專利名稱：用于癌癥治療的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及癌癥治療的生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，通過(guò)揭示出用于抗癌藥物開(kāi)發(fā)的新的治療靶。所述藥物由于其更大的選擇性和效力而有助于改進(jìn)癌癥患者的目前治療。描述了用于通過(guò)COMMDl蛋白的核表達(dá)和積累來(lái)治療癌癥的方法。在肽HARIKPTFRRLKffKYKGKFff的一級(jí)結(jié)構(gòu)中所引入的化學(xué)修飾增加了 COMMDl的核定位并提高了該肽的體外和體內(nèi)抗腫瘤活性。
現(xiàn)有技術(shù)盡管在癌癥治療方面有著巨大的進(jìn)展，但是由于腫瘤細(xì)胞形成對(duì)于目前的抗癌藥物的抗性，因而在開(kāi)發(fā)具有新的作用方式的新的抗腫瘤試劑方面存在有大利益。由于其作為重要生物學(xué)功能的介體的作用以及其獨(dú)特的固有特性(這使它們成為特別有吸引力的治療試劑)，因而肽作為新的治療藥物仍然具有大利益。肽顯示出高的生物學(xué)活性，伴有低的毒性和高的特異性。由于這些特征而造成的益處包括增高的對(duì)于所希望的靶標(biāo)的結(jié)合特異性，使藥物-藥物相互作用最小化，和表現(xiàn)出更小的在組織中的積累，從而降低了由于中間代謝物而引起的并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)(Vlieghe等人，2010，Drug Discovery Today, 15:40-56)。目前，存在有這樣的抗癌治療，其使用具有對(duì)于特定靶蛋白的結(jié)合選擇性的肽和/或小分子，所述靶蛋白在癌癥發(fā)展中具有重要的生物學(xué)功能。在第一種情形下，可以將這些治療導(dǎo)向抑制蛋白質(zhì)的特定功能，并且作為主要事件而引起癌細(xì)胞凋亡，例如熱休克蛋白(HSP)的抑制劑(Subbarao 等人，2004，Pharmacology & Therapeutics, 101:227-257);酪氨酸激酶的抑制劑(Garrido等人，2007，Rev Med Chil，10:1327-1332)。在大多數(shù)情況下，這些蛋白質(zhì)在惡性過(guò)程中是異常的，如果與正常組織相比較。在第二種情形下，藥物與靶蛋白相結(jié)合，所述靶蛋白在惡性過(guò)程中可以是或不是異常的(與正常組織相比較)；在這種情況下，在惡性過(guò)程中被激活的信號(hào)傳導(dǎo)途徑受到影響，例如脫氧核糖核酸(DNA)復(fù)制的抑制劑、微管裝配的抑制劑和轉(zhuǎn)錄因子NFkB的抑制劑。盡管第一種情形在特定的造血系統(tǒng)惡性腫瘤中是高度有效的，但是它們中的大多數(shù)在實(shí)體腫瘤的復(fù)雜性下具有有限的有效性。相反地，第二種情形包括一些在腫瘤學(xué)藥典中最有效和甚至最具有毒性的藥物。為此原因，需要在 尋找新藥物方面有所前進(jìn)，所述新藥物越來(lái)越是選擇性的和有效的，從而使其毒性最小化。在這個(gè)意義上，鑒定新的治療靶和了解其在癌癥發(fā)展中的作用有助于鑒定出新的藥物抗性機(jī)制，并促進(jìn)設(shè)計(jì)出保留更大的活性并可以與現(xiàn)有的藥物相組合的新藥物，從而降低這些藥物的毒性并提聞癌癥患者的生活質(zhì)量。COMMDl 蛋白，以前稱為 MURRl (van de Sluis 等人，2002，Human MolecularGenetic, 11:165-173)，屬于一個(gè)新的蛋白質(zhì)家族，其首字母縮寫為COMMD (銅代謝基因MURRl結(jié)構(gòu)域，縮寫為C0MMD)。該家族的十個(gè)蛋白質(zhì)成員在多細(xì)胞生物中是高度保守的并且遍在地表達(dá)，然而其大多數(shù)成員的生物學(xué)功能尚不知曉。該家族的主要特征是存在有保守且獨(dú)特的COMM結(jié)構(gòu)域(銅代謝Murrl結(jié)構(gòu)域)，其包含在C-末端的氨基酸殘基 110-190 之間(Burstein 等人,2005, The Journal of BiologicalChemistry, 280:22222-22232)。COMMDl牽涉各種不同的生物學(xué)過(guò)程，例如銅代謝的控制(Tao 等人，2003，Journal of Biological Chemistry, 278:41593-41596);鈉的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)(Biasio 等人，2004，Journal of Biological Chemistry, 279:5429-5434);轉(zhuǎn)錄因子 NFkB 的抑制(Maine 等人，2007，The EMBO Journal, 26:436-447);由低氧誘導(dǎo)因子HIF-I α 所調(diào)控的基因的表達(dá)的抑制(van de Sluis 等人，2007，Molecular and CellularBiology, 27:4142-4156)。COMMDl顯現(xiàn)出與 轉(zhuǎn)錄因子NFkB的RelA(p65)亞基、與因子HIF-1 α的催化性亞基-α和與上皮鈉通道中的Delta ENaC的物理相互作用。在所有情況下，該相互作用導(dǎo)致這些“客戶”蛋白質(zhì)的降解，其通過(guò)涉及遍在蛋白化和經(jīng)由蛋白酶體的降解的機(jī)制。已證明，COMM結(jié)構(gòu)域參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，不僅對(duì)于C0MMD1的“客戶”蛋白質(zhì)，而且還對(duì)于該家族的成員之間的相互作用。存在有關(guān)于C0MMD1的N-末端區(qū)域的三維結(jié)構(gòu)的提議，但還不存在關(guān)于COMM結(jié)構(gòu)域的三級(jí)結(jié)構(gòu)(Sommerhalter等人，2007, Journal of MolecularBiology, 365:715-721)。借助于遍在蛋白化和蛋白酶體降解(通過(guò)位于COMM結(jié)構(gòu)域中的一系列亮氨酸殘基)的過(guò)程，在細(xì)胞中C0MMD1的基礎(chǔ)表達(dá)受到控制(Maine等人，2009，BiochemicalJournal, 417:601-609)。最近，描述了 C0MMD1具有這樣的機(jī)制，該機(jī)制構(gòu)成通過(guò)也位于其COMM結(jié)構(gòu)域中的核輸出信號(hào)(NES)的細(xì)胞質(zhì)-細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)。已報(bào)道，亮氨酸序列的破化和/或抑制蛋白酶體降解的試劑造成在細(xì)胞中C0MMD1的表達(dá)的增加。此外，C0MMD1中的NES序列的破壞增強(qiáng)因子NFkB和HIF-I α的轉(zhuǎn)錄活性的抑制(MulIer等人，2009，Traffic, 10:514-527)。異常的贅生性細(xì)胞過(guò)表達(dá)不同的抗凋亡蛋白質(zhì)，例如抑制凋亡的蛋白XIAP和簇集蛋白(CLU)，其加速非雄激素依賴型前列腺癌的進(jìn)展。這兩種蛋白質(zhì)都有利于C0MMD1的遍在蛋白化和蛋白酶體降解，從而促進(jìn)NFkB的激活和腫瘤細(xì)胞的存活。據(jù)報(bào)道，蛋白酶體的抑制劑，例如 MG132 (Shirley 等人，2005，Neoplasia, 7:1104-1111 ；Zhou 等人，2009, Cancer Research, 21:333-339)，具有通過(guò)抑制遍在蛋白化和蛋白酶體降解的機(jī)制的抗腫瘤效應(yīng)。與XIAP結(jié)合的化合物通過(guò)阻斷該蛋白質(zhì)對(duì)于胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-9激活的抑制效應(yīng)來(lái)誘導(dǎo)凋亡(Vogler等人，Cancer Research, 2009, 69:2425-2434)。已提出，被設(shè)計(jì)用于抑制CLU的功能的干擾核糖核酸(iRNA)具有抗腫瘤效應(yīng)，通過(guò)使因子NFkB的細(xì)胞質(zhì)抑制劑(稱為I-kB)穩(wěn)定化(Zoubeidi等人，2010，Molecular CancerResearch, 8:19-30)。在國(guó)際專利申請(qǐng)WO 07/095867中，發(fā)明的實(shí)質(zhì)涉及源自LALF (鱟抗脂多糖因子)蛋白的32-51區(qū)域的肽，其中進(jìn)行了確保瓦解與細(xì)菌脂多糖(LPS)結(jié)合的能力的氨基酸置換，并且其具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。這些肽之一為稱為肽L2的肽。此外，在另一個(gè)發(fā)明(國(guó)際申請(qǐng)PCT/⑶2008/000006)中，揭示了上面所提及的肽穿透入細(xì)胞中的能力。然而，在所述發(fā)明中，既沒(méi)有公開(kāi)也沒(méi)有暗示這些肽的作用機(jī)制。目前,存在有眾多旨在治療癌癥的療法(化學(xué)療法、放射療法、免疫療法等),它們中的許多還處于臨床試驗(yàn)階段中。但是，仍然有著與這些療法相關(guān)的缺點(diǎn)，例如低選擇性、毒性和形成藥物抗性。在該領(lǐng)域中要考慮的另一個(gè)重要方面是選擇可用作藥物效力的診斷物和/或預(yù)測(cè)物的生物標(biāo)志物。因此，仍存在有研究和發(fā)現(xiàn)新分子的需要，所述新分子在癌癥的治療和/或診斷中，以及在具有更低毒性的、越來(lái)越選擇性和有效的藥物的設(shè)計(jì)中是有用的。發(fā)明描述本發(fā)明通過(guò)描述用于通過(guò)增加COMMDl蛋白的核定位來(lái)治療癌癥的方法而解決了上面提及的問(wèn)題。所述增加引起癌細(xì)胞的增殖的降低或阻斷。在本發(fā)明中，首次揭示了，在癌細(xì)胞中肽L2 (其序列為HARIKPTFRRLKWKKYKGKFW，SEQ ID No. I)與COMMDl相互作用，并且COMMDl的核定位與癌細(xì)胞的的死亡相關(guān)。由此，本發(fā)明提供了 COMMDl蛋白在鑒定具有抗腫瘤活性的化合物中的用途，所述化合物促進(jìn)COMMDl的核積累和定位。在本發(fā)明中所提供的數(shù)據(jù)證明，抗腫瘤肽L2與COMMDl相互作用，特別是在包含于COMMDl的氨基酸110-190之間的區(qū)域中。此外，肽L2引起COMMDl的核積累。此外，在本發(fā) 明中首次報(bào)道了，攜帶核定位序列(NLS)的COMMDl蛋白的表達(dá)足以誘導(dǎo)癌細(xì)胞的死亡。因此，本發(fā)明首次證明了 COMMDl在癌癥的治療中作為治療靶的用途。此外，從肽L2的序列(SEQ ID No. I)開(kāi)始，優(yōu)化了肽L552 (SEQ ID No. 3)，以引起COMMDl在核中的積累并提高所述肽的體外和體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)。經(jīng)優(yōu)化以促進(jìn)COMMDl的核定位的在本發(fā)明中所描述的肽L552 (SEQ ID No. 3)具有下述序列Ac-HARIKpTFRRIKffKYKGKFff SEQ ID No. 3。所述優(yōu)化基于進(jìn)行化學(xué)修飾，通過(guò)在特定位置(其在上面所包括的序列中以小寫和粗體來(lái)表示)處用非天然氨基酸(D-氨基酸)置換天然氨基酸和借助于乙?；?在上面所包括的序列中標(biāo)明為Ac-)的對(duì)于N-末端的保護(hù)。這些對(duì)于肽L2的序列(SEQ ID No. I)所進(jìn)行的并且導(dǎo)致產(chǎn)生肽L552 (SEQ ID No. 3)的修飾，確保了 COMMDl在核中的更大的積累以及肽L552相對(duì)于原始肽L2而言的抗腫瘤活性的提高。因此，肽L552是新的一個(gè)類別的分子，其與COMMDl相互作用，從而促進(jìn)COMMDl的核定位并引起癌細(xì)胞增殖的抑制。增加COMMDl蛋白的核定位的試劑在制備用于癌癥治療的藥物中的用途也是本發(fā)明的目標(biāo)。在促進(jìn)COMMDl的核積累的試劑或化合物之中，可以包括例如蛋白質(zhì)(包括抗體)、突變蛋白、肽、多核苷酸、適體、核酸和有機(jī)小分子。這些化合物可以從天然來(lái)源分離，以合成或重組方式進(jìn)行制備，或者它們的任何組合。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，增加COMMDl蛋白的核定位的試劑為肽L552(SEQ ID No. 3)。在本發(fā)明的背景下，提高或增加COMMDl的核定位與使COMMDl蛋白在細(xì)胞核中積累具有相同的含義。在另一個(gè)特別的實(shí)施方案中，增加COMMDl蛋白的核定位的試劑可以是核酸類型的，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，其包含編碼含有NLS的COMMDl蛋白的DNA序列。該類型的載體可以用作基因療法。此外，用于治療癌癥的藥物組合物也是本發(fā)明的一部分，所述藥物組合物包含增加COMMDl蛋白的核定位的試劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含有效量的增加COMMDl蛋白的核定位的試劑(通過(guò)其半數(shù)抑制濃度(IC5tl)而測(cè)定的)以及藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體。該組合物可以通過(guò)腸胃外途徑或通過(guò)局部途徑進(jìn)行施用。包含增加COMMDl蛋白的核定位的試劑的藥物組合物的施用構(gòu)成了用于治療或預(yù)防受試者中的實(shí)體腫瘤的方法，其中該方法包括以有效量施用促進(jìn)COMMDl的核定位的試齊U，以降低或阻斷腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以向白血病(特別是髓細(xì)胞白血病)患者施用增加COMMDl蛋白的核定位的試劑，從而阻斷癌細(xì)胞的增殖，甚至在炎癥刺激存在下。在本發(fā)明中證明，可以將肽L552與標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)療法相聯(lián)合地進(jìn)行使用，以產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)和減少細(xì)胞抑制劑(例如，順鉬和5-氟尿嘧啶(5-FU))的劑量。因此，用于治療癌癥的藥物組合也是本發(fā)明的目標(biāo)，所述藥物組合包含一種或多種增加COMMDl蛋白的核定位的試劑，以及一種或多種對(duì)于癌癥的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)療法特異的藥物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑為肽L552，并且所述對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)療法特異的藥物選自順鉬和5-FU。在所述藥物組合中，構(gòu)成所述藥物組合的一部分的所述試劑和所述藥物可以在同一治療過(guò)程中同時(shí)地、分開(kāi)地或順次地進(jìn)行施用。另一方面，炎癥與癌癥之間的關(guān)系是現(xiàn)今已接受的事實(shí)。目前，炎癥微環(huán)境被列為腫瘤的特點(diǎn)，其歸類在由Hanahan和Weinbergs (Perwez等人,2007, Int JCancer, 121:2373-2380)所描述的癌癥的六個(gè)最重要的特征之中。本發(fā)明中所提供的數(shù)據(jù)表明，在炎癥刺激存在下，肽L552在阻斷癌細(xì)胞生長(zhǎng)方面 是有效的。同樣地，攜帶NLS的GFP-NC0MMD1蛋白的表達(dá)在癌細(xì)胞中促進(jìn)相同的效應(yīng)。更特別地，結(jié)果顯示，肽L552在炎癥刺激例如LPS和腫瘤壞死因子(TNF-α )存在下促進(jìn)癌細(xì)胞的死亡。同樣地，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明了該肽在結(jié)腸腫瘤的鼠類模型中的有效性，其中用通過(guò)注射LPS而造成的炎癥刺激來(lái)攻擊小鼠。為此，本發(fā)明還提供了用于抑制與炎癥相關(guān)的腫瘤的發(fā)展以及其轉(zhuǎn)移的方法，其包括向有此需要的受試者施用肽L552。在與炎癥相關(guān)的腫瘤以及其轉(zhuǎn)移中存在有例如下述類型的癌癥結(jié)腸直腸癌、食道癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌和肝癌。此外，還可以以預(yù)防的方式進(jìn)行肽L552的施用，以預(yù)防與慢性炎癥(例如，克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、胰腺炎、肝硬化等)相關(guān)的癌癥的發(fā)展。因此，用于預(yù)防與慢性炎癥相關(guān)的癌癥的方法也是本發(fā)明的目標(biāo)，所述方法的特征在于，向有此需要的個(gè)體施用肽L552或包含所述肽的組合物。關(guān)于用包含肽L552 (作為增加COMMDl的核定位的試劑)的組合物要遵從的治療劑量和方案，技術(shù)人員可以容易地確定(預(yù)防性或治療性)治療的劑量和方案。有效量可以依據(jù)各個(gè)組合物的相對(duì)功效而變化，并且可以基于該肽的分子量和在體外或在動(dòng)物研究中的IC5tl來(lái)進(jìn)行計(jì)算。例如，在知曉所述化合物(化學(xué)結(jié)構(gòu))的分子量和有效實(shí)驗(yàn)劑量(IC5tl)的情況下，可以常規(guī)地計(jì)算出以mg/Kg體重表示的劑量。通常,所述劑量為O. 2-4mg/Kg體重。該肽或包含其的組合物可以每周地或甚至每幾個(gè)月地施用一次或多次。本發(fā)明還涉及COMMDl作為新的用于癌癥患者的預(yù)后標(biāo)記物的用途，通過(guò)測(cè)定在樣品中COMMDl的核定位的存在或不存在。同樣地，肽L552提供了用于治療疾病的活性試劑，在所述疾病中COMMD蛋白起作用或者牽涉該疾病的進(jìn)展。這是可能的，例如在那些這樣的疾病中，在所述疾病中COMMD家族的一些成員的量增加或減少和/或其活性提高或降低，并且這造成該疾病。肽L552與包含在COMMD蛋白的C-末端的氨基酸殘基110-190之間的COMM結(jié)構(gòu)域相結(jié)合的能力支持了該肽的治療活性。附圖
簡(jiǎn)述圖I.圖解說(shuō)明了肽L2與COMMDl蛋白之間的物理相互作用，其中使用酵母雙雜交技術(shù)。作為陰性對(duì)照，采用用空載體PGBKT7轉(zhuǎn)化的酵母菌株AH109與轉(zhuǎn)化到菌株Y187中的COMMDl片段的每種構(gòu)建物的交配。為了鑒定相互作用，進(jìn)行用攜帶L2序列的載體轉(zhuǎn)化的菌株AH109與轉(zhuǎn)化到菌株Y187中的COMMDl片段的每種構(gòu)建物的交配。作為陽(yáng)性對(duì)照，采用攜帶轉(zhuǎn)錄因子GAL4的pCLl的交配。如所觀察到的，用攜帶COMMDl基因的完整序列的質(zhì)粒和包含COMMDl蛋白的氨基酸110-190的構(gòu)建物，出現(xiàn)相互作用。圖2. (A)圖解說(shuō)明了肽L2與COMMDl的相互作用的驗(yàn)證，通過(guò)在SW948細(xì)胞中的免疫沉淀技術(shù)(pulldown)。在該實(shí)驗(yàn)中，添加100 μ g的總蛋白質(zhì)(TP)和在大腸桿菌(Escherichia coli)中獲得的重組COMMDl蛋白(C0MMDlr)，MW (分子量標(biāo)準(zhǔn))。(B)圖解說(shuō)明了在用肽L2處理的SW948細(xì)胞中COMMDl的亞細(xì)胞定位。在核中COMMDl的表達(dá)(N)，在細(xì)胞質(zhì)中COMMDI的表達(dá)(C)，未處理的細(xì)胞(NT )。β -肌動(dòng)蛋白為細(xì)胞質(zhì)級(jí)分的對(duì)照，hnRNP為核級(jí)分的對(duì)照。圖3. (A)圖解說(shuō)明了通過(guò)經(jīng)優(yōu)化的肽L552而引起的更大的COMMDl的核積累。(B)顯示了在免疫沉淀(pulldown)實(shí)驗(yàn)中，在不同的腫瘤細(xì)胞系中L552與COMMDl蛋白之 間的相互作用。用滯蛋白7 (CUL7)未檢測(cè)到相互作用。在所述不同的細(xì)胞系中，顯示了在總蛋白質(zhì)提取物中β_肌動(dòng)蛋白的存在。圖4.在不同組織學(xué)來(lái)源的腫瘤細(xì)胞中所述肽的抗增殖效應(yīng)，L0(從外周血分離的人淋巴細(xì)胞)。圖5.在TC-I腫瘤模型中肽L552的抗腫瘤效應(yīng)。(A)顯示了腫瘤塊的生長(zhǎng)抑制曲線。(B)顯示了不同實(shí)驗(yàn)組的累積存活百分比。圖6.圖解說(shuō)明了含有核定位序列的COMMDl蛋白的表達(dá)足以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。顯示了在72小時(shí)時(shí)用溴化乙錠染色的非活細(xì)胞的百分比，作為用攜帶作為陰性對(duì)照的綠色熒光蛋白(GFP)的構(gòu)建物、構(gòu)建物GFP-C0MMD1和核定位構(gòu)建物GFP-N-C0MMD1進(jìn)行的轉(zhuǎn)染的結(jié)果。圖7. (A)顯示了在用構(gòu)建物GFP-NC0MMD1轉(zhuǎn)染的結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29中對(duì)于5-FU的化學(xué)敏感性。指明了 IC5tl值。(B)圖解說(shuō)明了通過(guò)添加LPS和TNF-α而引起的炎癥環(huán)境對(duì)于IC5tl的影響。圖8.圖解說(shuō)明了在不同的炎癥刺激存在下，肽L552對(duì)于癌細(xì)胞增殖的效應(yīng)。在用LPS和TNF-α處理的人髓細(xì)胞白血病細(xì)胞(THP-1) (A)和鼠類結(jié)腸癌細(xì)胞(CT-26) (B)中測(cè)定ic5(l。圖9.在經(jīng)歷了通過(guò)注射LPS而引起的炎癥刺激的BALB/c小鼠中，在結(jié)腸癌模型中肽L552的抗腫瘤效應(yīng)。(A)顯示了不同實(shí)驗(yàn)組的累積存活百分比。(B)顯示了關(guān)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的腫瘤塊的體積的平均值。
實(shí)施例實(shí)施例I.肽L2與COMMDl之間的物理相互作用。為了鑒定抗腫瘤肽L2-蛋白質(zhì)相互作用，使用酵母雙雜交系統(tǒng)。為了克隆相應(yīng)于該肽的序列，設(shè)計(jì)了下列寡核苷酸L2F CATGCACGCTAGAATCAAGCCAACCTTCAGAAGATTGAAGTGGAAGTACAAGGGTAAGTTCTGGTAA
L2R GATCTTACCAGAACTTACCCTTGTACTTCCACTTCAATCTTCTGAAGGTTGGCTTGATTCTAGCGTG其相應(yīng)于肽序列L2 :HARIKPTFRRLKWKYKGKFW。為了將這些序列克隆在載體pGBKT7 NcoI-BamHI中，在這些寡核苷酸的末端添加與這些位點(diǎn)互補(bǔ)的序列。通過(guò)限制酶切分析和測(cè)序來(lái)驗(yàn)證攜帶肽序列L2的重組質(zhì)粒PGBKL2-1。通過(guò)乙酸鋰方法來(lái)將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母菌株AH109中，并接種在SD-Trp培養(yǎng)基中。驗(yàn)證了，當(dāng)接種在SD-Trp-His平板中時(shí)，不能自我激活。為了篩選相互作用，使用轉(zhuǎn)化到菌株Y187中的源自人肝臟cDNA的文庫(kù)。為了形成二倍體和選擇相互作用，使5X IO8個(gè)包含質(zhì)粒PGBKL2-1的AH109細(xì)胞與5 X IO8個(gè)包含人肝臟DNA文庫(kù)的Y187細(xì)胞一起在30°C 下在YPDA固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)4小時(shí)。在YPDA培養(yǎng)基平板上，在其表面上添加IOml無(wú)菌水，并且用刮刀小心地使細(xì)胞重懸浮，并轉(zhuǎn)移至15個(gè)SD-Trp-Leu-His-Ade基本培養(yǎng)基平板，并在30°C下生長(zhǎng)7天。將所得的74個(gè)菌落轉(zhuǎn)移到在96-深孔平板中的SD-Trp-Leu液體培養(yǎng)基中。在觀察到在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)后，進(jìn)行酵母DNA的純化。將每一個(gè)這些DNA獨(dú)個(gè)地轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株DHlOB中，純化其DNA并保存于_20°C。將這些獨(dú)個(gè)克隆中的每一個(gè)轉(zhuǎn)化到酵母菌株Y187中，并通過(guò)與用質(zhì)粒PGBKT7和pGBKL2_l轉(zhuǎn)化的菌株AH109進(jìn)行交配來(lái)驗(yàn)證相互作用。對(duì)陽(yáng)性克隆的DNA進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)BLAST程序(Altschul等人，1990. JMol Biol, 215:403-410)的序列分析揭示出，這些克隆之一(L2-21)相應(yīng)于編碼COMMDl蛋白的氨基酸6-190的基因的序列，并且該克隆能夠與包含肽序列L-2的質(zhì)粒相互作用。為了明確地鑒定出負(fù)責(zé)所述相互作用的COMMDl蛋白的區(qū)域，對(duì)于質(zhì)粒PGBKL2-1構(gòu)建物進(jìn)行缺失，從而產(chǎn)生克隆 pGBKL2 (6-110)、pGBKL2 (6-70)、pGBKL2 (71-190)、pGBKL2 (110-190)。如在圖I中所看到的，僅在質(zhì)粒PGBKL2 (110-190)中保留了相互作用，該質(zhì)粒包含負(fù)責(zé)對(duì)于COMMD家族的蛋白質(zhì)所描述的相互作用的COMM結(jié)構(gòu)域。該結(jié)果說(shuō)明，肽L2與包含在氨基酸110-190之間的區(qū)域特異性地結(jié)合。實(shí)施例2.使用肽L2的免疫沉淀以及COMMDl的核積累的實(shí)驗(yàn)。所述實(shí)驗(yàn)分為兩塊(A)使通過(guò)使用固相方法合成的合成肽L2(SEQ ID No. I)生物素化，并用作結(jié)合至鏈霉抗生物素蛋白瓊脂糖樹(shù)脂的“誘餌”。作為“捕獲物”，使用腫瘤細(xì)胞系SW948(人結(jié)腸癌)的蛋白質(zhì)提取物。這些實(shí)驗(yàn)被稱為“pulldown”。使用提取緩沖液(Triton X-1000. 5%;25mMHEPES, pH 7. 5; IOOmM NaCl; ImM EDTA;10% 甘油;ImM 二硫蘇糖醇(DTT)，和蛋白酶抑制劑)，從2X IO7個(gè)細(xì)胞獲得蛋白質(zhì)提取物。將所述生物素化的肽(300 μ g)與50 μ L鏈霉抗生物素蛋白瓊脂糖樹(shù)脂(GE Healthcare) —起溫育一小時(shí)，并用磷酸緩沖鹽水(IX PBS)+ImMDTT進(jìn)行洗滌。然后，將500 μ g總蛋白質(zhì)與50 μ L含有所述生物素化的肽的樹(shù)脂一起在環(huán)境溫度下溫育5小時(shí)。然后，用IX PBS和ImM DTT充分地洗滌所述樹(shù)脂。保持與樹(shù)脂相結(jié)合的蛋白質(zhì)是與所述肽相互作用的那些，并且將其懸浮在25 μ L電泳緩沖液(62. 5mM TrisHCl; pH 6. 9; O. IM DTT, 20%十二烷基硫酸鈉(SDS)，10%甘油和O. 01%溴酚藍(lán))中。為了檢測(cè)目的蛋白質(zhì)，進(jìn)行在聚丙烯酰胺凝膠(7. 5%)中的電泳，隨后通過(guò)“Western印跡”進(jìn)行免疫檢測(cè)。為了檢測(cè)COMMDl蛋白，使用抗-COMMDl單克隆抗體(Sigma，cion 2A12)。使用總蛋白質(zhì)提取物(100μ g)和在大腸桿菌中獲得的重組蛋白C0MMD1。在圖2A中呈現(xiàn)的結(jié)果顯示，當(dāng)與總蛋白質(zhì)提取物進(jìn)行比較時(shí)，在該“pulldown”實(shí)驗(yàn)中肽L2濃縮了 COMMDl蛋白。這是L2與COMMDl之間的相互作用的指示。(B)將 SW948 細(xì)胞(3 X IO6 個(gè)細(xì)胞)與肽 L2 (50 μ M) —起在 37 °C 和 5%C02 下溫育5小時(shí)。然后，按照所報(bào)道的(Vancurova等人，2001，Journal of BiologicalChemistry, 276:19746-19752),進(jìn)行胞質(zhì)蛋白質(zhì)和核蛋白質(zhì)的細(xì)胞分級(jí)分離。使用抗-C0MMD1抗體，通過(guò)“Western印跡”來(lái)進(jìn)行C0MMD1的檢測(cè)。圖2B顯示了在用肽L2處理的SW948細(xì)胞中C0MMD1的核定位。為了檢驗(yàn)所述細(xì)胞分級(jí)分離，使用β _肌動(dòng)蛋白作為細(xì)胞質(zhì)級(jí)分的對(duì)照，和使用人核糖核蛋白(hnRNP)作為核級(jí)分的對(duì)照。實(shí)施例3.肽L552的優(yōu)化以用于C0MMD1的核積累。假定肽L2與C0MMD1蛋白相互作用并且這與C0MMD1的核定位相關(guān)，那么從L2(SEQID No. I)開(kāi)始設(shè)計(jì)不同的肽，其目的是以所述肽變體加強(qiáng)C0MMD1的核積累。使用固相方法來(lái)合成本發(fā)明的肽。將粗制的肽用30%乙酸溶液進(jìn)行提取，凍干，然 后通過(guò)反向色譜法RP-HPLC進(jìn)行純化。借助于質(zhì)譜法來(lái)驗(yàn)證經(jīng)純化的肽的分子量。所得的制備物對(duì)于其在動(dòng)物和人中的施用來(lái)說(shuō)是非抗原性的、非致熱性的和藥學(xué)上可接受的。如在表I中所顯示的，通過(guò)在原始肽序列L2 (其序列為HARIKPTFRRLKWKYKGKFW (SEQ IDNo. I 中在特定位置處引入D-構(gòu)型的氨基酸，在特定位點(diǎn)處進(jìn)行置換。在一種情況下，還通過(guò)乙?；忾]了 N-末端。表I.在本發(fā)明中所使用的肽的序列
權(quán)利要求
1.用于癌癥治療的方法，其特征在于，增加在癌細(xì)胞中COMMDl蛋白的核定位，這引起所述細(xì)胞的增殖的降低或阻斷。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其特征在于，使癌細(xì)胞與增加在癌細(xì)胞中COMMDl蛋白的核定位的試劑相接觸，或者向受試者施用包含增加在癌細(xì)胞中COMMDl蛋白的核定位的試劑的組合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于，所述增加在癌細(xì)胞中COMMDl蛋白的核定位的試劑包括具有標(biāo)識(shí)為SEQ ID No. 3的氨基酸序列的肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于，抑制與炎癥相關(guān)的腫瘤的發(fā)展以及其轉(zhuǎn)移。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于，所述與炎癥相關(guān)的腫瘤以及其轉(zhuǎn)移位于結(jié)腸、直腸、食道、肺、前列腺、乳腺、胰腺或肝臟中。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于，所述增加在癌細(xì)胞中COMMDl蛋白的核定位的試劑包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，其包含編碼含有核定位序列(NLS)的COMMDl蛋白的DNA序列。
7.增加COMMDl蛋白的核定位的試劑在制備用于癌癥治療的藥物中的用途。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的用途，其中所述增加COMMDl蛋白的核定位的試劑為蛋白質(zhì)、合成肽、核酸或用于基因療法的載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其中所述合成肽為具有標(biāo)識(shí)為SEQIDNo. 3的氨基酸序列的肽。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其中所述用于基因療法的載體為哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，其包含編碼含有NLS的COMMDl蛋白的DNA序列。
11.用于癌癥治療的藥物組合物，其包含一種或多種增加在癌細(xì)胞中COMMDl蛋白的核定位的試劑，以及藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中所述增加在癌細(xì)胞中COMMDl蛋白的核定位的試劑為具有標(biāo)識(shí)為SEQ ID No. 3的氨基酸序列的肽。
13.權(quán)利要求11的組合物，其中所述增加在癌細(xì)胞中COMMDl蛋白的核定位的試劑為哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，其包含編碼含有NLS的COMMDl蛋白的DNA序列。
14.用于治療癌癥的藥物組合，其包含一種或多種增加COMMDl蛋白的核定位的試劑，以及一種或多種對(duì)于癌癥的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)療法特異的藥物。
15.權(quán)利要求14的藥物組合，其中所述增加COMMDl蛋白的核定位的試劑包括具有標(biāo)識(shí)為SEQ ID No. 3的氨基酸序列的肽，并且所述對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)療法特異的藥物選自順鉬和5-FU。
16.權(quán)利要求14的藥物組合，其中構(gòu)成所述藥物組合的一部分的所述試劑和所述藥物在同一治療過(guò)程中同時(shí)地、分開(kāi)地或順次地進(jìn)行施用。
17.用于預(yù)防與慢性炎癥相關(guān)的癌癥的方法，其特征在于，增加在細(xì)胞中COMMDl蛋白的 核定位。
18.權(quán)利要求17的方法，其中在細(xì)胞中COMMDl蛋白的核定位的增加通過(guò)向有此需要的個(gè)體施用具有標(biāo)識(shí)為SEQ ID No. 3的氨基酸序列的肽或包含所述肽的組合物來(lái)實(shí)現(xiàn)。
19.用于確定癌癥患者的預(yù)后的方法，其特征在于，通過(guò)測(cè)定在所述患者的樣品中COMMDl的核定位的存在或不存在，來(lái)將COMMDl用作預(yù)后標(biāo)志物。
20.具有與COMM結(jié)構(gòu)域結(jié)合的能力的肽，其特征在于，所述肽具有標(biāo)識(shí)為SEQID No. 3的氨基酸序列。
21.權(quán)利要求20的肽用于治療疾病的用途，其中COMMD家族的成員牽涉所述疾病的進(jìn)展。
全文摘要
本發(fā)明描述了用于通過(guò)增加COMMD1蛋白的核定位來(lái)治療癌癥的方法，這與癌細(xì)胞增殖的降低或阻斷相關(guān)。此外，本發(fā)明涉及增加COMMD1蛋白的核定位的試劑在制備用于癌癥治療的藥物中的用途。除了其他化合物之外，所述試劑尤其可以為肽或蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及從序列HARIKPTFRRLKWKKYKGKFW開(kāi)始進(jìn)行肽的優(yōu)化，以增加COMMD1蛋白的核定位，并從而提高所述肽的抗腫瘤效應(yīng)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102917725SQ201180026853
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2011年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月31日
發(fā)明者M·古埃拉巴萊斯皮, J·R·費(fèi)爾南德斯馬索, A·穆薩奇奧拉薩, J·希爾巴爾德斯, O·雷伊斯阿考斯塔, B·M·奧利瓦阿古雷斯 申請(qǐng)人:遺傳工程與生物技術(shù)中心