專利名稱：用于治療癌癥的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于治療癌癥的藥物組合物，包含有效劑量的樟芝萃取物。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的癌癥治療，主要是抑制快速增殖癌細(xì)胞的生長與引發(fā)其凋亡。然而癌細(xì)胞的異源性，造成在化療藥物及放射線治療后，惡性度較高的往往仍能存活，或是躲過免疫系統(tǒng)的偵測(cè)，導(dǎo)致癌癥在治療后經(jīng)常出現(xiàn)復(fù)發(fā)的情形。近年來，一種新理論的興起，對(duì)于癌癥難以治愈的原因提供一種新的解釋方式。許多研究指出，多數(shù)的癌細(xì)胞并不具有引起腫瘤發(fā)生的能力，只有極少部分癌細(xì)胞才具有致瘤性(tumorigenic)，并且可分化為腫瘤組織中的各種細(xì)胞?？茖W(xué)家在包括血癌、乳癌、腦癌、卵巢癌、前列腺癌、大腸直腸癌、口腔癌等不同的癌組織中，發(fā)現(xiàn)這些少數(shù)細(xì)胞相較于其它癌細(xì)胞而言，對(duì)于一般放射線或藥物更具有抵抗性。因此，將這些具有類似干細(xì)胞特性的癌細(xì)胞命名為癌癥干細(xì)胞(Cancer Stem Cell)。目前研究指出，癌癥干細(xì)胞可以從病患腫瘤中分離取出。而極少數(shù)的癌癥干細(xì)胞便可在病患體內(nèi)形成腫瘤，此種腫瘤干細(xì)胞的活化增生的調(diào)控與腫瘤復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)程侵犯甚至病患存活率有極密切的關(guān)聯(lián)。與正常干細(xì)胞相似的是，癌癥干細(xì)胞亦具有自我更新與分化的能力，會(huì)不斷的生長和分化為不同種類形態(tài)的腫瘤細(xì)胞，然而癌癥干細(xì)胞并不像正常的干細(xì)胞，其自我更新機(jī)制不受正常的調(diào)控。就以正常干細(xì)胞的表面抗原CD133為例，CD133是一個(gè)具有五個(gè)穿膜區(qū)域(transmembrane domains)的糖蛋白(glycoprotein),首度在成體血液、骨髓與胚胎干細(xì)胞中分離出的CD34+前驅(qū)細(xì)胞中被辨識(shí)，而被視為造血干細(xì)胞的標(biāo)志。然而在最近五年的研究中發(fā)現(xiàn)，CD133更被認(rèn)為是血癌、腦癌、視網(wǎng)膜目細(xì)胞瘤(retinoblastoma)、腎臟癌、胰臟癌、前列腺癌與肝癌的癌癥干細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志。最近研究報(bào)告也指出，髓母細(xì)胞瘤(medul1blastoma)以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤(glioma)可能具有⑶133+癌癥干細(xì)胞的存在，且這些⑶133+細(xì)胞的增殖與自我更新能力更勝于一般的腫瘤細(xì)胞，因此⑶133可視為癌癥干細(xì)胞的重要標(biāo)志之一。
目前，根據(jù)癌癥干細(xì)胞的特性，已能利用三種方式成功地自實(shí)體腫瘤(solidtumor)中分離出癌癥干細(xì)胞。第一，根據(jù)特異性表現(xiàn)在癌癥干細(xì)胞的表面抗原，例如CD44或⑶133,利用流式細(xì)胞儀(flow cytometry)分離出癌癥干細(xì)胞。其中，⑶133在多種腦部腫瘤的癌癥干細(xì)胞中分離出來，包括多形神經(jīng)膠母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme)、兒童髓母細(xì)胞瘤、室管膜瘤(印endymomas)。此外，它也在大腸癌的癌癥干細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，大腸癌中約1.8-24.5%的細(xì)胞表現(xiàn)⑶133，而這些細(xì)胞大多具有形成腫瘤的能力。第二，以熒光染劑Hoechst 33342對(duì)腫瘤組織或癌細(xì)胞群加以染色，分離出不具熒光訊號(hào)的側(cè)族群(side population),此為癌癥干細(xì)胞,據(jù)推測(cè)，這些細(xì)胞也許會(huì)導(dǎo)致腫瘤化學(xué)抗性(chemoresistance)。ABCG2-—種三憐酸腺苷水解酶運(yùn)轉(zhuǎn)子(ATPase transporter)的表現(xiàn)與側(cè)族群現(xiàn)象有密切相關(guān)；簡單說明其原理，因?yàn)楦杉?xì)胞的細(xì)胞膜表面會(huì)高度表現(xiàn)ABCG2，這個(gè)運(yùn)轉(zhuǎn)子會(huì)主動(dòng)的將Hoechst33342燃料從核內(nèi)排出到核外，因此流式細(xì)胞儀分析出來的這群側(cè)族群細(xì)胞就定義為具有干細(xì)胞的性質(zhì)。然而最新研究顯示，不論有沒有表現(xiàn)ABCG2的癌細(xì)胞都具有相似的致癌能力。第三，將腫瘤組織或癌細(xì)胞培養(yǎng)于不含血清但含有特定生長因子-如堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor ;bFGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor ；EGF)等人工合成生長因子的培養(yǎng)基,發(fā)現(xiàn)形成球體(sphere body formation)的細(xì)胞中富含癌癥干細(xì)胞，目前推論這種不含血清的培養(yǎng)環(huán)境，可以幫助癌癥干細(xì)胞維持在未分化的狀態(tài)。分子標(biāo)記物主要是確認(rèn)細(xì)胞的表面抗原或是特定的轉(zhuǎn)錄因子，各類干細(xì)胞及癌癥干細(xì)胞都需使用不同的標(biāo)志物來進(jìn)行確認(rèn)，而后再檢測(cè)干細(xì)胞自我更新及分化的能力。因此，如何能尋找出癌癥干細(xì)胞特有并專一表現(xiàn)的表面分子標(biāo)志或特定基因群，繼而辨識(shí)出具致瘤能力的癌癥干細(xì)胞，整飾目前各國頂尖研究團(tuán)隊(duì)的首要目標(biāo)。此外，如果能夠正確并且成功地分離出癌癥干細(xì)胞，將可藉由體外培養(yǎng)進(jìn)行后續(xù)的基因調(diào)控的基礎(chǔ)研究、人體修復(fù)或是藥物篩選平臺(tái)的開發(fā)，或直接應(yīng)用在癌癥病人的個(gè)體化抗癌治療的應(yīng)用。目前，這類癌癥干細(xì)胞被認(rèn)為有發(fā)展成癌癥的潛力，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的模式中，也證實(shí)極少量的癌癥干細(xì)胞即可形成腫瘤，而非干細(xì)胞的其它癌細(xì)胞，則需要遠(yuǎn)大于此數(shù)量的細(xì)胞數(shù)，才可以達(dá)到類似的腫瘤生成能力。另一方面，因癌癥干細(xì)胞的增殖速率極為緩慢，甚至處于停止分裂的狀態(tài)，也因其ABC運(yùn)輸?shù)鞍椎谋憩F(xiàn)量遠(yuǎn)超過一般的癌癥細(xì)胞，因此不易被化療藥物或放射線殺死。所以癌癥干細(xì)胞不但是癌癥在治療后復(fù)發(fā)并喪失對(duì)原本有效藥物反應(yīng)的主因，也很可能是癌癥惡性轉(zhuǎn)移的主要原因。這說明了只有消滅癌癥干細(xì)胞，癌癥才有治愈的機(jī)會(huì)。因此，找出這類細(xì)胞與一般癌細(xì)胞及正常干細(xì)胞間的差別，并針對(duì)這些特性發(fā)展有效治療殺死癌癥干細(xì)胞的策略，是目前癌癥研究的重要課題之一。近年來，醫(yī)學(xué)界對(duì)于這種難以治愈及容易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的情形提出新的看法，亦即不同的癌癥組織中可能存在特定的癌癥干細(xì)胞一Cancer Stem Cell，是造成癌癥病患腫瘤復(fù)發(fā)的主要關(guān)鍵。傳統(tǒng)的癌癥治療技術(shù)，是在手術(shù)切除之后進(jìn)行放射及化學(xué)治療，以抑制癌細(xì)胞的生長，進(jìn)而引發(fā)其凋亡。然而，惡性度較高的癌細(xì)胞，卻可以通過化療藥物及放射線治療而存活下來，并且躲過免疫系統(tǒng)的偵測(cè)，導(dǎo)致癌癥在治療后容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)情形。樟芝(Antrodia camphorata),又稱牛樟芝、牛樟燕或紅樟芝等，屬于無裙菌目(Aphyllophorales)、 多孔菌科(Polyporaceae)、薄孔菌屬(Antrodia)的裙多年生蕈菌類， 為臺(tái)灣特有種真菌，僅生長于臺(tái)灣保育類樹種-牛樟樹(Cinnamoum kanehirai Hay)的
中空腐朽心材內(nèi)壁上。由于牛樟樹分布數(shù)量極為稀少，加上人為的盜伐，使得寄生于其中方能生長的野生牛樟芝數(shù)量更加稀少，另外其子實(shí)體生長相當(dāng)緩慢，生長期亦僅在六月至十月之間，因此價(jià)格非常昂貴。在臺(tái)灣民俗醫(yī)學(xué)上，樟芝具有解毒、減輕腹瀉癥狀、消炎、治療肝臟相關(guān)疾病及抗癌等功能。樟芝乳痛一般食藥用的蕈菇類，具有許多復(fù)雜的成分，已知的生理活性成分中，包括:三職類化合物(triterpenoids)、多糖體(polysaccharides,如β-D-葡聚醣)、腺苷(ademosine)、維生素(如維生素B、煙堿酸)、蛋白質(zhì)(含免疫球蛋白)、超氧歧化酵母(superoxide dismutase, SOD)、微量元素(如丐、磷、鍺)、核酸、固醇類以及血壓穩(wěn)定物質(zhì)(如antrodia acid)等,這些生理活性成分被認(rèn)為具有抗腫瘤、增加免疫能力、抗過敏、抗病菌、抗高血壓、降血糖及降膽固醇等多種功效。目前，僅有樟芝萃取物對(duì)一般癌細(xì)胞具有抑制效果的研究，尚未有針對(duì)癌癥干細(xì)胞的研究。

發(fā)明內(nèi)容
為評(píng)估樟芝對(duì)抗肺癌、腦癌、頭頸癌、大腸直腸癌以及乳癌具有抑制癌癥干細(xì)胞生長潛力的藥物，共計(jì)5種樟芝萃取物于下:樟芝濃縮液(Dl)，樟芝濃縮液EA (乙酸乙酯)萃取物(D2)、樟芝濃縮液凍干粉(D3)、樟芝濃縮液凍干粉EA(乙酸乙酯)萃取物(D4)、樟芝菌絲體EA(乙酸乙酯萃取物(D5)。本發(fā)明的目的在于篩選具有抗癌作用的樟芝萃取物，以MTT(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl) ~2, 5-diphenyltetrazoIium bromide)測(cè)驗(yàn)來完成細(xì)胞毒性測(cè)試，本發(fā)明以人類肺癌干細(xì)胞Lung CSC、人類纖維母細(xì)胞AF-1 (Adultfibroblast-1)、腦癌干細(xì)胞GBM CSC、人類纖維母細(xì)胞AF-2 (Adult fibroblast-2)、頭頸癌干細(xì)胞HNSCC CSC、大腸直腸癌干細(xì)胞CRC CSC以及乳癌干細(xì)胞Breast CSC、肝癌干細(xì)胞Hepatoma CSC、血癌干細(xì)胞Leukemia CSC、胃癌干細(xì)胞Gastric CSC作為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。本發(fā)明提供一種用于治療由癌癥干細(xì)胞引起的癌癥的藥物組合物，包含有效劑量的樟芝萃取物。樟芝萃取物選自由樟芝濃縮液凍干粉乙酸乙酯萃取物及樟芝菌絲體乙酸乙酯萃取物做組成的群組；癌癥干細(xì)胞為肝癌干細(xì)胞、肺癌干細(xì)胞、腦癌干細(xì)胞、頭頸癌干細(xì)胞、大腸直腸癌干細(xì)胞、乳癌干細(xì)胞、血癌干細(xì)胞或胃癌干細(xì)胞；樟芝萃取物的有效劑量較佳為 10 μ g/ml 至 500 μ g/ml。本發(fā)明的藥物組合物與化療藥物并用可增加對(duì)癌癥干細(xì)胞的抑制效果；化療藥物為順鉬或紫杉醇；癌癥干細(xì)胞為肺癌干細(xì)胞、腦癌干細(xì)胞、頭頸癌干細(xì)胞、大腸直腸癌干細(xì)胞、乳癌干細(xì)胞或肝癌干細(xì)胞。本發(fā)明的藥物組合物與放射線治療并用亦可增加對(duì)癌癥干細(xì)胞的抑制效果；癌癥干細(xì)胞為肺癌干細(xì)胞、腦癌干細(xì)胞、頭頸癌干細(xì)胞、大腸直腸癌干細(xì)胞、乳癌干細(xì)胞或肝癌干細(xì)胞。本發(fā)明所述樟芝萃取物包含有效成份4-乙?；?安卓奎諾爾B (4-acetyl-antroquinonol B)。本發(fā)明亦提供一種用于治療由癌癥干細(xì)胞引起的癌癥的藥物組合物，包含有效劑量的4-乙酰基-安卓奎諾爾B (4-acetyl-antroquinonol B);癌癥干細(xì)胞為肺腺癌CD133陽性腫瘤干細(xì)胞、肺癌干細(xì)胞、腦癌干細(xì)胞、乳癌干細(xì)胞、口腔癌干細(xì)胞或大腸直腸癌干細(xì)胞；4-乙?；?安卓奎諾爾B的有效劑量較佳為0.1 μ g/ml至100 μ g/mlο


圖1為本發(fā)明所用樟芝萃取物的制作過程。圖2為4-乙?；?安卓奎諾爾B的ESI (+) -MS的質(zhì)譜圖。圖3為4-乙?；?安卓奎諾爾B的紫外光吸收光譜圖。圖4為4-乙?；?安卓奎諾爾B的1H-NMR (500MHz，CDCl3)光譜圖。圖5為4-乙?；?安卓奎諾爾B的13C-NMR(125MHZ，CDCl3)光譜圖。圖6是樟芝濃縮液的pH值特性與抑制人類干細(xì)胞生長圖。圖7為樟芝濃縮液(Dl)抑制人類肺癌干細(xì)胞Lung CSC的細(xì)胞毒性曲線。圖8為樟芝濃縮液EA (乙酸乙酯)萃取物(D2)抑制人類肺癌干細(xì)胞Lung CSC的細(xì)胞毒性曲線。
圖9為樟芝濃縮液凍干粉(D3)抑制人類肺癌干細(xì)胞Lung CSC的細(xì)胞毒性曲線。圖10為樟芝濃縮液凍干粉EA (乙酸乙酯)萃取物(D4)抑制人類肺癌干細(xì)胞LungCSC的細(xì)胞毒性曲線。圖11為樟芝菌絲體EA (乙酸乙酯)萃取物(D5)抑制人類肺癌干細(xì)胞Lung CSC的細(xì)胞毒性曲線。圖12為樟芝濃縮液(Dl)抑制人類纖維母細(xì)胞AF-1 (Adult fibroblast-1)的細(xì)胞毒性曲線。圖13為樟芝濃縮液EA (乙酸乙酯)萃取物(D2)抑制人類纖維母細(xì)胞AF_1 (Adultfibroblast-1)的細(xì)胞毒性曲線。圖14為樟芝濃縮液凍干粉(D3)抑制人類纖維母細(xì)胞AF-1 (Adultfibroblast-1)的細(xì)胞毒性曲線。圖15為樟芝濃縮液凍干粉EA(乙酸乙酯)萃取物(D4)抑制人類纖維母細(xì)胞AF-1 (Adult fibroblast-1)的細(xì)胞毒性曲線。圖16為樟芝菌絲體EA (乙酸乙酯)萃取物(D5)抑制人類纖維母細(xì)胞AF_1 (Adultfibroblast-1)的細(xì)胞毒性曲線。圖17為樟芝濃縮液(Dl)抑制腦癌干細(xì)胞GBM CSC的細(xì)胞毒性曲線。圖18為樟芝濃縮液EA (乙酸乙酯)萃取物(D2)抑制腦癌干細(xì)胞GBM CSC的細(xì)胞
毒性曲線。圖19為樟芝濃縮液凍干粉(D3)抑制腦癌干細(xì)胞GBM CSC的細(xì)胞毒性曲線。圖20為樟芝濃縮液凍干粉EA (乙酸乙酯)萃取物(D4)抑制腦癌干細(xì)胞GBM CSC的細(xì)胞毒性曲線。圖21為樟芝菌絲體EA (乙酸乙酯)萃取物(D5)抑制腦癌干細(xì)胞GBM CSC的細(xì)胞
毒性曲線。圖22為樟芝濃縮液(Dl)抑制人類纖維母細(xì)胞AF-2 (Adult fibroblast-2)的細(xì)胞毒性曲線。圖23為樟芝濃縮液EA (乙酸乙酯)萃取物(D2)抑制人類纖維母細(xì)胞AF_2 (Adultfibroblast-2)的細(xì)胞毒性曲線。圖24為樟芝濃縮液凍干粉(D3)抑制人類纖維母細(xì)胞AF_2 (Adultf ibroblast-2)的細(xì)胞毒性曲線。圖25為樟芝濃縮液凍干粉EA(乙酸乙酯)萃取物(D4)抑制人類纖維母細(xì)胞AF-2 (Adult fibroblast-2)的細(xì)胞毒性曲線。圖26為樟芝菌絲體EA (乙酸乙酯)萃取物(D5)抑制人類纖維母細(xì)胞AF_2 (Adultfibroblast-2)的細(xì)胞毒性曲線。圖27為樟芝濃縮液(Dl)抑制頭頸癌干細(xì)胞HNSCC CSC的細(xì)胞毒性曲線。圖28為樟芝濃縮液EA (乙酸乙酯)萃取物(D2)抑制頭頸癌干細(xì)胞HNSCCCSC的細(xì)胞毒性曲線。圖29為樟芝濃縮液凍干粉(D3)抑制頭頸癌干細(xì)胞HNSCC CSC的細(xì)胞毒性曲線。圖30為樟芝濃縮液凍干粉EA (乙酸乙酯)萃取物(D4)抑制頭頸癌干細(xì)胞HNSCCCSC的細(xì)胞毒性曲線。
圖31為樟芝菌絲體EA(乙酸乙酯)萃取物(D5)抑制頭頸癌干細(xì)胞HNSCCCSC的細(xì)胞毒性曲線.
圖32為樟芝濃縮液(Dl)抑制大腸直腸癌干細(xì)胞CRC CSC的細(xì)胞毒性曲線。圖33為樟芝濃縮液EA (乙酸乙酯)萃取物(D2)抑制大腸直腸癌干細(xì)胞CRC CSC的細(xì)胞毒性曲線。圖34為樟芝濃縮液凍干粉(D3)抑制大腸直腸癌干細(xì)胞CRC CSC的細(xì)胞毒性曲線。圖35為樟芝濃縮液凍干粉EA(乙酸乙酯)萃取物(D4)抑制大腸直腸癌干細(xì)胞CRC CSC的細(xì)胞毒性曲線。圖36為樟芝菌絲體EA (乙酸乙酯)萃取物(D5)抑制大腸直腸癌干細(xì)胞CRC CSC的細(xì)胞毒性曲線。圖37為樟芝濃縮液(Dl)抑制乳癌干細(xì)胞Breast CSC的細(xì)胞毒性曲線。圖38為樟芝濃縮液EA (乙酸乙酯)萃取物(D2)抑制乳癌干細(xì)胞Breast CSC的細(xì)胞毒性曲線。圖39為樟芝濃縮液凍干粉(D3)抑制乳癌干細(xì)胞Breast CSC的細(xì)胞毒性曲線。圖40為樟芝濃縮液凍干粉EA(乙酸乙酯)萃取物(D4)抑制乳癌干細(xì)胞BreastCSC的細(xì)胞毒性曲線。圖41為樟芝菌絲體EA (乙酸乙酯)萃取物(D5)抑制乳癌干細(xì)胞Breast CSC的細(xì)胞毒性曲線。圖42為樟芝濃縮液凍干粉EA (乙酸乙酯)萃取物(D4)抑制肝癌干細(xì)胞IfepatomaCSC的細(xì)胞毒性曲線。圖43為樟芝菌絲體EA (乙酸乙酯)萃取物抑制肝癌干細(xì)胞Ifepatoma CSC的細(xì)胞毒性曲線。圖44為樟芝濃縮液凍干粉EA (乙酸乙酯)萃取物(D4)抑制血癌干細(xì)胞LeukemiaCSC的細(xì)胞毒性曲線。圖45為樟芝菌絲體EA (乙酸乙酯)萃取物(D5)抑制血癌干細(xì)胞LeukemiaCSC的細(xì)胞毒性曲線。圖46為樟芝濃縮液凍干粉EA (乙酸乙酯)萃取物(D4)抑制胃癌干細(xì)胞GastricCSC的細(xì)胞毒性曲線。圖47為樟芝菌絲體EA (乙酸乙酯)萃取物(D5)抑制胃癌干細(xì)胞Gastric CSC的細(xì)胞毒性曲線。圖48為合并放射線治療(2Gy)對(duì)腦癌干細(xì)胞GBM CSC的效果圖。圖49為合并放射線治療(2Gy)對(duì)肺癌干細(xì)胞Lung CSC的效果圖。圖50為合并放射線治療(2Gy)對(duì)頭頸癌干細(xì)胞HNSCC CSC的效果圖。圖51為合并放射線治療(2Gy)對(duì)乳癌干細(xì)胞Breast CSC的效果圖。圖52為合并放射線治療(2Gy)對(duì)肝癌干細(xì)胞!fepatoma CSC的效果圖。圖53為合并放射線治療(2Gy)對(duì)大腸直腸癌干細(xì)胞CRC-CSC的效果圖。圖54為合并放射線治療(4Gy) 對(duì)腦癌干細(xì)胞GBM CSC的效果圖。圖55為合并放射線治療(4Gy)對(duì)肺癌干細(xì)胞Lung CSC的效果圖。圖56為合并放射線治療(4Gy)對(duì)頭頸癌干細(xì)胞HNSCC CSC的效果圖。
圖57為合并放射線治療(4Gy)對(duì)乳癌干細(xì)胞Breast CSC的效果圖。圖58為合并放射線治療(4Gy)對(duì)肝癌干細(xì)胞!fepatoma CSC的效果圖。圖59為合并放射線治療(4Gy)對(duì)肝癌干細(xì)胞!fepatoma CSC的效果圖。圖60為合并化療藥物治療(Cisplatin，10 μ g/ml)對(duì)腦癌干細(xì)胞GBM CSC的效果圖。圖61為合并化療藥物治療(Cisplatin，10 μ g/ml)對(duì)肺癌干細(xì)胞Lung CSC的效果圖。圖62為合并化療藥物治療(Cisplatin，10 μ g/ml)對(duì)頭頸癌干細(xì)胞HNSCCCSC的效果圖。圖63為合并化療藥物治療(Cisplatin，10 μ g/ml)對(duì)乳癌干細(xì)胞Breast CSC的效果圖。圖64為合并化療藥物治療(Cisplatin, 10 μ g/ml)對(duì)肝癌干細(xì)胞Hepatoma CSC的效果圖。圖65為合并化療藥物治療(Cisplatin，10 μ g/ml)對(duì)大腸直腸癌干細(xì)胞CRC-CSC的效果圖。圖66為合并化療藥物治療(Taxol，5ng/ml)對(duì)腦癌干細(xì)胞GBM CSC的效果圖。圖67為合并化療藥物治療(Taxol，5ng/ml)對(duì)肺癌干細(xì)胞Lung CSC的效果圖。圖68為合并化療藥物 治療(Taxol，5ng/ml)對(duì)頭頸癌干細(xì)胞HNSCC CSC的效果圖。圖69為合并化療藥物治療(Taxol，5ng/ml)對(duì)乳癌干細(xì)胞Breast CSC的效果圖。圖70為合并化療藥物治療(Taxol，5ng/ml)對(duì)肝癌干細(xì)胞H印atoma CSC的效果圖。圖71為合并化療藥物治療(Taxol，5ng/ml)對(duì)大腸直腸癌干細(xì)胞CRC-CSC的效果圖。圖72為4-乙?；?安卓奎諾爾B抑制肺腺癌⑶133陽性腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞毒性曲線。圖73為4-乙?；?安卓奎諾爾B抑制口腔癌干細(xì)胞Oral CSC的細(xì)胞毒性曲線。圖74為4-乙?；?安卓奎諾爾B抑制腦癌干細(xì)胞GBM-CSC的細(xì)胞毒性曲線。圖75為4-乙?；?安卓奎諾爾B抑制乳癌干細(xì)胞Breast CSC的細(xì)胞毒性曲線。圖76為4-乙?；?安卓奎諾爾B抑制肺癌干細(xì)胞Lung CSC的細(xì)胞毒性曲線。圖77為4-乙?；?安卓奎諾爾B抑制大腸直腸癌干細(xì)胞CRC-CSC的細(xì)胞毒性曲線。
具體實(shí)施例方式為更好的說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。實(shí)施例1樟芝萃取物的制備樟芝經(jīng)培養(yǎng)產(chǎn)生樟芝發(fā)酵濃縮液，樟芝生產(chǎn)過程如附圖1所不，共制備五種樟芝萃取物，如下:
1、樟芝濃縮液(Dl)；2、樟芝濃縮液EA (乙酸乙酯)萃取物(D2)；3、樟芝濃縮液凍干粉(D3)；4、樟芝濃縮液凍干粉EA(乙酸乙酯)萃取物(D4)；5、樟芝菌絲體EA (乙酸乙酯)萃取物(D5)。樟芝經(jīng)培養(yǎng)產(chǎn)生樟芝發(fā)酵液，經(jīng)低溫膜過濾濃縮產(chǎn)生樟芝濃縮液(Dl)，進(jìn)一步將樟芝濃縮液冷凍干燥可得樟芝濃縮液凍干粉(D3)。制備樟芝濃縮液乙酸乙酯萃取物(D2):取IOOml樟芝濃縮液加入IOOml乙酸乙酯分離(三次)，收集乙酸乙酯層，濃縮干燥后即為乙酸乙酯萃取物。制備樟芝濃縮液凍干粉乙酸乙酯萃取物(D4):取IOg樟芝濃縮液凍干粉加入IOOml 95%乙醇回流萃取3小時(shí)，樣品濃縮干燥后，加入IOOml水及IOOml乙酸乙酯分離(三次)，收集乙酸乙酯層，濃縮干燥后即為乙酸乙酯萃取物。制備樟芝菌絲體乙酸乙酯萃取物(D5):取IOg樟芝菌絲體加入IOOml 95%乙醇回流萃取3小時(shí)，樣品濃縮干燥后，加入IOOml水及IOOml乙酸乙酯分離(三次)，收集乙酸乙酯層，濃縮干燥后即為乙酸乙酯萃取物。實(shí)施例2分離樟芝菌絲體乙酸乙酯萃取物 (D5)的4-乙?；?安卓奎諾爾B成分取樟芝菌絲體3千克，以95%的乙醇IOL加熱回流萃取四次，萃取液經(jīng)過濾后濃縮，減壓干燥得乙醇萃取物384g，將乙醇萃取物懸浮于水以等量乙酸乙酯進(jìn)行分配(partition)分離，乙酸乙酯層經(jīng)減壓濃縮可得乙酸乙酯層分離物157.57g及水層分離物159.51g0上述乙酸乙酯層分離物157.57g以硅膠管柱(IOcmX30cm)進(jìn)行層析，依次以正己烷一正己烷-乙酸乙酯(10: I — 10: 2—10: 3—10: 4—10: 5—1: 1 — 1:2，v/v)—乙酸乙酯一甲醇，每種比例各IOL進(jìn)行沖提，每IL收集成一分離物。其中正己烷和乙酸乙酯混合物(正己烷:乙酸乙酯=10: 4)沖提的分離物56-63 (3.015g)，以逆相制備級(jí)管柱 Tosoh 0DS-80Ts (21.5mmX 300mm, 10 μ m)進(jìn)行層析，以 H2O-CH3CN(20: 80)為移動(dòng)相，流速10ml/min進(jìn)行層析，以265nm為檢測(cè)波長，管柱控溫40°C，可獲得4-乙?；?安卓奎諾爾 B (4-acetyl-antroquinonol B) 131mg04-乙酰基-安卓奎諾爾B的結(jié)構(gòu)鑒定4-乙?；?安卓奎諾爾 B ESI(+)MS (m/z):485 [M+Na]+, 502 [M+K]+.UV λ max (nm):206,265.1H-NMR(500MHz，CDCl3) δ (ppm):5.70 (1H, d, J = 3.2Hz, H_4)，5.20 (1H, t, J =6.4Hz，H-12)，5.09 (1H, t, J = 6.8Hz，H_8)，4.60 (1H, m, H-15)，3.98 (3H, s，H-24)，3.65 (3H,s’ H-23)，2.67 (1H, m, H-17)，2.50 (1H, dq, J = 6.9，10.8Hz, H_6)，2.39 (1H, dd, J = 6.5，
13.9Hz, H-14)，2.23 (1H, m, H-1 I)，2.19 (1H, m, H-14)，2.14 (1H, m, H-16)，2.09 (2H, m, H_7)，
2.08 (3H, OAc)，2.00 (2H, m, H-10)，1.94 (1H, m, H-1 I)，1.90 (1H, m, H-16)，1.86 (1H, m, H_5)，
1.63 (3H, s’ H-21)，1.54 (3H, s’ H_20)，1.25 (3H, d, J = 7.3Hz, H-19)，1.18 (3H, d, J =
6.9Hz, H-22).13C-NMR (125MHz，CDCl3) δ (ppm): 197.1 (C_l)，180.3 (C-18)，170.0 (CH3C0)，158.4(C-3)，137.7 (C_9)，137.6 (C_2)，130.4 (C-13)，128.5 (C-12)，121.0 (C_8)，77.1 (C-15)，69.4 (C_4) ,61.0 (C—23)，60.0 (C—24)，45.2 (C—14)，43.3 (C_5) ,41.6 (C_6)，39.6 (C-1O)，34.9 (C-16)，33.9 (C-17)，27.1 (C-1l)，26.5 (C_7)，21.2 (CH3CO)，16.7 (C-21)，16.3 (C-20)，16.1 (C-19)，13.1 (C-22)。實(shí)施例3藥物毒性試驗(yàn)本實(shí)施例以特定的細(xì)胞數(shù)種植在25T細(xì)胞培養(yǎng)基，等待六小時(shí)后，細(xì)胞貼附至培養(yǎng)基底部，但細(xì)胞仍未分裂的狀態(tài)下，加入濃度為0、50、100、200以及400nM的藥物，分別于時(shí)間0、6、12以及24小時(shí)后移除含有藥物的培養(yǎng)液，以PBS沖洗一次，再加入未含有藥物的新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)10至14天，以甲醇固定后，再以吉姆沙(Giemsa)染色，計(jì)算細(xì)胞菌落數(shù)(每個(gè)菌落須大于50個(gè)細(xì)胞)，則其存活分率(SF surviving fractions)的計(jì)算公式為:
權(quán)利要求
1.一種用于治療癌癥的藥物組合物，主要用于治療由癌癥干細(xì)胞引起的癌癥，其特征在于，包含有效劑量的樟芝萃取物。
2.按權(quán)利要求1所述的用于治療癌癥的藥物組合物，其特征在于，所述樟芝萃取物選自由樟芝濃縮液凍干粉乙酸乙酯萃取物及樟芝菌絲體乙酸乙酯萃取物所組成的群組。
3.按權(quán)利要求1所述的用于治療癌癥的藥物組合物，其特征在于，所述癌癥干細(xì)胞是肝癌干細(xì)胞、肺癌干細(xì)胞、腦癌干細(xì)胞、頭頸癌干細(xì)胞、大腸直腸癌干細(xì)胞、乳癌干細(xì)胞、血癌干細(xì)胞或胃癌干細(xì)胞。
4.按權(quán)利要求1所述的用于治療癌癥的藥物組合物，其特征在于，所述有效劑量為.10 μ g/ml 至 50 0 μ g/ml。
5.按權(quán)利要求1所述的用于治療癌癥的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物與化療藥物并用可增加對(duì)癌癥干細(xì)胞的抑制效果。
6.按權(quán)利要求5所述的用于治療癌癥的藥物組合物，其特征在于，所述化療藥物為順鉬或紫杉醇。
7.按權(quán)利要求5所述的用于治療癌癥的藥物組合物，其特征在于，所述癌癥干細(xì)胞為肺癌干細(xì)胞、腦癌干細(xì)胞、頭頸癌干細(xì)胞、大腸直腸癌干細(xì)胞、乳癌干細(xì)胞或肝癌干細(xì)胞。
8.按權(quán)利要求1所述的用于治療癌癥的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物與放射線治療并用可增加對(duì)癌癥干細(xì)胞的抑制效果。
9.按權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其特征在于，所述癌癥干細(xì)胞為肺癌干細(xì)胞、腦癌干細(xì)胞、頭頸癌干細(xì)胞、大腸直腸癌干細(xì)胞、乳癌干細(xì)胞或肝癌干細(xì)胞。
10.一種用于治療癌癥的藥物組合物，主要用于治療由癌癥干細(xì)胞引起的癌癥，其特征在于，包含有效劑量的4-乙酰基-安卓奎諾爾B (4-acetyl-antroquinonol B)。
11.按權(quán)利要求10所述的藥物組合物，其特征在于，所述癌癥干細(xì)胞是肺腺癌CD133陽性腫瘤干細(xì)胞、肺癌干細(xì)胞、腦癌干細(xì)胞、乳癌干細(xì)胞、口腔癌干細(xì)胞或大腸直腸癌干細(xì)胞。
12.按權(quán)利要求10所述的藥物組合物，其特征在于，所述有效劑量為0.1 μ g/ml至.100 μ g/mlο
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于治療由癌癥干細(xì)胞引起的癌癥的藥物組合物，包含有效劑量的樟芝萃取物。本發(fā)明亦提供一種用于治療由癌癥干細(xì)胞引起的癌癥的藥物組合物，包含有效劑量的4-乙?；?安卓奎諾爾B(4-acetyl-antroquinonol B)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK103083364SQ20111034497
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2011年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月4日
發(fā)明者黃俊智, 陳志杰, 陳立耿 申請(qǐng)人:麗豐實(shí)業(yè)股份有限公司