專(zhuān)利名稱(chēng)：一種海腸廢棄內(nèi)臟中粗多糖的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，是涉及一種海腸廢棄內(nèi)臟中粗多糖的提取方法。
背景技術(shù)：
海腸學(xué)名單環(huán)刺螆⑴rechis imiconctus)，在分類(lèi)上屬于螆蟲(chóng)動(dòng)物門(mén)、螆綱、無(wú)管螆目、刺螆科、刺螆屬。主要分布于我國(guó)渤海、黃海，俄羅斯、朝鮮半島、日本北海道和本州周?chē)^(qū)，是我國(guó)北方沿海一種特有的海洋無(wú)脊椎動(dòng)物，具有較高的科學(xué)研究和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。其中煙臺(tái)市是北方海腸的主要產(chǎn)地和重要集散地。從營(yíng)養(yǎng)角度看，海腸體壁組織的氨基酸組成與人體類(lèi)似，且富含多種風(fēng)味氨基酸， 被稱(chēng)為是“魯菜之魂”，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。楊桂文等對(duì)煙臺(tái)沿海的單環(huán)刺螆營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其含有豐富的蛋白質(zhì)及微量元素，具有良好的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值(楊桂文， 安利國(guó)，孫忠軍；《單環(huán)刺螆營(yíng)養(yǎng)成分分析》；海洋科學(xué)；1999年第6期；P13-14)；李諾等對(duì)單環(huán)刺螆?bào)w壁的氨基酸組成和含量進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其含有8種人體必需氨基酸，含量達(dá) 17. 79 %，且組成模式與人體所需一致(李諾，宋淑蓮，唐永政；《單環(huán)刺螆?bào)w壁氨基酸組分與含量的分析》；齊魯漁業(yè)；2000年第17期；P^-28)。當(dāng)前，海腸的利用價(jià)值還未被完全開(kāi)發(fā)出來(lái)，大量海腸內(nèi)臟作為廢棄物棄置，不僅對(duì)環(huán)境造成污染，也造成了資源的浪費(fèi)。孟祥欣等對(duì)煙臺(tái)市售單環(huán)刺螆廢棄內(nèi)臟進(jìn)行了營(yíng)養(yǎng)成分分析，結(jié)果表明單環(huán)刺螆新鮮廢棄內(nèi)臟蛋白質(zhì)含量為18. 25%，脂肪含量為0. 12%, 總糖含量為4. 09%，Ca為2. 10%，Mg為0. 41% Je為0. 32%，Si為0. 03%;對(duì)單環(huán)刺螆廢棄內(nèi)臟的脂肪酸分析發(fā)現(xiàn)EPA、DHA和DPA均較為豐富，分別占總脂肪酸的21. 61%、3. 67% 和56124%.由此提出單環(huán)刺螆廢棄內(nèi)臟具有很好的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值(孟祥欣，郭承華，董新偉，秦倩，周厚成，趙剛；《單環(huán)刺螆⑴rechis imicinctus)廢棄內(nèi)臟營(yíng)養(yǎng)成分分析》;煙臺(tái)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)與工程版)；2008年第21卷第3期；P232-234)。多糖是一類(lèi)廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞中具有特殊活性的重要生物大分子物質(zhì)。隨著分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，人們逐漸發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源的多糖具有廣泛而復(fù)雜的生物活性，已經(jīng)引起醫(yī)藥界高度重視，并成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用、抗腫瘤作用、抗病毒作用、抗衰老作用、抗動(dòng)脈粥樣硬化作用、對(duì)物質(zhì)代謝具有影響、抗?jié)冏饔谩㈩?lèi)腎上腺皮質(zhì)激素和促腎上腺皮質(zhì)激素作用以及對(duì)輻射損傷的保護(hù)等作用(楊小軍，王筱霏，尹瑞卿，姚軍虎；《功能性多糖與家禽腸道黏膜免疫調(diào)控的構(gòu)效關(guān)系》； 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)；2011年第23卷第7期；P1089-1093)。目前已報(bào)道的研究方法主要集中于植物組織中多糖的提取。包括熱水浸提、稀酸、 稀堿、酶法提取等。動(dòng)物組織多糖成分的提取方法包括分級(jí)沉淀、透析、柱層析、超濾、制備性區(qū)域電泳等。由于動(dòng)物多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有許多不同單糖殘基、連接位置和糖昔鍵，能形成具有不同的構(gòu)象，在分離制備時(shí)，應(yīng)根據(jù)不同的動(dòng)物來(lái)源采用不同的方法進(jìn)行提取提取 (陳浩凡，潘仕榮，胡喻，石桂新；《動(dòng)物多糖的分離純化方法》；現(xiàn)代食品與藥品雜志；2007年第17卷第3期；P9-12)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就是針對(duì)上述問(wèn)題，提供了一種操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)率高、產(chǎn)品活性高的海腸廢棄內(nèi)臟中粗多糖的提取方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案，以海腸廢棄內(nèi)臟為原料， 依次經(jīng)過(guò)除雜、粉碎、脫脂、酶解、脫蛋白、沉淀、冷凍干燥后得到所述的粗多糖。所述的酶解過(guò)程采用風(fēng)味酶進(jìn)行消化酶解。具體步驟為⑴除雜、粉碎；(2)脫脂將絞粉碎后的內(nèi)臟放置于體積比為1 1 2的丙酮和乙醚或石油醚混合液中浸泡過(guò)夜，料液比為1 2 4g/ml，接著在4 10°C下離心分離，離心速度為 12000 15000rpm，去除脂肪層；(3)烘干后得到干粉；(4)酶解將步驟(3)得到的干粉按照料液比1 5 10g/ml溶解在pH = 6. O 7. O的磷酸緩沖液中，風(fēng)味酶添加量為5000U/g(干粉)其中(酶活力單位為20萬(wàn)U/g)，在 50-55°C下水浴酶解，酶解時(shí)間2-3小時(shí)；(5)脫蛋白將步驟⑷得到的酶解液在10000-12000rpm離心，過(guò)濾后真空濃縮； 向濃縮物中加Vmi= 4 5 1的混合液，料液比為=1 1 4g/ml，離心除蛋白，離心速度為12000 140000rpm，離心后去除蛋白層，重復(fù)5-8次；(6)脫色向步驟(5)中得到的離心液加入食品級(jí)活性炭，脫色過(guò)夜；(7)沉淀過(guò)濾除去活性炭粉后，用無(wú)水乙醇進(jìn)行分級(jí)沉淀；(8)將收集的沉淀冷凍干燥后，得到粗多糖成品。步驟(6)中，食品級(jí)活性炭與離心液的料液比為1 10 20g/ml。步驟(7)中所述的分級(jí)沉淀為，首先向除去活性炭后的多糖溶液中加入無(wú)水乙醇，使體系中乙醇體積濃度達(dá)到70 75%，靜置2 池后過(guò)濾沉淀；然后繼續(xù)向?yàn)V液中加無(wú)水乙醇，使體系中乙醇濃度達(dá)到80 85%，靜置2 池后過(guò)濾沉淀，最后，再加無(wú)水乙醇，使乙醇濃度最終達(dá)到90 95%，靜置2 池后過(guò)濾得沉淀，將三次沉淀收集備用。本發(fā)明的有益效果利用本發(fā)明的提取方法，海腸廢棄內(nèi)臟中粗多糖的產(chǎn)率為2. 31%，占海腸內(nèi)臟中糖分總量的56.5%。所得成品色澤微黃，總糖含量為17. 1%，蛋白質(zhì)含量為0.76%。所制備的粗多糖產(chǎn)品的對(duì)OH自由基的清除能力為55. 1% -60. 1%，具有較好的劑量效應(yīng)，具備了一定的體外抗氧化活性，。本發(fā)明采用風(fēng)味酶進(jìn)行消化酶解，避免了高溫對(duì)多糖活性的影響。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)率較高，所得產(chǎn)品具有較好的生物活性，適合于大規(guī)模生產(chǎn)。有益于海洋生物廢棄資源的高值利用。此外，本發(fā)明是以海腸廢棄內(nèi)臟為原料進(jìn)行多糖的提取的，一方面減輕了環(huán)境的污染，同時(shí)使資源得到了最大限度的利用。


表1實(shí)施例1制得的粗多糖苯酚-硫酸顯色后穩(wěn)定性結(jié)果；圖1實(shí)施例1制得的粗多糖中總糖含量測(cè)定曲線(xiàn)；圖2實(shí)施例1制得的粗多糖中總蛋白質(zhì)含量測(cè)定曲線(xiàn)；圖3實(shí)施例1制得的粗多糖的體外抗氧化活性測(cè)定曲線(xiàn)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1(1)清洗取新鮮海腸廢棄的內(nèi)臟，將內(nèi)臟中殘留的食物殘?jiān)⒓S便等用清水處理干凈，用攪拌器絞碎。(2)脫脂將絞粉碎后的內(nèi)臟放置于體積比為1 1的丙酮和乙醚混合液中浸泡過(guò)夜，料液比為1 3g/ml，在4°C下離心，轉(zhuǎn)速為14000rpm，去掉脂肪層。(3)烘干上述混合液放在通風(fēng)櫥中，至有機(jī)溶劑完全揮發(fā)，烘干，粉碎得干粉。(4)酶解將上述干粉按照料液比1 5g/ml溶解在磷酸緩沖液中(pH = 7. 0)，風(fēng)味酶添加量為5000U/g(干粉)其中(酶活力單位為20萬(wàn)U/g)，水浴50-55°C，作用時(shí)間2_3小時(shí)。(5)脫蛋白上述浸提液12000rpm離心，過(guò)濾后(普通濾紙)，真空濃縮(用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至合適體積)，加混合液V氯仿V正丁醇=4 1，料液=1 lg/ml，重復(fù)兩次，除蛋白，離心14000rpm，去除蛋白層。(6)脫色按照料液比為1 20g/ml加入食品級(jí)活性炭粉，脫色過(guò)夜。(7)沉淀過(guò)濾除去活性炭粉后，用無(wú)水乙醇進(jìn)行分級(jí)沉淀，首先向除去活性炭后的多糖溶液中加入無(wú)水乙醇，使體系中乙醇濃度(ν/ν)達(dá)到70 75%，靜置2 池后過(guò)濾沉淀；然后繼續(xù)向?yàn)V液中加無(wú)水乙醇，使體系中乙醇濃度達(dá)到80 85%，靜置2 池后過(guò)濾沉淀， 最后，再加無(wú)水乙醇，使乙醇濃度最終達(dá)到90 95%，靜置2 池后過(guò)濾得沉淀，將三次沉淀收集備用。(8)將得到的沉淀冷凍干燥，即得粗多糖成品。實(shí)施例2粗多糖理化性質(zhì)測(cè)定以實(shí)施例1中得到的粗多糖為樣品進(jìn)行測(cè)定。粗多糖中總糖含量測(cè)定采用常規(guī)的苯酚-硫酸法，實(shí)施例1中得到的樣品經(jīng)苯酚-硫酸顯色后，分別在室溫下靜置0h，0. 5h，lh，1. 5h，2h，3h,考察吸光值變化情況見(jiàn)表1。 粗多糖中總糖含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。表 1時(shí)間 O.Oh 0.5h l.Oh 1.5h 2. Oh 2.5h 3. Oh RSD
A490nm 0.313 0.308 0.314 0.31 0.311 0.311 0.315 0.78% 硫酸-苯酚法是根據(jù)多糖在濃硫酸水解作用下產(chǎn)生單糖，并與苯酚發(fā)生顯色反應(yīng)的原理測(cè)定多糖濃度，在490nm處吸收值與糖含量呈線(xiàn)性關(guān)系。實(shí)施例1中所述樣品經(jīng)顯色后，0-3h內(nèi)，隨著時(shí)間的推移，吸光值無(wú)明顯變化，計(jì)算得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0. 78%，說(shuō)明實(shí)施例1中所述樣品具有較好的穩(wěn)定性，符合總糖含量測(cè)定條件；與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)比， 測(cè)得多糖樣品中總糖的濃度為42. 905μ g/mL，計(jì)算得到含量為17. 1%。
蛋白質(zhì)含量測(cè)定利用常規(guī)的考馬斯亮藍(lán)法，紫外280nm處所得吸光值與蛋白質(zhì)含量成正相關(guān)。樣品及標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，測(cè)得多糖樣品中蛋白質(zhì)的濃度為75. 665 μ g/mL，計(jì)算得到含量為 0. 76%。實(shí)施例3體外抗氧化活性測(cè)定以實(shí)施例1中得到的粗多糖為樣品，利用鄰菲羅啉法進(jìn)行測(cè)定。在試管中依次加入9mmol/L 的 FeSO4 溶液 2ml, 10 μ g/mL,30 μ g/mL,40 μ g/mL、 50 μ g/mL的多糖溶液anl，9mmol/L的H2A溶液^il，搖勻后靜置lOmin，再加入9mmol/L水楊酸溶液anl，搖勻后靜置30min，后于波長(zhǎng)510nm處測(cè)得不同濃度多糖的吸光度Ai，用蒸餾水代替水楊酸時(shí)測(cè)得吸光度Aj，空白對(duì)照組用蒸餾水代替多糖提取液，測(cè)得吸光度為Atlt5 測(cè)量結(jié)果見(jiàn)圖3。.清除率計(jì)算公式為:Ε(·0Η)(%)= [1- (Ai-Aj)/A0] X 100%由圖3可知，在10_50μ g/mL濃度范圍內(nèi)，樣品對(duì)· OH自由基的清除率為 55. 1-60. 1%。說(shuō)明實(shí)施例1所得樣品具有較好的對(duì)羥基自由基(· 0H)的清除效果。
權(quán)利要求
1.一種海腸廢棄內(nèi)臟中粗多糖的提取方法，其特征在于，以海腸廢棄內(nèi)臟為原料，依次經(jīng)過(guò)除雜、粉碎、脫脂、酶解、脫蛋白、沉淀、冷凍干燥后得到所述的粗多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的粗多糖的提取方法，其特征在于，所述的酶解過(guò)程采用風(fēng)味酶進(jìn)行消化酶解。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的粗多糖的提取方法，其特征在于，其具體步驟為，(1)除雜、粉碎；(2)脫脂將絞粉碎后的內(nèi)臟放置于體積比為1 1 2的丙酮和乙醚或石油醚混合液中浸泡過(guò)夜，料液比為1 2 4g/ml，接著在4 10°C下離心分離，離心速度為12000 15000rpm，去除脂肪層；(3)烘干后得到干粉；(4)酶解將步驟(3)得到的干粉按照料液比1 5 10g/ml溶解在pH = 6. 0 7. 0 的磷酸緩沖液中，風(fēng)味酶添加量為5000U/g(Te)其中酶活力單位為20萬(wàn)U/g，在50-55°C下水浴酶解，酶解時(shí)間2-3小時(shí)；(5)脫蛋白將步驟⑷得到的酶解液在10000 12000rpm離心，過(guò)濾后真空濃縮；向濃縮物中加入V氯仿V正丁醇=4 5 1的混合液，料液比為=1 1 4g/ml，離心除蛋白，離心速度為12000 14000rpm，離心后去除蛋白層，重復(fù)5-8次；(6)脫色向步驟(5)中得到的離心液加入食品級(jí)活性炭，脫色過(guò)夜；(7)沉淀過(guò)濾除去活性炭粉后，用無(wú)水乙醇進(jìn)行分級(jí)沉淀；(8))將收集的沉淀冷凍干燥后，得到粗多糖成品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的粗多糖的提取方法，其特征在于，步驟(6)中，食品級(jí)活性炭與離心液的料液比為1 10 20g/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的粗多糖的提取方法，其特征在于，步驟(7)中所述的分級(jí)沉淀為，首先向除去活性炭后的多糖溶液中加入無(wú)水乙醇，使體系中乙醇體積濃度達(dá)到70 75%，靜置2 池后過(guò)濾沉淀；然后繼續(xù)向?yàn)V液中加無(wú)水乙醇，使體系中乙醇濃度達(dá)到 80 85%，靜置2 池后過(guò)濾沉淀，最后，再加無(wú)水乙醇，使乙醇濃度最終達(dá)到90 95%， 靜置2 池后過(guò)濾得沉淀，將三次沉淀收集備用。
全文摘要
一種海腸廢棄內(nèi)臟中粗多糖的提取方法屬于農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，是涉及一種海腸廢棄內(nèi)臟中粗多糖的提取方法。本發(fā)明提供了一種操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)率高、產(chǎn)品活性高的海腸廢棄內(nèi)臟中粗多糖的提取方法。其以海腸廢棄內(nèi)臟為原料，依次經(jīng)過(guò)除雜、粉碎、脫脂、酶解、脫蛋白、沉淀、冷凍干燥后得到所述的粗多糖。
文檔編號(hào)A61K31/715GK102304191SQ201110260629
公開(kāi)日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2011年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月24日
發(fā)明者孟芳, 安傳峰, 焦緒棟, 王成林, 王福亮, 秦松 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所