專利名稱：人成纖維細胞生長因子21融合蛋白及其突變體的制備與應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及人糖尿病和肥胖癥的預防及治療藥物。具體的，本發(fā)明提供一種用于檢測和治療人I型或II型糖尿病，以及肥胖癥的融合蛋白及其制備方法和應用。所述融合蛋白含有人FGF21或其突變體和人IgG2-Fc(鉸鏈區(qū)-CH2_CH;3)或IgG2_Fc突變體 (T250Q/M428L ；T307Q/N434A)，能有效改善肥胖癥患者的生存狀況，降低糖尿病患者的血糖水平，增強胰島素的敏感性，同時增加FGF21體內(nèi)的半衰期，尤其是FGF21及突變體與 IgG-Fc (T250Q/M428L ；T307Q/N434A)突變體融合蛋白，增強與Fcfoi親和力，進一步增加 FGF21的體內(nèi)半衰期。
背景技術(shù)：
Testuya Nishimura等在2000年首先報道了人FGF21基因。該基因定位于人 α 1,2-墨角藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因的5’側(cè)翼區(qū)，編碼一個209個氨基酸大小的蛋白多肽，正常情況下特異性表達于肝臟中，蛋白N端前觀個氨基酸為引導肽，使FGF21分泌到細胞外。 FGF21屬于由FGF19、FGF21和FGF23的成纖維細胞生長因子(FGF)構(gòu)成的亞家族的分泌多肽(Itoh 等，2004，Trend Genet. 20 :563-69)。FGF21 與 FGF19 的同源性比較高，F(xiàn)GF19 已經(jīng)證明可以調(diào)節(jié)內(nèi)分泌代謝，據(jù)此研究人員推測FGF21可能也具有相應的能力。FGF21是非典型的FGF，因為它不依賴于肝素，并且在葡萄糖、脂質(zhì)和能量代謝的調(diào)節(jié)中起激素的作用。2005年，來自Lilly公司的研究人員Alexei Kharitonekov等首先在細胞水平和生物水平兩方面對FGF21的生物學活性展開研究。他們用FGF21處理脂肪細胞二4小時后發(fā)現(xiàn)FGF21刺激后的脂肪細胞表現(xiàn)出明顯葡萄糖吸收能力，但與胰島素的作用現(xiàn)象不同， 在加入胰島素刺激后，細胞很快出現(xiàn)葡萄糖吸收作用，而FGF21則需要持續(xù)作用4小時以上才能達到相似的結(jié)果。同樣的結(jié)果也在動物實驗上得到體現(xiàn)。而且FGF21還表現(xiàn)出一些很有意義的特點科研人員對健康鼠、糖尿病鼠及過表達該基因的轉(zhuǎn)基因小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，任何劑量的FGF21均未引起小鼠體重增加或?qū)е碌脱前Y現(xiàn)象出現(xiàn)，這再一次提示FGF21可能不依賴于胰島素途徑來調(diào)節(jié)血糖。從肝cDNA文庫中分離出作為肝分泌因子的FGF21。它在肝和胰腺中高表達，并且是主要在肝中表達的FGF家族的唯一成員。過量表達FGF21的轉(zhuǎn)基因小鼠具有生長速率緩慢、血漿葡萄糖和甘油三酯水平低下的代謝表型，并且不存在年齡相關性II型糖尿病、胰島增大和肥胖癥。在嚙齒動物和靈長類模型中藥物性給予重組FGF21蛋白導致血漿葡萄糖水平正?；?、甘油三酯和膽固醇水平降低以及葡萄糖耐量和胰島素敏感性得到改善。另外， FGF21通過增加能量消耗、體力活動和代謝率而減輕體重和體脂肪。實驗研究為藥物性給予 FGF21以治療人的II型糖尿病、肥胖癥、脂血癥和其它代謝狀況或代謝紊亂提供了支持。FGF21除直接調(diào)節(jié)血糖水平外，還可以激活胞外信號途徑并改善胰腺細胞功能。據(jù)報道，F(xiàn)GF21可以提高正常小鼠胰島素mRNA水平和蛋白水平，同時激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2和Akt信號途徑，但無誘導胰島素分泌功能。FGF21處理的糖尿病嚙齒動物，可以提高胰島素量和葡萄糖誘導胰島素分泌。正?；蛱悄虿⌒∈筮M行FGF21治療后，胰島素水平， 葡萄糖清除率都得到改善。而且未發(fā)現(xiàn)胰島細胞增殖。由此推測FGF21對胰腺的作用可能得益于其在內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起到的有益作用。另外，F(xiàn)GF21對糖脂毒性和細胞因子誘導的胰島細胞調(diào)亡也有局部保護作用。FGF21對血脂也有一定的調(diào)控作用。研究表明長期注射FGF21糖尿病恒河猴體內(nèi)， 除血糖水平得到控制外，脂蛋白代謝也得到改善，尤其是特異性的降低低密度脂蛋白膽固醇及升高高密度脂蛋白膽固醇水平，由此可見FGF21在整個內(nèi)分泌過程中的重要作用。此夕卜，HajimeYamauchi等通過對斑馬魚FGF21的研究發(fā)現(xiàn)，敲除FGF21基因的斑馬魚胚胎紅細胞生成能力受到明顯抑制，而該現(xiàn)象在向胚胎注入FGF21后得到改善。不僅如此，缺少 FGF21的斑馬魚胚胎在粒細胞的生成也受到干擾，因此FGF21可能在動物體內(nèi)的骨髓-紅系祖細胞的分化中起到?jīng)Q定性作用。由于FGF家族成員大都具有促細胞分裂即促腫瘤生成的作用。而且，研究人員發(fā)現(xiàn)與FGF21結(jié)構(gòu)相似的FGF19能使小鼠肝細胞增生，因此FGF21安全性是決定它是否能夠成為候選糖尿病藥物的關鍵因素。到目前為止，所有的研究都證明FGF21是非常安全的。研究人員在被FGF21長期處理的3T3-L1細胞、NIH3T3細胞、人臍靜脈上皮細胞(HUVECs)等細胞上沒有發(fā)現(xiàn)增殖現(xiàn)象，而且長期注射FGF21的小鼠、恒河猴及轉(zhuǎn)基因小鼠也沒有任何組織增生現(xiàn)象發(fā)生。除了在糖尿病領域的研究外，F(xiàn)GF21還在其他幾個方面給我們帶來了振奮人心的結(jié)果。Xinqing Huang等利用二乙基亞硝胺作用于肝細胞大量表達FGF21的轉(zhuǎn)基因小鼠，令人驚奇的是與裸鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠能明顯地延緩腺瘤的發(fā)生時間，雖然兩者在肝癌發(fā)生時間上并無太大區(qū)別，但是該結(jié)果也證明FGF21并不像FGF家族其他成員那樣具有癌癥因子的惡名。Alexei Kharitonenkov等對FGF21生物功能進行研究時發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21能夠使 FGFR-I (成纖維細胞生長因子受體1)和FGFR-2 (成纖維細胞生長因子受體2、磷酸化，但是這一過程并不需要肝磷脂的參與，這與以往對FGF家族成員的認識不符。而且FGF21只能對脂肪細胞起作用而不能促進前脂肪細胞產(chǎn)生葡萄糖吸收作用，Yasushi Ogawa等通過對不同分化時期的脂肪細胞研究發(fā)現(xiàn)beta-klotho在脂肪細胞分化過程中表達量從無到有，因此推測beta-klotho的存在與否可能決定了 FGF21信號傳遞過程是否通暢，隨后的試驗也證明了這一推斷，免疫沉淀檢測到FGF21受體復合物中包含了 beta-klotho，而且抑制 beta-klotho表達的脂肪細胞不能對FGF21的刺激起反應，因此beta-klotho取代肝磷脂參與FGF21的信號傳遞過程。人FGF21具有短的體內(nèi)半衰期。在小鼠中，人FGF21的半衰期為1_2小時，在獼猴體內(nèi)半衰期為2. 5-3小時。在開發(fā)在II型糖尿病的治療中用作藥物的FGF21蛋白時， 可能需要延長半衰期。具有半衰期延長的FGF21蛋白，可允許較低頻率的給藥。因此，如何在不影響FGF21生物活性的同時增加在體內(nèi)的半衰期，是眾多科學家研究的焦點。如US patent757619或US patent20040558862中描述的FGF21白蛋白融合蛋白或FGF21融合 IgG，能明顯的增強其在體內(nèi)的半衰期。半衰期延長是由于Fc與Fcfoi的結(jié)合，使IgG獲得了保護，同時增力口在體內(nèi)的循環(huán)時間(Derry C. Roopenian等人，Nature Reviews Immunology 7,715-725)。
IgG-Fc是被廣泛使用的延長肽類、細胞因子和可溶性受體類體內(nèi)半衰期的融合蛋白。在IgG中，位于Fc上CH2和CH3域之間的位點(圖1B)介導與新生受體Fcfoi的相互作用，其中結(jié)合可以讓來自內(nèi)體的內(nèi)吞抗體再循環(huán)到血流中(Raghavan et al. ,1996,Annu Rev Cell Dev Biol 12 :181-220 ；Ghetie et al,2000, Annu Rev Immunol 18:739-766)。 上述過程結(jié)合大分子減少腎臟濾過作用，產(chǎn)生1-3周的體內(nèi)血清半衰期。Fc與Fcfoi的結(jié)合在抗體轉(zhuǎn)運中也起關鍵作用。Fc上結(jié)合Fcfoi的位點也是細菌蛋白A和G結(jié)合的位點。與這些蛋白的緊密結(jié)合通?？梢杂米鞯鞍准兓?，使用蛋白A或蛋白G親和色譜法純化抗體Fc 的方式。因此，F(xiàn)cfoi受體也負責將與其結(jié)合的Fc融合蛋白轉(zhuǎn)移到新生兒的腸道和成年人的腸上皮月空中(Ghetie and Ward, Annu. Rev. Immunol.，2000，18 :739-766 ；Yoshida et al.， Immunity,2004,20(6) :769-783)。人Fc γ的突變研究過程中，已經(jīng)對結(jié)合Fcfoi重要的一些殘基進行了研究，結(jié)果表明他們能明顯的增加血清半衰期。Hinton等在人Fc Yl中逐一地將三個殘基突變成了另外19種常見的氨基酸。他們發(fā)現(xiàn)一些雙重點突變體增加了 Fcfoi結(jié)合親和力，其中T250Q/ M428L位點的雙突變能顯著提高Fc與Fcfoi的親和力效果，進而明顯提高在體內(nèi)的半衰期。 另外，HenryB. Lowman等通過突變IgG-Fc的T307Q/N434A位點，同樣能明顯的增強體內(nèi)血清半衰期。這些實驗都通過猴的體內(nèi)藥物代謝實驗得到了證實。另外，還可以增加融合蛋白或抗體的跨細胞作用(Transcytosis)和組織的通透性，增加體內(nèi)組織系統(tǒng)對藥物的暴露，最大程度的發(fā)揮藥效(Hinton et al.，2004，J. Biol. Chem. 279 (8) :6213-6216 ；Henry B. Lowman et al. , Cancer Research. 70 (8) :3269-3277)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及預防和治療I型和II型糖尿病的融合蛋白和生產(chǎn)方法。本發(fā)明的組合物包含新的FGF21融合蛋白及其突變體。該融合蛋白含有與IgG重鏈恒定(Fe)區(qū)融合的 FGF21分子或者其類似物或片段。該IgG為人源的，可以選自IgGl、IgG2或IgG4。本發(fā)明的融合蛋白在本發(fā)明中被稱為 FGF21/IgG-Fc 或 FGF21/IgG-Fc(T250Q/M^8L ；QL)或 FGF21/ IgG-Fc突變體。在本發(fā)明的其他方面，該融合蛋白的突變體為FGF21/IgG-Fc(QL)或FGF21/ IgG-Fc (QA)等，含有IgG-Fc T250Q, M428L, T307Q和N434A突變位點中的任意一個或者多個突變組合以及FGF21的突變體。本發(fā)明的融合蛋白及其突變體在受試者中對I型和II型糖尿病的治療有效。同樣地，本發(fā)明提供了用于治療受試者的I型和II型糖尿病的方法，其中如果需要給受試者使用所述的融合蛋白及其突變體。本發(fā)明還提供了使用哺乳動物表達和細菌培養(yǎng)系統(tǒng)，制備本發(fā)明的FGF21/IgG_Fc 及突變體融合蛋白的新方法。在這兩種系統(tǒng)中，培養(yǎng)細胞克隆以制備包括FGF21/IgG-Fc及突變體融合蛋白以及有效延長體內(nèi)半衰期的突變體型，例如但不限于FGF21/IgG-Fc (QL)， FGF21(P171A)/IgG-Fc (QL)和FGF21/IgG_Fc (QA)。增強Fcfoi受體的結(jié)合，延長體內(nèi)血清滯留時間。本發(fā)明的二價FGF21/IgG_Fc及其突變體融合蛋白具有獨特的特點1.增加了 FGF21的體內(nèi)循環(huán)半衰期tl/2，尤其是FGF21/1 gG_Fc (QL)，F(xiàn)GF21 (P 171 A) /1 gG-Fc ^L)或 FGF21 /1 gG-Fc (QA)能明顯的進一步增加了 FGF21 在體內(nèi)的半衰期；2.增強FGF21的體內(nèi)穩(wěn)定性，有效減少蛋白的降解和聚集；3.提高與Fcfoi的親和力，增強FGF21體內(nèi)組織系統(tǒng)的穿透性和跨細胞作用，提高藥物的效果，減少藥物的注射頻次，減輕患者的疼痛和降低治療成本；4.通過生物工程方法生產(chǎn)，有利于獲得生物活性更高的蛋白。用于大規(guī)模制備的簡便的一步ftx)tein A提純?？梢詫⒈景l(fā)明的融合蛋白按需要以多種形式提供給受試者。本發(fā)明的一方面提供了一種用于受試者控制血糖平衡的FGF21融合蛋白。本發(fā)明的一方面提供了一種用于控制受試者血糖濃度的FGF21融合蛋白。本發(fā)明的一方面提供了一種異源性融合蛋白，該融合蛋白含有與IgG多肽融合的 FGF21多肽或其變異體，其中所述的IgG。根據(jù)本發(fā)明的一方面，所述IgG-Fc是人IgGl、IgG2或IgG4，及上述的突變體。根據(jù)本發(fā)明的一方面，所述IgG-Fc是人源IgGl-Fc、IgG2_Fc或IgG4_Fc的雜合體。根據(jù)本發(fā)明的一方面，所述FGF21多肽選自由FGF21 (SEQ ID No. 1)及其片段和突變體組成的組。根據(jù)本發(fā)明的一方面，所述FGF21突變體選自如下任意一個突變或多突變的任意組合，突變位點選自(a) 45位點丙氨酸突變?yōu)榫彼?，谷氨酸，谷氨酰胺，賴氨酸或蘇氨酸；(b)98位點亮氨酸突變?yōu)榫彼?，谷氨酸，谷氨酰胺，賴氨酸或蘇氨酸；(c) 111位點丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸或賴氨酸；(d) 129位點丙氨酸突變?yōu)榫彼?，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸?e) 170位點甘氨酸突變?yōu)楸彼幔於０?，半胱氨酸或脯氨酸；?f) 171位點脯氨酸突變?yōu)楣劝彼幔M氨酸，谷氨酰胺，蘇氨酸或酪氨酸。根據(jù)本發(fā)明的一方面，所述FGF21為SEQ ID No. 1。根據(jù)本發(fā)明的一方面，所述藥用組合物用于受治療者的I型和II型糖尿病的治療，所述組合物含有包含與IgG多肽融合的FGF21多肽或者其衍生物或活性片段的異源性融合蛋白。本發(fā)明一方面提供了所述異源性融合蛋白用于治療或預防I型和/或II型糖尿病的藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的一方面，所述IgG選自由人IgGl、IgG2和IgG4組成的組。本發(fā)明的其他特點和優(yōu)越性可通過以下詳細的描述體現(xiàn)。但是，應該理解的是，僅以示例的方式給出詳細描述和具體實施例以表明本發(fā)明的實施方案，這是因為對于本領域熟練技術(shù)人員從所述的詳細描述中在本發(fā)明的實質(zhì)和范圍內(nèi)多種改變和改良是顯而易見的。


圖1 構(gòu)建編碼FGF21/IgG_Fc及其突變體的表達質(zhì)粒。圖IA顯示運用PCR技術(shù)， 分別將FGF21和IgG-Fc的序列從各自的模板中擴增，接下來以上述的PCR產(chǎn)物為模板，用引物1和4擴增出FGF21/IgG-Fc序列。然后，將編碼FGF21/IgG_Fc融合蛋白的cDNA 連接到表達載體pcDNA3. 1的BmHI和EcoRV位點之間。利用核苷酸位點定向突變方法， 產(chǎn)生編碼FGF21/IgG-Fc融合蛋白的cDNA，使用與上述相同的方法將FGF21/IgG_Fc (QL)， FGF21(P171A)/IgG-Fc (QL)或 FGF21/IgG_Fc (QA)克隆入 pcDNA3. 1 表達載體。IB 中顯示由活性FGF21分子和包含人IgG2重鏈恒定區(qū)(鉸鏈、CH2和CH3部分)的IgG-Fc組成的 FGF21/IgG-Fc融合蛋白的圖示。這些蛋白質(zhì)表達時均以同型二聚體的形式分泌，形成如圖所示的空間結(jié)構(gòu)。圖IC顯示FGF21/IgG-Fc(QL)的空間結(jié)構(gòu)。圖2 :FGF21/IgG-Fc融合蛋白及其突變體在CHO-S細胞中的表達和檢測。用編碼 I gG-Fc、FGF21 /1 gG-Fc、FGF21 (P 17 ΙΑ) /1 gG-Fc (QL)、FGF21 /1 gG-Fc (QL)或 FGF21 / IgG-Fc (QA)等蛋白的質(zhì)粒載體融合轉(zhuǎn)染CHO-S細胞，轉(zhuǎn)染4 后吸取上清液，用A蛋白瓊脂糖凝股純化融合蛋白。分別進行還原(reduced)和非還原(Non-reduced)的SDS-PAGE分析，用考馬斯亮藍(Comasie Blue)染色。然后，將SDS-PAGE膠轉(zhuǎn)移到醋酸纖維素膜上，進行Western blot分析。上述膜用抗小鼠抗體(1 5000)探測，并用ECL顯影。結(jié)果顯示 FGF21/IgG-Fc及其突變體約為IOOKDa的同源二聚體，與理論分子量一致。其中，泳道1、2、3 分別是 FGF21/IgG-Fc、FGF21/IgG-Fc (QL)或 FGF21/IgG_Fc (QA)還原狀態(tài)的 SDS-PAGE。泳道 5、6、7 為 FGF21/IgG-Fc、FGF21/1 gG-Fc (QL)或 FGF21/1 gG_Fc (QA)融合蛋白的非還原狀態(tài)SDS-PAGE分析。圖3:融合蛋白Western blot檢測結(jié)果。取小規(guī)模提取的溶于SDS上樣緩沖液的融合蛋白30μ 1經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜，并用抗鼠抗體 (1 5000, Amersham-Pharmacia)探測，用 ECL顯影。泳道 1-5 依次為 FGF21/IgG_Fc、FGF21/ IgG-Fc (QL)、FGF21/1 gG-Fc (QA)、FGF21 (P 171A) /IgG-Fc (QL)、FGF21 (L98R) /IgG-Fc (QA)， 蛋白的分子量約為lOOkDa。圖4 顯示通過將FGF21/IgG_Fc及其突變體注射到db\db小鼠腹膜內(nèi)，在注射后0、0. 25、1、3、5和7天從注射小鼠中抽取血樣，然后測定樣品中的血糖水平，來測定特定抗蛋白酶解FGF21/IgG-Fc突變體體內(nèi)活性。其表示在注射PBS對照、FGF21/IgG_Fc對照或者 FGF21(L98R/A45R/AlllK/G170A/P171A)/IgG-Fc、FGF21 (L98R/A111T/G170N/P171A) / IgG-Fc (QL)、FGF21 (A45T/A111K/P171A) /IgG-Fc (QA)或 FGF21 (A129E) /IgG-Fc 的小鼠中測定的血糖水平。圖5 顯示抗聚集突變蛋白的檢測。將預先設計的突變體按照實施例1的方法進行蛋白的表達和純化。將65mg/ml蛋白質(zhì)在4°C下溫育1天、6天和10天后，F(xiàn)GF21對照 (WT)以及卩6卩21/186呼^6卩21仏981 /^11117^1四0/617(^/卩17比)/186-卩(；或？6卩21仏980/ L98R/A111K/A129R/A129N/P171E)/IgG-Fc(QL)，F(xiàn)GF21(L98Q/L98R/A111T/A129N/G170A/ P171Q)/IgG-Fc (QA)的聚集變化百分比。數(shù)據(jù)表明，與野生型蛋白質(zhì)相比，F(xiàn)GF21 (P171E)/ I gG-Fc，F(xiàn)GF21 (L98Q/P171Q)/I gG-Fc (QL)，F(xiàn)GF21 (A111T/P171Q)/I gG-Fc (QA)導致蛋白質(zhì)的聚集減少。圖6 顯示FGF21/IgG_Fc及其突變體融合蛋白的3T3-L1脂肪細胞糖代謝實驗，細胞分別用 FGF21/IgG-Fc，F(xiàn)GF21/1 gG-Fc (QA), FGF21 (P 171A) /IgG-Fc (QL), FGF21 (Α129Ν) / IgG-Fc (QA)及 FGF21(AlllT)/IgG-Fc 各 1000nmol/L。表中顯示的值(χ士 s)都是至少三次試驗后的平均值。
圖 7:顯示的是 FGF21/IgG-Fc，F(xiàn)GF21(P171A)/IgG-Fc^QL)，F(xiàn)GF21(L98R)/ IgG-Fc (QA)，F(xiàn)GF21/IgG-Fc (QL)或FGF21 (A129E) /IgG-Fc (QA)融合蛋白對患有 II 型糖尿病的db/db模型鼠的作用。4周和/或6周齡的db/db小鼠通過肌肉注射上述FGF21/IgG-Fc 融合蛋白及其突變體。收集注射前的和注射后2、4、10天的血清。活性FGF21水平通過 FGF21Elisa試劑盒檢測(數(shù)據(jù)未顯示)。首次注射后2天檢測兩組小鼠的空腹血糖水平(η =5 6，ρ < 0. 001)。圖8 顯示STZ糖尿病鼠模型實驗。首先構(gòu)建實驗模型，將FGF21/IgG_Fc及其突變體融合蛋白注射模型鼠進行檢測，圖中顯示的值(X士S)都是至少三次試驗后的平均值， 其中η = 10。
具體實施例方式在一個實施方案中，本發(fā)明的組合物和方法延長了 FGF21/IgG_Fc的循環(huán)半衰期， 增強了其功效。這是通過IgG-Fc突變體增強與Fcfoi的親和力進一步增加體內(nèi)半衰期。本發(fā)明的IgG是人源的，可以選自IgGl、IgG2和IgG4。FGF21多肽可以是本身序列或衍生物的片段。FGF21多肽可以是SEQ ID No. 1的氨基酸序列。在另一個實施方案中，本發(fā)明的融合蛋白含有FGF21多肽、FGF21片段或和 IgG-Fc, IgG-Fc (T250Q/M428L)和 / 或 IgG-Fc (T307Q/N434A)突變體片段。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明的可分泌的融合蛋白的載體，所述融合蛋白包括但不局限于活性FGF21和人IgGl/IgG2/IgG4-Fc氨基酸序列，用于哺乳動物表達二價的FGF21 多肽；以及活性的 FGF21/IgG-Fc (QL)，F(xiàn)GF21 (P171A) /IgG-Fc (QL)和 reF21/IgG_Fc (QA)氨基酸序列。本領域技術(shù)人員可以在如同在本文實施例中描述的載體中或是以相同的方法容易地制備任何所需的FGF21序列。體外細胞系研究結(jié)合I型和II型糖尿病模型鼠體內(nèi)肌肉注射融合蛋白進行治療，證明重組的人類FGF21融合蛋白FGF21/IgG-Fc，F(xiàn)GF21(P171A)/ IgG-Fc (QL)，F(xiàn)GF21/1 gG-Fc (QL)和FGF21/IgG_Fc (QA)的生物學特性以及有效性。這種治療方法在嚴重的I型和II型糖尿病模型中證明有效。總之，本發(fā)明為用蛋白質(zhì)預防和治療 I型和II型糖尿病提供了一種新的方法。融合蛋白的構(gòu)建是融合FGF21和IgG-Fc突變體組成一種新的分子，該分子能促進 FGF21的功效并結(jié)合有IgG-Fc的優(yōu)點，即增加FGF21的體內(nèi)半衰期和減少促進細胞分裂的風險，避免胰島素抵抗。同樣，F(xiàn)GF21及其突變體與IgG-Fc (T250Q/M^8L)或IgG-Fc (T307Q/ N434A)形成的新分子，其具有所述的促進FGF21功效和IgG-Fc (T250Q/M428L ；T307Q/ N434A)分子的優(yōu)點，增強Fc與Fcfoi的親和力，進一步增加體內(nèi)的半衰期。本發(fā)明的融合蛋白作為藥物應用于人類或動物可以通過多種途徑，并不局限于局部施用，如口服、噴霧、氣管內(nèi)灌輸、腹膜內(nèi)注射、靜脈注射、肌肉注射和基因療法。施用劑量取決于患者需要、期望取得的效果和施用途徑。例如人類的施用量可以為2nmol/kg體重或是 0. 02 IOOnmol/kg 體重。本發(fā)明適用于任何需要此類治療的個體。這些個體有可能發(fā)展成糖尿病、或新近診斷為糖尿病的患者或是已經(jīng)診斷為糖尿病的患者。本發(fā)明與預防和治療如本文所述的I 型和II型糖尿病相關。例如，這樣的個體可以為肥胖的人或有糖尿病遺傳史但尚未發(fā)病的人、或新近診斷為或已經(jīng)診斷為糖尿病的人。世界衛(wèi)生組織(WHO)根據(jù)身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)定義肥胖。BMI是用Kg體重除以身高米數(shù)的平方得來。為18. 5 25則體重正常。個體的 BMI為25 30則為超重，等于或超過30則為肥胖。這些個體也可以是血糖高于相同年齡與體重的正常值(正常血糖可以是根據(jù)醫(yī)學參考資料常規(guī)測定的)的人，盡管還不至于診斷為糖尿病。這些個體也可以是有糖尿病遺傳史但是還沒有發(fā)展成為糖尿病的人。當血糖值高于普遍認可的正常范圍時即可診斷為糖尿病。本發(fā)明提供了一種基于FGF21突變體與IgG-Fc突變體的優(yōu)化組合的融合蛋白， 通過這種優(yōu)化的突變組合獲得明顯改善蛋白聚集和降解，顯著提高體內(nèi)的半衰期的融合蛋白，這些融合蛋白能夠增強藥物的體內(nèi)組織和細胞穿透能力，增強藥效。本發(fā)明還提供了新的編碼融合蛋白的質(zhì)粒，該融合蛋白編碼含有通過應用重疊 PCR(聚合酶鏈反應)得到的人FGF21和人IgG-Fc (圖1)。圖例顯示IgG-Fc區(qū)域含有IgG2 恒定重鏈(包括餃鏈、CH2和CH3)。本發(fā)明還提供了可產(chǎn)生先導序列并導入載體使融合蛋白可以表達后分泌到細胞外培養(yǎng)液環(huán)境中去的方法。如圖顯示，一段ERBITUX重鏈信號肽(IGH)先導肽序列與FGF21 序列融合引導合成的多肽分泌到培養(yǎng)液中。在本發(fā)明的實施例中，一段ERBITUX重鏈信號肽(IGH)先導肽序列(MAVLGLLFCLVTFPSCVLS)與FGF21及IgG-Fc序列融合引導合成的多肽分泌到培養(yǎng)液中。每一個實施例中，這一戰(zhàn)略保證了在分泌過程中在切除分泌先導肽之后將使產(chǎn)生的FGF21與IgG-Fc融合蛋白N端的活性組氨酸殘基融合。有代表性的FGF21/ IgG-Fc見圖2。這種方法能達到1.由于Fc融合蛋白以均一的二聚體的形式分泌，F(xiàn)GF21-FC融合蛋白半衰期長并且，其較高的配體親和性從而使融合蛋白具有更高的效價。2.由于大量的胰島素受體在細胞表面以二聚體的前體形式存在，因而增強了多肽的藥效。3.簡化了純化過程。利用ftOtein A凝膠可以一步完成提純，利于融合蛋白的分
離純化。本專利還公開了使用哺乳動物表達系統(tǒng)證明了上述融合蛋白的新載體的表達。為評估載體表達和分泌FGF21/IgG-Fc融合蛋白的能力，將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染至CHO-S細胞中。轉(zhuǎn)染4 后，從表達的轉(zhuǎn)染細胞中提取總RNA，用RT-PCR評估融合蛋白的表達情況。用Western免疫印跡法和抗鼠抗體還分析了轉(zhuǎn)染的中國倉鼠卵巢細胞CHO-S細胞裂解物和細胞培養(yǎng)液以確定融合蛋白在翻譯水平上的表達。如圖3中所示，在培養(yǎng)液和細胞裂解物檢測Fc融合蛋白。可以通過Western免疫印跡法來檢測融合蛋白。在條件培養(yǎng)液和細胞裂解物中同時檢測融合蛋白表明融合蛋白已經(jīng)在哺乳動物細胞中合成并分泌。 CHO-S細胞系分別瞬時轉(zhuǎn)染了遞增量的FGF21/IgG-Fc質(zhì)粒和FGF21-FC-only質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后 4 收集細胞培養(yǎng)液。從50ml培養(yǎng)液(接種濃度約1. 25X IO5個細胞/ml，2天靜止培養(yǎng))利用 Protein A 凝膠一步純化融合蛋白(Jungbauer 等人，J Chromatogr. 1989 ；46 :257-268) 得到約300 μ g融合蛋白。樣品再分別經(jīng)還原和非還原的2種凝膠電泳分離并經(jīng)考馬斯亮蘭染色分別檢測到了一個約50KDa或約IOOKDa的條帶(圖2)，表明二聚體FGF21/IgG_Fc 融合蛋白以天然狀態(tài)存在。在一個實施方案中，顯示的是FGF21/IgG-Fc，F(xiàn)GF21 (P171A)/IgG-Fc (QL)，F(xiàn)GF21/ IgG-Fc (QL)和FGF21/IgG-Fc(QA)在預防和治療I型和II型糖尿病中有效，用于實施例中，1.前期糖尿病db/db鼠作為II型糖尿病的模型；2. STZ誘導的I型糖尿病的模型；3. 3T3細胞系檢測。Db/db小鼠缺乏功能性的瘦素受體，因此形成肥胖、高胰島素癥 (hyperinsulincmia)并在4到6周齡時出現(xiàn)葡萄糖不耐受，在8周齡時出現(xiàn)明顯的糖尿病。 因此這些小鼠被廣泛應用并被認為是II型糖尿病的模型。目前可以獲得并能應用于本發(fā)明的其他小鼠糖尿病模型還有高脂飲食誘導的胰島素抵抗的小鼠模型；這種小鼠因過度攝入脂肪導致體內(nèi)脂肪過量沉積，因而形成肥胖，具胰島素抗性，和葡萄糖的不耐受性。另一種動物模型是非肥胖糖尿病(NOD)小鼠。STZ誘導的I型糖尿病的模型是很好的自體免疫型糖尿病(I型糖尿病)模型，其中胰島抗原活性了 T-細胞浸潤胰島并殺死胰島細胞，弓丨起炎癥過程使胰島細胞死亡(Anderson和Bluestone，2005)。本發(fā)明對人的FGF21/IgG_Fc 進行改造，與IgG2-Fc通過一段柔性短肽連接，構(gòu)建融合蛋白FGF21/IgG-Fc及其突變體，使其具有FGF21的療效又有Fc的特性，獲得一種具有穩(wěn)定、持續(xù)降糖作用的新型蛋白藥物。 更重要的是增強了與Fcfoi的親和力，進一步提高了其在體內(nèi)的半衰期。通過葡萄糖氧化酶-過氧化物酶(POD-GOD)法，在3T3-L1脂肪細胞模型中，對經(jīng)純化后的重組蛋白進行了生物活性鑒定；并在I型和II型糖尿病模型中對融合蛋白進行了藥效分析。通過體外注射治療途徑施用FGF21/IgG_Fc及其突變體的在預防和治療I型和II型糖尿病中有效。編碼本發(fā)明的任意融合蛋白例如FGF21/IgG-FC，F(xiàn)GF21 (P171A)/ IgG-Fc (QL)，F(xiàn)GF21/1 gG-Fc (QL)和FGF21/IgG_Fc (QA)分子用于治療是有效的。通過融合蛋白注射和對4周齡db/db受試鼠注射施用上述的融合蛋白。所有的受試鼠中，在第一次注射后1周進行第二次注射，并監(jiān)控受試鼠糖尿病的進展情況。遺傳性缺乏瘦素受體的db/ db鼠是嚙齒類的II型糖尿病模型(Leiter,FASEB J. 1989 ；3(11) =2231-2241)。如上所示， 同時通過融合蛋白治療途徑用FGF21/IgG-Fc處理的年齡匹配的鼠在16周齡時(注射后1 周)顯示出血糖量正常，而對照組小鼠空腹血糖(FBG)水平則高出了正常范圍(圖4)。這些結(jié)果表明用FGF21/IgG-Fc的治療可以防止db/db鼠發(fā)生糖尿病。在表達FGF21/IgG_Fc 的db/db受試鼠中沒有糖尿病的發(fā)生?；贗gG-Fc的藥物有許多優(yōu)點。因為融合蛋白能夠形成IOOKDa的二聚體的形式，并不會被腎臟在短時間內(nèi)清除，因此具有實質(zhì)上更長的半衰期(Larrick and Fry, Hum Antibodies Hybridomas. 1991 ；2 (4) :172-189 ；Weir ^A, Biochem Soc Trans. 2002 ； 30(4) :512-516)。因此，大的FGF21/IgG_Fc同型二聚體融合蛋白較天然FGF21半衰期增長。由于一些酶更容易降解較小的多肽(Hupe-Sodmann等人，Regul Pept. 1995 ； 58 (3). 149-156)，而分子量較大的FGF21/IgG_Fc不容易被降解。而且FGF21/IgG_Fc 二聚體可以增加配體的親和性，通過預先形成的胰島素受體二聚體及多聚體(George等人，Nat Rev Drug Discov. 2002 ； (10) :808-820 ；Dupuis ^A, Brain Res Mol Brain Res. 1999 ； 67(1) :107-123)增強細胞內(nèi)信號傳導，因此以同型二聚體形式存在的FGF21-融合蛋白有更多潛力，結(jié)合更多的FGF21受體?？傊景l(fā)明是FGF21及突變體與IgG-Fc及其突變體(QA/QL)融合形成FGF21/ IgG-Fc突變體以增加半衰期、增強在體內(nèi)活性并減少免疫原性FGF21/IgG-Fc融合蛋白以天然二價的形式存在。在本發(fā)明的一個實施方案中，F(xiàn)GF21/IgG-Fc融合蛋白可以直接通過注射施用。用鼠糖尿病模型體內(nèi)試驗表明，可以通過融合蛋白的注射施用，這種方法可以有效控制體內(nèi)的血糖水平，避免胰島素抵抗的發(fā)生；在II型糖尿病db/db鼠模型證明可以治療糖尿病。同時，通過恒河猴的藥物代謝實驗進一步證實FGF21/IgG-Fc (QL),FGF21 (P171A/ L98R)/IgG-Fc (QL)和 FGF21/1 gG_Fc (QA)比 FGF21/IgG_Fc 具有更長的體內(nèi)半衰期。上述公開的內(nèi)容對本發(fā)明進行了大體的描述。通過參考下列具體實施例對本發(fā)明做更全面的理解。這些實施例僅僅是為了進一步的說明，而不是為了限定本發(fā)明的范圍。換言之，一些形式上的變異或替換是用作達意的考量。因此，在下文例引用的一些特殊的術(shù)語旨在達意，而非限制其意的目的。實施例實施例1 載體的構(gòu)建使用重疊PCR(overlap PCR)構(gòu)建了含有TOF21及突變體和IgG2_Fc及突變體的編碼融合蛋白的載體。IgG2-Fc區(qū)含有IgG2恒定重鏈(鉸鏈-CH2-CH3部分)。將鼠 IgK分泌先導肽序列與FGF21序列融合以便引導合成的融合蛋白分泌到培養(yǎng)液中。編碼 FGF21/hIgG-Fc融合蛋白的cDNA是化學合成的，并將其連接到編碼人IgG2_Fc (鉸鏈、CH2 和CH3)的PCR擴增的產(chǎn)物上，然后插入pcDNA3. 1載體的EcoRV和BamHI位點間構(gòu)建FGF21/ hIgG-Fc-pcDNA3. 1載體?？煞置诘腇GF21/hIgG_Fc及其突變體融合蛋白含有IgG2恒定重鏈(鉸鏈-CH2-CH3)。ERBITUX重鏈分泌引導肽序列(IGH)與FGF21序列融合引導合成的蛋白分泌到細胞培養(yǎng)液中。圖1顯示分泌的FGF21/IgG-Fc融合蛋白的圖示。其特點是1.解決了 FGF21半衰期短的問題，因為融合蛋白是以同型二聚體的形式分泌的，在體內(nèi)具有長的半衰期并由于配體的高度親和性而達到了高效價(Ozmen等人， J Immunol. 1993,150(7) :2698-2705 ；Kurschner 等人，J Immunol. 1992 ；149(12) 4096-4100 ；Kurschner 等，J Biol Chem. 1992 ；267 (13) :9354-9360)。2.基于Fcfoi親和力的突變改造，能夠進一步的增加FGF21在體內(nèi)的半衰期，同時增強藥物在體內(nèi)組織和細胞的穿透能力，增強藥物的效果；3.由于大多數(shù)FGF21受體是在細胞表面預先形成二聚體(Kharitonenkov A等人， J Cell Physiol. 2008 Apr ；215(1) 1-7)因而多肽與其受體的結(jié)合將更為有效；4.有效減少FGF21蛋白的聚集與降解問題；使用基因特異性引物和重疊PCR從FGF21 (化學合成，Shenggong company， Shanghai) cDNA和IgG質(zhì)粒擴增全長FGF21和IgG-Fc cDNA。對于第一輪重疊PCR，使用 5 ‘ -GGATCCCACCCCATCCCTGACTCCAGTCCTCTCCTGCAATTCGG-3'和 5 ‘ -CCGCCTCCGGAGCCGCCG CCTCCGGAGCCGCCGCCTCCGGAAGCGTAGATTTGCGCTCGGAGCCG-3‘；5' -CTACGCTTCCGGAGGCGGCGGC TCCGGAGGCGGCGGCTCCGGAGGCGGCGGCTCCGAGCGCAAAT-3，和 5' -TGATGTGCGTCTTCTCGGAGAGGG ACAGAGGCCCATTTCTAIAG-3‘。在第二輪重疊PCR中使用PCR及產(chǎn)物制備備用FGF21/IgG_Fc cDNA。將擴增的產(chǎn)物亞克隆到載體Bam HI和Eco RV位點，使用5 ‘ -GGATCCCACCCCATCCCT GACTCCAGTCCTCTCCTGCAATTCGG-3'和 5‘ -TGATGTGCGTCTTCTCGGAGAGGGACAGAGGCCCATTTCTA TAG-3’ 引物。為構(gòu)建編碼FGF21-IgG-Fc 的對照載體，使用 5 ‘ -GGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCG GCAG-3，和 5 ‘ -TGATGTGGGTCTTCTCGGACTCGGACTCGGACCCGTTC-3，，通過 PCR 單獨擴增 I gG cDNA并克隆到載體Bam HI和Eco RV位點。用于編碼人IgG2_Fc (鉸鏈-CH2-CH3)的cDNA 片段的PCR擴增的引物為5' -GGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAG-3，和5' -TGATGTGGGTCT TCTCGGACTCGGACTCGGACCCGTTCCCTAAG-3，。載體含有 CMV 直接-早期(immediate-early)增強子和啟動子、單一真核生物轉(zhuǎn)錄單元。嘌呤尾和轉(zhuǎn)錄終止序列。為使FGF21序列分泌，通過PCR于其5’端引入鼠IgK-鏈信號肽序列。為在細菌中表達FGF21/IgG-Fc融合蛋白，融合 cDNA序列通過 PCR擴增并亞克隆至 pET32a 載體(Novagen，EMD Bioscience, San Diego, CA)。IgG-Fc (QL)和 FGF21/IgG-Fc(QA)表達質(zhì)粒的構(gòu)建方法同上，T250Q/M^8L 和 T307Q/ N434A突變位點另外設計兩對PCR引物，進行重疊PCR反應，最后獲得FGF21/IgG_Fc (QL)、 FGF21(P171A)/IgG-Fc (QL)和 FGF21/IgG_Fc (QA)表達質(zhì)粒(圖 1)。實施例2 :FGF21/IgG-Fc及其突變體融合蛋白的CHO表達將FGF21/IgG_Fc 或 IgG-Fc 的 cDNA 通過 月旨質(zhì)體 (Lipofectamine) 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)轉(zhuǎn)染到 CH0-S 細胞中。其過程是先將密度為每孔2. 5X IO5個的CHO-S細胞生長在6孔細胞培養(yǎng)板。添加含有4yg FGF21/ IgG-Fc cDNA和10 μ 1轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體的無血清無抗菌素的DMEM(Invitrogen)進行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染他后，轉(zhuǎn)換為全培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染后4 分別收集培養(yǎng)液和細胞。為了大規(guī)模地表達FGF21/ IgG-Fc融合蛋白，將生長在150mm培養(yǎng)皿內(nèi)的CHO-S細胞用陽離子轉(zhuǎn)染試劑、聚乙酰亞胺 (Poly-ethyleneimine ；PEI,25kDa)禾P80yg 相關。cDNA 轉(zhuǎn)染。用 150mM Nacl 分別稀釋 DNA和PEI，混合后培養(yǎng)20min。然后將DNA/PEI復合物加到細胞中，并在無血清無抗菌素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)他。以加有10% FBS和P/S的DMEM替換培養(yǎng)液。為建立穩(wěn)定表達FGF21/IgG_Fc的CH0-S細胞，將在6孔細胞培養(yǎng)板(2. 5 X IO5個細胞/孔)上生長的細胞用4 μ g線性化的FGF21/IgG-Fc或IgG-Fc轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24h后，細胞在含有G418(500y g/ml)的DMEM培養(yǎng)液分裂和培養(yǎng)，以篩選那些已經(jīng)將重組質(zhì)粒穩(wěn)定整合到其基因組內(nèi)的細胞。培養(yǎng)過程中，每3天換培養(yǎng)液一次直至細胞克隆形成。分離單克隆細胞并擴展成穩(wěn)定的細胞系并將這些細胞系在M孔板上生長的組織培養(yǎng)的上清液用人 FGF21試劑盒檢測融合蛋白，選擇能分泌融合蛋白的細胞用作以后的特性分析。實施例3 從哺乳動物細胞培養(yǎng)液中純化融合蛋白應用A蛋白葡聚糖凝膠柱可以進行中規(guī)模的蛋白純化。50ml的柱體積可以純化 15cm培養(yǎng)皿中生長的轉(zhuǎn)染FGF21/lgG-Fc及其突變體融合載體的CHO-S細胞的條件培養(yǎng)液。 收集細胞轉(zhuǎn)染后48h的50ml DMEM培養(yǎng)液，或是收集穩(wěn)定表達融合蛋白的細胞，將其加入 A蛋白葡聚糖凝膠ImL滿體積(Amersham-Pharmacia)。加入TritonX-100在4°C下培養(yǎng)過夜。然后用含TritonX-100的PBS緩沖液洗滌，然后用150mM Nacl洗滌，最后用 ImM Nacl氨基乙酸(pH2. 7)將蛋白從樹脂上洗脫。洗脫液立即用Tris緩沖液(pH9. 0)中和并且純化的蛋白用PD-10凝膠柱除鹽(Amersham-Pharmacia)并用PBS洗脫。如圖中所見(圖2)，兩步洗脫方法可以將大部分融合蛋白由葡聚糖凝膠柱上洗脫下來。樣品的組分經(jīng)SDS-PAGE溶解并經(jīng)考馬斯亮蘭染色顯影以評估產(chǎn)率和純化率，結(jié)果顯示每ml培養(yǎng)液接種1. 25 X IO5細胞培養(yǎng)2d后，融合蛋白得率約為6 μ g/ml。實施例4 融合蛋白的細菌表達在大腸桿菌細胞中表達FGF21/IgG_Fc及其突變體融合蛋白。為了補償大腸桿菌 BL21細胞的密碼子偏倚(Codon bias)，使用了可以促進二硫鍵形成并可額外搭載質(zhì)粒以表達 7 個罕見的 tRNAs 的 Rosetta garni2 細胞(Merck, Germany)用 FGF21/IgG_Fc/pET32a， FGF21(P171A)/IgG-Fc, FGF21/IgG-Fc(QL)pET32a, FGF21/IgG-Fc(QA)pET32a 或 IgG-Fc/ pET3h載體(Novagen)轉(zhuǎn)化細菌后，選擇并篩選出其中幾個克隆以最佳表達融合蛋白。蛋白質(zhì)的表達是將單一克隆培養(yǎng)在有卡那霉素的50ml的2XYT培養(yǎng)液中于37°C過夜培養(yǎng)。 而后將培養(yǎng)液稀釋成(1 50)新培養(yǎng)液，直至細胞密度達到0D_讀數(shù)值0.6后，再在培養(yǎng)液中添加ImM的IPTG(EMD)3h以誘導表達。收集細菌并將菌球(Pallet)保存以進行其他步驟。蛋白質(zhì)的提取是將離心后的細菌重新懸浮在冰浴的含有蛋白酶抑制劑雞尾酒 (Sigma, St. Louis, MO)的PBS緩沖液后用超聲波裂解細胞。添加TritonX-IOO以溶解蛋白，30min后離心(12000g，IOmin)收集含有融合蛋白的上清液。表達的融合蛋白通過A 蛋白葡聚糖凝膠純化并通過SDS-PAGE和考馬斯亮蘭染色分析驗證。從4L的細菌培養(yǎng)液中可以提純約120 μ g的FGF21/IgG-Fc和Fc_only融合蛋白。實施例5 =SDS-PAGE和/或免疫印跡法檢測融合蛋白對表達的融合蛋白進行翻譯水平上的檢測。用Western免疫印記法和抗鼠抗體檢測了轉(zhuǎn)染的CHO-S細胞裂解物和細胞培養(yǎng)液以確定融合蛋白在翻譯水平上的表達。如圖3 中所示，同時在培養(yǎng)液和細胞裂解物中檢測到Fc融合蛋白。融合蛋白在電泳遷移位置大約在50kDa，是在還原的SDS-PAGE條件下融合蛋白單體的分子量。取小規(guī)模提取的溶于SDS 上樣緩沖液的融合蛋白30 μ 1經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜，并用
(1 5000, Amersham-Pharmacia) ^llJ, M ECL Mfi (Amersham-Pharmacia) ( B 圖3)。中等規(guī)模提取的融合蛋白則經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳分離后用考馬斯亮蘭染色檢測。實施例6 抗蛋白酶降解的FGF21/IgG_Fc及其突變體的設計通過數(shù)據(jù)庫(ProteinData Bank, PDB ；SWISS-PORT)分析了野生型 FGF21 主要的蛋白水解活性位點的序列位置，從而對原有的氨基酸進行替換，通過設計引入特定的氨基酸，來減少蛋白酶對FGF21/IgG-Fc的降解作用。氨基酸替換以具有其它物種的FGF21序列保守性和具有氨基酸殘基的生化保守性為基礎。已引入或可引入野生型FGF21蛋白的氨基酸取代表見表1，然而表1只是示例性的，并且可進行其它取代。表1中給定的位置數(shù)對應由181氨基酸殘基組成的成熟FGF21蛋白中的殘基位置。表1. FGF21/1 RG-Fc 殘基突變
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，由人成纖維細胞生長因子21(FGF21)及突變體通過連接肽 (Linker)與IgG-Fc或IgG-Fc突變體形成，其通式為reF21-Linker-IgG_Fc或者 IgG-Fc-Linker-FGF21。
2.權(quán)利要求1所述FGF21為人成纖維細胞生長因子21(SEQ ID NO=D或其突變體，根據(jù)本發(fā)明的一方面，所述FGF21突變體選自如下任意一個突變或者多突變的任意組合，其中突變位點選自(a)45位丙氨酸突變?yōu)榫彼幔劝彼?，谷氨酰胺，賴氨酸或蘇氨酸；(b)98位亮氨酸突變?yōu)榫彼?，谷氨酸，谷氨酰胺，賴氨酸或蘇氨酸；(c)111位丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸或賴氨酸；(d)129位丙氨酸突變?yōu)榫彼?，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸?e)170位甘氨酸突變?yōu)楸彼?，天冬酰胺，半胱氨酸或脯氨酸；?f)171位脯氨酸突變?yōu)楣劝彼?，組氨酸，谷氨酰胺，蘇氨酸或酪氨酸。
3.權(quán)利要求1 所述 Linker 選自序列 SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :4，SEQ ID NO 5, SEQ ID NO :6 或 SEQ ID NO :7，也可以選自(GGGGS) n，其中 η 可以是 1，2，3，4，5 或 6。
4.權(quán)利要求1所述Linker可以選自SEQID NO :8，其中η可以是1，2，3，4，5或6，另夕卜，也可以直接連接，或者為其它甘氨酸富集的連接肽。
5.權(quán)利要求1所述IgG-Fc(鉸鏈區(qū)-CH2-CH3)序列為人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的 Fc及其突變或缺失體，上述序列選自SEQ ID NO :9,SEQ ID NO 10, SEQ ID N0:11或SEQ ID NO :12，或者選自上述IgG-Fc序列的雜合體，其中IgG-Fc序列參照EU(Kakit)指數(shù)進行編號，重要的是上述IgG-Fc突變體選自序列SEQ ID NO 13, SEQ ID NO :14，SEQ ID NO 15, SEQ ID NO :16，上述突變位點可以是單個位點突變或是選自如下多位點突變組合，其中Xaa1 = Gln 或 ThrXaa2 = Gln 或 ThrXaa3 = Leu, Met 或 HisXaa4 = Ala 或 Asn0
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述，更進一步，與FGF21相連的融合蛋白可以選自人血白蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白，也可以選自人血白蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白部分片段、突變體和缺失體。
7.權(quán)利要求1 5所述融合蛋白應用于人I型和II型糖尿病及肥胖癥的預防與治療， 或者其DNA序列應用于基因治療。
8.權(quán)利要求5所述融合蛋白突變體，是基于增加與Fcfoi的親和力來進一步增加FGF21 在體內(nèi)的半衰期。
9.權(quán)利要求1 5所述融合蛋白使用酵母，CHO,SP2/0, BHK和/或HEK293細胞進行表達，蛋白純化過程中使用A或G蛋白葡聚糖凝膠層析柱。
10.權(quán)利要求1 5所述融合蛋白使用大腸桿菌進行表達。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于檢測和治療人I型和II型糖尿病、肥胖癥的融合蛋白及其制備方法和應用。所述融合蛋白含有人FGF21或其突變體和人IgG2-Fc(鉸鏈區(qū)-CH2-CH3)或IgG2-Fc突變體(T250Q/M428L；T307Q/N434A)，能有效改善肥胖癥患者的生存狀況，降低糖尿病患者的血糖水平，有效減少FGF21蛋白的聚集和降解，同時增加FGF21體內(nèi)的半衰期，尤其是FGF21及突變體與IgG-Fc(T250Q/M428L；T307Q/N434A)突變體融合，增強與FcRn親和力，進一步增加FGF21的體內(nèi)半衰期。
文檔編號A61P3/10GK102558358SQ20111046300
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者張海濤 申請人:張海濤