專利名稱：一種調(diào)節(jié)脂代謝的蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥；更具體地，本發(fā)明涉及一種調(diào)節(jié)脂代謝的蛋白及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
非酒精性脂肪肝(Nonalcoholicfatty liver disease, NAFLD)會(huì)引起許多肝臟慢性疾病，如肝硬化、肝癌和肝臟衰竭(1-3)。NAFLD的發(fā)生與年齡，二型糖尿病和高血脂相關(guān)(4)。肝臟脂肪化是NAFLD的早期癥狀，它的發(fā)生也是和年齡、二型糖尿病和高血脂相關(guān)的(5，6)。小鼠隨著年齡增長(zhǎng)或者在高脂食物喂養(yǎng)情況下都會(huì)發(fā)生肝臟脂肪化(7)。甘油三酯在肝臟中的過度積累會(huì)導(dǎo)致肝臟脂肪化，其中的機(jī)制包括:增加的脂肪攝入、增強(qiáng)的脂肪合成和脂肪氧化及肝臟脂肪向外輸出的減少(8)。脂代謝能夠被許多轉(zhuǎn)錄后修飾所調(diào)控，如:磷酸化、泛素化和乙?；?9，10)。蛋白的乙?；揎椧呀?jīng)成為調(diào)控細(xì)胞代謝的一種非常重要的轉(zhuǎn)綠后修飾(11)，同時(shí)乙?；且粋€(gè)動(dòng)態(tài)的過程，這個(gè)過程受乙?；负腿ヒ阴；杆{(diào)控。SIRTl是一個(gè)NAD+依賴的去乙?；?，在肝臟中敲除SIRTl會(huì)影響脂肪酸氧化造成肝臟脂肪化(12)。肝臟特異性敲除另一個(gè)去乙酰化酶SIRT6會(huì)增加糖原和甘油三酯的合成從而形成脂肪肝(13)。乙?；敢矃⑴c了許多的脂代謝過程。SREBP是脂代謝中關(guān)鍵的調(diào)控因子，有報(bào)導(dǎo)發(fā)現(xiàn)乙?；窹300能夠乙?；疭REBP從而增加它的穩(wěn)定性(14，15)。另外的報(bào)導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，p300還可以乙?；x的另一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控因子PPAR Y (16)。乙?；窯CN5被報(bào)導(dǎo)能夠乙酰化PGC-1 β從而抑制它的下游參與脂代謝的基因的表達(dá)(17)。乙?；窹CAF被發(fā)現(xiàn)能夠乙?；⒃鰪?qiáng)β -catenin的穩(wěn)定性(18),而β -catenin可以影響脂代謝和肝臟中甘油三酯的濃度(19)。雖然一些乙酰化酶被發(fā)現(xiàn)參與脂代謝的調(diào)控，但參與肝臟脂代謝的乙酰化酶還需要更多的研究。 蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶-1 (Pattl)是本實(shí)驗(yàn)室克隆并鑒定的一個(gè)新的乙?；?，它屬于 GNAT(GCN5 related N-acetyltransferase) family,同時(shí) Pattl 在肝臟中是高表達(dá)的
(20)。但是，以往它在肝臟中的作用還不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種調(diào)節(jié)脂代謝的蛋白及其應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶-UProteinacetyltransferase-1, Patti)的下調(diào)劑的用途,用于制備改善肝臟脂代謝的組合物。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的組合物還用于:緩解或治療脂肪肝，緩解年齡相關(guān)的肝臟脂肪化，降低體脂肪含量，增加瘦體重，增強(qiáng)葡萄糖耐受能力，降低肝臟脂肪含量，減少肝臟中年齡相關(guān)的甘油三酯含量，降低低密度脂蛋白-膽固醇含量，減弱肝細(xì)胞脂肪酸攝取能力，降低肝臟中⑶36基因的表達(dá)，降低肝臟中PPARy的表達(dá)，降低肝臟中ACL基因的表達(dá)，降低肝臟中FAS基因的表達(dá)，降低肝臟中EL0VL6基因的表達(dá)，上調(diào)ACC蛋白磷酸化水平，降低肝臟中ACC的活性，減弱體內(nèi)脂肪合成，上調(diào)CPT-1蛋白的表達(dá)和活性，提高肝臟ATP水平和/或提高脂肪酸氧化能力。在另一優(yōu)選例中，所述的蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶-1的下調(diào)劑選自(但不限于):特異性干擾蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶-1的編碼基因表達(dá)的干擾分子；或特異性與蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶-1結(jié)合的結(jié)合分子(如能夠抑制蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶-1活性的抗體或配體)。在另一優(yōu)選例中，所述的干擾分子選自(但不限于):反義核酸、小干擾RNA、dsRNA、微小RNA ;或能表達(dá)或形成所述反義核酸、小干擾RNA、dsRNA、微小RNA的構(gòu)建物。在另一優(yōu)選例中，所述的干擾分子是小干擾RNA(SiRNA)，其序列具有18_22bp的序列長(zhǎng)度，且能夠與蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶-1的mRNA互補(bǔ)并導(dǎo)致蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶-1的表達(dá)被下調(diào)。在另一優(yōu)選例中，所述的干擾分子具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的核苷
酸序列。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于改善肝臟脂代謝的小干擾RNA分子，所述的小干擾RNA分子是:(a)具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的小干擾RNA分子；和/或(b)核苷酸序列與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示核苷酸序列互補(bǔ)的小干擾RNA分子。 在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于改善肝臟脂代謝的組合物，所述的組合物含有:(I)有效量的所述的小干擾RNA分子；和(2)藥學(xué)上可接受的載體。在本發(fā)明的另一方面，提供蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶-1的用途，用于作為篩選改善肝臟脂代謝的藥物的靶標(biāo)。在本發(fā)明的另一方面，提供一種篩選改善肝臟脂代謝的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括:(I)將候選物質(zhì)與包含(如表達(dá))蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶-1的體系接觸；(2)篩選出下調(diào)蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶-1的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)或活性的物質(zhì)，所述物質(zhì)是改善肝臟脂代謝的潛在物質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選例中，步驟(I)包括:向包含(如表達(dá))蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶-1的體系中添加候選物質(zhì)；和步驟⑵包括:檢測(cè)蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶-1的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)或活性，并與對(duì)照組比較，其中所述的對(duì)照組是不添加所述候選物質(zhì)的、表達(dá)蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶-1的體系；若候選物質(zhì)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上下調(diào)(如顯著下調(diào)20%以上，較佳的下調(diào)50%以上；更佳的下調(diào)80%以上)蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶-1的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)或活性，則該候選物質(zhì)是改善肝臟脂代謝的潛在物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的體系選自(但不限于):細(xì)胞體系(或細(xì)胞培養(yǎng)物體系)、亞細(xì)胞體系、溶液體系、動(dòng)物體系或組織體系。在另一優(yōu)選例中，所述的體系是細(xì)胞體系，該細(xì)胞是肝臟細(xì)胞。
在另一優(yōu)選例中，所述的候選物質(zhì)選自(但不限于):針對(duì)蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶-1設(shè)計(jì)的干擾分子、核酸抑制物、結(jié)合分子(如抗體或配體)、小分子化合物。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括:對(duì)獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和/或動(dòng)物試驗(yàn)，以從候選物質(zhì)中進(jìn)一步選擇和確定對(duì)于改善肝臟脂代謝有用的物質(zhì)。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1、構(gòu)建Pattl肝臟特異敲除(PattlLKO)的小鼠。(A-D)通過Western印跡檢測(cè)Pattl在PattlLKO小鼠中被特異性敲除，其在肝(A)、肌肉(B)、白色脂肪組織(C)和腦⑶中表達(dá)正常。圖2、肝臟特異敲除的Pattl小鼠脂肪重量和脂肪含量都有顯著降低。(A-B)通過核磁共振(NMR)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)20周齡的雄性PattlLKO小鼠的脂肪重量和體脂含量比同窩對(duì)照(CTR)顯著降低。(C-D) NMR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，20周齡的雄性PattlLKO小鼠的瘦體重及瘦體重含量有一定的增加。(E)雙因素方差分析發(fā)現(xiàn)，雄性PattlLKO小鼠與同窩對(duì)照比有略微的增加，p =0.0413。 (F)在15-17周對(duì)攝食進(jìn)行檢查，發(fā)現(xiàn)雄性PattlLKO小鼠的攝食量略有增加。(G)葡萄糖耐受(GTT實(shí)驗(yàn)顯示)15周齡的雄性PattlLKO小鼠對(duì)葡萄糖的耐受性略高于同窩對(duì)照。(H)為(G)的曲線下面積。(I)胰島素耐受性實(shí)驗(yàn)(ITT)顯示，雄性PattlLKO小鼠的胰島素耐量與同窩對(duì)照相似。(J)為(I)的曲線下面積。η = 10-12/ 組，*ρ < 0.05，**ρ < 0.0l0圖3、特異敲除肝臟Pattl可以保護(hù)雄性小鼠肝臟對(duì)抗肝臟脂肪變性(A)肝臟切片蘇木精-曙紅染色顯示，31周齡雄性PattlLKO小鼠肝臟中的脂滴積累顯著少于同窩對(duì)照小鼠。(B)肝臟Pattl敲除緩解了年齡相關(guān)的肝臟甘油三酯的積累。(C-D)雄性PattlLKO小鼠肝臟中游離脂肪酸(FFA)含量降低，而總膽固醇(TC)含
量沒有顯著差異。(E) 31周齡的雄性PattlLKO小鼠的肝臟占體重的百分比與同窩對(duì)照沒有差異。(F-G)肝臟Pattl的敲除對(duì)31周齡雄性PattlLKO小鼠肝功能沒有顯著的影響。η=10-12/group, *p < 0.05, **p < 0.01。圖4、PattlLKO小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞能夠?qū)棺貦八嵴T導(dǎo)的脂肪堆積。⑷在如圖所示不同濃度的棕櫚酸處理18小時(shí)后，PattlLKO小鼠的原代肝細(xì)胞中脂滴的積累顯著少于同窩對(duì)照的原代肝細(xì)胞。(B)為(A)的紅色熒光通過酶標(biāo)儀檢測(cè)后得到的量化結(jié)果。(C)Western檢測(cè)不同濃度棕櫚酸處理后原代肝細(xì)胞中Pattl的蛋白水平。
(D)PattlLKO小鼠的原代肝細(xì)胞對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的甘油三酯的積累有抵抗作用。*p
<0.05，**p < 0.01。圖5、肝臟Pattl特異敲除能減少脂肪酸的攝取和脂質(zhì)的合成(A-B)經(jīng)過Real time PCR檢測(cè)，在如圖所示2個(gè)與脂肪酸攝入相關(guān)的基因中，⑶36的mRNA在9周和31周PattlLKO小鼠的肝臟中顯著下調(diào)。η = 4-6/組。(C)通過檢測(cè)3H-棕櫚酸的攝入，發(fā)現(xiàn)PattlLKO小鼠原代肝細(xì)胞的脂肪酸攝入顯著降低。(D-E)在如圖所示的脂代謝關(guān)鍵調(diào)控因子中，PPARa在9周的PattlLKO小鼠肝臟中下調(diào)，同時(shí)PPAR Y在9周和31周的PattlLKO小鼠肝臟中顯著降低。η = 4-6/組。(F-G)在如圖所示的參與脂肪酸和甘油三酯合成的酶中，ACL在9周和31周小鼠肝臟中顯著下調(diào)。η = 4-6/組。(H、J) western檢測(cè)9周和31周PattlLKO小鼠肝臟樣品發(fā)現(xiàn)，在如圖所示的參與脂合成的酶中，ACL、FAS和EL0VL6的蛋白水平顯著下調(diào)，同時(shí)磷酸化的ACC顯著上調(diào)。η =4-6/組。(1、K)對(duì)(H、J)中蛋白水平的定量。(L)ACC為脂肪酸合成途徑中的限速酶，它的活性在PattlLKO小鼠的肝臟中顯著下調(diào)。η = 8/組。(M)通過檢測(cè)3H-葡萄糖在新和成脂肪中的含量，發(fā)現(xiàn)PattlLKO小鼠原代肝細(xì)胞的脂肪酸合成速率顯著低于同窩對(duì)照小鼠的原代肝細(xì)胞。< 0.05，**ρ < 0.01。圖6、肝臟Pattl特異敲除能增強(qiáng)肝臟脂肪酸氧化。(A) western檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，脂肪酸氧化途徑中的限速酶CPT-1的蛋白水平在9周和31周雄性PattlLKO小鼠的肝臟中顯著上調(diào)。(B)對(duì)(A)圖中CPT-1蛋白水平的定量。η = 4-6/組。(C)CPT-1的活性在雄性PattlLKO小鼠肝臟中顯著升高。(D)ACS是催化脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行β氧化的一個(gè)重要的酶，它在雄性PattlLKO小鼠肝臟中的活性顯著升高。η = 8/組。(E)通過檢測(cè)3H-棕櫚酸氧化所釋放的3H2O,發(fā)現(xiàn)雄性PattlLKO小鼠原代肝細(xì)胞的脂肪酸氧化增強(qiáng)。(F)在饑餓6小時(shí)后，9周和31周的雄性PattlLKO小鼠肝臟中ATP水平與同窩對(duì)照小鼠有顯著升高。8-12/組。(G-L) 22周齡的雄性PattlLKO小鼠在夜間顯示出降低的呼吸熵(RQ)，增加的耗氧量(VO2)和總的能量消耗(TEE)。n = 10/group O *p < 0.05，**p < 0.01。圖7、Pattl在PattlLKO小鼠的胰腺、腎臟和褐色脂肪組織(BAT)中表達(dá)水平與同窩對(duì)照相似。圖8、對(duì)照小鼠的脂肪重量和體脂含量隨著年齡增加呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，PattlLKO小鼠在6周齡和9周齡時(shí)的脂肪重量和體脂含量顯著低于同窩對(duì)照小鼠。η = 8-12/組，*ρ
<0.05，**Ρ < 0.01。圖9、雄性PattlLKO小鼠顯示升高的空腹血糖和降低的低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)，空腹胰島素、血清中的甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)和游離脂肪酸(FFA)水平保持不變。η = 8-12/組，*ρ < 0.05。圖10、(A-B)與9周小鼠相比，31周小鼠肝臟中的Pattl蛋白水平略有降低。(C)與9周小鼠相比，31周小鼠肝臟中的Pattl的mRNA水平略有降低。η = 6/組，*ρ < 0.05, **Ρ < 0.01。(D)小鼠肝臟中Pattl的蛋白水平不受饑餓和再喂食條件的影響。η = 3 (E)在胰島素處理不同時(shí)間后，小鼠原代肝細(xì)胞中的Pattl蛋白水平?jīng)]有顯著變化。圖11、雄性PattlLKO小鼠肝臟中去乙酰化酶SIRTl和SIRT3的mRNA水平與同窩對(duì)照相比沒有顯著性差異。圖12、通過轉(zhuǎn)染siRNA，能夠下調(diào)肝細(xì)胞中Pattl的蛋白表達(dá)水平。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，首次證實(shí)了 Pattl蛋白在肝臟脂代謝中起著重要的作用，下調(diào)Pattl蛋白的表達(dá)不影響肝功能但能夠顯著降低動(dòng)物的體脂含量以及改善動(dòng)物的肝臟脂代謝。因此，Pattl蛋白可以作為篩選肝臟脂代謝調(diào)節(jié)藥物的靶標(biāo)。PattlPattl蛋白是新發(fā)現(xiàn)的在肝臟中高表達(dá)的蛋白乙?；?，以往它在肝臟中的作用還不清楚。而本發(fā)明第一次揭示了其在調(diào)節(jié)肝臟脂代謝中的作用。在本發(fā)明中，所述的P attl蛋白(多肽)可以是天然存在的，比如其可被分離或純化自動(dòng)物。此外，所述的Pattl蛋白也可以是人工制備的，比如可以根據(jù)常規(guī)的基因工程重組技術(shù)來產(chǎn)生重組Pattl蛋白。任何適合的Pattl蛋白均可用于本發(fā)明。所述的Pattl蛋白包括全長(zhǎng)的Pattl蛋白或其生物活性片段(或稱為活性片段)。例如，所述的Pattl蛋白的氨基酸序列可以與GenBank登錄號(hào)NP_079047所示的序列基本上相同；其核苷酸序列可以與GenBank登錄號(hào)NM_024771所示的序列基本上相同。經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的Pattl蛋白或其生物活性片段的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。Pattl蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述經(jīng)氨基酸替換的序列并不影響其活性或保留了其部分的活性。適當(dāng)替換氨基酸是本領(lǐng)域公知的技術(shù)，所述技術(shù)可以很容易地被實(shí)施，并且確保不改變所得分子的生物活性。這些技術(shù)使本領(lǐng)域人員認(rèn)識(shí)到，一般來說，在一種多肽的非必要區(qū)域改變單個(gè)氨基酸基本上不會(huì)改變生物活性。見Watson等Molecular Biology of The Gene,第四版，1987, TheBenjamin/Cummings Pub.C0.P224。任何一種Pattl蛋白的生物活性片段都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里，Pattl蛋白的生物活性片段的含義是指作為一種多肽，其仍然能保持全長(zhǎng)的Pattl蛋白的全部或部分功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50%的全長(zhǎng)Pattl蛋白的活性。在更優(yōu)選的條件下，所述活性片段能夠保持全長(zhǎng)Pattl蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。Pattl蛋白已經(jīng)公知在許多動(dòng)物中以高度的保守性存在，例如在人和小鼠中，Pattl蛋白的序列相同性(同源性)達(dá)到99%。因此，可以理解，來源于不同動(dòng)植物的Pattl均包含于本發(fā)明中。較佳地，它們是與GenBank登錄號(hào)NP_079047或其生物活性片段所示氨基酸序列相比，序列相同性高于60 %的，更佳地是高于70 %，更佳地是高于80 %，更佳地是高于85 %，更佳地是高于88 %，更佳地是高于90 %，更佳地是高于95 %，更佳地是高于98%。用途及篩選方法本發(fā)明人構(gòu)建了肝臟特異性Pattl敲除的小鼠，發(fā)現(xiàn)其在脂代謝方面有較明顯表型。肝臟Pattl敲除的雄性小鼠的體脂含量明顯減少，并且年齡相關(guān)的甘油三酯在肝臟中的積累和游離脂肪酸也顯著減少，同時(shí)Pattl的敲除并不影響肝功能。與此一致的是，在Pattl敲除的小鼠肝原代細(xì)胞也顯示了對(duì)于棕櫚酸誘導(dǎo)的脂滴積累有明顯的抵抗作用。更進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Pattl敲除的小鼠肝原代細(xì)胞顯示了脂肪酸攝入、脂肪合成的降低，以及脂肪酸氧化的增強(qiáng)，這些脂代謝的改善緩解了肝臟特異性Pattl敲除小鼠肝臟中的脂肪積累。本發(fā)明提出了 Pattl 在脂代謝中有重要作用，這對(duì)于治療年齡相關(guān)的脂肪肝有重要意義。基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，對(duì)Pattl的研究有著多方面的用途，所述的用途包括(但不限于):篩選下調(diào)Pattl的基因轉(zhuǎn)錄或蛋白表達(dá)的物質(zhì)，該物質(zhì)可用于制備改善肝臟脂代謝的藥物。因此，本發(fā)明提供了篩選改善肝臟脂代謝的潛在物質(zhì)的方法，將候選物質(zhì)與表達(dá)Pattl蛋白的體系接觸；篩選出抑制Pattl蛋白的編碼基因的轉(zhuǎn)錄或Pattl蛋白表達(dá)的物質(zhì)，所述物質(zhì)是改善肝臟脂代謝的潛在物質(zhì)。 如本文所用，所述的“下調(diào)”或“抑制”是指具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的“下調(diào)”或“抑制”。即:顯著地“下調(diào)”或“抑制”。如與不給予候選物質(zhì)的對(duì)照組的蛋白活性、蛋白表達(dá)、蛋白相互作用相比，顯著“下調(diào)”或“抑制”20%以上，較佳的50%以上；更佳的80%以上。所述的表達(dá)Pattl蛋白的體系選自:細(xì)胞體系(或細(xì)胞培養(yǎng)物體系)、亞細(xì)胞體系、溶液體系、動(dòng)物體系或組織體系。例如，所述的表達(dá)Pattl蛋白的體系是肝細(xì)胞。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的方法還包括:對(duì)獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和/或動(dòng)物試驗(yàn)，以從候選物質(zhì)中進(jìn)一步選擇和確定對(duì)于改善肝臟脂代謝有用的物質(zhì)。當(dāng)進(jìn)行篩選時(shí)，可以采用本領(lǐng)域熟知的各種技術(shù)來確定蛋白或其編碼基因的變化情況以及相互作用情況?？梢圆捎枚喾N常規(guī)的技術(shù)來鑒定系統(tǒng)中基因的轉(zhuǎn)錄或蛋白表達(dá)情況。這些技術(shù)包括但不限于:寡核苷酸雜交技術(shù)(如探針)，多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)，聚丙烯酰胺凝膠電泳，免疫印跡(如Western印跡)等。通過上述方法初步篩選出的物質(zhì)可構(gòu)成一個(gè)篩選庫(kù)，以便于人們最終可以從中篩選出能夠?qū)τ诟纳聘闻K脂代謝真正有用的物質(zhì)。本發(fā)明還提供了采用所述篩選方法獲得的可用于改善肝臟脂代謝的潛在物質(zhì)。所述物質(zhì)是下調(diào)Pattl蛋白的抑制劑、拮抗劑或下調(diào)劑。本發(fā)明還提供了一種制備改善肝臟脂代謝的藥物的方法，所述方法包括:合成和/或純化前述篩選獲得的對(duì)于改善肝臟脂代謝有用的物質(zhì)，作為用于改善肝臟脂代謝的藥物?？蓪@得的對(duì)于改善肝臟脂代謝有用的物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8,較佳地pH約為6-8,盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于):肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、或皮下給藥。Pattl蛋白的下調(diào)劑及其用途基于本發(fā)明人的上述新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種Pattl蛋白的下調(diào)劑的用途，用于制備改善哺乳動(dòng)物肝臟脂代謝的組合物。所述的Pattl的下調(diào)劑還用于:緩解或治療脂肪肝，緩解年齡相關(guān)的肝臟脂肪化，降低體脂肪含量，增加瘦體重，增強(qiáng)葡萄糖耐受能力，降低肝臟脂肪含量，減少肝臟中年齡相關(guān)的甘油三酯含量，降低低密度脂蛋白-膽固醇含量，減弱肝細(xì)胞脂肪酸攝取能力，降低肝臟中⑶36基因的表達(dá)，降低肝臟中PPARy的表達(dá)，降低肝臟中ACL基因的表達(dá)，降低肝臟中FAS基因的表達(dá)，降低肝臟中EL0VL6基因的表達(dá)，上調(diào)ACC蛋白磷酸化水平，降低肝臟中ACC的活性，減弱體內(nèi)脂肪合成，上調(diào)CPT-1蛋白的表達(dá)和活性，提高肝臟ATP水平和/或提高脂肪酸氧化能力。如本文所用，所述的Pattl基因或蛋白的下調(diào)劑包括了抑制劑、拮抗劑、阻滯劑、阻斷劑等。所述的Pattl基因或蛋白的下調(diào)劑是指任何可降低Pattl蛋白的活性、降低Pattl基因或蛋白的穩(wěn)定性、下調(diào)Pattl蛋白的表達(dá)、減少Pattl蛋白有效作用時(shí)間、或抑制Pattl基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的·物質(zhì)，這些物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為對(duì)于下調(diào)Pattl有用的物質(zhì)，從而可用于改善肝臟脂肪代謝。例如，所述的下調(diào)劑是:特異性干擾Pattl基因表達(dá)的小干擾RNA分子或反義核苷酸；或特異性與Pattl結(jié)合的抗體或配體。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的Pattl的下調(diào)劑是一種特異性與Pattl結(jié)合的抗體。所述的抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。可用Pattl蛋白免疫動(dòng)物，如家兔，小鼠，大鼠等來生產(chǎn)多克隆抗體；多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。與之相似的，表達(dá)Pattl或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。所述的抗體也可以是單克隆抗體，此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256 ；495,1975 ；Kohler 等人，Eur.J.1mmunol.6:511,1976 ；Kohler 等人，Eur.J.1mmunol.6:292,1976 ;Hammerling 等人，In Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas, Elsevier, N.Y.,1981)。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的Pattl的下調(diào)劑是一種Pattl特異性的小干擾 RNA 分子(siRNA)。如本文所用，所述的“小干擾 RNA (small interfering RNA, siRNA) ”是指一種短片段雙鏈RNA分子，能夠以同源互補(bǔ)序列的mRNA為靶目標(biāo)降解特定的mRNA，這個(gè)過程就是RNA干擾(RNA interference)過程。小干擾RNA可以制備成雙鏈核酸的形式，它含有一個(gè)正義鏈和一個(gè)反義鏈，這兩條鏈僅在雜交的條件下形成雙鏈。一個(gè)雙鏈RNA復(fù)合物可以由相互分離的正義鏈和反義鏈來制備。因此，舉例來講，互補(bǔ)的正義鏈和反義鏈?zhǔn)腔瘜W(xué)合成的，其后可通過退火雜交，產(chǎn)生合成的雙鏈RNA復(fù)合物。對(duì)小干擾RNA的制備方法沒有特別的限制，包括但不限于:化學(xué)合成法，體外轉(zhuǎn)錄法等。在得知了 Pattl與肝臟脂肪代謝的相關(guān)性以后，可以制備出所述的小干擾RNA，從而用于改善肝臟脂肪代謝。此外，小干擾RNA包含的正義鏈和反義鏈可通過一個(gè)或多個(gè)編碼正義鏈和反義鏈的表達(dá)盒來制備。當(dāng)正義鏈和反義鏈由一個(gè)單獨(dú)的表達(dá)盒編碼時(shí)，它們可以從生成的轉(zhuǎn)錄物中斷裂形成分離的正義鏈和反義鏈，其后雜交生成雙鏈小干擾RNA。所述的小干擾RNA可通過采用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染試劑被輸送到細(xì)胞內(nèi)，或還可采用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)被輸送到細(xì)胞內(nèi)。本發(fā)明還提供了一種組合物，它含有有效量(如0.000001-50wt% ;較佳的0.00001-20 丨％;更佳的，0.0001-10wt% )的所述的Pattl的下調(diào)劑，以及藥學(xué)上可接受的載體。所述的組合物可用于改善肝臟脂代謝。如本文所用，所述“有效量”是指可對(duì)人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動(dòng)物所接受的量。所述“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語(yǔ)指這樣一些藥劑載體:它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、緩沖液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充齊U、潤(rùn)滑劑、助流劑、潤(rùn)濕劑或乳化劑、PH緩沖物質(zhì)等。所述的載體中還可以含有細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑。在得知了所述Pattl基因或蛋白的下調(diào)劑的用途后，可以采用本領(lǐng)域熟知的多種方法來將所述的下調(diào)劑或其編碼基因、或其藥物組合物給藥于哺乳動(dòng)物。包括但不限于:皮下注射、肌肉注射、經(jīng)皮給予、局部給予、植入、緩釋給予等；優(yōu)選的，所述給藥方式是非腸道給予的。優(yōu)選的，可采用基因治療的手段進(jìn)行。如，可直接將Pattl的下調(diào)劑通過諸如注射等方法給藥于受試者；或者，可通過一定的途徑將攜帶Pattl的下調(diào)劑的表達(dá)單位(比如表達(dá)載體或病毒等，或siRNA)遞送到祀點(diǎn)上,并使之表達(dá)活性的Pattl下調(diào)劑,具體情況需視所述的下調(diào)劑的類型而定，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。

本發(fā)明所述的Pattl的下調(diào)劑的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來確定(例如通過臨床試驗(yàn))。所述的因素包括但不限于:所述的Pattl基因或蛋白的下調(diào)劑的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴(yán)重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。通常，當(dāng)本發(fā)明的Pattl的下調(diào)劑每天以約0.00001mg-50mg/kg動(dòng)物體重(較佳的0.0001mg-10mg/kg動(dòng)物體重)的劑量給予，能得到令人滿意的效果。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。材料與方法小鼠飼養(yǎng)
所有的小鼠實(shí)驗(yàn)均按照中科院營(yíng)養(yǎng)所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)小鼠可以自由獲取食物及飲水，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，環(huán)境溫度22±3°C，濕度35±5%，12小時(shí)晝夜周期(每天早上6: 30亮燈)。Alb-Cre小鼠購(gòu)于美國(guó)JacksonLaboratory,并按照其提供的方法進(jìn)行基因型鑒定。肝臟特異性Pattl敲除小鼠的構(gòu)建從野生型129/SvJ小鼠出發(fā)，采用常規(guī)的基因同源重組方法建立Pattl敲除小鼠，使得PattlmRNA上編碼Pattl蛋白第84-237位氨基酸的堿基被敲除，表達(dá)出無活性片段(即蛋白第1-83位)。簡(jiǎn)述如下:構(gòu)建Pattl基因外顯子5-8兩端插入1xP位點(diǎn)的重組質(zhì)粒，以Not I線性化后顯微注射到129/SvJ小鼠的受精卵使其與小鼠基因組發(fā)生同源重組。挑選重組陽(yáng)性的受精卵植入母鼠的輸卵管或子宮內(nèi)。出生的小鼠即為Pattliw+小鼠，Pattliw+小鼠自交后得到Pattlwirai小鼠。得到Pattliwirai后，將其與Alb-Cre小鼠進(jìn)行雜交，得到雙雜合子Pattl+/1°x，Cre+/-鼠，隨后雙雜合子小鼠互交得到肝臟特異性Pattl敲除小鼠(PattlLKO):PattlWl°x，Cre+/-小鼠，該小鼠同PattllWl°x雜交得到PattlLKO小鼠及其同窩對(duì)照小鼠Pattliwirai進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)葡萄糖耐受性實(shí)驗(yàn)前，將小鼠饑餓15小時(shí)，檢測(cè)空腹血糖后，腹腔注射葡萄糖溶液(根據(jù)小鼠體重，2g/kg)，然后分別用血糖儀檢測(cè)注射后15、30、60和120分鐘小鼠尾靜脈血液中葡萄糖的濃度。血糖用血糖儀(FreeStyle, Alameda, California, USA)檢測(cè)。胰島素耐受實(shí)驗(yàn)胰島素耐受性 實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食4小時(shí)，之后檢測(cè)空腹血糖后，根據(jù)體重注射
0.75U/kg的人胰島素溶液，分別用血糖儀檢測(cè)注射后15，30，60和120分鐘小鼠的血糖水平。酶活性檢測(cè)血清中的谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性用上海申索佑福醫(yī)學(xué)診斷用品有限公司提供的試劑盒，根據(jù)說明書進(jìn)行檢測(cè)。ACC的活性的檢測(cè)是通過將ACC催化的脂肪酸合成與NAD的生成偶聯(lián)起來，通過檢測(cè)NAD的生成來檢測(cè)ACC的酶活性⑴。CPT-1的酶活性檢測(cè)通過偶聯(lián)CoASH的釋放及其與4，4’ - 二硫代聯(lián)吡啶的反應(yīng)⑵。ACS酶活性的檢測(cè)也是通過與NAD的生成偶聯(lián)來檢測(cè)的(3)。甘油三酯、膽固醇和游離脂肪酸的檢測(cè)肝臟甘油三酯、膽固醇和游離脂肪酸的抽提是按照(4，5)所示文獻(xiàn)進(jìn)行抽提的。40-50mg的肝臟組織或4X IO5個(gè)原代肝細(xì)胞加入ImL的氯仿/甲醇溶液(I: 2,v/v)在室溫?fù)u床上放置2小時(shí)，隨后加入200 μ I的0.1M NaCl，漩渦震蕩后3，OOOg離心10分鐘。將200 μ I的下層有機(jī)層轉(zhuǎn)移至新的試管中，放入通風(fēng)櫥中過夜使氯仿?lián)]發(fā)干凈。在干燥的樣品中加入100 μ I的異丙醇將脂質(zhì)重懸。甘油三酯和膽固醇采用上海申索佑福醫(yī)學(xué)診斷用品有限公司提供的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，游離脂肪酸通過美國(guó)Biovision公司的游離脂肪酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。
小鼠原代肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng)小鼠原代肝細(xì)胞是從10-15周齡的小鼠肝臟中分離制備的(6)。雄性PattlLKO小鼠及其同窩對(duì)照小鼠麻醉后進(jìn)行肝臟灌注。首先用含有100 μ M EGTA的Krebs Ringe含糖緩沖液(4.8mM KCl, 1.2mM MgSO4,1.2mM KH2PO4,120mM NaCl,24mM NaHCO3, 20mM 葡萄糖和5mM HEPES, pH 7.45)進(jìn)行灌注，灌注液流速3ml/min。灌注15分鐘后，換溶液2 (KrebsRinger含糖緩沖液中加入5mM CaCl2和100U/ml膠原酶I)進(jìn)行灌注，15分鐘后停止灌注并小心剪掉肝臟，置于冰上的DMEM培養(yǎng)基中。將肝臟剪碎并用7(^111濾網(wǎng)過濾后，在5(^，4°C離心2分鐘。得到的原代肝細(xì)胞，用冰的DMEM洗3遍后，臺(tái)盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞活率。隨后將細(xì)胞鋪于事先用鼠尾膠原包被好的12孔板,細(xì)胞鋪板密度為2 X IO5每孔,用DMEM培養(yǎng)液在37°C培養(yǎng)。脂肪酸誘導(dǎo)原代肝細(xì)胞脂滴與尼羅紅染色原代肝細(xì)胞用如圖所示的不同濃度的棕櫚酸處理18小時(shí)后，PBS洗兩遍后用2 μ g/ml的尼羅紅在37°C孵育15分鐘。再用PBS洗兩遍后，將細(xì)胞置于熒光顯微鏡下拍照，隨后用酶標(biāo)儀對(duì)熒光進(jìn)行讀值(7)。免疫印跡細(xì)胞蛋白樣品經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，用不同抗體:Pattl⑶；ACL，Ser79-磷酸化的 ACC, ACC, FASN 和 C/EBP a (Cell Signaling) ；PATTI 和 EL0VL6 (Abeam)，CPT-1 (Alpha Diagnostics);以及 Tubulin 和 Actin (Sigma)檢測(cè)相應(yīng)蛋白。二抗結(jié)合后，加入ECL結(jié)合底物反應(yīng)2 5分鐘，用保鮮膜包好壓片，先依次以5、15、30、60秒曝光顯影曝光在Kodak X-Omat膠片上，再根據(jù)結(jié)果調(diào)整曝光時(shí)間或者顯影液。脂肪酸攝入

脂肪酸攝入實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)進(jìn)行(9)。12孔板中的原代肝細(xì)胞加入300 μ I/孔的反應(yīng)液(Hanks’balanced buffer, I % BSA 和 5 μ Ci/ml 3H_ 掠桐酸)在 37°C鮮育。5 分鐘后，用冰冷的PBS將細(xì)胞洗兩遍后加入100 μ I的0.3Μ的NaOH將細(xì)胞裂解，并加入閃爍液檢測(cè)放射性。脂肪酸合成脂肪酸合成實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)進(jìn)行(10)。12孔板中培養(yǎng)的原代肝細(xì)胞在含6 μ Ci/ml的3H-葡萄糖和ImM未標(biāo)記的葡萄糖的DMEM中孵育。60分鐘后，用PBS將細(xì)胞洗兩遍后，用上述的方法抽提細(xì)胞中的脂質(zhì)，并檢測(cè)其中3H的放射性。脂肪酸氧化脂肪酸氧化實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)進(jìn)行(11)。分離的小鼠原代肝細(xì)胞在培養(yǎng)24小時(shí)后用PBS洗兩遍，隨后加入300 μ I/孔的反應(yīng)液(Hanks’ balanced buffer, 10mg/ml BSA和3.3 μ Ci/ml3H-棕櫚酸)。37°C孵育I小時(shí)后，取150 μ I的反應(yīng)液到新的試管中，并加入400 μ I甲醇/氯仿溶液(2: 1，ν/ν)和400 μ I 2Μ KC1/2MHC1。漩渦震蕩后，在3，OOOg離心5分鐘，取上層水相層檢測(cè)其中3H2O的放射性。RNA抽提，逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR肝臟總RNA 用 TRIzol (Invitrogen)提取后用 RNase-free 的 DNase I (Takara)消化。隨后RNA用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV ReverseTranscriptase (Promega)進(jìn)行反轉(zhuǎn)。實(shí)時(shí)定量PCR(Realtime PCR)在ABI Prism 7900Sequence Detection System上進(jìn)行。實(shí)時(shí)定量PCR中所用到的引物主要來自 PrimerBank(http://pga.mgh.harvard, edu/primerbank),如表 I所示。表1、實(shí)時(shí)定量PCR中所用到的引物序列
權(quán)利要求
1.白乙?；D(zhuǎn)移酶-1的下調(diào)劑的用途，用于制備改善肝臟脂代謝的組合物。
2.權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于:緩解或治療脂肪肝，緩解年齡相關(guān)的肝臟脂肪化，降低體脂肪含量，增加瘦體重，增強(qiáng)葡萄糖耐受能力，降低肝臟脂肪含量，減少肝臟中年齡相關(guān)的甘油三酯含量，降低低密度脂蛋白-膽固醇含量，減弱肝細(xì)胞脂肪酸攝取能力，降低肝臟中CD36基因的表達(dá)，降低肝臟中PPARy的表達(dá)，降低肝臟中ACL基因的表達(dá)，降低肝臟中FAS基因的表達(dá)，降低肝臟中EL0VL6基因的表達(dá)，上調(diào)ACC蛋白磷酸化水平，降低肝臟中ACC的活性，減弱體內(nèi)脂肪合成，上調(diào)CPT-1蛋白的表達(dá)和活性，提高肝臟ATP水平和/或提高脂肪酸氧化能力。
3.權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶-1的下調(diào)劑選自: 特異性干擾蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶-1的編碼基因表達(dá)的干擾分子；或 特異性與蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶-1結(jié)合的結(jié)合分子。
4.權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述的干擾分子是小干擾RNA，其序列具有18-22bp的序列長(zhǎng)度，且能夠與蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶-1的mRNA互補(bǔ)并導(dǎo)致蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶-1的表達(dá)被下調(diào)。
5.權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的干擾分子具有SEQID NO:1或SEQID NO:3所示的核苷酸序列。
6.種用于改善肝臟脂代謝的小干擾RNA分子，其特征在于，所述的小干擾RNA分子是:(a)具有SEQID NO:1或SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的小干擾RNA分子；和/或 (b)核苷酸序列與SEQID NO:1或SEQ ID NO:3所示核苷酸序列互補(bǔ)的小干擾RNA分子。
7.種用于改善肝臟脂代謝的組合物，其特征在于，所述的組合物含有: (1)有效量的權(quán)利要求6所述的小干擾RNA分子；和 (2)藥學(xué)上可接受的載體。
8.白乙?；D(zhuǎn)移酶-1的用途，用于作為篩選改善肝臟脂代謝的藥物的靶標(biāo)。
9.種篩選改善肝臟脂代謝的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括: (1)將候選物質(zhì)與包含蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶-1的體系接觸； (2)篩選出下調(diào)蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶-1的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)或活性的物質(zhì)，所述物質(zhì)是改善肝臟脂代謝的潛在物質(zhì)。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，步驟(I)包括:向包含蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶-1的體系中添加候選物質(zhì)；和 步驟(2)包括:檢測(cè)蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶-1的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)或活性，并與對(duì)照組比較，其中所述的對(duì)照組是不添加所述候選物質(zhì)的、表達(dá)蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶-1的體系； 若候選物質(zhì)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上下調(diào)蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶-1的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)或活性，則該候選物質(zhì)是改善肝臟脂代謝的潛在物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種調(diào)節(jié)脂代謝的蛋白及其應(yīng)用。本發(fā)明首次證實(shí)了Patt1蛋白在肝臟脂代謝中起著重要的作用，下調(diào)Patt1蛋白的表達(dá)不影響肝功能但能夠顯著降低動(dòng)物的體脂含量以及改善動(dòng)物的肝臟脂代謝。因此，Patt1蛋白可以作為篩選肝臟脂代謝調(diào)節(jié)藥物的靶標(biāo)。
文檔編號(hào)A61P3/06GK103083668SQ20111034657
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2011年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月4日
發(fā)明者翟琦巍, 劉洋 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院