專利名稱：一種甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬靶向性納米材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種肝腫瘤靶向性甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝癌、肝炎等肝臟疾病是嚴(yán)重威脅人類健康的常見病和多發(fā)病，常規(guī)劑型的藥物經(jīng)靜脈、口服或局部注射后，藥物分布于全身，毒副作用較大。靶向給藥系統(tǒng)通過載體材料可將藥物選擇性輸送至肝臟的病變部位，降低對(duì)正常組織的毒副作用，減少用藥劑量和給藥次數(shù)，提高藥效。納米粒是由天然或合成高分子材料制成的粒徑10 1000 nm固態(tài)膠體粒子，其作為新型給藥載體可提高藥物的溶解性和穩(wěn)定性、改變藥物體內(nèi)分布、延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間，且具有良好的緩控釋效果。納米粒表面經(jīng)過特異性配體的修飾，可實(shí)現(xiàn)藥物的主動(dòng)靶向。實(shí)質(zhì)細(xì)胞是肝臟的主要組成部分和代謝場(chǎng)所，肝臟的多數(shù)病變均發(fā)生于實(shí)質(zhì)細(xì)胞。甘草酸是存在于甘草根、莖部的活性成分。哺乳動(dòng)物肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞膜表面已被證實(shí)存在甘草酸特異性受體(Negishi M et al. Biochim Biophys Acta 1991，1066 (1) 77-82)，且在腫瘤組織中過量表達(dá)(Ilicheva TN et al. Vopr Onko 1998，44 (4) 390-394)。國內(nèi)外已有研究表明，以甘草酸修飾的脂質(zhì)體或納米?？稍诟闻K中高度蓄積，且具有良好的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞靶向性(Osaka S et al. Biol Pharm Bull 1994，17 (7) 940-943 ； Lin AH et al. Int J Pharmaceut 2008，359 (1-2)247-253)。殼聚糖是自然界唯一存在的堿性多糖，具有良好的生物相容性且無毒可降解，但殼聚糖僅溶于酸性溶液，生理?xiàng)l件下不穩(wěn)定，易聚集沉淀，殼聚糖的水溶性衍生物可有效改善其體內(nèi)性質(zhì)。殼聚糖及其衍生物已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域，可作為納米藥物載體的組成材料。中國專利CN1760223用殼聚糖水溶性衍生物制備黏膜粘附性納米粒，表面可吸附親水性藥物。甘草酸作為靶向配體修飾殼聚糖納米載體的研究較少，中國專利CN101006983A公開了一種甘草酸鹽修飾殼聚糖/羧化殼聚糖復(fù)合載藥納米粒的制備方法，通過靜電相互作用形成納米粒，僅適于包載水溶性藥物；僅證明該納米粒可靶向至肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，未表明其對(duì)肝癌細(xì)胞具有主動(dòng)靶向性；且與殼聚糖相比，甘草酸鹽修飾殼聚糖/ 羧化殼聚糖復(fù)合納米粒的細(xì)胞攝取僅提高約2倍，并未有效發(fā)揮甘草酸的主動(dòng)靶向作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種穩(wěn)定性和重復(fù)性好、安全可靠的核殼型肝腫瘤靶向性甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的基本方案如下
親水性的羧甲基殼聚糖和疏水性的甲基丙烯酸烷基酯、丙烯酸烷基酯或氰基丙烯酸烷基酯在水溶液中通過引發(fā)劑作用，接枝聚合得到兩親性共聚物；該兩親性共聚物自組裝形成具有疏水內(nèi)核、親水外殼的聚合物羧甲基殼聚糖納米粒；疏水性藥物通過疏水相互作用載入納米粒內(nèi)核。本發(fā)明依據(jù)甘草酸對(duì)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的高度靶向性，將甘草酸分子共價(jià)連接至該羧甲基殼聚糖納米粒的親水表面，實(shí)現(xiàn)納米粒對(duì)肝癌細(xì)胞的主動(dòng)靶向，減小藥物對(duì)正常組織的毒副作用。本發(fā)明的制備避免使用有機(jī)溶劑，且在PH 3^12的范圍內(nèi)均不會(huì)產(chǎn)生沉淀析出。具體說來，本發(fā)明提供的肝腫瘤靶向性甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒，是由親水性的羧甲基殼聚糖和疏水性的聚甲基丙烯酸烷基酯、聚丙烯酸烷基酯或聚氰基丙烯酸烷基酯接枝共聚形成的具有疏水內(nèi)核、親水外殼的核殼結(jié)構(gòu)納米粒，親水外殼的表面共價(jià)連接有甘草酸；
其中，羧甲基殼聚糖與疏水性單體甲基丙烯酸烷基酯、丙烯酸烷基酯或氰基丙烯酸烷基酯的質(zhì)量體積比為1:0.251:4 (g/ml)，甘草酸基團(tuán)的含量為納米粒質(zhì)量的2 40%。所述的羧甲基殼聚糖為氧取代羧甲基殼聚糖，分子量范圍為10，00(Γ500，000 Da, 脫乙酰度>85%。所述的甲基丙烯酸烷基酯為甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丙酯、 甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸異丁酯和甲基丙烯酸己酯中的一種或一種以上。所述的丙烯酸烷基酯為丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸異丁酯、丙烯酸己酯中的一種或一種以上。所述的氰基丙烯酸烷基酯為氰基丙烯酸甲酯、氰基丙烯酸乙酯、氰基丙烯酸丙酯、 氰基丙烯酸丁酯、氰基丙烯酸異丁酯、氰基丙烯酸己酯中的一種或一種以上。所述的肝腫瘤靶向性甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒粒徑為10(T300 nm。本發(fā)明的肝腫瘤靶向性甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的制備方法如下
(1)將羧甲基殼聚糖溶解于水中，加熱至3(Γ50V，加入疏水性的甲基丙烯酸烷基酯、 丙烯酸烷基酯或氰基丙烯酸烷基酯，攪拌，加入引發(fā)劑，升溫至7(T85 °C，反應(yīng)纊24 h，純化，冷凍干燥，得羧甲基殼聚糖納米粒；
(2)將甘草酸溶解于pH8. (Γ10. 0的碳酸鹽緩沖液中，加入高碘酸鈉溶液，冰浴下避光攪拌6 12 h，得甘草酸氧化產(chǎn)物甘草酸醛；
(3)將步驟(1)的納米粒產(chǎn)物分散于水中，加入步驟(2)的甘草酸醛溶液中，室溫下避光攪拌12 36 h;加入硼氫化鈉水溶液，室溫下避光攪拌12 36 h ；純化，冷凍干燥，得甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒。所述的羧甲基殼聚糖為氧取代羧甲基殼聚糖，分子量范圍為10，00(Γ500，000 Da,
脫乙酰度>85%。所述的甲基丙烯酸烷基酯為甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丙酯、 甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸異丁酯和甲基丙烯酸己酯中的一種或一種以上。所述的丙烯酸烷基酯為丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸異丁酯、丙烯酸己酯中的一種或一種以上。所述的氰基丙烯酸烷基酯為氰基丙烯酸甲酯、氰基丙烯酸乙酯、氰基丙烯酸丙酯、 氰基丙烯酸丁酯、氰基丙烯酸異丁酯、氰基丙烯酸己酯中的一種或一種以上。步驟(1)中，羧甲基殼聚糖與疏水性甲基丙烯酸烷基酯、丙烯酸烷基酯或氰基丙烯酸烷基酯的質(zhì)量體積比為1:0. 1:4 (g/ml)。步驟(1)中的引發(fā)劑為過硫酸銨或過硫酸鉀的一種，用量為反應(yīng)體系的0. 0Γ0. 2%，g/mL。引發(fā)劑過少則反應(yīng)不完全，過多則聚合反應(yīng)過快，優(yōu)選0. 05%。步驟(2)中，高碘酸鈉與甘草酸的摩爾比為1:廣4:1。步驟(3)中，甘草酸醛與納米粒質(zhì)量比為0.25:廣4:1，質(zhì)量比高于4:1時(shí)，納米粒易產(chǎn)生沉淀，優(yōu)選甘草酸醛與納米粒質(zhì)量比為1:廣4:1。步驟(3)中，硼氫化鈉與甘草酸醛的摩爾比為1:廣4:1。作為上述肝腫瘤靶向性甘草酸修飾 羧甲基殼聚糖納米粒的應(yīng)用，本發(fā)明還提供一種肝腫瘤靶向性甘草酸修飾羧甲基殼聚糖載藥納米粒。該載藥納米粒以上述的納米粒為載體，包載疏水性藥物制成；其中，疏水性藥物與肝腫瘤靶向性甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的質(zhì)量比為1:5 1:20。其中，所述疏水性藥物為抗癌藥物和分子探針中的一種或幾種的混合物。所述抗癌藥物為紫杉醇、阿霉素、表阿霉素、5-氟尿嘧啶、全反式維甲酸、喜樹堿中的一種或幾種的混合物；所述疏水性分子探針為熒光標(biāo)記物、放射性分子、磁性分子、溫度敏感型或PH敏感型分子等。上述肝腫瘤靶向性甘草酸修飾羧甲基殼聚糖載藥納米粒的制備方法如下 將肝腫瘤靶向性甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒分散于PH 7. 4的磷酸緩沖液中，力口
入用有機(jī)溶劑溶解的疏水性藥物，室溫?cái)嚢?. 5^4 h，冰浴下脈沖式超聲，透析除去殘留有機(jī)溶劑，得載藥納米粒懸液。其中，疏水性藥物與肝腫瘤靶向性甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的質(zhì)量比為 1:5 1:20。所述的有機(jī)溶劑為乙醇、乙腈、丙酮、四氫呋喃、N，N-二甲基甲酰胺中的一種。所述的脈沖式超聲的條件為輸出功率100 W，工作2 s,間歇2 S。本發(fā)明的肝腫瘤靶向性甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米?？勺鳛榘d疏水性抗癌藥物和分子探針的靜脈注射給藥載體，用于肝臟疾病的治療。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于
(1)將甘草酸的趨肝性與殼聚糖衍生物納米粒優(yōu)良的生物學(xué)性能相結(jié)合，制備了一種新型肝腫瘤靶向性給藥載體，兼具被動(dòng)靶向和主動(dòng)靶向雙重功效。本發(fā)明的納米粒表面親水，且甘草酸修飾可增加其親水性，避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清除，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)，載藥納米粒在腫瘤新生血管滲漏處可通過EPR效應(yīng)聚集在腫瘤組織。納米粒上的靶向基團(tuán)(甘草酸) 可被肝腫瘤細(xì)胞表面特異性受體的識(shí)別、結(jié)合，顯著提高細(xì)胞攝取效率，與未修飾羧甲基殼聚糖納米粒相比，甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的細(xì)胞攝取提高10倍，更有效發(fā)揮甘草酸的主動(dòng)靶向作用，從而增加藥物的胞內(nèi)濃度，提高藥效，達(dá)到靶向治療的目的。(2)本發(fā)明的納米粒甘草酸修飾度較高，易與肝癌細(xì)胞表面受體結(jié)合，靶向能力較強(qiáng)。(3)本發(fā)明的納米粒分散均勻，多分散性系數(shù)均小于0. 2，分布范圍較窄。同時(shí)，本發(fā)明的納米粒均帶有較強(qiáng)的表面電荷，室溫保存和生理?xiàng)l件下均穩(wěn)定，不易產(chǎn)生凝聚和沉淀。(4)本發(fā)明的納米粒結(jié)構(gòu)致密，可通過超聲直接、快速包載疏水性藥物，保護(hù)藥物活性。所載藥物在體內(nèi)釋放緩慢，可防止藥物到達(dá)靶點(diǎn)前對(duì)正常組織的毒性。(5)本發(fā)明的納米粒以羧甲基殼聚糖為骨架材料，無毒且無免疫原性，生物相容性良好，體內(nèi)可降解，降解產(chǎn)物對(duì)生物體無害。
(6)羧甲基殼聚糖中含有羧基，具有抑酶作用。(7) 本發(fā)明各種原料廉價(jià)易得，納米粒合成工藝簡(jiǎn)單，條件可控，重復(fù)性好。納米?？稍谒芤褐薪?jīng)共聚物自組裝形成，引入靶向基團(tuán)的方法簡(jiǎn)捷方便，連接鍵牢固，且制備過程中無需使用表面活性劑等有機(jī)溶劑，安全可靠。本文所用術(shù)語
“CMCNP”指羧甲基殼聚糖納米粒，其組成為羧甲基殼聚糖-甲基丙烯酸甲酯兩親性共聚物?！癈MCNP-GL”指甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒。“PTX/CMCNP”指載紫杉醇羧甲基殼聚糖納米粒?！癙TX/CMCNP-GL”指載紫杉醇甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒。


圖1為納米粒的透射電鏡圖，(A)羧甲基殼聚糖納米粒(實(shí)施例1)，(B)甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒(實(shí)施例18)。圖中標(biāo)尺為100 nm。圖2為羧甲基殼聚糖納米粒(實(shí)施例1)與甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒(實(shí)施例17、18、19)的血清穩(wěn)定性。圖3為羧甲基殼聚糖納米粒(實(shí)施例1)與甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒(實(shí)施例17、18、19)在肝癌細(xì)胞2 h的細(xì)胞攝取。圖4為紫杉醇溶液和載紫杉醇納米粒(實(shí)施例24、25、26、27)與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng) 24 h的體外細(xì)胞毒性。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。下例實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，濃度為質(zhì)量體積百分?jǐn)?shù)(w/v)。實(shí)施例1羧甲基殼聚糖納米粒的制備
取分子量10，000 Da的羧甲基殼聚糖lg，加至100 mL水中，室溫?cái)嚢柚镣耆芙?。加熱?0°C，加入0.5 mL甲基丙烯酸甲酯，攪拌20 min后，加入0.05 g過硫酸銨，緩慢升溫至70°C，繼續(xù)反應(yīng)24 h。將反應(yīng)得到的乳白色納米粒懸液置14，000 Da半透膜中透析純化，冷凍干燥。實(shí)施例2羧甲基殼聚糖納米粒的制備
取分子量10，000 Da的羧甲基殼聚糖lg，加至100 mL水中，室溫?cái)嚢柚镣耆芙?。加熱?0°C，加入0.25 mL甲基丙烯酸甲酯，攪拌10 min后，加入0.01 g過硫酸銨，緩慢升溫至75°C，繼續(xù)反應(yīng)12 h。將反應(yīng)得到的乳白色納米粒懸液置14，000 Da半透膜中透析純化，冷凍干燥。實(shí)施例3羧甲基殼聚糖納米粒的制備
取分子量10，000 Da的羧甲基殼聚糖lg，加至100 mL水中，室溫?cái)嚢柚镣耆芙狻＜訜嶂?0°C，加入4 mL甲基丙烯酸甲酯，攪拌30 min后，加入0.2 g過硫酸銨，緩慢升溫至 85°C，繼續(xù)反應(yīng)2 h。將反應(yīng)得到的乳白色納米粒懸液置14，000 Da半透膜中透析純化，冷凍干燥。實(shí)施例4羧甲基殼聚糖納米粒的制備
取分子量10，000 Da的羧甲基殼聚糖lg，加至100 mL水中，室溫?cái)嚢柚镣耆芙?。加熱?0°C，加入1 mL丙烯酸甲酯，攪拌30 min后，加入0. 1 g過硫酸鉀，緩慢升溫至80°C， 繼續(xù)反應(yīng)8 h。將反應(yīng)得到的乳白色納米粒懸液置14，000 Da半透膜中透析純化，冷凍干
O實(shí)施例5羧甲基殼聚糖納米粒的制備
取分子量100，000 Da的羧甲基殼聚糖lg，加至100 mL水中，室溫?cái)嚢柚镣耆芙狻＜訜嶂?5°C，加入2 mL甲基丙烯酸乙酯，攪拌30 min后，加入0.05 g過硫酸銨，緩慢升溫至70°C，繼續(xù)反應(yīng)6 h。將反應(yīng)得到的乳白色納米粒懸液置14，000 Da半透膜中透析純化， 冷凍干燥。實(shí)施例6羧甲基殼聚糖納米粒的制備
取分子量100，000 Da的羧甲基殼聚糖lg，加至100 mL水中，室溫?cái)嚢柚镣耆芙狻?加熱至35°C，加入3 mL丙烯酸乙酯，攪拌20 min后，加入0.02 g過硫酸銨，緩慢升溫至 75°C，繼續(xù)反應(yīng)4 h。將反應(yīng)得到的乳白色納米粒懸液置14，000 Da半透膜中透析純化，冷凍干燥。實(shí)施例7羧甲基殼聚糖納米粒的制備
取分子量100，000 Da的羧甲基殼聚糖lg，加至100 mL水中，室溫?cái)嚢柚镣耆芙?。加熱?0°C，加入1 mL氰基丙烯酸甲酯，攪拌10 min后，加入0.05 g過硫酸銨，緩慢升溫至80°C，繼續(xù)反應(yīng)10 h。將反應(yīng)得到的乳白色納米粒懸液置14，000 Da半透膜中透析純化， 冷凍干燥。實(shí)施例8羧甲基殼聚糖納米粒的制備
取分子量100，000 Da的羧甲基殼聚糖lg，加至100 mL水中，室溫?cái)嚢柚镣耆芙?。加熱?0°C，加入0.5 mL甲基丙烯酸丙酯，攪拌20 min后，加入0.15 g過硫酸鉀，緩慢升溫至85°C，繼續(xù)反應(yīng)14 h。將反應(yīng)得到的乳白色納米粒懸液置14，000 Da半透膜中透析純化，冷凍干燥。實(shí)施例9羧甲基殼聚糖納米粒的制備
取分子量300，000 Da的羧甲基殼聚糖lg，加至100 mL水中，室溫?cái)嚢柚镣耆芙狻＜訜嶂?0°C，加入0.25 mL甲基丙烯酸丁酯，攪拌20 min后，加入0.1 g過硫酸銨，緩慢升溫至70°C，繼續(xù)反應(yīng)16 h。將反應(yīng)得到的乳白色納米粒懸液置14，000 Da半透膜中透析純化，冷凍干燥。實(shí)施例10羧甲基殼聚糖納米粒的制備
取分子量300，000 Da的羧甲基殼聚糖lg，加至100 mL水中，室溫?cái)嚢柚镣耆芙?。加熱?5°C，加入4 mL氰基丙烯酸異丁酯，攪拌30 min后，加入0.2 g過硫酸鉀，緩慢升溫至80°C，繼續(xù)反應(yīng)18 h。將反應(yīng)得到的乳白色納米粒懸液置14，000 Da半透膜中透析純化， 冷凍干燥。實(shí)施例11羧甲基殼聚糖納米粒的制備
取分子量500，000 Da的羧甲基殼聚糖lg，加至100 mL水中，室溫?cái)嚢柚镣耆芙狻＜訜嶂?0°C，加入2 mL丙烯酸己酯，攪拌10 min后，加入0.2 g過硫酸銨，緩慢升溫至75°C，繼續(xù)反應(yīng)20 h。將反應(yīng)得到的乳白色納米粒懸液置14，000 Da半透膜中透析純化，冷凍干燥。
實(shí)施例12羧甲基殼聚糖納米粒的制備
取分子量500，000 Da的羧甲基殼聚糖lg，加至100 mL水中，室溫?cái)嚢柚镣耆芙?。加熱?0°C，加入0.5 mL氰基丙烯酸乙酯，攪拌20 min后，加入0.05 g過硫酸鉀，緩慢升溫至85°C，繼續(xù)反應(yīng)22 h。將反應(yīng)得到的乳白色納米粒懸液置14，000 Da半透膜中透析純化，冷凍干燥。實(shí)施例13甘草酸醛的制備
將甘草酸(GL)溶于pH 9.0的碳酸緩沖液，取NaIO4適量溶于水，甘草酸和NaIO4摩爾濃度均為0.05 mol/L。攪拌下將NaIO4溶液緩慢滴加至上述甘草酸溶液中，NaIO4與甘草酸的摩爾比為1:1。冰浴避光攪拌6 h，得甘草酸氧化產(chǎn)物，記為甘草酸醛。 實(shí)施例14甘草酸醛的制備
將甘草酸(GL)溶于pH 8.0的碳酸緩沖液，取NaIO4適量溶于水，甘草酸和NaIO4摩爾濃度均為0.05 mol/L。攪拌下將NaIO4溶液緩慢滴加至上述甘草酸溶液中，NaIO4與甘草酸的摩爾比為2:1。冰浴避光攪拌9 h，得甘草酸氧化產(chǎn)物，記為甘草酸醛。 實(shí)施例15甘草酸醛的制備
將甘草酸(GL)溶于pH 10.0的碳酸緩沖液，取NaIO4適量溶于水，甘草酸和NaIO4摩爾濃度均為0.05 mol/L。攪拌下將NaIO4溶液緩慢滴加至上述甘草酸溶液中，NaIO4與甘草酸的摩爾比為4:1。冰浴避光攪拌12 h，得甘草酸氧化產(chǎn)物，記為甘草酸醛。 實(shí)施例16醛基的檢測(cè)
用新制的Cu(OH)2溶液與GL醛產(chǎn)物溶液混合加熱，有紅色沉淀(Cu2O)證明有醛基存在。實(shí)施例17甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的制備
將實(shí)施例1的羧甲基殼聚糖納米粒均勻分散于水中，攪拌下將納米粒懸液緩慢加入實(shí)施例13的甘草酸醛溶液中，甘草酸醛與羧甲基殼聚糖納米粒的質(zhì)量比為1:1，室溫避光攪拌24 h。將NaBH4溶于水，逐滴加入上述反應(yīng)體系，NaBH4與甘草酸的摩爾比為1:1，室溫?cái)嚢?4 h。超聲后將產(chǎn)物置3，500 Da半透膜中透析純化，冷凍干燥。實(shí)施例18甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的制備
將實(shí)施例1的羧甲基殼聚糖納米粒均勻分散于水中，攪拌下將納米粒懸液緩慢加入實(shí)施例13的甘草酸醛溶液中，甘草酸醛與羧甲基殼聚糖納米粒的質(zhì)量比為2:1，室溫避光攪拌24 h。將NaBH4溶于水，逐滴加入上述反應(yīng)體系，NaBH4與甘草酸的摩爾比為1:1，室溫?cái)嚢?4 h。超聲后將產(chǎn)物置3，500 Da半透膜中透析純化，冷凍干燥。實(shí)施例19甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的制備
將實(shí)施例1的羧甲基殼聚糖納米粒均勻分散于水中，攪拌下將納米粒懸液緩慢加入實(shí)施例13的甘草酸醛溶液中，甘草酸醛與羧甲基殼聚糖納米粒的質(zhì)量比為4:1，室溫避光攪拌24 h。將NaBH4溶于水，逐滴加入上述反應(yīng)體系，NaBH4與甘草酸的摩爾比為1:1，室溫?cái)嚢?4 h。超聲后將產(chǎn)物置3，500 Da半透膜中透析純化，冷凍干燥。實(shí)施例20甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的制備
將實(shí)施例3的羧甲基殼聚糖納米粒均勻分散于水中，攪拌下將納米粒懸液緩慢加入實(shí)施例14的甘草酸醛溶液中，甘草酸醛與羧甲基殼聚糖納米粒的質(zhì)量比為0. 25:1，室溫避光攪拌12 h。將NaBH4溶于水，逐滴加入上述反應(yīng)體系，NaBH4與甘草酸的摩爾比為2:1，室溫?cái)嚢?6 h。超聲后將產(chǎn)物置3，500 Da半透膜中透析純化，冷凍干燥。實(shí)施例21甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的制備
將實(shí)施例6的羧甲基殼聚糖納米粒均勻分散于水中，攪拌下將納米粒懸液緩慢加入實(shí)施例15的甘草酸醛溶液中，甘草酸醛與羧甲基殼聚糖納米粒的質(zhì)量比為0. 25:1，室溫避光攪拌12 h。將NaBH4溶于水，逐滴加入上述反應(yīng)體系，NaBH4與甘草酸的摩爾比為4:1，室溫?cái)嚢?2 h。超聲后將產(chǎn)物置3，500 Da半透膜中透析純化，冷凍干燥。實(shí)施例22甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的制備
將實(shí)施例9的羧甲基殼聚糖納米粒均勻分散于水中，攪拌下將納米粒懸液緩慢加入實(shí)施例14的甘草酸醛溶液中，甘草酸醛與羧甲基殼聚糖納米粒的質(zhì)量比為0. 5:1，室溫避光攪拌36 h。將NaBH4溶于水，逐滴加入上述反應(yīng)體系，NaBH4與甘草酸的摩爾比為1:1，室溫?cái)嚢?2 h。超聲后將產(chǎn)物置3，500 Da半透膜中透析純化，冷凍干燥。實(shí)施例23甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的制備
將實(shí)施例12的羧甲基殼聚糖納米粒均勻分散于水中，攪拌下將納米粒懸液緩慢加入實(shí)施例15的甘草酸醛溶液中，甘草酸醛與羧甲基殼聚糖納米粒的質(zhì)量比為0.5:1，室溫避光攪拌36 h。將NaBH4溶于水，逐滴加入上述反應(yīng)體系，NaBH4與甘草酸的摩爾比為1:1，室溫?cái)嚢?6 h。超聲后將產(chǎn)物置3，500 Da半透膜中透析純化，冷凍干燥。實(shí)施例24載紫杉醇羧甲基殼聚糖納米粒的制備
將實(shí)施例1的羧甲基殼聚糖納米粒均勻分散于磷酸緩沖液(0.2 Μ,ρΗ 7. 4)，紫杉醇溶于無水乙醇，攪拌下將紫杉醇溶液滴加至甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒懸液中，紫杉醇和羧甲基殼聚糖納米粒的質(zhì)量比為1:5。室溫?cái)嚢? h，冰浴下脈沖式超聲儀超聲(輸出功率100 W，工作2 s，間歇2 s)，產(chǎn)物置3，500 Da半透膜中，透析純化。實(shí)施例25載紫杉醇甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的制備
將實(shí)施例17的甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒均勻分散于磷酸緩沖液(0. 2 Μ, pH 7. 4)，紫杉醇溶于無水乙醇，攪拌下將紫杉醇溶液滴加至甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒懸液中，紫杉醇和甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的質(zhì)量比為1:5。室溫?cái)嚢? h，冰浴下脈沖式超聲儀超聲(輸出功率100 W，工作2 s，間歇2 s)，產(chǎn)物置3，500 Da半透膜中，透析純化。實(shí)施例26載紫杉醇甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的制備
將實(shí)施例18的甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒均勻分散于磷酸緩沖液(0. 2 M, pH 7. 4)，紫杉醇溶于無水乙醇，攪拌下將紫杉醇溶液滴加至甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒懸液中，紫杉醇和甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的質(zhì)量比為1:5。室溫?cái)嚢? h，冰浴下脈沖式超聲儀超聲(輸出功率100 W，工作2 s，間歇2 s)，產(chǎn)物置3，500 Da半透膜中，透析純化。實(shí)施例27載紫杉醇甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的制備
將實(shí)施例19的甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒均勻分散于磷酸緩沖液(0. 2 M, pH 7. 4)，紫杉醇溶于無水乙醇，攪拌下將紫杉醇溶液滴加至甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒懸液中，紫杉醇和甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的質(zhì)量比為1:5。室溫?cái)嚢? h，冰浴下脈沖式超聲儀超聲(輸出功率100 W，工作2 s，間歇2 s)，產(chǎn)物置3，500 Da半透膜中，透析純化。實(shí)施例觀載紫杉醇甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的制備
將實(shí)施例20的甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒均勻分散于磷酸緩沖液(0. 2 Μ, pH 7. 4)，紫杉醇溶于無水乙腈，攪拌下將紫杉醇溶液滴加至甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒懸液中，紫杉醇和甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的質(zhì)量比為1:10。室溫?cái)嚢?.5 h，冰浴下脈沖式超聲儀超聲(輸出功率100 W，工作2 s，間歇2 s)，產(chǎn)物置3，500 Da半透膜中，透析純化。實(shí)施例四載紫杉醇甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的制備
將實(shí)施例21的甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒均勻分散于磷酸緩沖液(0. 2 M, pH 7. 4)，紫杉醇溶于無水丙酮，攪拌下將紫杉醇溶液滴加至甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒懸液中，紫杉醇和甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的質(zhì)量比為1:10。室溫?cái)嚢? h，冰浴下脈沖式超聲儀超聲(輸出功率100 W，工作2 s，間歇2 s)，產(chǎn)物置3，500 Da半透膜中，透析純化。實(shí)施例30載紫杉醇甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的制備
將實(shí)施例22的甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒均勻分散于磷酸緩沖液(0. 2 M, pH 7. 4)，紫杉醇溶于四氫呋喃，攪拌下將紫杉醇溶液滴加至甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒懸液中，紫杉醇和甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的質(zhì)量比為1:20。室溫?cái)嚢?.5 h，冰浴下脈沖式超聲儀超聲(輸出功率100 W，工作2 s，間歇2 s)，產(chǎn)物置3，500 Da半透膜中，透析純化。實(shí)施例31載紫杉醇甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的制備
將實(shí)施例23的甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒均勻分散于磷酸緩沖液(0. 2 M, pH 7. 4)，紫杉醇溶于N，N- 二甲基甲酰胺，攪拌下將紫杉醇溶液滴加至甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒懸液中，紫杉醇和甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的質(zhì)量比為1:20。室溫?cái)嚢? h，冰浴下脈沖式超聲儀超聲(輸出功率100 W，工作2 s，間歇2 s)，產(chǎn)物置3，500 Da半透膜中，透析純化。實(shí)施例32載阿霉素甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的制備
將實(shí)施例18的甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒均勻分散于磷酸緩沖液(0. 2 M, pH 7. 4)，阿霉素溶于無水乙醇，攪拌下將阿霉素溶液滴加至甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒懸液中，阿霉素和甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的質(zhì)量比為1:5。室溫?cái)嚢? h，冰浴下脈沖式超聲儀超聲(輸出功率100 W，工作2 s，間歇2 s)，產(chǎn)物置3，500 Da半透膜中，透析純化。實(shí)施例33載喜樹堿甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的制備
將實(shí)施例18的甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒均勻分散于磷酸緩沖液(0. 2 M, pH 7. 4)，喜樹堿溶于無水乙醇，攪拌下將喜樹堿溶液滴加至甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒懸液中，喜樹堿和甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的質(zhì)量比為1:5。室溫?cái)嚢? h，冰浴下脈沖式超聲儀超聲(輸出功率100 W，工作2 s，間歇2 s)，產(chǎn)物置3，500 Da半透膜中，透析純化。實(shí)施例34載5-氟尿嘧啶甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的制備將實(shí)施例18的甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒均勻分散于磷酸緩沖液(0. 2 M，pH 7. 4), 5-氟尿嘧啶溶于無水乙醇，攪拌下將5-氟尿嘧啶溶液滴加至甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒懸液中，喜樹堿和甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的質(zhì)量比為1:5。室溫?cái)嚢? h， 冰浴下脈沖式超聲儀超聲(輸出功率100 W，工作2 s，間歇2 s)，產(chǎn)物置3，500 Da半透膜中，透析純化。實(shí)施例35透射電鏡表征納米粒形態(tài)
將實(shí)施例1的羧甲基殼聚糖納米粒與實(shí)施例18的甘草酸修飾的羧甲基殼聚糖納米粒用適量水分散后滴加至載有碳膜的銅網(wǎng)上，室溫下晾干，透射電鏡觀察并拍照，見附圖1。由圖可見納米粒均呈呈核殼狀球形，分散均勻，大小均一。與羧甲基殼聚糖納米粒相比，甘草酸修飾后納米粒粒徑減小，表面親水層加厚。實(shí)施例36甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的粒徑、電勢(shì)
Zetasizer Nano電勢(shì)及粒度測(cè)定儀測(cè)定羧甲基殼聚糖納米粒(實(shí)施例1)與甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒(實(shí)施例17、18、19)的粒徑和Zeta電勢(shì)。粒徑測(cè)定參數(shù)=He-Ne激光 (波長(zhǎng)633nm)，散射角θ =90°，測(cè)定溫度23 ° C。Zeta電勢(shì)測(cè)定參數(shù)=He-Ne激光(波長(zhǎng) 653nm)，散射角θ =14°，測(cè)定溫度23 ° C。每份樣品平行測(cè)定3次。測(cè)定結(jié)果見表1。如表1所示，甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒電勢(shì)絕對(duì)值均大于25mV，表明納米粒較穩(wěn)定。納米粒的粒徑范圍為102-202 nm，體內(nèi)分布過程中可先被肝臟吞噬，易于通過病變部位的滲透性和滯留作用在腫瘤部位聚集。納米粒粒徑大小受甘草酸接枝率的影響。少量的甘草酸修飾使羧甲基殼聚糖納米粒粒徑增大，隨GL修飾量的提高，粒徑減小。實(shí)施例37載紫杉醇甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的粒徑、電勢(shì)、包封率及載藥量
粒徑、Zeta電勢(shì)
Zetasizer Nano電勢(shì)及粒度測(cè)定儀測(cè)定載紫杉醇羧甲基殼聚糖納米粒(實(shí)施例24)與載紫杉醇甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒(實(shí)施例25、26、27)的粒徑和Zeta電勢(shì)。粒徑測(cè)定參數(shù)=He-Ne激光(波長(zhǎng)633nm)，散射角θ =90°，測(cè)定溫度23 ° C。Zeta電勢(shì)測(cè)定參數(shù)He-Ne激光(波長(zhǎng)653nm)，散射角θ =14°，測(cè)定溫度23 ° C。每份樣品平行測(cè)定3 次。測(cè)定結(jié)果見表1。紫杉醇包封率和載藥量
層析用硅膠裝柱(6(Γ100目)，排盡氣泡。將載紫杉醇羧甲基殼聚糖納米粒(實(shí)施例24) 和載紫杉醇甘草酸修飾使羧甲基殼聚糖納米粒(實(shí)施例25、26、27)分別分散于水中制得納米粒懸液，各取0.5 mL上樣，以水洗脫，根據(jù)WXJ-9388型紫外檢測(cè)儀280 nm處顯示的峰值收集納米粒洗脫液，精確測(cè)量其體積。取適量納米粒洗脫液，用10倍體積甲醇溶解，渦旋2 min，12，000 rpm離心20 min，取上清液20 μ L過0. 45 μ m濾膜，高效液相色譜(HPLC)測(cè)定包載于納米粒中的紫杉醇濃度。再用乙醇與水混合溶劑梯度洗脫，同法收集游離紫杉醇洗脫液，精確測(cè)量其體積。HPLC測(cè)定游離紫杉醇濃度。按下式計(jì)算紫杉醇包封率 包封率(％)= AXIOO/ (A+B)，載藥量(％)= AXlOO/ ( A+C) 其中A為包載于納米粒中的紫杉醇含量(mg) ；B為存在于納米粒懸液中游離紫杉醇含量(mg) ；C為納米粒的質(zhì)量(mg)。如表1所示，與空白納米粒相比，載藥后各納米粒粒徑均略增加，Zeta電勢(shì)均無變化。經(jīng)GL表面修飾后，CMCNP對(duì)紫杉醇的包封率與載藥量顯著提高，且隨GL修飾度的增加而增加。 表1甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒和載紫杉醇甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的粒徑、電勢(shì)、包封率(n=3)
權(quán)利要求
1.一種肝腫瘤靶向性甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒，其特征在于是由親水性的羧甲基殼聚糖和疏水性的聚甲基丙烯酸烷基酯、聚丙烯酸烷基酯或聚氰基丙烯酸烷基酯接枝共聚形成的具有疏水內(nèi)核、親水外殼的核殼結(jié)構(gòu)納米粒，親水外殼的表面共價(jià)連接有甘草酸；其中，羧甲基殼聚糖與疏水性單體甲基丙烯酸烷基酯、丙烯酸烷基酯或氰基丙烯酸烷基酯的質(zhì)量體積比為1:0.251:4 g/ml，甘草酸基團(tuán)的含量為納米粒質(zhì)量的2 40%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米粒，其特征在于所述的羧甲基殼聚糖為氧取代羧甲基殼聚糖，分子量范圍為10，000 500，000 Da。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米粒，其特征在于所述的甲基丙烯酸烷基酯為甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丙酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸異丁酯和甲基丙烯酸己酯中的一種或一種以上；所述的丙烯酸烷基酯為丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸異丁酯、丙烯酸己酯中的一種或一種以上；所述的氰基丙烯酸烷基酯為氰基丙烯酸甲酯、氰基丙烯酸乙酯、氰基丙烯酸丙酯、氰基丙烯酸丁酯、氰基丙烯酸異丁酯、氰基丙烯酸己酯中的一種或一種以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的納米粒，其特征在于納米粒為球形，粒徑為10(Γ300nm0
5.一種如權(quán)利要求1一4之一所述的肝腫瘤靶向性甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的制備方法，其特征在于具體步驟如下(1)將羧甲基殼聚糖溶解于水中，加熱至3(Γ50V，加入疏水性的甲基丙烯酸烷基酯、 丙烯酸烷基酯或氰基丙烯酸烷基酯，攪拌，加入引發(fā)劑，升溫至7(T85 °C，反應(yīng)214 h，純化，冷凍干燥，得羧甲基殼聚糖納米粒；(2)將甘草酸溶解于pH8. (Γ10. 0的碳酸鹽緩沖液中，加入高碘酸鈉溶液，冰浴下避光攪拌6 12 h，得甘草酸氧化產(chǎn)物甘草酸醛溶液；(3)將步驟(1)的納米粒產(chǎn)物分散于水中，加入步驟(2)的甘草酸醛溶液中，室溫下避光攪拌12 36 h;加入硼氫化鈉水溶液，室溫下避光攪拌12 36 h;純化，冷凍干燥， 得甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒；其中，甘草酸醛與羧甲基殼聚糖納米粒的質(zhì)量比為 0.25:1 4:1 g/ml 。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述的引發(fā)劑為過硫酸銨或過硫酸鉀的一種，用量為反應(yīng)體系的0.0廣0. 2% g/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的納米粒的制備方法，其特征在于高碘酸鈉與甘草酸的摩爾比為1:廣4:1，硼氫化鈉與甘草酸醛的摩爾比為1:廣4:1。
8.一種肝腫瘤靶向性甘草酸修飾羧甲基殼聚糖載藥納米粒，其特征在于以權(quán)利要求廣4之一所述的納米粒為載體，包載疏水性藥物制成；其中，疏水性藥物與肝腫瘤靶向性甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒的質(zhì)量比為1:5 1:20。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的載藥納米粒，其特征在于所述疏水性藥物為抗癌藥物和分子探針中的一種或幾種的混合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的載藥納米粒，其特征在于所述抗癌藥物為紫杉醇、阿霉素、 表阿霉素、5-氟尿嘧啶、全反式維甲酸、喜樹堿中的一種或幾種的混合物；所述疏水性分子探針為熒光標(biāo)記物、放射性分子、磁性分子、溫度敏感型或PH敏感型分子。
11.一種如權(quán)利要求8-10之一所述的載藥納米粒的制備方法，其特征在于具體步驟如下將權(quán)利要求1一4之一所述的肝腫瘤靶向性甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒分散于pH 7. 4的磷酸緩沖液中，加入用有機(jī)溶劑溶解的疏水性藥物，室溫?cái)嚢?. 5^4 h，冰浴下脈沖式超聲，透析除去殘留有機(jī)溶劑，得載藥納米粒懸液。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的載藥納米粒的制備方法，其特征在于所述的有機(jī)溶劑為乙醇、乙腈、丙酮、四氫呋喃、N，N-二甲基甲酰胺中的一種。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的載藥納米粒的制備方法，其特征在于所述脈沖式超聲的條件為輸出功率100 W，工作2 S，間歇2 S。
全文摘要
本發(fā)明屬于納米材料技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種肝腫瘤靶向性甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的納米粒呈核殼型，以疏水性聚合物為內(nèi)核包載藥物，以羧甲基殼聚糖為親水外殼并共價(jià)連接肝靶向配體甘草酸。其制備方法為在引發(fā)劑作用下，羧甲基殼聚糖與疏水單體接枝共聚并自組裝形成納米粒；將甘草酸氧化得甘草酸醛溶液，按一定比例與納米?；旌弦氚邢蚧鶊F(tuán)，藥物通過超聲載入。與現(xiàn)有技術(shù)相比，其制備方法簡(jiǎn)單易控、重復(fù)性好，穩(wěn)定性和安全性較好，顯著增強(qiáng)抗腫瘤藥物的靶向性和抑瘤效果。該納米粒作為疏水性藥物或分子探針的靶向遞送載體，可用于肝臟疾病的治療及診斷。
文檔編號(hào)A61K9/14GK102357079SQ20111033352
公開日2012年2月22日 申請(qǐng)日期2011年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月28日
發(fā)明者印春華, 施麗麗 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)