲基胞苷)、s2C(2-巰基胞苷)、ac4C(N4-乙酰胞苷)、f5C(5-甲?；?(5-fonnylcytidine)、m5Cm(5, 2_0_ 二甲基胞苷)、ac4Cm(N4 乙?；?2T0 甲基胞苷)、k2C (賴西丁) (Iysidine)、mlGd-甲基鳥苷)、m2G(N2-甲基鳥苷)、m7G(7_甲基鳥苷)、Gm(2’-O-甲基鳥苷)、m22G (N2, N2- 二甲基鳥苷)、m2Gm (N2, 2’ -O- 二甲基鳥苷)、m22Gm (N2, N2, 2’ -O-三甲基鳥苷)、Gr (P) (2，-O-核糖基鳥苷(磷酸))、yW(懷丁苷)(wybutosine)、o2yff (過氧懷丁苷)(peroxywybutosine)、OHyff (輕基懷丁苷)(hydroxywybutosine)、OHyff* (改性不足的輕基懷丁苷)(undermodified hydroxywybutosine)、imG (懷俄苷)、mimG (甲基鳥苷)、Q (q苷)、oQ (環(huán)氧q苷)、galQ (半乳糖_q苷)、manQ (甘露糖_q苷)、preQo (7_氰基- -脫氮鳥苷)、preQi (7-氨甲基-7-脫氮鳥苷)、G*(古嘌苷)(archaeosine)、D (二氫尿苷)、m5Um(5，2’ -O- 二甲基尿苷)、s4U(4_硫脲苷)、m5s2U(5_甲基_2_硫脲苷)、s2Um (2-硫_2’ -O-甲基尿苷)、acp3U (3- (3-氨基-3-羧基丙基)尿苷)、ho5U (5-羥基尿苷)、mo5U(5-甲氧基尿苷)、cmo5U(尿苷5-氧乙酸)、mcmo5U(尿苷5-氧乙酸甲酯)、chm5U (5-(羧基輕基甲基)尿苷))、mchm5U (5-(羧基輕基甲基)尿苷甲酯)、mcm5U (5-甲氧羰基甲基尿苷)、mcm5Um(S-甲氧羰基甲基-2-0-甲基尿苷)、mcm5s2U (5-甲氧羰基甲基-2-硫脲苷)、nm5s2U (5-氨基甲基_2_硫脲苷)、mnm5U (5-甲氨基甲基尿苷)、mnm5s2U(5-甲氨基甲基-2-硫脲苷)、mnm5se2U(5-甲氨基甲基-2-硒基尿苷)、ncm5U(5-氨甲?；谆蜍?、ncm5Um(5-氨甲?；谆鵢2’ -O-甲基尿苷)、cmnm5U (5-羧甲基氨甲基鳥昔)、cnmm5Um (5-竣甲基氛甲基-2-L-0甲基尿昔)、cmnm5s2U (5-竣甲基氛甲基-2-硫脲苷)、m62A (N6, N6- 二甲基腺苷)、Tm (2’ -O-甲基肌苷)、m4C (N4-甲基胞苷)、m4Cm (N4, 2-0- 二甲基胞苷)、hm5C (5-羥甲基胞苷)、m3U (3-甲基尿苷)、cm5U (5-羧甲基尿苷)、m6Am(N6, T-O- 二甲基腺苷)、rn62Am(N6, N6, 0_2_ 三甲基腺苷)、m2，7G (N2, 7_ 二甲基鳥苷)、m2’ 2’ 7G (N2, N2, 7-三甲基鳥苷)、m3Um(3, 2T-0- 二甲基尿苷),m5D(5-甲基二氫尿苷)、f5Cm(5-甲?；?2，-O-甲基胞苷)、11116111(1，2’-0-二甲基鳥苷)、111’六111(1，2-0-二甲基腺苷)虹膜甲基尿苷)(irin omethyluridine)、tm5s2U (S-?；撬峒谆鵢2_硫脲苷))、imG-14(4-去甲基鳥苷)、imG2 (異鳥苷)，或ac6A(N6-乙酰腺苷)、次黃嘌呤、肌苷、8-氧代-腺嘌呤、其7-取代衍生物、二氫尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5- (C1-C6)-烷基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5- (C2-C6)-烯基尿嘧啶、5- (C2-C6)-炔基尿嘧啶、5-(羥甲基)嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羥基胞嘧啶、5- (C1-C6)-烷基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5- (C2-C6)-烯基胞嘧啶、5- (C2-C6)-炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N2- 二甲基鳥嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、8-氮鳥嘌呤、7-脫氮-7-取代鳥嘌呤、7-脫氮-7-(C2-C6)炔基鳥嘌呤、7-脫氮-8-取代鳥嘌呤、8-羥基鳥嘌呤、6-硫鳥嘌呤、8-氧橋鳥嘌呤(8-oxoguanine)、2_氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，4- 二氨基嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、8-氮嘌呤、取代的7-脫氮嘌呤、7-脫氮-7-取代嘌呤、7-脫氮-8-取代嘌呤、或脫堿基核苷酸。例如，自復(fù)制RNA可包括一種或多種經(jīng)修飾的嘧啶核堿基，例如假尿苷和/或5 —甲基胞苷殘基。然而在一些實施方式中，該RNA不包含經(jīng)修飾的核堿基，并可不包含經(jīng)修飾的核苷酸，即，RNA中所有核苷酸是標準的A、C、G和U核糖核苷酸(除了任何的5’帽子結(jié)構(gòu)，其可包含7’-甲基鳥苷)。在其他實施方式中，該RNA可包括含7-甲基鳥苷的5’帽，且第1、2或3個5’核糖核苷酸可在核糖的2’位置被甲基化。本發(fā)明所用的RNA理想上僅包括核苷之間的磷酸二酯連接，但在一些實施方式中其可含氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和/或甲基磷酸酯連接。理想上，脂質(zhì)體包含少于10種不同種類的RNA，例如5、4、3或2種不同種類，最優(yōu)選脂質(zhì)體包含單一的RNA種類，即脂質(zhì)體中所有RNA分子具有相同的序列和相同的長度?？筛淖兠總€脂質(zhì)體的RNA量。每個脂質(zhì)體的單獨自復(fù)制RNA分子數(shù)目通?！?0，例如〈20、〈10、〈5或1-4/每個脂質(zhì)體。免疫原本發(fā)明所用的RNA分子編碼多肽免疫原。給予脂質(zhì)體后，該RNA體內(nèi)翻譯并且該免疫原可引起受體的免疫應(yīng)答。該免疫原可引起抗細菌、病毒、真菌或寄生蟲(或者在一些實施方式中針對變應(yīng)原，并在其它實施方式中針對腫瘤抗原)的免疫應(yīng)答。該免疫應(yīng)答可包含抗體應(yīng)答(通常包括IgG)和/或細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。該多肽免疫原通常會引起免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答識別相應(yīng)的細菌、病毒、真菌或寄生蟲(或變應(yīng)原或腫瘤)多肽，但在一些實施方式中，該多肽可用作模擬表位來引起識別細菌、病毒、真菌或寄生蟲糖的免疫應(yīng)答。該免疫原通常是表面多肽，例如粘附素、血凝素、包膜糖蛋白、刺突糖蛋白等。所述RNA分子可編碼單一多肽免疫原或多個多肽。多個免疫原可以單一多肽免疫原(融合蛋白)或分開的多肽形式存在。如果免疫原作為來自復(fù)制子的分開多肽表達，那么這些多肽中的一種或多種可與上游IRES或額外的病毒啟動子元件一起提供?；蛘撸鄠€免疫原可從多聚蛋白表 達或作為內(nèi)含肽表達，所述多聚蛋白編碼與小自催化蛋白酶融合的單獨免疫原(例如口蹄疫病毒2A蛋白)。與參考文獻I和10不同,所述RNA編碼免疫原。為避免疑義,本發(fā)明不包括編碼以下的RNA:螢火蟲熒光素酶或大腸桿菌(E.coli) β -半乳糖苷酶的融合蛋白或綠色熒光蛋白(GFP)。所述多肽可用作標志物，或甚至在基因治療背景下使用，但是本發(fā)明涉及引起免疫反應(yīng)系統(tǒng)的RNA的遞送。用于基因治療的脂質(zhì)體的最優(yōu)直徑可與用于免疫目的的脂質(zhì)體不同，因為這兩種方法的靶標細胞和組織不同。因此，所述免疫原也不是遞送用于增補或替代缺陷宿主蛋白(如在基因治療中)的自身蛋白。并且，該RNA不是全小鼠胸腺RNA。在一些實施方式中，該免疫原引起抵御這些細菌之一的免疫應(yīng)答:腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis):有用的免疫原包括但不限于膜蛋白，例如粘附素、自轉(zhuǎn)運蛋白(autotransporter)、毒素、攝鐵蛋白(iron acquisitionprotein)和H因子結(jié)合蛋白。三種有用多肽的組合公開在參考文獻11中。肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae):有用的多肽免疫原公開在參考文獻12中。其包括但不限于RrgB菌毛亞基、β -N-乙酰-己糖胺酶前體(spr0057)、spr0096、一般應(yīng)激蛋白GSP-781 (spr2021、SP2216)、絲氨酸/蘇氨酸激酶StkP(SP1732)和肺炎球菌表面粘附素PsaA。釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes):有用的免疫原包括但不限于參考文獻13和14中公開的多肽。
粘膜炎莫拉菌(Moraxellacatarrhal is) 百日咳博德特菌(Bordetella pertussis):有用的百日咳免疫原包括但不限于:百日咳毒素或類毒素(PT)、絲狀血細胞凝集素(FHA)、百日咳菌粘附素以及凝集原2和3。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus):有用的免疫原包括但不限于:參考文獻15中公開的多肽，例如溶血素、esxA、esxB、鐵色素結(jié)合蛋白(sta006)和/或staOll脂蛋白。破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani):典型的免疫原是破傷風(fēng)類毒素。白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae):典型的免疫原是白喉類毒素。流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae):有用的免疫原包括但不限于參考文獻16和17中公開的多肽。銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae):有用的免疫原包括但不限于參考文獻13中公開的多肽。沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis):有用的免疫原包括但不限于:PepA、LcrE, ArtJ, DnaK, CT398、OmpH-樣、L7/L12、OmcA, AtoS, CT547、Eno, HtrA 和 MurG。(例如參考文獻18中公開的那些)。LcrE[19]和HtrA[20]是兩種優(yōu)選的免疫原。肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae):有用的免疫原包括但不限于參考文獻21中公開的多肽。

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori):有用的免疫原包括但不限于CagA、VacA、NAP和/或脲酶[22]。大腸桿菌(Escherichia coli):有用的免疫原包括但不限于:衍生自腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)、腸聚集性大腸桿菌(EAggEC)、彌散粘附性大腸桿菌(DAEC)、腸致病性大腸桿菌(EPEC)、腸外致病性大腸桿菌(ExPEC)和/或腸出血性大腸桿菌(EHEC)的免疫原。ExPEC株包括尿致病性大腸桿菌(UPEC)和腦膜炎/敗血癥相關(guān)的大腸桿菌(MNEC)。有用的UPEC多肽免疫原公開在參考文獻23和24中。有用的MNEC免疫原公開在參考文獻25中。數(shù)種大腸桿菌類型的有用免疫原是AcfD [26]。炭疽桿菌(Bacillusanthracis)。鼠疫耶爾森菌(Yersinia pestis):有用的免疫原包括但不限于參考文獻27和28中公開的那些。表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermis)。產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)或肉毒梭菌(Clostridiumbotulinums)。嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila)。伯內(nèi)特科克斯立克次體(Coxiella burnetti)。布魯氏菌(Brucella),例如，流產(chǎn)布魯氏菌(B.abortus)、犬種布魯氏菌(B.canis)、羊種布魯氏菌(B.melitensis)、沙林鼠布魯氏菌(B.neotomae)、綿羊布魯氏菌(B.0vis)、豬布魯氏菌(B.suis)、鰭足類布魯氏菌(B.pinnipediae)。弗朗西斯氏菌(Francisella),例如,新兇手弗朗西斯氏菌(F.novicida)、蜃樓弗朗西斯氏菌(F.philomiragia)、土拉熱弗朗西斯氏菌(F.tularensis)。
淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)蒼白密螺旋體(Treponemapallidum)杜氏嗜血菌(Haemophilusducreyi)類腸球菌(Enterococcusfaecalis)或屎腸球菌(Enterococcus faecium)腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitic)結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)立克次體(Rickettsia)單核細胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)霍亂弧菌(Vibriocholerae)傷寒沙門菌(Salmonellatyphi)布氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)牙銀口卜啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)克雷伯菌(Klebsiella)在一些實施方式中，該免疫原引起抵御這些病毒之一的免疫應(yīng)答:正粘病毒(Orthomyxovirus):有用的免疫原可來自甲型、乙型或丙型流感病毒，例如血凝素、神經(jīng)氨酸酶或基質(zhì)M2蛋白。所述免疫原是甲型流感病毒血凝素時，其可來自任何亞型例如 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 或 H16。副粘病毒科(Paramyxoviridae)病毒:病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:肺炎病毒(例如，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)、腮腺炎病毒屬(例如，腮腺炎病毒)、副粘病毒(例如，副流感病毒)、偏肺病毒和麻疹病毒(例如，麻疹病毒)。痘病毒(Poxviridae):病毒免疫原包括但不限于衍生自正痘病毒(Orthopoxvirus)如天花(Variola vera)的免疫原，包括但不限于重型天花(Variolamajor)和輕型天花(Variola minor)。小核糖核酸病毒(Picornavirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:小核糖核酸病毒，如腸道病毒、鼻病毒、嗜肝RNA病毒、心臟病毒和口蹄疫病毒。在一個實施方式中，所述腸道病毒是脊髓灰質(zhì)炎病毒，例如I型、2型和/或3型脊髓灰質(zhì)炎病毒。在另一個實施方式中，所述腸道病毒是EV71腸道病毒。在另一個實施方式中，所述腸道病毒是A型或B型柯薩奇(coxsackie)病毒。布尼亞病毒(Bunyavirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:正布尼亞病毒(Orthobunyavirus)如加利福尼亞腦炎病毒、白蛉病毒(Phlebovirus)如裂谷熱病毒或內(nèi)羅病毒(Nairovirus)如克里米亞-剛果出血熱病毒。嗜肝RNA病毒(Heparnavirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自嗜肝RNA病毒如甲型肝炎病毒(HAV)的免疫原。
線狀病毒(Filovirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自線狀病毒的那些免疫原，例如埃博拉病毒屬(Ebola virus)(包括扎伊爾(Zaire)埃博拉病毒、象牙海岸(IvoryCoast)埃博拉病毒、雷斯頓(Reston)或蘇丹(Sudan)埃博拉病毒)或者馬爾堡病毒(Marburg virus)。
披膜病毒(Togavirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:披膜病毒(Togavirus),如風(fēng)疫病毒(Rubivirus)、α病毒(Alphavirus)或動脈炎病毒屬(Arterivirus)。該病毒包括風(fēng)疫病毒(rubella virus)。黃病毒(Flavivirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:黃病毒，如蜱傳腦炎(TBE)病毒、登革熱(1、2、3或4型)病毒、黃熱病毒、日本腦炎病毒、開薩諾森林病毒、西尼羅河腦炎病毒、圣路易斯腦炎病毒、俄國春夏腦炎病毒、波瓦生腦炎病毒。瘟病毒(Pestivirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自瘟病毒，如牛病毒性腹瀉(BVDV)、經(jīng)典豬瘟(CSFV)或邊界病(BDV)的那些免疫原。嗜肝DNA病毒(Hepadnavirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自嗜肝DNA病毒如乙型肝炎病毒的那些免疫原。組合物可包括乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)。其它肝炎病毒:組合物可包括來自丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒或庚型肝炎病毒的免疫原。棒狀病毒(Rhabdovirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自棒狀病毒如狂犬病病毒屬(例如狂犬病毒)和水泡病毒(VSV)的那些免疫原。杯狀病毒(Caliciviridae):病毒免疫原包括但不限于衍生自杯狀病毒，如諾沃克病毒(Norwalk virus)(諾如病毒(Norovirus))和諾沃克樣病毒，如夏威夷病毒(HawaiiVirus)和雪山病毒(Snow Mountain Virus)的那些免疫原。冠狀病毒(Coronavirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自SARS冠狀病毒、禽傳染性支氣管炎(IBV)、小鼠肝炎病毒(MHV)和豬傳染性腸胃炎病毒(TGEV)的那些免疫原。所述冠狀病毒免疫原可以是刺突多肽。逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自腫瘤病毒(Oncovirus)、慢病毒(Lentivirus)(例如 HIV-1 或 HIV-2)或者泡沫病毒(Spumavirus)的那些免疫原。呼腸病毒(Reovirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自正呼腸孤病毒屬(Orthoreovirus)、輪狀病毒(rotavirus)、環(huán)狀病毒(Orbivirus)、或科羅拉多壁風(fēng)熱病毒(Coltivirus)的那些免疫原。細小病毒(Parvovirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自細小病毒B19的那些免疫原。
皰疫病毒(Herpesvirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自人皰疫病毒的那些免疫原，例如單純皰疹病毒(HSV)(例如HSVl型和2型)、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)、艾伯斯坦-巴爾病毒(EBV)、巨細胞病毒(CMV)、人皰疹病毒6 (HHV6)、人皰疹病毒7 (HHV7)和人皰疹病毒8 (HHV8)乳頭狀多瘤空泡病毒(Papovaviruses):病毒免疫原包括但不限于衍生自乳頭狀瘤病毒(Papillomaviruses)和多瘤病毒(Polyomaviruses)的那些免疫原。(人)乳頭狀瘤病毒可以是血清型 1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63 或65，例如來自血清型6、11、16和/或18中的一種或多種。腺病毒(Adenovirus):病毒免疫原包括衍生自腺病毒血清型36 (Ad_36)的那些免疫原。
在一些實施方式中，所述免疫原引起針對感染魚的的病毒的免疫應(yīng)答，例如 傳染性鮭魚貧血病毒(ISAV)、鮭魚胰腺病病毒(SPDV)、傳染性胰臟壞死病毒(IPNV)、水道貓魚病毒(CCV)、魚類淋巴囊腫病病毒(FLDV)、傳染性造血組織壞死病毒(IHNV)、錦鯉皰疹病毒、鮭魚小核糖核酸樣病毒(也稱作大西洋鮭魚的小核糖核酸樣病毒)、陸封鮭病毒(landlocked salmon virus，LSV)、大西洋娃魚輪狀病毒(ASR)、蹲魚草毒病病毒(TSD)、銀鮭魚腫瘤病毒(CSTV)或病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)。真菌免疫原可衍生自皮膚真菌(Dermatophytres)，包括:絮狀表皮癬菌(Epidermophyton f 1ccusum)、奧杜安氏小抱子菌(Microsporum audouini)、犬小抱子菌(Microsporum canis)、扭曲小抱子菌(Microsporum distortum)、馬類小抱子菌(Microsporum equinum)、石膏樣小抱子菌(Microsporum gypsum)、矮小小抱子菌(Microsporum nanum)、同心性毛癬菌(Trichophyton concentricum)、馬發(fā)癬菌(Trichophyton equinum)、雞毛癬菌(Trichophyton gallinae)、石膏狀毛癬菌(Trichophyton gypseum)、麥格氏毛癬菌(Trichophyton megnini)、須癬毛癬菌(Trichophyton mentagrophytes)、昆克努發(fā)癬菌(Trichophyton quinckeanum)、紅色毛癬菌(Trichophyton rubrum)、許蘭毛癬菌(Trichophyton schoenleini)、斷發(fā)毛癬菌(Trichophyton tonsurans)、撫狀毛癬菌(Trichophyton verrucosum)、撫狀毛癬菌的白變種(var.album)、盤狀變種(var.discoides)、赫色變種(var.0chraceum)、紫色毛癬菌(Trichophyton violaceum)和 / 或蜜塊狀發(fā)癬菌(Trichophyton faviforme);或者衍生自煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、土曲霉(Aspergillus terreus)、聚多曲霉(Aspergillus sydowi)、黃曲霉(Aspergillus flavatus)、灰綠曲霉(Aspergillusglaucus)、頭狀芽裂殖菌(Blastoschizomyces capitatus)、白假絲酵母(Candidaalbicans)、烯醇酶假絲酵母(Candida enolase)、熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)、光滑假絲酵母(Candida glabrata)、克魯斯假絲酵母(Candida krusei)、近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)、類星形假絲酵母(Candida stellatoidea)、克魯斯假絲酵母(Candida kusei)、帕拉克斯假絲酵母(Candida parakwsei)、葡萄牙假絲酵母(Candidalusitaniae)、偽熱帶假絲酵母(Cand ida pseudotropicalis)、季也蒙假絲酵母(Candidaguilliermondi)、卡氏枝抱霉(Cladosporium carrionii)、粗球抱子菌(Coccidioidesimmitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatidis)、新型隱球菌(Cryptococcusneoformans)、棒地霉(Geotrichum cIavatum)Λ 莢膜組織胞衆(zhòng)菌(Histoplasmacapsulatum)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、微抱子蟲(Microsporidia)、腦炎微孢子蟲屬(Encephalitozoon spp)、表層角結(jié)膜炎微孢子蟲(Septata intestinalis)和腸微孢子蟲(Enterocytozoon bieneusi);較不常見的是:短粒蟲屬(Brachiola spp.)、微抱子蟲屬(Microsporidium spp.)、抱子蟲屬(Nosema spp.)、皮里蟲屬(Pleistophoraspp)、氣管普抱蟲屬(Trachipleistophora spp.)、條抱蟲屬(Vittaforma spp.)、巴西芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis)、卡氏月市抱子蟲(Pneumocystis carinii)、苜猜腐酶(Pythiumn insidiosum)、卵狀糖疫癬菌(Pityrosporum ovale)、釀酒酵母(Sacharomycescerevisae)、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)、粟酒酵母(Saccharomyces pombe)、尖端賽多抱子菌(Scedosporium apiosperum)、申克抱子絲菌(Sporothrix schenckii)、白吉利絲孢酵母(Trichosporon beigelii)、弓形蟲(Toxoplasma gondii)、馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)、馬拉色菌(Malassezia spp.)、著色真菌屬(Fonsecaea spp.)、王氏霉菌屬(ffangiella spp.)、孢子絲菌屬(Sporothrix spp.)、娃糞霉屬(Basidiobolusspp.)、耳霉屬(Conidiobolus spp.)、根霉屬(Rhizopus spp.)、毛霉屬(Mucor spp.)、犁頭霉屬(Absidia spp.)、被抱霉屬(Mortierella spp.)、小克銀漢霉屬(Cunninghamellaspp.)、瓶霉屬(Saksenaea spp.)、鏈格抱菌屬(Alternaria spp.)、彎抱菌屬(Curvulariaspp.)、長螺孢菌屬(Helminthosporium spp.)、鐮胞菌屬(Fusarium spp.)、曲霉屬(Aspergillus spp.)、青霉屬(Penicillium spp.)、鏈核霉菌屬(Monolinia spp.)、絲核菌屬(Rhizoctonia spp.)、擬青霉屬(Paecilomyces spp.)、皮司霉屬(Pithomyces spp.)和枝抱霉屬(Cladosporium spp.)。在一些實施方式中，所述免疫原引起針對痕原蟲(Plasmodium)屬的寄生蟲的免疫應(yīng)答，例如惡性瘧原蟲(P.falciparum)、間日瘧原蟲(P.vivax)、三日瘧原蟲(P.malariae)或卵形瘧原蟲(P.0vale)。因此，本發(fā)明可用于針對瘧疾免疫。在一些實施方式中，所述免疫原引起的免疫應(yīng)答針對源自魚虱科(Caligidae)的寄生蟲，尤其是那些來自瘡痂魚虱屬(L印eophtheirus)和魚虱屬(Caligus)例如海虱如鮭瘡痂魚虱(Lepeophtheirus salmonis)或智利魚風(fēng)(Caligus rogercresseyi)的寄生蟲。

在一些實施方式中，所述免疫原引起針對以下的免疫應(yīng)答:花粉過敏原(樹、草本和草花粉過敏原)、昆蟲或蜘蛛類動物過敏原(吸入式、唾液和毒液過敏原，例如螨蟲過敏原、蟑螂和蠓過敏原、膜翅類毒液過敏原)、動物毛發(fā)和皮屑過敏原(來自例如狗、貓、馬、大鼠、小鼠等)；以及食物過敏原(例如麥醇溶蛋白)。來自樹、草和草本植物的重要花粉過敏原源于例如以下分類學(xué)的目:殼斗目(Fagales)、木樨目(Oleales)、松柏目(Pinales)以及懸鈴木科(platanaceae),包括但不限于樺木(樺屬(Betula))、赤楊(棺木屬(Alnus))、榛木(榛屬(Corylus))、鵝耳櫪木(鵝耳櫪屬(Carpinus))和橄欖(齊墩果屬(Olea))、雪松(柳杉屬(Cryptomeria)和檜屬(Juniperus))、懸鈴木(懸鈴木屬(Platanus)),禾本目包括以下屬的草:黑麥草屬(Lolium)、貓尾草屬(Phleum)、早熟禾(Poa)、狗牙根屬(Cynodon)、鴨茅屬(Dactylis)、絨毛草屬(Holcus)、薦草屬(Phalaris)、黑麥屬(Secale)和蜀黍?qū)?Sorghum),菊目(Asterales)和蕁麻目(Urticales)包括以下屬的草本植物:豚草屬(Ambrosia)、艾屬(Artemisia)和墻草屬(Parietaria)。其它重要的吸入式過敏原是來自以下那些過敏原:表皮螨屬(Dermatophagoides)和嗜霉螨屬(Euroglyphus)的屋塵螨、儲糧塵螨例如害嗜鱗螨(Lepidoglyphus)、食甜螨屬(Glycyphagus)和食酪螨屬(Tyrophagus),來自蟑螂、蠓和跳蚤例如小蠊屬(Blatella)、大蠊屬(Periplaneta)、搖蚊屬(Chironomus)和柿頭蚤屬(Ctenocephalides),來自哺乳動物如貓、狗和馬,毒液過敏原包括例如源自針蟲或咬蟲的過敏原，例如來自分類學(xué)的膜翅目的那些昆蟲，包括蜜蜂(蜜蜂科，Apidae)、黃蜂(胡蜂科，Vespidea)和螞蟻(蟻科，F(xiàn)ormicidae)。在一些實施方式中，所述免疫原是選自以下的腫瘤抗原:(a)癌癥-睪丸抗原，如NY-ESO-1、SSX2、SCPl 以及 RAGE、BAGE、GAGE 和 MAGE 家族多肽，如 GAGE-1、GAGE_2、MAGE_1、MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5、MAGE-6和MAGE-12 (例如，可用于針對黑色素瘤、肺腫瘤、頭頸部腫瘤、NSCLC瘤、乳腺腫瘤、胃腸道腫瘤和膀胱腫瘤)；(b)突變的抗原，例如p53(與各種實體瘤如結(jié)直腸癌、肺癌、頭頸癌有關(guān))、P21/Ras (與例如黑色素瘤、胰腺癌和結(jié)直腸癌有關(guān))、⑶K4(與例如黑色素瘤有關(guān))、MUMl (與例如黑色素瘤有關(guān))、半胱天冬酶-8(與例如頭頸癌有關(guān))、CIA0205(與例如膀胱癌有關(guān))、HLA-A2-R1701、β聯(lián)蛋白(與例如黑色素瘤有關(guān))、TCR(與例如T-細胞非霍奇金淋巴瘤有關(guān))、BCR-abl (與例如慢性髓細胞性白血病有關(guān))、磷酸丙糖異構(gòu)酶、KIA0205、⑶C-27和LDLR-FUT ； (c)過表達的抗原，例如半乳糖凝集素4 (與例如結(jié)直腸癌有關(guān))、半乳糖凝集素9 (與例如霍奇金病有關(guān))、蛋白酶3 (與例如慢性髓細胞性白血病有關(guān))、WT1 (與例如各種白血病有關(guān))、碳酸酐酶(與例如腎癌有關(guān))、醛縮酶A(與例如肺癌有關(guān))、PRAME (與例如黑色素瘤有關(guān))、HER-2/neu (與例如乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌和卵巢癌有關(guān))、乳腺球蛋白、甲胎蛋白(與例如肝細胞癌有關(guān))、KSA(與例如結(jié)直腸癌有關(guān))、胃泌素(與例如胰腺癌和胃癌有關(guān))、端粒酶催化蛋白、MUC-1 (與例如乳腺癌和卵巢癌有關(guān))、G-250 (與例如腎細胞癌有關(guān))、p53 (與例如乳腺癌和結(jié)腸癌有關(guān))和癌胚抗原(與例如乳腺癌、肺癌和胃腸道癌如結(jié)直腸癌有關(guān))；(d)共有的抗原，例如黑色素瘤-黑素細胞分化抗原如MART-l/Melan A、gplOO、MClR、黑素細胞-刺激激素受體、酪氨酸酶、酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1/TRP1和酪氨酸酶相關(guān)蛋白_2/TRP2(與例如黑色素瘤有關(guān))；(e)前列腺相關(guān)抗原，如PAP、PSA、PSMA, PSH-PU PSM-PU PSM-P2,與例如前列腺癌有關(guān)；(f)免疫球蛋白獨特型(與例如骨髓瘤和B細胞淋巴瘤有關(guān))。在某些實施方式中，腫瘤抗原包括但不限于巾15、!10111/]^1-40、!1-1^8 424- 虬、!14-1 1\16!1-161(、]^1^-狀1 、艾伯斯坦-巴爾病毒抗原、EBNA、人乳頭瘤病毒(HPV)抗原，包括E6和E7、乙肝和丙肝病毒抗原、人T細胞嗜淋巴病毒抗原、15卩-180、？1856^^2、？18(^^^-3、。1^111111-23!11、1六6-72-4、0六19-9、0六72-4、CAMl7.UNuMa, K_ras、pl6、TAGE, PSCA, CT7、43_9F、5T4、791Tgp72、β -HCG, BCA225、BTAA,CA125、CA 15-3 (CA27.29\BCAA)、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、C0-029、FGF-5、Ga733 (EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7_Ag、M0V18、NB/70K、NY-CO-1、RCASl、SDCCAG16、TA-90 (Mac-2結(jié)合蛋白/親環(huán)蛋白C相關(guān)蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS等。藥物組合物本發(fā)明的脂質(zhì)體可用作藥物組合物中的組分來免疫對象抵御各種疾病。除脂質(zhì)體之外，這些組合物通常還包括藥學(xué)上可接受的運載體。關(guān)于藥學(xué)上可接受運載體的全面討論參見參考文獻29。 本發(fā)明的藥物組合物可包括一種或多種小分子免疫增強劑。例如，所述組合物可包括TLR2激動劑(例如Pam3CSK4)、TLR4激動劑(例如氨烷基氨基葡糖苷磷酸，如E6020)、TLR7激動劑(例如咪喹莫特(imiquimod))、TLR8激動劑(例如瑞喹莫德(resiquimod))和/或TLR9激動劑(例如IC31)。任何所述的激動劑理想上具有<2000Da的分子量。在一些實施方式中，所述激動劑也與RNA—同在脂質(zhì)體內(nèi)包封，但在其它實施方式中，不包封所述激動劑。本發(fā)明的藥物組合物可包括溶于淡水(例如w.f.1)或緩沖液的脂質(zhì)體，所述緩沖液為例如磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、硼酸鹽緩沖液、琥珀酸鹽緩沖液、組氨酸緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液。緩沖鹽濃度一般在5-20mM范圍內(nèi)。本發(fā)明的藥物組合物的pH可為5.0-9.5，如6.0-8.0。本發(fā)明的組合物可含有鈉鹽(如氯化鈉)以產(chǎn)生張力。NaCl的濃度通常是10+2mg/mL,例如約 9mg/mL。本發(fā)明的組合物可包含金屬離子螯合劑。這些金屬離子螯合劑可通過移除能加速磷酸二酯水解的離子來延長RNA穩(wěn)定性。因此，組合物可包含EDTA、EGTA、BAPTA、噴替酸等中的一種或多種。所述螯合劑的濃度通常為10-500 μ M，例如0.1mM。檸檬酸鹽例如檸檬酸鈉，既可作為螯合劑，又有利地提供緩沖活性。本發(fā)明藥物組合物的摩爾滲透壓濃度可為200m0sm/kg-400m0sm/kg,如240_360m0sm/kg 或 290_310m0sm/kg。本發(fā)明的藥物組合物可包含一種或多種防腐劑，例如硫柳汞或2-苯氧乙醇。優(yōu)選不含汞的組合物，且可制備不含防腐劑的疫苗。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選無菌。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選無熱源，如含有〈1EU (內(nèi)毒素單位，標準量度)/劑量，并優(yōu)選〈0.1EU/劑量。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選不含谷蛋白。本發(fā)明的藥物組合物可以單位劑量形式制備。在一些實施方式中，單位劑量的體積可為0.1-1.0mL,例如約0.5mL?？蓪⑺鼋M合物制備為溶液或懸浮液形式的注射劑。所述組合物可制備用于肺部給藥，例如用細霧通過吸入器給藥。所述組合物可制備用于鼻部、耳部或眼部給藥，例如作為噴霧或滴劑。一般是用于肌肉內(nèi)給藥的注射劑。組合物包含免疫有效量的脂質(zhì)體，以及任何其它所需的組分?！懊庖哂行Я俊笔侵冈谝淮蝿┝炕蛞幌盗袆┝康囊徊糠种薪o予個體的量對治療或預(yù)防有效。該量的變化取決于如下因素:待治療個體的健康和身體狀況、年齡、待治療個體的分類群(例如，非人的靈長動物、靈長動物等)、個體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需的保護程度、疫苗配方、治療醫(yī)生對醫(yī)學(xué)情況的評估和其它相關(guān) 因素。預(yù)計所述量將落入可通過常規(guī)試驗測定的相對較寬范圍內(nèi)。本發(fā)明組合物的脂質(zhì)體和RNA含量一般按每劑量RNA的量來表示。優(yōu)選劑量具有
100 μ g 的 RNA (例如 10-100 μ g,如約 10 μ g、25 μ g、50 μ g、75 μ g 或 100 μ g),但可見表達的水平低很多，例如< lyg/劑量、-1OOng/劑量、< IOng/劑量、< Ing/劑量等。本發(fā)明還提供一種遞送裝置(例如注射器、霧化器、噴霧器、吸入器、透皮貼片等)，所述遞送裝置包含本發(fā)明的藥物組合物。該裝置可用于將所述組合物給予脊椎動物對象。本發(fā)明的脂質(zhì)體不包括核糖體。治療及醫(yī)學(xué)應(yīng)用方法與參考文獻10中公開的顆粒相反，本發(fā)明的脂質(zhì)體和藥物組合物用于體內(nèi)應(yīng)用以弓I起針對感興趣免疫原的免疫應(yīng)答。本發(fā)明提供了用于在脊椎動物內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予有效量的本發(fā)明脂質(zhì)體或藥物組合物的步驟。所述免疫應(yīng)答優(yōu)選為保護性免疫應(yīng)答，并優(yōu)選涉及抗體和/或細胞介導(dǎo)的免疫。所述方法可產(chǎn)生加強應(yīng)答。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的脂質(zhì)體或藥物組合物在產(chǎn)生脊椎動物體內(nèi)免疫應(yīng)答的方法中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了本發(fā)明脂質(zhì)體在制造用于引起脊椎動物體內(nèi)免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用。通過這些應(yīng)用和方法在脊椎動物體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，可保護所述脊椎動物抵御各種疾病和/或感染，例如，針對如上討論的細菌和/或病毒性疾病。所述脂質(zhì)體和組合物是免疫原性的，更優(yōu)選為疫苗組合物。本發(fā)明所述的疫苗可以是預(yù)防性(即，用來預(yù)防感染)或治療性(即，用來治療感染)疫苗，但一般是預(yù)防性疫苗。所述脊椎動物優(yōu)選哺乳動物，如人或大型獸類哺乳動物(例如，馬、牛、鹿、山羊、豬)。當所述疫苗用于預(yù)防性用途時，人優(yōu)選是兒童(如幼童或嬰兒)或青少年；當所述疫苗用于治療用途時，人優(yōu)選是青少年或成人。用于兒童的疫苗也可給予成年人，例如，用以評估其安全性、劑量、免疫原性等。按本發(fā)明所述制備的疫苗可用于治療兒童和成年人。因此，人患者可小于I歲、小于5歲、I 5歲、5 15歲、15 55歲或至少55歲。接受疫苗的患者優(yōu)選老年人(如彡50歲，彡60歲并優(yōu)選彡65歲)、年輕人(如< 5歲)、住院病人、保健護理人員、武裝人員和軍人、孕婦、慢性病人或免疫缺陷病人。然而，所述疫苗不僅適用于這些人群，還可用于更廣泛的群體。通常將本發(fā)明的組合物直接給予患者?？赏ㄟ^腸胃外注射實現(xiàn)直接遞送(例如皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)或注入組織間隙；不同于參考文獻I，本發(fā)明一般不使用舌內(nèi)注射)。替代的 遞送途徑包括直腸、口服(例如片劑、噴霧)、頰部、舌下、陰道、局部、透皮或經(jīng)皮、鼻內(nèi)、眼部、耳部、肺部或其它粘膜給藥。皮內(nèi)和肌內(nèi)給藥是兩種優(yōu)選的途徑。注射可以通過針頭(例如皮下針頭)進行，但也可替代使用無針注射。肌內(nèi)劑量一般為0.5mL。本發(fā)明可用于引起全身和/或粘膜免疫，優(yōu)選引起增強的全身和/或黏膜免疫?？梢酝ㄟ^單劑量方案或多劑量方案給藥。多劑量可以用于初次免疫方案和/或加強免疫方案。在多劑量方案中，可通過相同或不同的途徑如胃腸道外初始和粘膜加強，粘膜初次和胃腸道外加強等給予多個劑量。一般間隔至少I周(例如約2周、約3周、約4周、約6周、約8周、約10周、約12周、約16周等)給予多劑量。在一個實施方式中，可在出生后約6周、10周和14周給予多劑量,例如按世界衛(wèi)生組織的擴大免疫規(guī)劃(Expanded Programon Immunisation，“EPI”)中常用的6周齡、10周齡和14周齡時給藥。在一個替代實施方式中，間隔約兩個月(例如間隔約7、8或9周)給予兩個主要劑量，然后在第二次主要劑量后約6個月 I年(例如在第二次主要劑量后約6、8、10或12個月)給予一個或多個加強劑量。在另一個實施方式中，間隔約兩個月(例如間隔約7、8或9周)給予三個主要劑量，然后在第三次主要劑量后約6個月 I年(例如，在第三次主要劑量后約6、8、10或12個月)給予一個或多個加強劑量。概述除非另有說明，本發(fā)明的實施將采用化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)和藥理學(xué)的常規(guī)方法，這些常規(guī)方法在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。這些技術(shù)在文獻中已有充分描述。參見例如，參考文獻30-36等。術(shù)語“包含”涵蓋“包括”以及“由…組成”，例如，“包含”X的組合物可以僅由X組成或可包括其它物質(zhì)，例如X+Y。與數(shù)值X相關(guān)的術(shù)語“約”是可選的并表示，例如，x±10%。術(shù)語“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的組合物可完全不含Y。如有需要，“基本上” 一詞可以從本發(fā)明的定義中省略。提及電荷、陽離子、陰離子、兩性離子等時都是指pH7情況下。
TLR3是Toll樣受體3。它是在先天免疫系統(tǒng)中起重要作用的單次跨膜受體，其。已知的TLR3激動劑包括聚(1:C)?！癟LR3”是該受體編碼基因的批準HGNC名稱，并且其專有 HGNC ID 是 HGNC:11849。人 TLR3 基因的 RefSeq 序列是 G1:2459625。TLR7是Toll樣受體7。它是在先天免疫系統(tǒng)中起重要作用的單次跨膜受體。已知的TLR7激動劑包括例如咪喹莫特。“TLR7”是該受體編碼基因的批準HGNC名稱，并且其專有 HGNC ID 是 HGNC:15631。人 TLR7 基因的 RefSeq 序列是 G1:67944638。TLR8是Toll樣受體8。它是在先天免疫系統(tǒng)中起重要作用的單次跨膜受體。已知的TLR8激動劑包括例如瑞喹莫德(resiquimod)?！癟LR8”是該受體編碼基因的批準HGNC名稱，并且其專有HGNC ID是HGNC:15632。人TLR8基因的RefSeq序列是G1:20302165。RIG-1樣受體(“RLR”)家族包括多種RNA解旋酶，其在先天免疫系統(tǒng)中起重要作用[37]。RLR-1(也稱作RIG-1或維甲酸誘導(dǎo)基因I)在其N-末端附近有兩個半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域。該RLR-1解旋酶編碼基因的批準HGNC名稱是“DDX58”(用于DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp)盒多肽 58)，并且其專有 HGNC ID 是 HGNC: 19102。人 RLR-1 基因的RefSeq序列是G1:77732514。RLR2 (也稱作MDA5或黑色素瘤分化相關(guān)基因5)在其N-末端附近也具有兩個半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域。該RLR-2解旋酶編碼基因的批準HGNC名稱是“IFIH1”(用于由解旋酶C結(jié)構(gòu)域I誘導(dǎo)的干擾素(interferon induced with helicaseC domainl))，并且其專有 HGNC I D 是 HGNC: 18873。人 RLR-2 基因的 RefSeq 序列是 G1:27886567。RLR-3 (也稱作LGP2或遺傳學(xué)和生理學(xué)實驗室蛋白2 (laboratory of geneticsandphysiology2))沒有半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域。該RLR-3解旋酶編碼基因的批準HGNC名稱是“DHX58”(用于 DEXH(Asp-Glu-X-His)盒多肽 58)，并且其專有 HGNC ID 是 HGNC:29517。人 RLR-3 基因的 RefSeq 序列是 G1: 149408121。PKR是雙鏈RNA依賴性蛋白激酶。其在先天免疫系統(tǒng)中起重要作用。“EIF2AK2”(用于真核生物翻譯起始因子2-α激酶2)是該酶編碼基因的批準HGNC名稱，并且其專有HGNCID 是 HGNC:9437ο 人 PKR 基因的 RefSeq 序列是 G1:208431825。


圖1顯示RNA染色凝膠。泳道顯示:(I)標記物(2)裸復(fù)制子(3) RNA酶處理后的復(fù)制子(4)包封在脂質(zhì)體內(nèi)的復(fù)制子(5)RNA酶處理后的脂質(zhì)體(6)經(jīng)RNA酶處理后又經(jīng)苯酚/氯仿提取的脂質(zhì)體。圖2是脂質(zhì)體的電子顯微照片。圖3顯示在大(下方線)或小(上方線)脂質(zhì)體中遞送RNA后第I天、第3天和第6天的蛋白表達(以相對光單位(RLU)形式)。圖4顯示RNA染色凝膠。泳道顯示:(I)標記物(2)裸復(fù)制子(3)包封在脂質(zhì)體內(nèi)的復(fù)制子(4)經(jīng)RNA酶處理后又經(jīng)苯酚/氯仿提取的脂質(zhì)體。圖5顯示RNA遞送后第1、3和6天的蛋白質(zhì)表達，其中，RNA以病毒例包裝的復(fù)制子形式遞送(方形)、以裸露RNA形式遞送(菱形)或在脂質(zhì)體內(nèi)遞送(+=0.1 μ g，X=I μ g)。圖6顯示四種不同劑量的脂質(zhì)體包封RNA遞送后第1、3和6天的蛋白質(zhì)表達。圖7顯示接受病毒粒包裝的復(fù)制子(VRP或VSRP)、I μ g裸露RNA和I μ g脂質(zhì)體包封RNA的動物中抗F IgG效價。
圖8顯示接受VRP、1 μ g裸露RNA和0.1g或I μ g脂質(zhì)體包封RNA的動物中抗FIgG效價。圖9顯示接受VRP、0.1g或I μ g脂質(zhì)體包封RNA的動物內(nèi)中和抗體效價。圖10顯示復(fù)制子以裸露RNA (圓形)、脂質(zhì)體包封的RNA (三角形和方形)或脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物(lipoplex)(倒三角形)形式遞送后的表達水平。圖11顯示復(fù)制子以裸露RNA (0.01 lyg)、脂質(zhì)體包封的RNA (0.01 IOyg)或包裝成病毒粒(VRP，106感染單位或IU)形式遞送后的F特異性IgG效價(第二劑量后2周)。圖12顯示復(fù)制子以裸露RNA(1 μ g)、脂質(zhì)體包封的RNA (0.1或I μ g)或包裝成病毒粒(VRP，106IU)的形式遞送后的F特異性IgG效價(圓形)和PRNT效價(方形)。也顯示了未處理(nai’veH、鼠的效價。實線表示幾何平均數(shù)。圖13顯示在第二劑量后4周，用代表F蛋白內(nèi)主要抗原表位的合成肽再刺激后的胞內(nèi)細胞因子生成。I軸表示⑶8+⑶4-的細胞因子+%。圖14顯示小牛免疫后210天內(nèi)F特異性IgG效價(平均1gltl效價土標準偏差)。在第63天時，三條 線可由底至頂部輕易區(qū)分:PBS陰性對照、脂質(zhì)體遞送的RNA以及所述“三角4 (Triangle4)”產(chǎn)物。圖15顯示在編碼F蛋白的復(fù)制子第一劑量后兩周的抗F效價表達(相對)。所述效價對脂質(zhì)體Z均直徑(nm)作圖。圖16A 16M顯示替代陽離子型脂質(zhì)的結(jié)構(gòu):(A)RV05 ;(B)RV02 ;(C)RV04 ;(D)RVO7 ； (E) RVO3 ； (F) RV08 ； (G) RVO9 ； (H) RV14 ； (I)RVlO ； (J) RVll ； (K) RV15 ； (L) RV16 ； (M)RV17。圖17顯示有用的“分裂"PEG偶聯(lián)脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)。在測試的脂質(zhì)體中，框內(nèi)PEG的總分子量是2000。圖18A 18E顯示多種PEG偶聯(lián)脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)，其中R是具有所需長度的PEG。
具體實施例方式RNA復(fù)制子下文使用多種復(fù)制子。一般而言，這些復(fù)制子基于雜交α病毒基因組，其具有來自委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的非結(jié)構(gòu)蛋白，來自VEEV的包裝信號，以及來自辛德畢斯病毒或VEEV突變體的3’ UTR0該復(fù)制子長約10kb，且具有聚腺苷酸尾。將編碼α病毒復(fù)制子的質(zhì)粒DNA (名為:pT7-mVEEV_FL.RSVF或A317、pT7-mVEEV-SEAP或A306、pSP6_VCR-GFP或A50)作為用于體外合成RNA的模板。所述復(fù)制子含有RNA復(fù)制所需的α病毒遺傳元件，但缺乏編碼顆粒組裝所必需基因產(chǎn)物的那些遺傳元件；所述結(jié)構(gòu)蛋白由感興趣的蛋白質(zhì)(報告子(如SEAP或GFP)或者免疫原(如全長RSVF蛋白))取代，因此所述復(fù)制子不能誘導(dǎo)傳染性顆粒產(chǎn)生。所述α病毒cDNA上游的噬菌體(T7或SP6)啟動子促進所述復(fù)制子RNA的體外合成，并且緊鄰聚(A)尾下游的丁型肝炎病毒(HDV)核酶通過其自切割活性產(chǎn)生正確的3’末端。用合適的限制性內(nèi)切核酸酶線性化所述HDV核酶下游的質(zhì)粒DNA后，用T7或SP6曬菌體衍生的DNA依賴性RNA聚合酶體外合成失控轉(zhuǎn)錄物(run-offtranscript)。按照生產(chǎn)商(安碧公司(Ambion))提供的說明，在7.5mM(T7RNA聚合酶)或5mM(SP6RNA聚合酶)各三磷酸核苷(ATP、CTP、GTP和UTP)存在下37°C轉(zhuǎn)錄2小時。轉(zhuǎn)錄后，用TURBO DNA酶(安碧公司(Ambion))消化模板DNA。用LiCl沉淀復(fù)制子RNA，并將其復(fù)溶于無核酸酶的水中。通過ScriptCap m7G加帽系統(tǒng)(埃皮森特生物技術(shù)公司(Epicentre Biotechnologies))按照使用手冊所述，用牛痘加帽酶(VCE)對未加帽的RNA進行轉(zhuǎn)錄后加帽；以該方式加帽的復(fù)制子標有前綴“V”，例 如，vA317是通過VCE加帽的A317復(fù)制子。用LiCl沉淀轉(zhuǎn)錄后加帽的RNA，并將其復(fù)溶于無核酸酶的水中。RNA樣品的濃度通過檢測0D260nm測定。體外轉(zhuǎn)錄物的完整性通過變性瓊脂糖凝膠電泳證實。脂質(zhì)體包封將RNA包封在基本按參考文獻7和38所述方法制備的脂質(zhì)體內(nèi)。所述脂質(zhì)體由10%DSPC (兩性離子型)、40%DLinDMA (陽離子型)、48%膽固醇和2%PEG偶聯(lián)DMG (2kDa PEG)制成。這些比例指占整個脂質(zhì)體中的摩爾％。用參考文獻2的方法合成DLinDMA(l，2_ 二亞油氧基-N，N- 二甲基-3-氨基丙燒)。DSPC(1，2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿)購自健贊公司(Genzyme)。膽固醇獲自西格瑪-奧德里奇公司(Sigma-Aldrich)。PEG偶聯(lián)DMG (I，2-二肉豆蘧酰基-sn_丙三基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)，銨鹽)、D0TAP(1，2-二油酰基-3-三甲基銨基丙燒，氯鹽)和DC-chol (3 β _[N_(N’，N’- 二甲氨基乙燒)-氨基甲酸基]鹽酸膽固醇)，來自阿凡提極性脂公司(Avanti Polar Lipids)。簡單來說，將脂質(zhì)溶解于乙醇(2mL)中，將RNA復(fù)制子溶解于緩沖液(2mL，IOOmM檸檬酸鈉，pH6)中，用2mL緩沖液混合這些物質(zhì)，然后平衡I小時。用6mL緩沖液稀釋所述混合物，然后過濾。所得產(chǎn)物包含脂質(zhì)體，具有約95%的包封率。例如，在一個具體方法中，在乙醇中制備新鮮的脂質(zhì)儲液。稱量37mg DLinDMA,
11.8mg DSPC、27.8mg 膽固醇和 8.07mg PEG-DMG，并在 7.55mL 乙醇中溶解。在 37。C 溫和搖動新鮮制備的脂質(zhì)儲液約15分鐘以形成均質(zhì)混合物。然后，將755μ L所述儲液加入1.245mL乙醇中形成2mL工作脂質(zhì)儲液。將這個量的脂質(zhì)用于形成含有250 μ g RNA的脂質(zhì)體。還以IOOmM檸檬酸鹽緩沖液(pH6)中約I μ g/μ L儲液制備2mL RNA工作溶液。三個20mL的玻璃瓶(有攪拌棒)用RNA酶清除液(分子生物產(chǎn)品公司(Molecular BioProducts))沖洗并用足量Mi 11 iQ水清洗，然后用于去除瓶子的RNA酶污染。將所述玻璃瓶中的一個用于所述RNA工作溶液，其它的瓶用于收集所述脂質(zhì)和RNA混合物(如后文所述)。在37° C加熱所述工作脂質(zhì)和RNA溶液lOmin，然后將其裝入3cc魯爾鎖(Iuer-1ok)注射器。將2mL檸檬酸鹽緩沖液(pH6)加載入另一個3cc注射器中。使用FEP管(氟化乙烯-丙烯；所有使用的FEP管都具有2mm內(nèi)直徑和3mm外直徑,獲自藝達思健康科學(xué)公司(Idex HealthScience))將含有RNA和所述脂質(zhì)的注射器連接至T型混流器(ΡΕΕΚ 500 μ m ID連接，藝達思健康科學(xué)公司(Idex Health Science))。所述T型混流器的出口也裝有FEP管。將含有檸檬酸鹽緩沖液的第三注射器連接至一段單獨的管。然后，用注射泵以7mL/min的流速驅(qū)動所有注射器。放置所述管的出口以使所述混合物收集到20mL玻璃瓶中(同時攪拌)。取出所述攪拌棒，使所述乙醇/水性溶液平衡至室溫lh。將4mL所述混合物加載入連有一段FEP管的5cc注射器，將等量的IOOmM檸檬酸鹽緩沖液(pH6)加載入另一個連有一段等長FEP管的5cc注射器。用注射泵以7mL/分鐘的流速驅(qū)動所述兩個注射器，并將最終的混合物收集到20mL玻璃瓶中(同時攪拌)。其次，使收集自第二混合步驟的混合物(脂質(zhì)體)通過Mustang Q膜(結(jié)合并移除陰離子分子的陰離子交換支持物，獲自波爾公司(PaliCorporation))。在該膜用于脂質(zhì)體之前,4mL IM NaOH>4mL IM NaCl 和 IOmL IOOmM朽1 樣酸鹽緩沖液(PH6)依次通過該膜。將脂質(zhì)體在37° C加溫IOmin后通過所述膜。接著，將脂質(zhì)體濃縮到2mL，使用切向流過濾(TFF)相對10 15體積IXPBS透析，然后回收終產(chǎn)物。所述TFF系統(tǒng)和中空纖維過濾膜購自斯派實驗室(Spectrum Labs)(多明格斯牧場(RanchoDominguez)),并按照生產(chǎn)商指南使用。使用具有IOOkD孔徑截止值、8cm2表面積的聚砜中空纖維過濾膜。對于體外和體內(nèi)實驗，制劑用I XPBS稀釋到所需的RNA濃度。圖2顯示通過這些方法制備的脂質(zhì)體的示例性電子顯微照片。這些脂質(zhì)體包含編碼全長RSV F抗原的包封RNA。一個批次的動態(tài)光散射顯示其平均直徑是141nm(根據(jù)密度)或78nm (根據(jù)數(shù)量)。包封RNA的百分比和RNA濃度利用Quant-1T RiboGreen RNA試劑盒(英杰公司(Invitrogen))按照生產(chǎn)商說明來測定。利用所述試劑盒提供的核糖體RNA標準品生成標準曲線。在添加染料前，在I XTE緩沖液(來自試劑盒)中10X或100X稀釋所述脂質(zhì)體。單獨地，在添加染料(用于破壞脂質(zhì)體并由此檢測總RNA)前，在含有0.5%曲通(Triton)X的IXTE緩沖液中10X或100X稀釋脂質(zhì)體。之后，向各溶液添加等量染料，然后，將約180 μ L添加染料后的各溶液一式兩份加入96孔組織培養(yǎng)板。在酶標儀上讀取熒光(激發(fā)波長485nm，發(fā)射波長528nm)。所有脂質(zhì)體制劑的體內(nèi)給藥都基于RNA的包封量。脂質(zhì)體內(nèi)包封顯示保護RNA免予RNA酶消化。實驗使用3.8mAU RNA酶A/微克RNA，在室溫孵育30分鐘。RNA酶用蛋白酶K在55° C滅活10分鐘。然后添加l:lv/v的樣品混合物到25:24: lv/v/v的苯酚:氯仿:異戊醇以從所述脂質(zhì)提取所述RNA進入水相。渦旋數(shù)秒混勻樣品，然后將樣品置于離心機上以12，000RPM離心15分鐘。移出并使用所述水相(含有所述RNA)來分析所述RNA。在上樣之前(每孔400ng RNA)，將所有樣品和甲醛上樣染料一起孵育，在65° C變性10分鐘，并冷卻至室溫。使用安碧公司(Ambion)的Millennium標記物來估計RNA構(gòu)建物的分子量。在90V跑膠。按照生產(chǎn)商指南，在水中使用0.P/oSYBR金通過室溫 搖晃I小時對所述凝膠染色。圖1顯示在無包封情況下，RNA被RNA酶完全消化(第3泳道)。包封后無法檢測到RNA (第4泳道)，即便這些脂質(zhì)體經(jīng)RNA酶處理也未見變化(第4泳道)。脂質(zhì)體經(jīng)RNA酶處理后又經(jīng)苯酚提取，發(fā)現(xiàn)未被消化的RNA(第6泳道)。甚至在4° C經(jīng)過I周后，仍能觀察到RNA而沒有任何片段化(圖4，箭頭)。在4° C持續(xù)6周和一個凍融循環(huán)后，體內(nèi)蛋白表達不變。因此，脂質(zhì)體包封的RNA是穩(wěn)定的。為評估所述RNA的體內(nèi)表達，在所述復(fù)制子內(nèi)編碼了報告酶(SEAP;分泌型堿性磷酸酶)而不是免疫原。以1:4在IXPhospha-Light稀釋緩沖液中稀釋血清，在該稀釋液中使用化學(xué)發(fā)光堿性磷酸鹽底物來檢測表達水平。在第O天，以0.1 μ g或I μ g RNA劑量對8 10周齡BALB/c小鼠(5只/組)進行肌內(nèi)注射(50 μ L/腿)。不含所述脂質(zhì)體的相同載體(溶于無RNA酶的1XPBS)也以Iyg給藥。還測試了病毒粒包裝的復(fù)制子。本文所用的病毒粒包裝的復(fù)制子(稱為“VRP”)按參考文獻39的方法獲得，其中，所述α病毒復(fù)制子衍生自突變VEEV或者VEEV基因組衍生嵌合體，所述VEEV經(jīng)工程改造成含有辛德畢斯病毒3’UTR和辛德畢斯病毒包裝信號(PS)，通過共電穿孔使其與編碼辛德畢斯病毒衣殼和糖蛋白基因的缺陷型輔助RNA包裝入BHK細胞。如圖5所示，就I μ g劑量而言，包封使SEAP水平增加約l/21og，在第6天，0.1 μ g包封劑量的表達符合I μ g未包封劑量所見的水平。到第3天時，表達水平超過了那些使用VRP(SB)所達到的水平。因此，RNA在脂質(zhì)體中配制時表達相對裸露RNA對照增加，甚至在IOX更低劑量也如此。表達與VRP對照相比也更高，但表達動力學(xué)非常不同(參見圖5)。由電穿孔遞送所述RNA使得表達相對于裸露RNA增加，但這些水平都低于用脂質(zhì)體遞送。為評估所述脂質(zhì)體組所見效果是僅僅歸因于脂質(zhì)體組分還是與包封相關(guān)，所述復(fù)制子以包封形式(用兩種不同的純化方法，0.1yg RNA)給藥，或在脂質(zhì)體形成后與其混合(非包封的“脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物”，0.1 μ g RNA)給藥，或者以裸露RNA(1 μ g)給藥。圖10顯示所述脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物產(chǎn)生最低表達水平，顯示包封對蛋白表達是必要的。進一步的SEAP實驗顯示清晰的體內(nèi)劑量應(yīng)答，少至Ing的RNA遞送后即可觀察到表達(圖6)。比較包封和裸露復(fù)制子表達的進一步實驗表明0.0lyg包封的RNA相當于I μ g裸露RNA。就0.5 μ g劑量的RNA而言，在第6天，包封的材料顯示高12倍的表達；就
0.1 μ g劑量而言,在第6天，表達水平高24倍。也研究了動物個體，而不是觀察組的平均水平。數(shù)種動物對裸露復(fù)制子無應(yīng)答,包封消除了這些無應(yīng)答情況。進一步的實驗用DOTAP替代DLinDMA。盡管相比于裸露復(fù)制子，DOTAP脂質(zhì)體顯示了較好表達，但其仍然低于DLinDMA脂質(zhì)體(在第I天有2_3倍差異)。為評估體內(nèi)免疫原性，構(gòu)建復(fù)制子來表達源自呼吸道合胞病毒(RSV)的全長F蛋白。該復(fù)制子以裸露(I μ g)形式、脂質(zhì)體中包封(0.1或I μ g)形式或病毒粒中包封(IO6IU ；“VRP”)形式，在第O天和第 21 天遞送。圖7顯示在第二劑量后兩周的抗F IgG效價，所述脂質(zhì)體明顯增強了免疫原性 。圖8顯示兩周后的效價，在此點處0.1 μ g的包封RNA組、
Iμ g的包封RNA組或VRP組之間沒有統(tǒng)計學(xué)上差異。在第二劑量后兩周，這三組的中和效價(以噬菌斑減少60%測量，“PRNT60”)無顯著差異(圖9)。圖12顯示第二劑量后4周的IgG和PRNT效價。圖13證實所述RNA引起強⑶8T細胞應(yīng)答。進一步實驗比較接受VRP、0.1 μ g脂質(zhì)體包封RNA或者I μ g脂質(zhì)體包封RNA的小鼠中F特異性IgG效價。第二劑量后不同時間的效價比(VRP:脂質(zhì)體)如下:
權(quán)利要求
1.一種內(nèi)部包封編碼感興趣免疫原的RNA的脂質(zhì)體，其中，所述脂質(zhì)體的直徑在60 180nm范圍內(nèi)。
2.如權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述脂質(zhì)體的直徑在80 160nm范圍內(nèi)。
3.如前述權(quán)利要求中任一項所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述脂質(zhì)體包含具有陽離子頭部基團的脂質(zhì)。
4.如前述權(quán)利要求中任一項所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述脂質(zhì)體包含具有兩性離子頭部基團的脂質(zhì)。
5.如前述權(quán)利要求中任一項所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述RNA是自復(fù)制RNA。
6.如權(quán)利要求5所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述自復(fù)制RNA分子編碼(i)RNA依賴性RNA聚合酶，所述RNA聚合酶能從所述自復(fù)制RNA分子轉(zhuǎn)錄RNA，和(ii)免疫原。
7.如權(quán)利要求6所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述RNA分子具有兩個開放閱讀框，第一個所述開放閱讀框編碼α病毒復(fù)制酶并且第二個所述開放閱讀框編碼所述免疫原。
8.如前述權(quán)利要求中任一項所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述RNA分子長度為9000 12000個核苷酸。
9.如前述權(quán)利要求中任一項所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述免疫原能在體內(nèi)引起針對細菌、病毒、真菌或寄生蟲的免疫反應(yīng)。
10.一種藥物組合物，所述組合物包含前述權(quán)利要求中任一項所述的脂質(zhì)體。
11.一種包含脂質(zhì)體群的藥物組合物，其中，所述群中脂質(zhì)體的平均直徑為60nm-180nm (含)。
12.—種在脊椎動物體內(nèi)引起保護性免疫反應(yīng)的方法，所述方法包括向脊椎動物給予有效量的權(quán)利要求1-9所述脂質(zhì)體或者權(quán)利要求10或權(quán)利要求11所述藥物組合物的步驟。
全文摘要
通過遞送包封于脂質(zhì)體內(nèi)的RNA來實現(xiàn)核酸免疫。所述RNA編碼感興趣的免疫原，并且所述脂質(zhì)體的直徑在60～180nm范圍內(nèi)，理想上在80～160nm范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明提供具有包封水性核心的脂雙層的脂質(zhì)體，其中(i)所述脂雙層的直徑在60～180nm范圍內(nèi)；和(ii)所述水性核心包含編碼免疫原的RNA。這些脂質(zhì)體適用于在體內(nèi)遞送RNA至脊椎動物細胞，從而所述脂質(zhì)體可用作藥物組合物中的成分以免疫對象抵抗各種疾病。
文檔編號A61K39/00GK103179989SQ201180051161
公開日2013年6月26日 申請日期2011年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月31日
發(fā)明者A·吉爾, A·維爾瑪 申請人:諾華有限公司