專利名稱：一種雞艾美耳球蟲免疫調(diào)節(jié)型多價多表位dna疫苗的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生物獸藥技術(shù)領域，涉及ー種雞艾美耳球蟲免疫調(diào)節(jié)型多價多表位DNA疫苗。
背景技術(shù)：
雞球蟲病是ー種嚴重危害養(yǎng)雞業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的寄生原蟲病，毎年因此而導致的經(jīng)濟損失高達20億英鎊以上。隨著雞球蟲抗藥性和藥物殘留問題的日趨嚴重，人們期待用更理想的方法代替抗球蟲藥的使用。然而球蟲活疫苗的成功研制和應用提供了ー種可代替藥物控制雞球蟲病的技術(shù)手段，但卻存在成本高、難保存、散毒及潛在的致病威脅等缺點。因此隨著分子生物學和現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，DNA疫苗以其獨特的優(yōu)勢顯示出在未來畜禽疫病控制中的誘人前景，它與傳統(tǒng)疫苗相比，具有成本低、穩(wěn)定、便于貯藏和運輸、安全性高、在體內(nèi)維持時間長、制備簡單等優(yōu)點。國內(nèi)外ー些學者已經(jīng)構(gòu)建了一些雞球蟲DNA疫苗，但多集中在單價疫苗的研究上，關(guān)于多價DNA疫苗的研究未見報道。能夠感染雞的球蟲公認的有7種，危害較大的有4種，分別是柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)、毒害艾美耳球蟲(E. necatrix)、巨型艾美耳球蟲(E. maxima)和堆型艾美耳球蟲(E. acervulina),在臨床上,這4種球蟲多為混合感染，給養(yǎng)雞業(yè) 帶來了巨大的危害，因此，研制能夠同時抵抗4種球蟲混合感染的多價DNA疫苗顯得尤為重要。同時隨著分子生物學及免疫學技術(shù)的日益成熟，抗原分子表位的研究成了近年來新的發(fā)展趨勢。研究表明，T細胞免疫應答反應在抗球蟲免疫應答中處于核心地位，因而選擇雞球蟲能夠編碼集中的T細胞表位的多種基因片段串聯(lián)起來，將其構(gòu)建成球蟲多表位DNA疫苗，這樣既増加了 T細胞表位的濃度和密度，又增強了重組抗原的反應范圍。因此本試驗詣在構(gòu)建出抗球蟲混合感染的多價多表位DNA疫苗。IL-2是細胞介導免疫中的ー種重要的細胞因子，具有廣譜的免疫增強作用，它能促進CD4+T細胞和CD8+T細胞的分化増殖，維持T細胞生長，促進NK細胞和B細胞功能。許多研究表明，IL-2與球蟲基因聯(lián)合插入到DNA疫苗載體中所構(gòu)建的免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗，產(chǎn)生的免疫保護效果要明顯優(yōu)于單獨構(gòu)建的DNA疫苗。本發(fā)明運用DNAstar軟件，對E. tenella的TA4、5401、pEtK2和mic4抗原基因，E. necatrix 的 NA4 抗原基因，E. maxima 的 EMCDPK 抗原基因和 E. acervulina 的 LDH和 3-1E抗原基因的抗原表位進行分析，每個基因選取I到2段T細胞表位比較集中的序列進行動物保護試驗，篩選出免疫保護效果最好的抗原T細胞表位，并將這4種球蟲的T細胞表位同時克隆到同一 DNA疫苗載體pVAXl中，同時串聯(lián)具有免疫調(diào)節(jié)作用的chIL-2作為基因佐齊U，構(gòu)建出能夠抵抗4種球蟲混合感染的免疫調(diào)節(jié)型多價多表位DNA疫苗，并進行免疫保護性試驗，檢測其對臨床上危害最為嚴重的4種球蟲的抵抗力，以期為該疫苗在臨床上的應用提供參考。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠預防多種雞球蟲混合感染的免疫調(diào)節(jié)型多價多表位的DNA疫苗。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)一種雞艾美耳球蟲(Eimeria spp)多價多表位DNA疫苗，該疫苗包含其中插入T 細胞表位集中的 4 個基因片段NA4-1 (E. necatrix)、TA4-1 (E. tenella)、EMCDPK-1 (Ε·maxima)以及 LDH-2 (E. acervulina)，NA4-1、TA4-1、LDH-2、EMCDPK_1 核苷酸序列分別為 SEQID NO.1的第1-312個喊基，第319-645個喊基，第652-984個喊基，第991-1299個喊基。所述的4個基因片段NA4-1、TA4-1、EMCDPK-1和LDH-2通過連接成融合基因NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1的形式插入真核表達載體中，該融合基因NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1 序列如 SEQ ID NO. 40 所示。一種雞艾美耳球蟲多價多表位DNA疫苗，包含真核表達載體以及其中插入的T細胞表位集中的4個基因片段序列為SEQ ID NO.1的第1-312個堿基所示的NA4-1、序列為SEQ ID NO.1的第319-645個堿基所示的TA4-1、序列為SEQ ID NO.1的第652-984個堿基所示的LDH-2以及序列為SEQ ID NO.1的第991-1299個堿基所示的EMCDPK-1 ;以及序列為SEQ ID NO.1的第1309-1740個堿基所示的雞白介素_2基因chIL_2。所述的NA4-1、TA4-1、EMCDPK-1、LDH-2 和 chIL_2 連接在一起形成序列為 SEQ IDNO.1所示的的融合基因NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-1L-2，插入到真核表達載體pVAXl中組成免疫調(diào)節(jié)型多價多表位DNA疫苗pV AXl-NA4-l-TA4-l-LDH-2-EMCDPK-l-1L-2，質(zhì)粒譜圖見圖1。該DNA疫苗可以在制備預防和/或治療雞球蟲病的藥物制劑中的應用。本發(fā)明建立在本實驗室下列發(fā)現(xiàn)之上含有E. tenella、E. necatrix、Ε· maxima子孢子階段抗原基因TA4、NA4、EMCDPK和在E. acervulina不同發(fā)育階段(卵囊，子孢子，裂殖體，裂殖子)均有表達的抗原基因LDH的真核質(zhì)粒載體能夠為雞提供針對艾美耳球蟲的有效免疫保護；將chIL-2基因與球蟲保護性基因一起引入真核質(zhì)粒，能夠進一步增強所述球蟲保護基因的免疫保護效果。生產(chǎn)本發(fā)明雞艾美耳球蟲免疫調(diào)節(jié)型多價多表位DNA疫苗的方法，簡而言之，其技術(shù)路線如下1.多價多表位DNA疫苗的4種雞球蟲候選多表位基因片段的篩選運用DNAstar軟件對E. tenella的TA4(李祥瑞.用于預防雞球蟲病的免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗.中華人民共和國發(fā)明專利，專利號ZL 200510124048. 4)、5401(黃欣梅.雞柔嫩艾美耳球蟲免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗pVAXl.O-5401-1FN-Y的研究.南京農(nóng)業(yè)大學碩士論文，2006)、pEtK2 (謝昆等.柔嫩艾美球蟲pEtK2抗原基因的克隆表達及其表達產(chǎn)物的抗原性分析.中國獸醫(yī)科學，2007，37 (03) =200-204)和mic4(陳益.雞柔嫩艾美耳球蟲免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗pcDNA-1L-2-mic4的研究.南京農(nóng)業(yè)大學碩士論文，2005)抗原基因，E. necatrix的NA4 (李祥瑞等.預防雞毒害艾美耳球蟲的免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗.中華人民共和國發(fā)明專利，專利號ZL200810155080. 2)抗原基因，E. maxima 的 EMCDPK(Mohammed Ali A. Shah. Researchon the Mult1-epitopes DNA Vaccines against Chicken Coccidiosis.南京農(nóng)業(yè)大學博士學位論文，2010)抗原基因和E. acervulina的LDH(宋鴻雁.堆型艾美耳球蟲乳酸脫氫酶DNA疫苗免疫保護作用及免疫機理研究.南京農(nóng)業(yè)大學博士學位論文，2010)和3-1E (周婷婷.五種雞堆型艾美耳球蟲DNA疫苗免疫保護效果比較.南京農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文，2008)抗原基因的抗原表位進行分析，每個基因選取I到2段T細胞表位比較集中的序列通過動物保護試驗，篩選出免疫保護效果最好的抗原T細胞表位NA4-1 (E. necatrix)、TA4-1 (E. tenella)、EMCDPK-1 (E. maxima)以及 LDH-2 (e. acervulina)。2.免疫調(diào)節(jié)型多價多表位 DNA 疫苗 pVAXl-TA4-l-NA4-l-LDH-2-EMCDPK-l-1L-2 的構(gòu)建。3.免疫調(diào)節(jié)型多價多表位 DNA 疫苗 p VAX1-TA4-1-NA4-1-LDH-2-EMCDPK-1 -1L-2 在雞體內(nèi)轉(zhuǎn)錄與翻譯情況檢測4.免疫調(diào)節(jié)型多價多表位 DNA 疫苗 pVAXl-TA4-l-NA4-l-LDH-2-EMCDPK-l-1L-2 的免疫保護性檢測本發(fā)明具有以下優(yōu)點和效果1.該疫苗是DNA疫苗，與傳統(tǒng)疫苗相比，具有安全性高、在體內(nèi)維持時間長、制備簡單、熱穩(wěn)定性良好、便于貯藏和運輸、使用省時省力等優(yōu)點。2.雞球蟲臨床上多為混合感染，本發(fā)明兩種疫苗均包含危害嚴重的4種球蟲的抗原基因片段，能夠抵抗4種球蟲的混合感染。3. T細胞免疫應答反應在球蟲免疫應答中處于核心地位。本發(fā)明兩種疫苗所選用的4個基因，都編碼集中的T細胞表位，特異性地誘導T細胞免疫應答反應；通過選擇最佳和最具免疫保護潛カ的T細胞表位誘生特異性免疫應答，能盡量減少無關(guān)、干擾和抑制序列可能產(chǎn)生的負面影響；4個片段串聯(lián)以增加表位濃度和密度，增強重組抗原的反應范圍。4.雞感染球蟲后會產(chǎn)生多種細胞因子，包括chIL-2。它能促進⑶4+T細胞和⑶8+T細胞的分化増殖，維持T細胞生長，促進NK細胞和B細胞功能。DNA疫苗pVAXl_TA4-l_NA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-1L-2含有chIL_2基因，增強了該疫苗的免疫保護效果。試驗證明，該疫苗在抗球蟲感染中，不僅能夠抵抗4種球蟲的混合感染，而且具有良好的免疫保護效果。


圖1 為 DNA 疫苗 pVAXl-TA4-l-NA4-l-LDH-2-EMCDPK-l-1L-2 的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為利用DNAstar對候選抗原基因的抗原表位分析結(jié)果。圖 3 為 pVAXl-NA4-l-TA4-l-LDH-2-EMCDPK-l-1L-2 的 RT-PCR 檢測圖，M DNA 分子量標準物 DL2000 ;1_5 分別為 NA4-1 (326bp)、TA4-1 (343bp)、LDH-2 (349bp)、EMCDPK-1 (329bp)、chIL-2 (432bp)的檢測；6 :空白對照。圖4為以大鼠抗NA4重組蛋白多克隆抗體對pVAXl-NA4-l-TA4-l-LDH-2_EMCDPK-1-1L-2進行Western-blot檢測結(jié)果圖，M :蛋白Marker，1:注射部位(腿肌)裂解上清；2 :非注射部位肌肉(胸部)裂解上清。圖5為以大鼠抗TA4重組蛋白多克隆抗體對pVAXl-NA4-l-TA4-l-LDH-2-EMCDPK-1-1L-2進行Western-blot檢測結(jié)果圖；M :蛋白Marker，1:注射部位(腿肌)裂解上清；2 :非注射部位肌肉(胸部)裂解上清。
圖6為以大鼠抗LDH重組蛋白多克隆抗體對pVAXl-NA4-l-TA4-l-LDH-2_EMCDPK-1-1L-2進行Western-blot檢測結(jié)果圖；M :蛋白Marker，1:注射部位(腿肌)裂解上清；2 :非注射部位肌肉(胸部)裂解上清。
具體實施例方式基礎材料1.孢子化卵囊江蘇株柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊，每3個月經(jīng)雞體復壯并孢子化，孢子化率在80%以上(索勛，李國清.雞球蟲病學[M].北京中國農(nóng)業(yè)大學出版社，1998.)。2.實驗動物0齡的小公雛購自南京青龍山雞場，自出殼至實驗結(jié)束時飼養(yǎng)在嚴格消毒，無球蟲的環(huán)境中，自由采食和飲水。3.質(zhì)粒與菌種宿主菌E. coli DH5a、BL21、質(zhì)粒pMD18-T_mic4(陳益·雞柔嫩艾美耳球蟲免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗pcDNA-1L-2-mic4的研究.南京農(nóng)業(yè)大學碩士論文，2005)pET-28a(+)-NA4(李祥瑞等.預防雞毒害艾美耳球蟲的免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗.中華人民共和國發(fā)明專利，專利號ZL 200810155080. 2)、pcDNA-TA4-Xa-chIL_2 (ZL 200510124048. 4實施例 3)、pET-28a(+)-TA4(即專利號ZL 200510124048. 4 實施例 4 中的 pET_TA4)、pET-28a(+)-LDH (宋鴻雁.堆型艾美耳球蟲乳酸脫氫酶DNA疫苗免疫保護作用及免疫機理研究.南京農(nóng)業(yè)大學博士學位論文，2010)，pMD18-T-pEtK2 (謝昆.柔嫩艾美耳球蟲免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗pEtK2-1L-2的研究.南京農(nóng)業(yè)大學碩士論文，2004)和pMD18-T_5401 (黃欣梅.雞柔嫩艾美耳球蟲免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗PVAX1.0-5401-1FN-Y的研究.南京農(nóng)業(yè)大學碩士論文， 2006)，pMD18-T-3E-l (周婷婷.五種雞堆型艾美耳球蟲DNA疫苗免疫保護效果比較·南京農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文，2008)、pMD18-T-EMCDPK (Mohammed Ali A. Shah. Researchon the Mult1-epitopes DNA Vaccines agamst ChickenCoccidiosis.南京農(nóng)業(yè)大學博士學位論文，2010)真核表達載體pVAXl (Invitrogen公司)。4.工具酶與試劑Trizol試劑為Promega公司產(chǎn)品；DEPC為Amresco公司產(chǎn)品；β -巰基乙醇為Fluka公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄酶AMV、01igo(dT) 18、rTaq酶、dNTP、DNA分子量標準物DL2000、T4DNA Ligase、限制性內(nèi)切酶，水飽和酚、瓊脂糖膠回收試劑盒均為大連寶生物(TaKaRa)工程有限公司產(chǎn)品；其余試劑為國產(chǎn)分析純。5.主要儀器設備冷凍臺式離心機(Eppendorf centrifuge 5417R);紫外可見分光光度計(Bio-Rad) ;PCR儀(HYBAID公司)；空氣浴搖床(THZ，江蘇太倉市實驗設備廠)；紫外分析儀(WD-9304C型，北京市六一儀器廠)；電泳儀(DYY-11B，北京市六一儀器廠)。實施例1.多價多表位DNA疫苗的4種雞球蟲候選多表位基因片段的篩選I多價多表位DNA疫苗候選抗原基因的抗原表位分析利用DNAstai^fE. tenella的4個抗原基因TA4(李祥瑞.用于預防雞球蟲病的免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗.中華人民共和國發(fā)明專利，專利號ZL 200510124048. 4，SEQN0.1中的第1-648個核苷酸)、mic4(陳益.雞柔嫩艾美耳球蟲免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗pcDNA-1L-2-mic4的研究.南京農(nóng)業(yè)大學碩士論文，2005)、pEtK2 (謝昆.柔嫩艾美耳球蟲免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗pEtK2-1L-2的研究.南京農(nóng)業(yè)大學碩士論文，2004)和5401(黃欣梅.雞柔嫩艾美耳球蟲免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗pVAXl. 0-5401-1FN- Y的研究.南京農(nóng)業(yè)大學碩士論文，2006)，E. necatrix的NA4 (李祥瑞等.預防雞毒害艾美耳球蟲的免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗.中華人民共和國發(fā)明專利，專利號ZL200810155080. 2)，E. acervulina的LDH(宋鴻雁·堆型艾美耳球蟲乳酸脫氫酶DNA疫苗免疫保護作用及免疫機理研究.南京農(nóng)業(yè)大學博士學位論文，2010)和3E-1 (周婷婷.五種雞堆型艾美耳球蟲DNA疫苗免疫保護效果比較.南京農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文，2008)以及 E. maxima 的 EMCDPK (Mohammed Ali A. Shah. Research on theMult1-epitopes DNA Vaccines against Chicken Coccidiosis.南京農(nóng)業(yè)大學博士學位論文，2010)基因序列進行抗原表位分析，各確定1-2段T細胞表位比較集中的序列(見圖2)，TA4基因中T細胞表位比較集中的序列為TA4-1 (TA4基因的第40-366個核苷酸)，mic4基因中T細胞表位比較集中的序列為mic4-l (mic4基因的第109-387個核苷酸)和mic4_2 (mic4基因的第487-771個核苷酸)，pEtK2基因中T細胞表位比較集中的序列為pEtK2_l (pEtK2基因的第43-450個核苷酸)和pEtK2-2 (pEtK2基因的第508-954個核苷酸)，5401基因中T細胞表位比較集中的序列為5401-1(5401基因的第463-852個核苷酸)，NA4基因中T細胞表位比較集中的序列為NA4-1 (NA4基因的第61-369個核苷酸)和NA4-2 (NA4基因的第343-681個核苷酸)，LDH基因中T細胞表位比較集中的序列為LDH-1 (LDH基因的第52-366個核苷酸)和LDH-2(LDH基因的第385-717個核苷酸)，3E_1基因中T細胞表位比較集中的序列為3E-1-K3E-1基因的第34-243個核苷酸)和3E_1_2(3E_1基因的第268-501個核苷酸)，EMCDPK基因中T細胞表位比較集中的序列為EMCDPK-1 (EMCDPK基因的第325-633個核苷酸)和EMCDPK-2 (EMCDPK基因的第886-1206個核苷酸)。 選擇參數(shù)為I)Hydropathy-Hopp-Woods-通過計算蛋白質(zhì)序列上的最大局部親水性尋找蛋白質(zhì)的抗原決定簇。2) Antigenicity-AMPH1-根據(jù)序列預測免疫優(yōu)勢輔助性T淋巴細胞抗原位點。3) Antigenicity-Rothbard-Taylor-預測含有特定基序(motif)的潛在了淋巴細胞抗原決定簇。4) Antigenicity-Jameson-Wolf-通過聯(lián)合現(xiàn)有的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測方法預測潛在的蛋白質(zhì)抗原決定族。2多價多表位DNA疫苗的4種雞球蟲候選多表位基因片段的篩選2. 14種雞球蟲候選多表位基因片段的克隆與DNA疫苗的構(gòu)建根據(jù)所選定的序列，利用軟件primer premier5. O設計以下14對特異性引物，由Invitrogen公司合成,引物序列及擴增模板見表I。表I用于克隆候選多表位基因片段的引物序列及擴增模板
權(quán)利要求
1.一種雞艾美耳球蟲多價多表位DNA疫苗，其特征在于該疫苗包含真核表達載體以及其中插入的T細胞表位集中的4個基因片段序列為SEQ ID NO.1的第1-312個堿基所示的NA4-1、序列為SEQ ID NO.1的第319-645個堿基所示的TA4-1、序列為SEQ ID NO.1 的第652-984個堿基所示的LDH-2以及序列為SEQID NO.1的第991-1299個堿基所示的 EMCDPK-1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA疫苗，其特征在于所述的4個基因片段NA4-1、TA4-1、 EMCDPK-1和LDH-2通過連接成融合基因NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1的形式插入真核表達載體中，該融合基因NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1序列如SEQ ID NO. 40所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA疫苗，其特征在于所述的真核表達載體為pVAXl。
4.權(quán)利要求1 3中任一項所述的DNA疫苗在制備預防雞球蟲病的藥物中的用途。
5.一種雞艾美耳球蟲多價多表位DNA疫苗，其特征在于該疫苗包含真核表達載體以及其中插入的T細胞表位集中的4個基因片段序列為SEQ ID NO.1的第1-312個堿基所示的NA4-1、序列為SEQ ID NO.1的第319-645個堿基所示的TA4-1、序列為SEQ ID NO.1 的第652-984個堿基所示的LDH-2以及序列為SEQID NO.1的第991-1299個堿基所示的EMCDPK-1 ；以及序列為SEQ ID NO.1的第1309-1740個堿基所示的雞白介素_2基因 chIL_2ο
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的DNA疫苗，其特征在于所述的NA4-1、TA4-1、 EMCDPK-1、LDH-2和chIL-2連接在一起形成序列為SEQ ID NO.1所示的的融合基因 NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1 -1L-2,插入到真核表達載體pVAXl中組成免疫調(diào)節(jié)型多價多表位 DNA 疫苗 pVAXl-NA4-l-TA4-l-LDH-2-EMCDPK-l-1L-2。
7.權(quán)利要求5 6中任一項所述的DNA疫苗在制備預防和/或治療雞球蟲病的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物獸藥技術(shù)領域，公開一種雞艾美耳球蟲免疫調(diào)節(jié)型多價多表位DNA疫苗。一種雞艾美耳球蟲多價多表位DNA疫苗，包含真核表達載體以及其中插入的T細胞表位集中的4個基因片段序列為SEQ ID NO.1的第1-312個堿基所示的NA4-1、序列為SEQ ID NO.1的第319-645個堿基所示的TA4-1、序列為SEQ ID NO.1的第652-984個堿基所示的LDH-2以及序列為SEQ ID NO.1的第991-1299個堿基所示的EMCDPK-1；以及序列為SEQ ID NO.1的第1309-1740個堿基所示的雞白介素-2基因chIL-2。該疫苗在抗球蟲感染中，不僅能夠抵抗4種球蟲的混合感染，而且具有良好的免疫保護效果。
文檔編號A61K39/012GK103028111SQ20111030730
公開日2013年4月10日 申請日期2011年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月10日
發(fā)明者李祥瑞, 宋小凱, 嚴若峰, 徐立新, 任喆 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學