專利名稱：豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒病與豬偽狂犬病三聯(lián)滅活疫苗以及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動物多價(jià)滅活疫苗及其制備方法，特別是指一種豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒病與豬偽狂犬病的三聯(lián)滅活疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合征(Poreiner印roduetive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的一種以妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖 障礙以及仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征的高度接觸性傳染病。1996年從我國PRRS血清陽性豬群中分離到PRRSV，從而證實(shí)我國也有此病的流行，我國也將其列為二類傳染病。由于PRRS具有高度的傳染性，既能垂直傳播又能水平傳播，導(dǎo)致該病在世界各養(yǎng)豬國家蔓延，各國學(xué)者在疫苗研制方面都作了大量的工作。偽狂犬病(Pseudorables、PR)是由PRV引起多種家畜和野生動物的一種急性傳染病。豬是PRV的儲存宿主，對其危害大，可致妊娠母豬流產(chǎn)、死產(chǎn)、木乃伊胎；成年豬常呈隱性感染，但病毒可長期存在；初生仔豬則引起神經(jīng)癥狀，出現(xiàn)運(yùn)動失調(diào)、麻痹、衰竭死亡，病死率幾乎達(dá)100%。PRV對環(huán)境的抵抗力較強(qiáng)。病毒在pH4-9之間保持穩(wěn)定。PRV只有一個(gè)血清型，這為其疫苗制造帶來了便利。PRV能在多種組織細(xì)胞內(nèi)增殖，但表現(xiàn)的敏感度不同。豬圓環(huán)病毒病是由豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus, PCV)引起豬的一種多系統(tǒng)功能障礙性疾病，豬圓環(huán)病毒屬于圓環(huán)病毒科，是迄今發(fā)現(xiàn)的一種最小的動物病毒。根據(jù)豬圓環(huán)病毒的致病性以及基因組差異又可將其分為無致病性(或PK15源性)的豬圓環(huán)病毒I型(PCV-I)和有致病性(PMWS源性)的豬圓環(huán)病毒II型(PCV-2)。PCV-2除了引發(fā)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)夕卜，還與豬皮炎與腎病綜合征(porcinedermatitis and nephropathy syndrome, F1DNS)、新生仔豬先天性腦震顫(Congenital tremors, CT)、增生性壞死性肺炎(proliferative andnecrotizingpneumonia, PNP)以及懷孕母豬的繁殖障礙(reproductive disorders)等病的發(fā)生有關(guān)。豬繁殖與呼吸綜合征-豬圓環(huán)病毒病-豬偽狂犬病對養(yǎng)豬業(yè)危害十分嚴(yán)重，目前也有相應(yīng)的單項(xiàng)疫苗和相應(yīng)的二聯(lián)滅活疫苗如豬圓環(huán)病毒病和繁殖與呼吸綜合征二聯(lián)滅活疫苗對此三種病的預(yù)防起到一定作用，但需要分別多次注射，動物應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)，使用不方便，防疫成本高。而多價(jià)疫苗雖然使用方便，但由于多價(jià)疫苗的抗原之間往往會相互干擾，因此，制備和應(yīng)用多價(jià)疫苗或聯(lián)合疫苗，必須首先保證其中各個(gè)免疫成分之間不發(fā)生免疫干擾現(xiàn)象，也就是不降低各該免疫成分的免疫效能。而在病毒多價(jià)疫苗中，干擾現(xiàn)象更為突出。因此，市場上一直缺少PRRSV、PRV以及PCV2三種病毒的多價(jià)疫苗
發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種三價(jià)滅活疫苗，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型以及豬偽狂犬病毒滅活后制備獲得，其中，滅活獲得的豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原，豬圓環(huán)病毒2型抗原以及豬偽狂犬病毒抗原的體積比例為I : I : I。優(yōu)選地，本發(fā)明的豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原滅活前，豬繁殖與呼吸綜合征病毒的含量為> 108_5TCID5ciAil ;豬圓環(huán)病毒2型抗原滅活前，豬圓環(huán)病毒2型含量為彡106 0TCID50/ml ;豬偽狂犬病毒抗原滅活前，豬偽狂犬病毒含量為彡108 0TCID50/mlo優(yōu)選地，本發(fā)明的豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型以及豬偽狂犬病毒使用潮汐式懸浮培養(yǎng)獲得的。優(yōu)選地，本發(fā)明的豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型以及豬偽狂犬病毒是經(jīng)過超濾濃縮處理的。 優(yōu)選地，本發(fā)明的豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型以及豬偽狂犬病毒的滅活是將病毒液中加入體積比為I : 4000的￠-丙內(nèi)酯，混勻，放37°C培養(yǎng)箱中滅活12h獲得的。優(yōu)選地，本發(fā)明的三價(jià)滅活疫苗還含有佐劑，抗原與佐劑的體積比例為I : I。優(yōu)選地，本發(fā)明的佐劑為Montanide ISA 206佐劑。本發(fā)明的另一目的在于提供一種三價(jià)滅活疫苗的制備方法，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型以及豬偽狂犬病毒滅活后制備獲得，包括以下步驟I)豬繁殖與呼吸綜合征病毒液制備運(yùn)用潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞及豬繁殖與呼吸綜合征病毒；2)豬圓環(huán)病毒病毒液制備運(yùn)用潮汝式微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)高密度培養(yǎng)PK15細(xì)胞及豬圓環(huán)病毒II型；3)偽狂犬病毒制備運(yùn)用潮汝式細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)BHK21細(xì)胞及偽狂犬病毒；4)病毒液濃縮使用超濾濃縮的方法處理；5)濃縮后的病毒液加入P -丙內(nèi)酯滅活，然后等體積量混合乳化制成雙相油乳劑聯(lián)苗。灌裝，壓蓋，貼簽，入庫。優(yōu)選地，本發(fā)明的三價(jià)滅活疫苗的制備方法中，滅活獲得的豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原、豬圓環(huán)病毒2型抗原以及豬偽狂犬病毒抗原的體積比例為I : I : I。技術(shù)效果首先，本發(fā)明通過優(yōu)化參數(shù)的方法使用微載體懸浮生物反應(yīng)器系統(tǒng)培養(yǎng)的三種病毒，其數(shù)量和滴度顯著高于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方法，使得本發(fā)明可以獲得適宜的抗原含量的病毒原液。而且在疫苗的后工藝中，該方法不但提高了疫苗產(chǎn)量，也可大量減少殘余細(xì)胞宿主蛋白、殘余細(xì)胞DNA、殘余牛血清等異源物質(zhì)的含量，進(jìn)一步提高了疫苗接種的安全性。其次，本發(fā)明通過大量細(xì)致的試驗(yàn)，選擇三種病毒抗原的含量與配比，并在較大數(shù)量的實(shí)驗(yàn)動物和本動物的免疫效果測定，保證多價(jià)疫苗中各個(gè)免疫成分之間不發(fā)生免疫干擾現(xiàn)象，也就是不降低各該免疫成分的免疫效能，使得三價(jià)滅活疫苗的免疫效力比單苗的免疫效力沒有明顯降低，實(shí)現(xiàn)了本領(lǐng)域一直沒有實(shí)現(xiàn)的豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型以及豬偽狂犬病毒多價(jià)滅活疫苗的制備與應(yīng)用。最后，本發(fā)明提供了適宜的佐劑與三種抗原混合配苗，適合的滅活方法和高效的超濾濃縮的處理方法，使得到三種抗原的相互干擾現(xiàn)象降到了最低，進(jìn)一步提高了多價(jià)疫苗的安全性和免疫效力。本發(fā)明的三價(jià)滅活疫苗和現(xiàn)有的打三針單項(xiàng)疫苗才能預(yù)防這三種傳染病比較，經(jīng)濟(jì)使用，簡化了免疫程序，降低了防疫成本。


圖I為潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)施例中使用了潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器，其他類型的微載體懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器，如攪拌式、旋轉(zhuǎn)式或灌注式微載體懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器，均可以使用本發(fā)明之方法大規(guī)模生產(chǎn)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型以及豬偽狂犬病毒或疫苗。優(yōu)選地，本發(fā)明使用潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器，可以提高培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)基和 溶解氧的供應(yīng)，無氣泡并且剪切力小，對細(xì)胞傷害小。而且，可以保證獲得本發(fā)明的三價(jià)滅活疫苗所需要的病毒的特定含量與質(zhì)量。本發(fā)明實(shí)施例中采用的生物反應(yīng)器為潮汐式生物反應(yīng)器。結(jié)構(gòu)示意圖如圖4所示。其中，各個(gè)標(biāo)記分別為恒溫?cái)嚢柘到y(tǒng)I,培養(yǎng)基恒溫備料槽體2，自動饋料系統(tǒng)3，恒溫培養(yǎng)箱4,載體瓶5,微載體6, DO檢測器及pH控制器7,收集器8。培養(yǎng)系統(tǒng)分為兩部份；一個(gè)是載體瓶5，另一個(gè)是培養(yǎng)基攪拌袋(槽)。細(xì)胞固定在載體瓶，培養(yǎng)基流動于載體瓶與攪拌槽之間，造成間歇性的暴露與淹沒載體。本發(fā)明試驗(yàn)了載體瓶5體積為0. 5L、2. 5L、5L、10L、20L、50L、100L，均能對溫度、pH值、溶解氧、二氧化碳濃度自動控制。本發(fā)明的實(shí)施例中載體瓶體積為20L。本發(fā)明所述方法中，在細(xì)胞吸附微載體階段與細(xì)胞培養(yǎng)階段，啟動了細(xì)胞吸附程序與細(xì)胞培養(yǎng)程序，本發(fā)明實(shí)施例中優(yōu)化了反應(yīng)器的控制參數(shù)，但本發(fā)明方法不僅限于實(shí)施例中的參數(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明提供的技術(shù)啟示，根據(jù)不同的生物反應(yīng)器，調(diào)整相應(yīng)的參數(shù)，達(dá)到微載體與細(xì)胞充分結(jié)合后，大量擴(kuò)增細(xì)胞的目的。本發(fā)明所述方法中，在病毒吸附微載體上的細(xì)胞階段與病毒培養(yǎng)階段，啟動了病毒吸附程序與病毒培養(yǎng)程序，本發(fā)明實(shí)施例中優(yōu)化了反應(yīng)器的控制參數(shù)，但本發(fā)明方法不僅限于實(shí)施例中的參數(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明提供的技術(shù)啟示，根據(jù)不同的生物反應(yīng)器，調(diào)整相應(yīng)的參數(shù)，達(dá)到病毒與細(xì)胞及微載體充分結(jié)合后，大量擴(kuò)增病毒的目的。本發(fā)明試驗(yàn)了如下豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型以及豬偽狂犬病毒株及疫苗的制備方法豬繁殖與呼吸綜合征病毒株為NVDC-JXAl毒株(保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏日期=2007年3月9日，保藏號=CGMCC No. 1964)，豬圓環(huán)病毒為SH毒株(保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏日期2008年3月4日，保藏號=CGMCC No. 2389)，豬偽狂犬毒株為Fa毒株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(保藏于國家獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，保藏號VRIPRV0002)。本發(fā)明實(shí)施例中，傳代細(xì)胞使用了非洲綠猴腎細(xì)胞(Marc-145)，豬腎細(xì)胞系(PK15細(xì)胞)和幼年敘利亞地鼠腎細(xì)胞(BHK21細(xì)胞)其他本領(lǐng)域常用的傳代細(xì)胞如CL2621細(xì)胞、MA104細(xì)胞，也可用于本發(fā)明之方法大規(guī)模生產(chǎn)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型以及豬偽狂犬病毒或疫苗。
為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。實(shí)施例1 :豬繁殖與呼吸綜合征_豬圓環(huán)病毒病2型-豬偽狂犬病三聯(lián)滅活疫苗的制備及檢驗(yàn)I材料與方法I. I毒株來源選用毒株為豬繁殖與呼吸綜合征病毒NVDC-JXAl株(參見中國專利CN100439494C)，豬圓環(huán)病毒2型為SH株(參見中國專利CN101240264A)，偽狂犬毒株為Fa株(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)，I. 2制苗用病毒液的制備及檢驗(yàn)(I) PRRSV病毒液的制備及檢驗(yàn)將Marc-145接種PH值為7. 0-7. 4的培養(yǎng)液和聚酯纖維的載體罐中，并將Marc-145細(xì)胞與聚酯纖維混合均勻，啟動貼附程序4h，使Marc-145細(xì)胞貼服在聚酯纖維上。切換細(xì)胞培養(yǎng)程序，在37°C，5%的CO2培養(yǎng)環(huán)境中，使Marc-145生長至接種濃度的5_40倍時(shí)，換用細(xì)胞維持液，將PRRSV制成病毒懸液，使其吸附在上述的Marc-145細(xì)胞上，適宜的環(huán)境下連續(xù)培養(yǎng)2-3日后收獲病毒液。(2)PCV_2病毒液的制備及檢驗(yàn)將PK15細(xì)胞接種到細(xì)胞生長所用的PH為7. 0-7. 4的培養(yǎng)液與聚酯纖維的載體罐中，并將PK15細(xì)胞與聚酯纖維混合均勻，啟動貼附程序4h ;在37 V ’ CO2濃度為5%的環(huán)境下，使PK15細(xì)胞生長至接種濃度的5-40倍時(shí)，將細(xì)胞生長液換成細(xì)胞維持液，并同步加入PCV-2種毒，啟動貼附程序4h，使其吸附在細(xì)胞上，然后進(jìn)行培養(yǎng)增殖病毒。培養(yǎng)10日后，收獲病毒液。(3) PRV病毒液的制備及檢驗(yàn)將BHK21細(xì)胞接種到細(xì)胞生長液PH為7. 0-7. 4與聚酯纖維的載體罐中，啟動貼附程序4h，使BHK21細(xì)胞與聚酯纖維混合均勻，啟動細(xì)胞培養(yǎng)程序，培養(yǎng)條件為37°C，CO2濃度為5%。當(dāng)BHK21細(xì)胞生長至接種濃度的5-40倍時(shí)換用細(xì)胞維持液，接種PRV病毒，啟動病毒吸附程序，使其完全吸附到細(xì)胞上后，適宜的環(huán)境下培養(yǎng)PRV病毒。病毒培養(yǎng)10日后，收獲偽狂犬病毒。3種病毒液檢驗(yàn)按《中華人民獸藥典》2005年版附錄15、19、20頁的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，檢測結(jié)果為完全符合安全、無副作用、無細(xì)菌霉菌，支原體，外源病毒污染。通過接種細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變作用，測定病毒含量。I. 3病毒液的濃縮(I)濃縮設(shè)備使用美國密理博公司的MINI-PELLIC0N標(biāo)準(zhǔn)超濾設(shè)備。該設(shè)備由兩部分裝置組成。其一是病毒尿囊液預(yù)過濾裝置，此裝置使用平板式293圓盤過濾器，該濾器用316L不銹鋼制造，全不銹鋼接口。運(yùn)行成本低，病毒液殘留體積很小，可夾持預(yù)過濾及除菌過濾膜數(shù)片。使用0. 45 ii m孔徑的MILLIP0RE的AP2529325型號專用預(yù)過濾膜，對病毒液進(jìn)行粗濾，可濾除病毒液中的雜質(zhì)和很多微生物。其二是病毒液超過濾濃縮裝置，該裝置使用316L不銹鋼膜包夾具及管路，全部采用衛(wèi)生接口，內(nèi)外表面電拋光處理。動力裝置使用不銹鋼蠕動泵和硅膠蠕動泵管。此超濾膜包采用低蛋白吸附改良纖維材料，其蛋白吸附量僅為國際通用的聚醚砜材料的1/4 1/5。本超濾裝置的進(jìn)液口和回流口及透過口均配有隔膜壓力表及隔膜閥，可控制系統(tǒng)的壓力，保證超濾濃縮過程的安全和高效。同時(shí)膜包夾具為直立式結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)排放容易，殘留體積小，再加上最后用滅菌生理鹽水沖洗、頂洗病毒液，使病毒液損耗極小。(2)超濾濃縮工藝方法粗濾將病毒液先用3000 5000rpm/min的離心機(jī)離心30min.去除沉洛,吸取上
清液至消毒容器內(nèi)。預(yù)過濾將293圓盤平板濾器及管道等高壓蒸汽消毒(12rC，30min)，把盛有病毒液的容器通過管道與濾器連接充入除菌的空氣加壓后，病毒液在一定壓力下通過平板濾器的濾膜，從出口流出。用消毒的容器收集從平板濾器濾過后流出的病毒液，完成預(yù)過濾。·超濾濃縮先將超濾裝置用蒸餾水反復(fù)沖洗干凈，然后用IN濃度的氫氧化鈉溶液浸泡過夜12小時(shí)以上，使用時(shí)先用消毒的蒸鎦水反復(fù)沖洗，將NaOH沖洗干凈，使沖洗后的廢棄液近中性。然后將預(yù)過濾的病毒液容器通過消毒管道與超濾裝置連接，開啟蠕動泵，使其流量達(dá)到4L/分鐘，這樣高的流速保證超濾膜包較長的使用壽命和最佳的超濾效果。經(jīng)超濾濃縮的病毒液盛入密閉的容器內(nèi)，并反復(fù)循環(huán)通過超濾裝置，直至達(dá)到要求的濃縮終點(diǎn)。(3)濃縮效果測定3種病毒液按相關(guān)規(guī)程濃縮終點(diǎn)進(jìn)行濃縮，濃縮后的病毒應(yīng)達(dá)到濃縮終點(diǎn)的要求，即達(dá)到制備多價(jià)疫苗的病毒含量，具體參見含量測定部分。I. 4濃縮病毒液的滅活將病毒液中加入體積比為I : 4000的￠-丙內(nèi)酯，混勻，放37°C培養(yǎng)箱中滅活12h。細(xì)胞感染法檢測滅活效果將滅活后的病毒液進(jìn)行稀釋并分別接種Marc-145細(xì)胞，PK15細(xì)胞，BHK21細(xì)胞3瓶/組，觀察細(xì)胞無細(xì)胞致病作用(Cytopathogenic，CPE)出現(xiàn)。I. 5含量測定I. 5. I豬繁殖與呼吸綜合征病毒NVDC-JXAl株病毒含量測定將病毒用含I %的牛血清細(xì)胞維持液做10倍系列稀釋，取10_9-10人每個(gè)稀釋度接種8個(gè)孔，同時(shí)設(shè)立陰性對照，放入5% C02溫箱中37°C培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下逐步觀察CPE,每天觀察一次，并記錄結(jié)果。觀察天數(shù)為直至出現(xiàn)CPE終點(diǎn)，即能看到引起病毒增殖的病毒最高稀釋度。并根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算病毒含量，每I. Oml病毒含量> IO8-5TCID50I. 5. 2豬圓環(huán)病毒SH株病毒含量測定將病毒液用MEM維持液做10倍系列稀釋，取10_5、10' 10^3個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度分別接種96孔培養(yǎng)板PK15-B1細(xì)胞單層4孔，每孔0. Iml,同時(shí)設(shè)立陰性對照，在37°C含5% CO2的溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，換含2mM的D-氨基葡萄糖鹽酸的MEM維持液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)；用冷丙酮固定細(xì)胞，用間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)測定每個(gè)稀釋度含有PCV2陽性細(xì)胞(呈綠色)的孔數(shù)，根據(jù)Karber氏法計(jì)算病毒TCID5(I。每ml病毒含量彡106_°TCID5(I。
I. 5. 3偽狂犬病毒Fa株病毒含量測定將PK15細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞板中，每孔細(xì)胞含量為1父104個(gè)培養(yǎng)16-2411備用；按含毒組織量用DMEM培養(yǎng)液將毒種做10倍系列稀釋，取10' 10_4、10_5、10' 10' 10_8六個(gè)稀釋度各接種上述制備好的96孔細(xì)胞板，每孔0. Iml,每個(gè)稀釋度設(shè)8個(gè)重復(fù)，觀察細(xì)胞病變率，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算病毒含量計(jì)算TCID5(I。每Iml病毒含量^ IO8 0TCID500I. 6三聯(lián)苗的乳化與分裝(I)油相制備所用的Montanide ISA 206佐劑為法國SEPPIC公司生產(chǎn)，經(jīng)121°C 60min高壓滅菌后冷卻備用。(2)水相制備經(jīng)檢驗(yàn)合格后的3種滅活濃縮病毒液，等量混合并充分振蕩混均后 備用。(3)疫苗的乳化先將Montanide ISA 206佐劑加入到乳化機(jī)料桶內(nèi)，在攪拌過程中將滅活的抗原水相PRRSV/PCV2/PRV病毒液按I : I : l(v : V : V)的比例滴入到佐劑中，使抗原與佐劑的比例為I : l(v V)。滴完后，繼續(xù)循環(huán)攪拌至抗原與佐劑充分混合，乳化成雙相油乳劑滅活疫苗，分裝。乳化工具膠體磨JTM50為沈陽新光機(jī)械廠制造，勻漿泵為上海東華機(jī)械廠制造。使用前先用0. 5%甲醛溶液浸泡消毒8小時(shí)以上，用前以滅菌的熱蒸餾水沖洗干凈。用后用熱水反復(fù)沖洗，徹底消除殘留油苗。I. 7物理性狀檢驗(yàn)穩(wěn)定性將各批次試制疫苗以3000r/min離心15min,觀察疫苗分層現(xiàn)象。粘度用ImL吸管(出口內(nèi)徑為I. 2mm)吸取25°C左右的疫苗lmL，令其垂直自然流出，記錄流出所需時(shí)間。I. 8無菌檢驗(yàn)按《獸用生物制品規(guī)程》有關(guān)方法對三批三聯(lián)苗進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，結(jié)果無菌生長。I. 9安全性試驗(yàn)I. 9. I新生仔豬安全性試驗(yàn)選擇健康I日齡初生仔豬，每批疫苗接種5頭豬，各肌肉注射2倍免疫劑量4ml聯(lián)苗，另設(shè)5頭作空白對照。接種后每天觀察豬的生長狀況、精神、食欲、體溫及局部變化，觀察 15d。1.9.2妊娠母豬安全性試驗(yàn)每批疫苗用4倍免疫劑量接種妊娠80d左右的母豬3頭，每頭肌肉注射8ml。觀察母豬的反應(yīng)和產(chǎn)仔情況。I. 10效力檢驗(yàn)I. 10. I豬繁殖與呼吸綜合征病毒部分用3 6周齡PRRSV抗原、抗體陰性豬10頭，其中5頭耳后部肌肉注射疫苗2ml，另5頭做對照，同條件下飼養(yǎng)。28日后，所有豬對側(cè)耳后部肌肉注射PRRSV NVDC-JXAl毒株強(qiáng)毒3ml (含105_°TCID5(l/ml)，每目測溫并觀察21日。5頭對照豬應(yīng)全部發(fā)病，且至少2頭死亡；免疫豬至少4頭健活。I. 10. 2豬圓環(huán)病毒2型部分
用14 21日齡健康易感仔豬15頭，分成3組，每組5頭，第I組每頭頸部肌肉注射疫苗1ml，兩周后按相同途徑和劑量進(jìn)行第2次接種，第2組作非免疫攻毒對照，第3組作空白對照(非免疫、非攻毒)，均隔離飼養(yǎng)觀察。首免后5周對所有豬稱重，第1、2組各用PCV2SH株(含IO6. tlTCID5tZml)滴鼻1ml、肌肉注射2ml，隔離飼養(yǎng)。攻毒第4、7日，分別在每頭豬的兩側(cè)腋下及兩側(cè)臀部共4個(gè)點(diǎn)對所有豬接種用弗氏不完全佐劑乳化的鑰匙孔血藍(lán)蛋白(KLH/ICFA，O. 5mg/ml)，每個(gè)點(diǎn)接種Iml (4ml/頭)，同時(shí)腹腔接種巰基乙酸培養(yǎng)基，IOml/頭；攻毒后第11、19日再次腹腔接種巰基乙酸培養(yǎng)基，IOml/頭。攻毒后連續(xù)觀察25日。攻毒對照組應(yīng)至少4頭發(fā)病，免疫組至少4頭保護(hù)。I. 10. 3偽狂犬病毒部分用體重17 22g小鼠20只，各皮下注射疫苗O. 3ml。15日后，再次各皮下注射疫苗·O.3ml，繼續(xù)觀察15日后，連同對照小鼠5只，皮下注射偽狂犬強(qiáng)毒液O. 2ml (含105_ciTCID5tl/ml)，觀察10日。對照組應(yīng)全部死亡，免疫組至少保護(hù)14只。I. 11田間試驗(yàn)用3個(gè)批次的濃縮PRRSV-PCV2-PRV三聯(lián)滅活疫苗在豬場對生產(chǎn)母豬進(jìn)行田間免疫效果實(shí)驗(yàn)，具體方法是配種前10天在母豬頸部肌肉接種2ml濃縮三聯(lián)苗，配種后30天在加強(qiáng)一次，以未注射三聯(lián)苗的生產(chǎn)母豬作為空白對照組，生產(chǎn)以后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。2.結(jié)果2. I抗原含量結(jié)果3批豬藍(lán)耳病毒NVDC-JXAl株、豬圓環(huán)病毒2型SH株、偽狂犬病毒Fa株分別培養(yǎng)三批，批號為1101、1102和1103,抗原的含量見表2-1,其病毒液含量均符合要求。表2-1抗原含量測定
權(quán)利要求
1.一種三價(jià)滅活疫苗，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型以及豬偽狂犬病毒滅活后制備獲得，其特征在于，滅活獲得的豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原，豬圓環(huán)病毒2型抗原以及豬偽狂犬病毒抗原的體積比例為I : I : I。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的三價(jià)滅活疫苗，其特征在于，豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原滅活前，豬繁殖與呼吸綜合征病毒的含量為> 108 5TCID5(l/ml ;豬圓環(huán)病毒2型抗原滅活前，豬圓環(huán)病毒2型含量為> 106 0TCID50/ml ;豬偽狂犬病毒抗原滅活前，豬偽狂犬病毒含量為彡 108 0TCID50/mlo
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的三價(jià)滅活疫苗，其特征在于，所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型以及豬偽狂犬病毒使用潮汐式懸浮培養(yǎng)獲得的。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的三價(jià)滅活疫苗，其特征在于，豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型以及豬偽狂犬病毒是經(jīng)過超濾濃縮處理的。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的三價(jià)滅活疫苗，其特征在于，豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型以及豬偽狂犬病毒的滅活是將病毒液中加入體積比為I : 4000的￠-丙內(nèi)酯，混勻，放37 °C培養(yǎng)箱中滅活12h獲得的。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的三價(jià)滅活疫苗，其特征在于，所述三價(jià)滅活疫苗還含有佐劑，抗原與佐劑的體積比例為I : I。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的三價(jià)滅活疫苗，其特征在于，所述佐劑為MontanideISA 206佐劑。
8.一種三價(jià)滅活疫苗的制備方法，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型以及豬偽狂犬病毒滅活后制備獲得，其特征在于，包括以下步驟 1)豬繁殖與呼吸綜合征病毒液制備運(yùn)用潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞及豬繁殖與呼吸綜合征病毒； 2)豬圓環(huán)病毒病毒液制備運(yùn)用潮汝式微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)高密度培養(yǎng)PK15細(xì)胞及豬圓環(huán)病毒II型； 3)偽狂犬病毒制備運(yùn)用潮汐式細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)BHK21細(xì)胞及偽狂犬病毒； 4)病毒液濃縮使用超濾濃縮的方法處理； 5)濃縮后的病毒液加入￠-丙內(nèi)酯滅活，然后等體積量混合乳化制成雙相油乳劑聯(lián)苗。灌裝，壓蓋，貼簽，入庫。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，滅活獲得的豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原，豬圓環(huán)病毒2型抗原以及豬偽狂犬病毒抗原的體積比例為I : I : I。
全文摘要
本發(fā)明提供了豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型以及豬偽狂犬病毒的三價(jià)滅活疫苗，滅活前，三種病毒含量分別大于108.5TCID50/ml、106.0TCID50/ml和108.0TCID50/ml。滅活后各個(gè)抗原的體積比例為1∶1∶1。本發(fā)明通過大量細(xì)致的試驗(yàn)，選擇三種病毒抗原的含量與配比，并在較大數(shù)量的實(shí)驗(yàn)動物和本動物的免疫效果測定，保證多價(jià)疫苗中各個(gè)免疫成分之間不發(fā)生免疫干擾現(xiàn)象。本發(fā)明的三價(jià)滅活疫苗和現(xiàn)有的打三針單項(xiàng)疫苗才能預(yù)防這三種傳染病比較，經(jīng)濟(jì)使用，簡化了免疫程序，降低了防疫成本。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了本領(lǐng)域一直沒有實(shí)現(xiàn)的豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型以及豬偽狂犬病毒多價(jià)滅活疫苗的制備與應(yīng)用。
文檔編號A61P31/20GK102973932SQ201110264068
公開日2013年3月20日 申請日期2011年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月7日
發(fā)明者張?jiān)S科, 孫進(jìn)忠, 白朝勇 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司