專利名稱：Cyclin D/CDK4來源的具有抗腫瘤活性的嵌合多肽以及作為抗腫瘤藥物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤多肽，尤其是涉及一種Cyclin D/⑶K4來源的具有抗腫瘤活性的嵌合多肽，本發(fā)明還涉及該嵌合多肽作為抗腫瘤藥物的用途。
背景技術(shù)：
腫瘤的發(fā)生，實質(zhì)上是一種細(xì)胞周期調(diào)控上的失衡，致使細(xì)胞呈現(xiàn)出失控樣生長， 這個過程產(chǎn)生的生長因子、激素、各種蛋白以及遺傳物質(zhì)DNA的代謝，都是通過細(xì)胞周期來實現(xiàn)和調(diào)控的。細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的基因在腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性方面起著決定性的作用。細(xì)胞周期蛋白(cyclin)、周期蛋白依賴性激酶(CDK)和周期蛋白依賴性激酶抑制物 (CKI)通過正負(fù)調(diào)控控制著整個細(xì)胞周期的正常運轉(zhuǎn)。cyclin和⑶K過表達和活性異常增強，CKI表達缺失和檢測點異常都可能導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂而發(fā)生癌變。cyclin D是G1/S期轉(zhuǎn)換的重要正性調(diào)控因子，⑶K4，即細(xì)胞周期素D依賴性激酶 4，是細(xì)胞周期Gl期重要的調(diào)控分子。⑶K4蛋白能夠特異性地與cyclin D結(jié)合形成復(fù)合物。cyclin D/⑶K4復(fù)合物可以使Rb蛋白的絲氨酸或蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化。已經(jīng)證實 cyclinDl是一種原癌基因，其基因結(jié)構(gòu)和功能異常與多種腫瘤(如乳腺癌、食管癌、宮頸癌、 肺癌、卵巢癌、黑色素瘤等)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。cyclin D2在胃癌、結(jié)直腸癌、骨肉癌、慢性B細(xì)胞淋巴細(xì)胞白血病等腫瘤中發(fā)現(xiàn)有異常表達。cyclin D3幾乎在所有增生細(xì)胞中都有表達，并且在3種D型cyclin蛋白是表達最廣泛的一種。在胃癌、膀胱尿路上皮細(xì)胞癌、 非霍奇金淋巴瘤等腫瘤中發(fā)現(xiàn)有高表達。近來，蛋白一蛋白相互作用的特異性使得針對cyclin/⑶K蛋白復(fù)合物結(jié)合區(qū)域的多肽片段成為新的高度選擇性藥物的來源。有關(guān)cyclin/CDK晶體結(jié)構(gòu)的研究也很多，可以通過對晶體結(jié)構(gòu)的研究來判定結(jié)合部位，研究者們開創(chuàng)了一種新的設(shè)計CDK抑制劑的方法，即設(shè)計出抑制復(fù)合物相互結(jié)合的抗腫瘤活性肽。但是許多腫瘤靶向的配基如多肽、抗體雖能靶向腫瘤組織或細(xì)胞，減少毒副作用，但卻缺乏穿透細(xì)胞膜的能力。目前介導(dǎo)生物大/ 小分子穿透細(xì)胞的方法主要是利用細(xì)胞穿膜肽(cell-penetrating peptides, CPP)作為載體。經(jīng)典的穿模肽HIV-Tat來源的PTD4的穿膜效率比HIV-Tat要高出許多，且多肽序列容易合成。PTD4與目的肽中間以Gly連接得到嵌合多肽，Gly連接兩條多肽即可保持兩條肽段的柔性，又不改變兩條肽段原有的二級結(jié)構(gòu)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種CyclinD/⑶K4來源的具有抗腫瘤活性的嵌合多肽， 本發(fā)明還提供該多肽作為抗腫瘤藥物的用途。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案
本發(fā)明所述的Cyclin D/CDK4來源的具有抗腫瘤活性的嵌合多肽，是基于Cyclin D/ ⑶K4復(fù)合物的多肽與載體穿模肽PTD4連接而成的PTD4-D1 α 5活性肽、PTD4-D3 α 5活性肽和PTD4-CDK4 α C活性肽。所述cyclin Dl來源的PTD4-D1 α 5活性肽的氨基酸序列為Tyr-Ala-Arg-Ala_A Ia-Ala-Arg-Gln-Ala-Arg-Ala-Gly-Arg-Pro-Glu-Glu-Leu-Leu-Gln-Met-Glu-Leu-Leu-Le U-Val-Asn-Lys0所述cyclin D3來源的PTD4-D3 α 5活性肽的氨基酸序列為Tyr-Ala-Arg-Ala_A Ia-Ala-Arg-Gln-Ala-Arg-Ala-Gly-Ala-Val-Ser-Pro-Arg-Gln-Leu-Arg-Asp-Trp-Glu-Va I-Leu-Val-Leu-Gly-Lys。所述CDK4來源的PTD4-CDK4 α C活性肽的氨基酸序列為Tyr-Ala-Arg-Ala_Ala-Ala-Arg-Gln-Ala-Arg-Ala-Gly-Leu-Pro-Ile-Ser-Thr-Val-Arg-Glu-Val-Ala-Leu-Leu-A rg-Arg-Leu-Glu—Ala—Phe。本發(fā)明的嵌合多肽作為抗腫瘤藥物的用途。本發(fā)明的優(yōu)點在于首次利用cyclin Dl/⑶K4、cyclin D3/⑶K4晶體結(jié)構(gòu)設(shè)計三條具有抗腫瘤活性的多肽一PTD4-D1 α 5活性肽、PTD4-D3 α 5活性肽和PTD4-⑶Κ4 α C活性肽，將PTD4-D1 α 5活性肽、PTD4-D3 α 5活性肽和PTD4-⑶Κ4 α C活性肽通過柔性連接子Gly 與穿模肽PTD4連接起來，固相合成目的肽，使得目標(biāo)肽能夠進入細(xì)胞與目標(biāo)蛋白復(fù)合物結(jié)合，有效抑制了腫瘤細(xì)胞的生長。為基于Cyclin D/CDK4復(fù)合物結(jié)合特性的多肽抑制劑作為一種新型抗腫瘤藥物提供新的思路。


圖1是PTD4肽質(zhì)譜鑒定圖。
圖2是Dl肽質(zhì)譜鑒定圖。
圖3是PTD4- Dl肽質(zhì)譜鑒定圖。
圖4是D3肽質(zhì)譜鑒定圖。
圖5是PTD4- D3肽質(zhì)譜鑒定圖。
圖6是⑶K4肽質(zhì)譜鑒定圖。
圖7是PTD4- CDK4肽質(zhì)譜鑒定圖。
圖8是本發(fā)明肽對EC-9706食管癌細(xì)胞的殺傷率。
圖9是本發(fā)明肽對MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的殺傷率。
圖10是本發(fā)明肽對H22鼠源肝癌細(xì)胞的殺傷率。
圖11是H22小鼠腫瘤體積的變化圖。
圖12是H22小鼠腫瘤瘤重的變化圖。
圖13是本發(fā)明多肽藥物對H22昆明小鼠移植瘤的抑瘤率。
具體實施例方式本發(fā)明所述的Cyclin D/⑶Κ4來源的具有抗腫瘤活性的嵌合多肽，是基于Cyclin D/⑶Κ4復(fù)合物的多肽與載體穿模肽PTD4連接而成的PTD4-D1 α 5活性肽、PTD4-D3 α 5活性肽和PTD4-CDK4 α C活性肽。所述cyclin Dl來源的PTD4-D1 α 5活性肽的氨基酸序列為Tyr-Ala-Arg-Ala_A Ia-Ala-Arg-Gln-Ala-Arg-Ala-Gly-Arg-Pro-Glu-Glu-Leu-Leu-Gln-Met-Glu-Leu-Leu-LeU-Val-Asn-Lys0所述cyclin D3來源的PTD4-D3 α 5活性肽的氨基酸序列為Tyr-Ala-Arg-Ala_A Ia-Ala-Arg-Gln-Ala-Arg-Ala-Gly-Ala-Val-Ser-Pro-Arg-Gln-Leu-Arg-Asp-Trp-Glu-Va I-Leu-Val-Leu-Gly-Lys0所述CDK4來源的PTD4-CDK4 α C活性肽的氨基酸序列為Tyr-Ala-Arg-Ala_Ala-Ala-Arg-Gln-Ala-Arg-Ala-Gly-Leu-Pro-Ile-Ser-Thr-Val-Arg-Glu-Val-Ala-Leu-Leu-A rg-Arg-Leu-Glu—Ala-Phe。本發(fā)明所涉及的實驗方法和結(jié)果如下
1、本發(fā)明所述的PTD4-D1 α 5活性肽、PTD4-D3 α 5活性肽和PTD4-CDK4 α C活性肽采用 Fomc固相有機合成法進行合成。首先通過樹脂與目的多肽的第一位帶保護基的氨基酸在一定條件下進行縮合，隨后脫掉保護基，加入第二個氨基酸進行縮合。重復(fù)以上步驟，直到加入最后一個氨基酸，脫掉其保護基后，利用切割試劑把多肽從樹脂上切下得到粗肽。經(jīng)過脫鹽處理，RP-HPLC分析純化，其純度大于95%，得到精肽。ESI-MS質(zhì)譜分析并證實其分子量符合理論值。本發(fā)明cyclin D/CDK4相關(guān)多肽序列及分子量見表1，本發(fā)明相關(guān)多肽的質(zhì)譜鑒定結(jié)果見圖1-圖7。
權(quán)利要求
1.一種Cyclin D/CDK4來源的具有抗腫瘤活性的嵌合多肽，其特征在于所述嵌合多肽是基于Cyclin D/⑶K4復(fù)合物的多肽與載體穿模肽PTD4連接而成的PTD4-D1 α 5活性肽、 PTD4-D3 α 5活性肽和PTD4-CDK4 α C活性肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CyclinD/CDK4來源的具有抗腫瘤活性的嵌合多肽，其特征在于所述cyclin Dl來源的PTD4-D1 α 5活性肽的氨基酸序列為Tyr-Ala-Arg-Ala_Ala-Ala-Arg-Gln-Ala-Arg-Ala-Gly-Arg-Pro-Glu-Glu-Leu-Leu-Gln-Met-Glu-Leu-Leu-Leu-V al—Asn—Lys。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CyclinD/CDK4來源的具有抗腫瘤活性的嵌合多肽，其特征在于所述cyclin D3來源的PTD4-D3 α 5活性肽的氨基酸序列為Tyr-Ala-Arg-Ala_Ala-Ala-Arg-Gln-Ala-Arg-Ala-Gly-Ala-Val-Ser-Pro-Arg-Gln-Leu-Arg-Asp-Trp-Glu-Val-L eu-Val-Leu-Gly-Lys。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CyclinD/CDK4來源的具有抗腫瘤活性的嵌合多肽，其特征在于所述CDK4來源的PTD4-CDK4 α C活性肽的氨基酸序列為Tyr-Ala-Arg-Ala-Ala_Ala -Arg-Gln-Ala-Arg-Ala-Gly-Leu-Pro-Ile-Ser-Thr-Val-Arg-Glu-Val-Ala-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Glu—Ala-Phe。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合多肽作為抗腫瘤藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種Cyclin D/CDK4來源的具有抗腫瘤活性的嵌合多肽，是基于Cyclin D/CDK4復(fù)合物的多肽與載體穿模肽PTD4連接而成的PTD4-D1α5活性肽、PTD4-D3α5活性肽和PTD4-CDK4αC活性肽。cyclin D1來源肽PTD4-D1α5序列為YARAAARQARAGSIRPEELLQMELLLVNK；cyclin D3來源肽PTD4-D3α5序列為YARAAARQARAGAVSPRQLRDWEVLVLGK；CDK4來源肽PTD4-CDK4αC序列為YARAAARQARAGLPISTVREVALLRRLEAF。本發(fā)明是根據(jù)cyclin D1/CDK4、cyclin D3/CDK4的一級結(jié)構(gòu)和晶體結(jié)構(gòu)設(shè)計得到，通過MTT細(xì)胞增殖實驗和體內(nèi)荷瘤實驗驗證這些多肽的抗腫瘤活性?；赾yclin D/CDK復(fù)合物的多肽抑制劑將為新型抗腫瘤藥物的研發(fā)提供新的思路。
文檔編號A61K38/10GK102321181SQ201110277779
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月19日
發(fā)明者王海麗, 祁元明, 陳艷平, 高艷鋒 申請人:鄭州大學(xué)