專利名稱：口腔用組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在預(yù)防齲齒中有用的抑制生物膜形成的口腔用組合物，特別涉及采用利用口腔微生物的群體感應(yīng)的新型的抑制生物膜形成的方法而得的口腔用組合物。
背景技術(shù)：
附著在物體表面的微生物不是單獨存在的，而是在具有特征的結(jié)構(gòu)中與其他的微生物一起形成生物膜。該生物膜因為在固定化微生物中中的應(yīng)用前景而起到對人類有益的作用，另一方面，已知也是引起齲齒及食品污染的原因，近年來正積極地對其進行著研究?？谇簧锬び?00種以上的細菌構(gòu)成，Img中存在IO8個以上的菌。其中占多數(shù)(20% 40%)的鏈球菌(Streptococci)以口腔表面上的動態(tài)的細菌間活性物質(zhì)介導(dǎo)的細菌間通訊為基礎(chǔ)形成生物膜。其中，變異鏈球菌(Streptococcus mutans: S.mutans)產(chǎn)生具有粘著性的菌體外多糖，起到形成具有病原性的生物膜的中心作用。已知口腔生物膜是導(dǎo)致齲齒及牙周炎的原因，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些疾病是由以變異鏈球菌為代表的細菌引起的微生物感染癥。以往的齲齒預(yù)防中，主流的思路是將變異鏈球菌滅菌，或通過抑制葡糖基轉(zhuǎn)移酶等酶以防止噬斑的形成，從而抑制齲齒。但是，實際的齲齒病灶中，由于覆蓋在生物膜表層的菌體外多糖而妨礙抗菌物質(zhì)、酶抑制劑或抗生素等的滲透，因此大多無法獲得預(yù)料的效果。而且，抗菌劑、酶抑制劑、抗生素等的使用經(jīng)常伴隨出現(xiàn)耐性菌的危險性。此外，也有通過刷或刮等機械性的除去來抑制生物膜的方法，但對于難以進行這種機械性的口腔生物膜的控制的需護理的高齡者等而言，用現(xiàn)在的方法難以實行精確的口腔護理。從這些觀點考慮，人們期望開發(fā)通過與以往不同的切入點來除去生物膜、預(yù)防蛀牙的方法。此外，口腔生物膜的控制中，理想的是日常習(xí)慣性地持續(xù)實施，因此使用口香糖等食品及潔齒劑等口腔用組合物是有效的。作為新的口腔生物膜除去法的候選，可例舉阻礙群體感應(yīng)。近年來，已知作為細菌相互間的信息傳遞系統(tǒng)的分子機理的群體感應(yīng)(QS ;依賴于細菌密度的基因表達調(diào)控體系)對變異鏈球菌的生物膜的形成及病原性表達起作用，以及變異鏈球菌的QS由作為自誘導(dǎo)物的感受態(tài)刺激肽(Competence stimulating peptide:CSP)調(diào)控。現(xiàn)在，以該QS為革巴點來控制生物膜的形成及病原性的表達的研究與以口腔疾患為代表的微生物感染癥的預(yù)防方法的開發(fā)有關(guān)聯(lián)而受到期待，雖然嘗試了各種研究，但尚未達到實用化。例如,非專利文獻I中公開了唾液鏈球菌(S.salivarius)這種菌阻礙變異鏈球菌的生物膜形成，以及利用特定的基因的表達可以控制CSP。但是，將微生物導(dǎo)入口腔內(nèi)存在安全性的問題，此外，基因表達的控制在多數(shù)情況下伴隨有困難。因此，人們期望開發(fā)一種安全性更高、且簡便的阻礙生物膜形成的方法?，F(xiàn)有技術(shù)文獻非專利文獻 非特許文獻1:《口腔微生物學(xué)與免疫學(xué)》(Oral Microbiology AndImmunology), 200924(2):ppl52_6
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的技術(shù)問題目前已有的使用抗菌劑、酶抑制劑或抗生素等的齲齒抑制法中，口腔生物膜的菌體外多糖妨礙抗菌劑、酶抑制劑、抗生素等的滲透，因此難以出現(xiàn)預(yù)期的齲齒抑制效果。此夕卜，使用抗菌劑、酶抑制劑、抗生素等會提高出現(xiàn)耐性菌的危險性，因而不理想。因此，本發(fā)明的目的是不通過控制齲齒病原菌，而是通過控制由齲齒病原菌引起的生物膜的形成，從而提供更安全且高效的齲齒抑制用的口腔用組合物。解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案本發(fā)明人進行了認真研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用控制群體感應(yīng)的組合物能夠阻礙蛀牙生物膜的形成，從而完成了本發(fā)明。發(fā)明的效果利用本發(fā)明的口腔用組合物，可以阻礙齲齒病原菌的生物膜的形成。這些口腔用組合物可以添加在飲食品、藥品、潔齒劑等中，安全地用于蛀牙的預(yù)防治療。


圖1是表示實施例1中各對照組和試樣組中的CSP誘導(dǎo)組和CSP非誘導(dǎo)組的生物膜形成量的圖。圖2是表示實施例1中各CSP誘導(dǎo)組和CSP非誘導(dǎo)組中的添加植物提取物后的生物膜形成量的變化比率的圖。
具體實施方式
根據(jù)非專利文獻I所記載的現(xiàn)有的研究，可知變異鏈球菌的群體感應(yīng)(QS)由特定的微生物或基因表達控制。但是，從通過摻合在口香糖等食品及潔齒劑等口腔用組合物中來日常習(xí)慣性地進行齲齒生物膜的控制的觀點考慮，在安全性及簡便性方面需要解決的課題多，其中任一種的QS控制方法都尚未達到實用化。對此本發(fā)明人進行認真研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)變異鏈球菌的群體感應(yīng)能夠由可日常安全地攝取的特定物質(zhì)控制，由此實現(xiàn)了通過控制群體感應(yīng)來阻礙齲齒生物膜的形成。S卩，本發(fā)明的特征是利用含豆類提取物的口腔用組合物來阻礙與群體感應(yīng)有關(guān)聯(lián)的蛀牙生物膜的形成。利用本發(fā)明的口腔用組合物，可以阻礙依賴CSP的變異鏈球菌的生物膜形成，因此病原性細菌不會附著在口腔內(nèi)。因此，無需刷或刮等機械性的方法也能夠抑制生物膜。此外，也不會產(chǎn)生如現(xiàn)有的使用抗菌劑、酶抑制劑或抗生素等的齲齒抑制法那樣的由于口腔生物膜的菌體外多糖妨礙抗菌劑、酶抑制劑、抗生素等的滲透，而難以出現(xiàn)預(yù)期的齲齒抑制效果之類的問題。還有，由于不使用抗菌劑、酶抑制劑、抗生素等也能夠抑制齲齒，因此可減小出現(xiàn)相對于抗菌物質(zhì)或抗生素的耐性菌的可能性。對本發(fā)明中使用的豆類的種類沒有特別限定，較好是使用從選自豇豆、紅豆、紫花蕓豆、白花蕓豆、黑豆、金時豆的至少I種以上的豆類提取得到的提取物。對于獲得作為本發(fā)明的有效成分的豆類的提取物的方法沒有特別限定，可以用合適的粉碎方法將上述豆類的種子或果實(豆)粉碎，再通過溶劑提取等方法來制備提取物。作為提取溶劑，可使用水以及甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇等低級醇、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甘油、丙二醇等有機溶劑中的I種或?qū)?種以上混合使用，優(yōu)選使用熱水或親水性的有機溶劑。此外，如果考慮到本發(fā)明的提取物多用于飲食品，作為提取溶劑，從安全性方面來看優(yōu)選使用水和乙醇的組合。較好是用90%以下的乙醇提取，更好是用60%以下的乙醇提取，進一步更好是用30 %以下的乙醇提取，最好是用熱水提取。作為提取條件，可以在高溫、室溫、低溫中的任一種溫度下進行提取，較好是在50 90°C提取I 5小時左右。所得提取物可以在過濾并餾去提取溶劑后，在減壓下濃縮或冷凍干燥。此外，也可以將這些提取物用有機溶劑、柱色譜法等分離純化后使用。此外，由于本發(fā)明的口腔用組合物安全性高，所以可以摻入如下的飲食品中以在日常生活中使用:例如，漱口劑、牙膏、除臭噴霧劑等口腔用組合物，或口香糖、糖果、壓片糖、軟糖、巧克力、餅干、零食等點心，冰淇淋、雪糕、冰點心等冷飲，飲料，面包，烤餅，乳制品，火腿、香腸等畜肉制品類，魚糕、圓筒狀魚糕等魚肉制品，副食品類，布丁，湯以及果醬其摻合量可根據(jù)各種制造條件而改變，相對于口腔用組合物，較好是摻合0.01重量％以上且2.0重量％以下的豆類提取物，更好是摻合0.01重量％以上且1.0重量％以下的豆類提取物。由于本發(fā)明使用一直以來作為食用的物質(zhì)的提取物，因此即使攝取到口腔內(nèi)或體內(nèi)時其安全性也沒有問題。此外，也可以通過使口香糖等食品或潔齒劑等含有上述提取物而容易地攝取，由于不需要基因表達調(diào)控這樣的復(fù)雜的步驟，因此能夠在日常生活中持續(xù)進行生物膜的控制。實施例以下利用實施例對本發(fā)明進行說明，但這些實施例不對本發(fā)明的范圍造成任何限定。[實施例1]1.制備提取物作為植物試樣，使用豇豆、紅豆(大納言)、紅豆(襟裳紅豆)、紫花蕓豆、白花蕓豆、黑豆、金時豆這7種。各植物試樣作為市售品購得，將20g試樣用粉碎機細細地粉碎后，用200ml水于70°C提取2小時。所得的提取液在3000rpm下離心分離10分鐘，過濾上清液后，將冷凍干燥后的試樣作為各植物的熱水提取物供于試驗。2.生物膜形成的抑制活性評價2-1.生物膜形成對變異鏈球菌UA159株用5ml的腦心浸液(Brain Heart Infusion:BHI)液體培養(yǎng)基于37°C進行10小時的厭氧培養(yǎng)，在3000rpm下進行10分鐘的離心分離，用磷酸緩沖生理鹽水(PBS)將收集的細菌制備成OD55tol=0.5，將其作為供試菌懸濁液。生物膜形成通過使用96孔微型板來進行試驗。在各孔中添加植物的熱水提取物60 μ 1、CSP20 μ 1、變異鏈球菌供試菌懸濁液20 μ 1、添加有0.1 %蔗糖的托德一休伊特肉湯(Todd Hewitt Broth)100y 1，在37°C、5% CO2的條件下進行16小時的培養(yǎng)，形成CSP誘導(dǎo)組的生物膜。CSP的濃度以終濃度計為I μ M，各試樣的熱水提取物的濃度以終濃度計為lmg/ml。為了便于比較，在不添加CSP且除此以外與上述相同的條件下進行培養(yǎng)，形成CSP非誘導(dǎo)組的生物膜。還有，作為對照，對于各CSP誘導(dǎo)組及CSP非誘導(dǎo)組，在不添加試樣的熱水提取物且除此以外與上述相同的條件下進行培養(yǎng)。2-2.生物膜定量對于各CPS誘導(dǎo)組和CSP非誘導(dǎo)組，除去培養(yǎng)后的上清液，用PBS對各孔進行2次清洗。清洗后，向各孔中添加0.25%番紅溶液，靜置15分鐘后，除去過量的番紅溶液，用PBS對各孔進行2次清洗。清洗后向各孔中添加乙醇，通過振蕩30分鐘使染色的番紅溶出，使用酶標儀測定492nm的吸光度，對生物膜形成量進行定量。其結(jié)果示于圖1及圖2。圖1表示對于各CSP誘導(dǎo)組和CSP非誘導(dǎo)組在加入植物提取物進行培養(yǎng)后的組(試樣組)和對照組中的生物膜形成量。此外，圖2表示對于各CSP誘導(dǎo)組和CSP非誘導(dǎo)組，將對照組的生物膜形成量記作100時的試樣組的生物膜形成量的比率。由圖1可知，對照組中，CSP誘導(dǎo)組與CSP非誘導(dǎo)組相比生物膜形成量增加?？烧J為該增加量是由將CSP作為自誘 導(dǎo)物的群體感應(yīng)引起的生物膜的增加量。此外，試樣組中，CSP誘導(dǎo)組(黑柱)的生物膜形成量與對照組相比較少，但CSP非誘導(dǎo)組(白柱)的生物膜形成量與對照組相比沒有變化。該情況從圖2也可看出，CSP誘導(dǎo)組(黑柱)中試樣組的生物膜形成量與對照組相比較少(不足100%)，但CSP非誘導(dǎo)組(白柱)中試樣組的生物膜形成量與對照組相比沒有變化(約100% )。根據(jù)上述情況，可認為將CSP作為自誘導(dǎo)物的變異鏈球菌的群體感應(yīng)受到了試樣組中添加的植物提取物的控制，從而生物膜的形成量沒有增加。此外，圖1中，在CSP誘導(dǎo)組中添加大納言紅豆、襟裳紅豆、紫花蕓豆、金時豆的熱水提取物來進行培養(yǎng)的情況下(試樣組的CSP+)，與既沒有添加CSP也沒有添加植物提取物的組(對照組的CSP-)相比生物膜形成量減少了。還有，使用實施例1中制備的紅豆提取物，并使用常規(guī)方法制備了口香糖、糖果、牙膏。以下示出其配方。另外，這些示例不代表對本發(fā)明的范圍有任何限制。[實施例2]按照以下配方制備口香糖。
權(quán)利要求
1.一種用于抑制生物膜形成的口腔用組合物，其特征在于，其中摻合控制由感受態(tài)刺激肽調(diào)控的變異鏈球菌的群體感應(yīng)的物質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所示的用于抑制生物膜形成的口腔用組合物，其特征在于，控制群體感應(yīng)的物質(zhì)是豆類的提取物。
3.如權(quán)利要求1或2所述的用于抑制生物膜形成的口腔用組合物，其特征在于，豆類提取物是選自紅豆、豇豆、白花蕓豆、紫花蕓豆、黑豆、金時豆的至少I種以上的豆類的提取物。
4.如權(quán)利要求1 3中任一項所述的用于抑制生物膜形成的口腔用組合物，其特征在于，豆類提取物是選自大納言紅豆、襟裳紅豆、紫花蕓豆、金時豆的至少I種以上的豆類的提取物。
5.如權(quán)利要求1 4中任一項所述的用于抑制生物膜形成的口腔用組合物，其特征在于，其中沒有摻合抗菌劑、酶抑制劑及抗生素。
全文摘要
目前已有的使用抗菌劑、酶抑制劑或抗生素的齲齒抑制法中，口腔生物膜的菌體外多糖妨礙抗菌劑、酶抑制劑、抗生素等的滲透，因此難以出現(xiàn)預(yù)期的齲齒抑制效果。此外，使用抗菌劑等會提高出現(xiàn)耐性菌的危險性，因而不理想。因此，人們要求開發(fā)一種不通過控制齲齒病原菌，而是通過控制由齲齒病原菌引起的生物膜的形成的更安全且高效的齲齒抑制用的口腔用組合物。本發(fā)明通過采用控制群體感應(yīng)的組合物能夠阻礙蛀牙生物膜的形成。
文檔編號A61P1/02GK103140242SQ20118004524
公開日2013年6月5日 申請日期2011年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月21日
發(fā)明者津金貴則, 佐伯洋二 申請人:羅蒂株式會社