專利名稱：缺血模型多模態(tài)分子成像監(jiān)測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及到多模態(tài)分子成像技術領域，具體涉及一種缺血模型多模態(tài)分子成像監(jiān)測方法。背景技術：
近年來，基于缺血型的小動物分子成像技術受到了廣泛關注，針對這一動物模型應用干細胞介導的缺血損傷修復和血管新生的研究已屢見不鮮。然而，對動物模型的干預效果監(jiān)測手段目前主要有離體的免疫組化、免疫熒光等手段，對于干細胞在小動物體內的存活情況則需要通過移植來源于帶有綠色熒光蛋白(GFP)的轉基因動物的干細胞到損傷動物模型，干細胞的存活情況需要處死動物后獲取組織在顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白來進行鑒定(Katstural Jetal, Circulation Research, 2005)，在體觀察干細胞也有文獻報道采用生物發(fā)光成像(Bioluminescence imaging, BLI)技術對表達熒光素酶(Iuciferase) 的干細胞進行觀測(Cao, F. et al. In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery. Circulation 113，1005-1014, 2006)；生物發(fā)光成像技術只能獲取二維的平面像，不能直觀地顯示小動物體內光源所處的三維空間位置信息，在可視化效果上有很大的局限性；在定量分析方面，生物發(fā)光成像只能進行相對的定量分析，不具有絕對定量的意義，可以參見R. Weissleder and Μ. J. Pittetj "Imaging in the era of molecular oncology, “ Nature 452，580-589 (2008).另外，對小動物缺血模型還需要觀察干細胞干預后的血管新生情況，傳統(tǒng)的方法是取缺血區(qū)域的組織對血管內皮的標志分子CD31進行抗體染色，通過對照組和干預組比較血管新生的情況。這種方法需要在不同的階段處死動物模型，給實驗的連續(xù)觀測帶來了很大的不便。
發(fā)明內容
本發(fā)明針對上述現(xiàn)有技術方法中對小動物缺血模型的干細胞干預過程中干細胞的存活和定位示蹤、以及血管新生的離體觀測方法的缺陷，提供一種缺血模型多模態(tài)分子成像監(jiān)測方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為缺血模型多模態(tài)分子成像監(jiān)測方法， 其特征在于所述的監(jiān)測步驟為
(1)穩(wěn)定表達熒光素酶和綠色熒光蛋白的干細胞的分離和培養(yǎng)；
(2)構建缺血動物模型；
(3)移植步驟(1)中的培養(yǎng)的干細胞到步驟(2)所構建的動物模型的缺血損傷區(qū)域；
(4)在第1天、第7天、第14天、第21天、第觀天、第35天、第42天用生物發(fā)光斷層成像系統(tǒng)進行成像，觀測時間點直到看不到發(fā)光的干細胞為止；從而可以定位干細胞在小動物體內存在的三維空間位置和示蹤干細胞的存活情況，通過干細胞定量方法觀測干細胞在體內不同時間點的存活數(shù)量；
(5)通過穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的干細胞進行抗綠色熒光蛋白的抗體染色，處死動物模型并在注射干細胞的區(qū)域取肌肉組織制作冰凍切片，用熒光顯微鏡觀察標記綠色熒光蛋白的干細胞來做干細胞在缺血組織中的存在性驗證；
(6)在第1天、第7天、第14天、第21天、第28天、第35天、第42天用micro-CT成像系統(tǒng)對動物缺血模型的微血管網(wǎng)絡成像，觀測微血管網(wǎng)絡密度是否發(fā)生了變化；
(7)由小動物缺血模型和干細胞移植后的不同時間點的干預組和對照組的血管鑄型、 血管鑄型的電鏡掃描結果來驗證micro-CT對微血管網(wǎng)絡密度變化的成像結果以及驗證血管是否有發(fā)芽情況。在步驟(1)中的干細胞是由穩(wěn)定表達熒光素酶和綠色熒光蛋白的轉基因動物分離出來的，通過穩(wěn)定表達熒光素酶在底物熒光素和氧以及三磷酸腺苷的作用下在動物體內產(chǎn)生生物發(fā)光，并采用光學分子成像設備探測到生物發(fā)光穿透生物組織，通過光信號的強度確定熒光素酶標記的干細胞的分布密度或干細胞的數(shù)量。在步驟(2)中成功建立小動物缺血模型，結扎動脈的中間部位，保證有微弱的側枝循環(huán)，要保證缺血的效果既不能使缺血區(qū)域壞死，又要保證多只動物缺血模型的一致性。在步驟(3)將脂肪來源的間充質干細胞多點肌肉注射到缺血損傷區(qū)域，注射的多點個數(shù)為3-5個，注射點距離血管結扎部位l_3mm。在步驟(4)中利用生物發(fā)光斷層成像系統(tǒng)對動物缺血模型中移植的干細胞進行示蹤、觀測存活情況，首先，在成像前10分鐘對缺血動物模型注射熒光素底物每千克體重注射熒光素底物150mg，濃度為150ug/ml，然后，將小動物放置到生物發(fā)光斷層成像系統(tǒng)的支架上，用裝有異氟烷的動物麻醉機通過氣體麻醉，并密閉暗箱，調節(jié)系統(tǒng)的成像參數(shù)， 曝光時間設置為5分鐘、根據(jù)生物發(fā)光信號的強度設置科學級CCD相機的光圈范圍為1至 8，采集圖像的binning值設置為4或者8，間隔90度拍攝小動物體表的4個位置的生物發(fā)光信號，并在動物體表間隔90度放置Imm尼龍球作為標志物，并同樣用CCD相機采集四個位置的照片，用于生物發(fā)光斷層成像系統(tǒng)與micro-CT系統(tǒng)的雙模態(tài)配準融合，對于缺血模型還要通過與生物發(fā)光斷層成像系統(tǒng)垂直安裝的micro-CT系統(tǒng)獲得缺血模型的解剖結構信息；對這些解剖結構信息賦予光學參數(shù)后，進行生物發(fā)光信號的體內光源重建；設置 micro-CT系統(tǒng)的X-ray球管電壓為50kVp、電流為0. 95mA、積分時間為0. 5秒、采用外觸發(fā)模式、間隔0. 6度或者0. 75度采集一幅圖像，對動物采集360幀或者480幀圖像，采集完圖像后將動物和附著在動物體表的標記點取下，通過micro-CT采集180幀鋼珠幾何仿體、暗電流以及空掃數(shù)據(jù)，用于動物的micro-CT的校準和三維重建；從而得到動物模型的三維解剖結構信息，micro-CT重建后的解剖結構信息與前面采集的四個位置的生物發(fā)光信號相結合即可以重建得到穩(wěn)定表達熒光素酶的干細胞發(fā)光的三維空間位置和光源能量的定量信肩、ο對步驟(5)中的干細胞在缺血組織中的存在情況進行驗證，通過處死缺血模型取缺血區(qū)域的肌肉組織，制作冰凍切片并用抗綠色熒光蛋白抗體染色，通過熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察來證明干細胞在缺血組織中是否存在。在步驟(6)中觀測干細胞干預后微血管的網(wǎng)絡的密度變化情況，觀測新生情況，通過生物發(fā)光斷層系統(tǒng)成像進而示蹤干細胞在缺血部位的存在，與步驟(4)相同時間點對缺血部分的血管新生情況的觀測則需要通過在體的micro-CT對微血管網(wǎng)絡進行造影成像， 在步驟(6)中，首先在micro-CT掃描前，通過動物的靜脈注射AuroVist-15nm造影劑，注射完造影劑后立即將動物固定到支架上并用異氟烷氣體麻醉機保持動物在成像期間穩(wěn)定呼吸、身體平穩(wěn)，這里同樣設置X-ray球管電壓50kVp、電流0. 95mA、積分時間為0. 5秒、外觸發(fā)模式、間隔0. 6度或者0. 75度采集一幅圖像，對小動物采集360幀或者480幀圖像；最終進行micro-CT數(shù)據(jù)重建，并利用3DMed軟件結合閾值分割的方法將血管從造影增強的數(shù)據(jù)中分割出來，通過步驟(6)中不同時間點的成像結果可以觀測微血管網(wǎng)絡的密度變化情況； 另外，在對干細胞定量的分析中，采用動物缺血模型術后12小時成像并重建光源總能量的方法確立干細胞與光源重建總能量的定量關系。在步驟(7)中對微血管網(wǎng)絡密度變化情況以及血管的新生情況，采用掃描電鏡的方法對血管的超微結構進行觀測，確定是否有血管發(fā)芽現(xiàn)象發(fā)生，進而明確微血管網(wǎng)絡密度變化情況的根由是由血管新生造成的。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點和效果如下通過干細胞示蹤以及觀測血管新生的方法以及驗證手段，可以證實本發(fā)明采用的生物發(fā)光斷層成像方法以及micro-CT 血管造影的方法在活體情況下，通過干細胞的存活、三維定位定量觀測以及微血管網(wǎng)絡的密度變化情況來分析血管新生的情況，這一套方法避免了在不同時間點處死小動物模型的缺點，可以對動物連續(xù)長程地觀測。四

圖1為缺血模型多模態(tài)分子成像監(jiān)測方法流程圖2穩(wěn)定表達熒光素酶(luciferase)和綠色熒光蛋白(GFP)的脂肪來源間充質干細胞顯微鏡圖3小鼠下肢股動脈結扎造模圖； 圖4生物發(fā)光斷層成像與micro-CT融合定位的過程圖； 圖5生物發(fā)光斷層成像對下肢缺血模型移植干細胞的定量分析圖； 圖6通過抗GFP抗體染色的冰凍切片的熒光顯微圖像來驗證干細胞在缺血區(qū)域的存在情況；
圖7 micro-CT微血管網(wǎng)絡造影成像及微血管密度對比結果； 圖8血管鑄型對缺血模型小鼠下肢微血管密度對比結果； 圖9掃描電鏡對血管鑄型的微觀掃描結果； 五具體實施例方式
本發(fā)明提出了對小動物缺血模型研究的系統(tǒng)觀測方法，具體步驟如下
(1)穩(wěn)定表達熒光素酶(luciferase)和綠色熒光蛋白(GFP)的干細胞的分離和培養(yǎng)， 干細胞是由穩(wěn)定表達熒光素酶(luciferase)和綠色熒光蛋白(GFP)的轉基因動物分離出來的；因為穩(wěn)定表達熒光素酶，所以在底物熒光素(luciferin)和氧以及三磷酸腺苷(ATP) 的作用下產(chǎn)生生物發(fā)光，這種生物發(fā)光穿透生物組織后可以被光學分子成像設備探測到， 信號的強度(或者本發(fā)明中所提到的重建光源得到的總能量)直接反應了通過熒光素酶標記的干細胞的分布密度或干細胞的數(shù)量；
(2)構建缺血型動物模型，要保證缺血的效果既不能使缺血區(qū)域壞死，又要保證多只小動物缺血模型的一致性。例如構建小鼠的下肢缺血模型，需要結扎小鼠的股動脈中間部位， 這樣可以保證小鼠在缺血期間不會造成下肢壞死，同時又可以得到明顯的缺血效果；若干只缺血模型保持很好的一致性，為不同模態(tài)的成像對比提供可參考的數(shù)據(jù)。(3)移植步驟(1)中培養(yǎng)的干細胞到步驟(2)所構建的小動物模型的缺血損傷區(qū)域，例如在構建的下肢缺血模型中，則可以在下肢股動脈結扎的附近肌肉區(qū)域實施多點(3 至5個注射點)注射，注射點距離血管結扎部位l-3cm。(4)在第1天、第7天、第14天、第21天、第28天、第35天、第42
天等用生物發(fā)光斷層成像系統(tǒng)進行成像，觀測時間點直到看不到發(fā)光的干細胞為止； 從而可以定位干細胞在小動物體內存在的三維空間位置和示蹤干細胞的存活情況，通過干細胞定量方法觀測干細胞在體內不同時間點的存活數(shù)量，利用生物發(fā)光斷層成像系統(tǒng)對小動物缺血模型中移植的干細胞進行示蹤、觀測存活情況。首先，在成像前10分鐘對缺血動物模型注射熒光素底物(每千克體重注射熒光素底物150mg，濃度為150ug/ml)，然后，將小動物放置到生物發(fā)光斷層成像系統(tǒng)的支架上，用裝有異氟烷的小動物麻醉機通過氣體麻醉，并密閉暗箱。調節(jié)系統(tǒng)的成像參數(shù)，曝光時間設置為5分鐘、根據(jù)生物發(fā)光信號的強度設置科學級CXD相機的光圈范圍為1至8，采集圖像的binning值設置為4或者8，間隔 90度拍攝小動物體表的4個位置的生物發(fā)光信號，并在小動物體表間隔90度放置Imm尼龍球作為標志物，并同樣用CCD相機采集四個位置的照片，用于生物發(fā)光斷層成像系統(tǒng)與 micro-CT系統(tǒng)的雙模態(tài)配準融合。對于缺血模型還要通過與生物發(fā)光斷層成像系統(tǒng)垂直安裝的micro-CT系統(tǒng)獲得缺血模型的解剖結構信息，對這些解剖結構信息賦予光學參數(shù)后， 進行生物發(fā)光信號的體內光源重建。設置micro-CT系統(tǒng)的X-ray球管電壓為50kVp、電流為0. 95mA、積分時間為0. 5秒、采用外觸發(fā)模式、間隔0. 75度采集一幅圖像，對小動物采集 480幀圖像，采集完圖像后將小動物和附著在小動物體表的標記點取下，通過micro-CT采集180幀鋼珠幾何仿體(間隔2度采集一幀投影圖像)、暗電流以及空掃數(shù)據(jù)(分別采集50幀投影圖像)，用于小動物的micro-CT的校準和三維重建；從而得到小動物模型的三維解剖結構信息，micro-CT重建后的解剖結構信息與前面采集的四個位置的生物發(fā)光信號相結合即可以重建得到穩(wěn)定表達熒光素酶的干細胞發(fā)光的三維空間位置和光源能量的定量信息。(5)通過穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白(GFP)的干細胞進行抗GFP的抗體染色，通過處死缺血模型取缺血區(qū)域的肌肉組織，制作冰凍切片并用GFP抗體染色，因為干細胞也是由GFP 穩(wěn)定表達的轉基因鼠分離獲得的，因此通過GFP抗體染色后可以在熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下看到綠色的干細胞存在于缺血組織部位，證明干細胞在缺血組織中的存在。(6)在第1天、第7天、第14天、第21天、第28天、第；35天、第42天
等用micro-CT成像系統(tǒng)對小動物缺血模型的微血管網(wǎng)絡成像，觀測微血管網(wǎng)絡密度是否發(fā)生變化，首先，在micro-CT掃描前，通過小動物的靜脈注射
AuroVist-15nm造影劑，若采用小鼠缺血動物模型，則可以采用尾靜脈注射造影劑的方法，注射完造影劑后立即將小動物固定到支架上并用異氟烷氣體麻醉機保持小動物在成像期間穩(wěn)定呼吸、身體平穩(wěn)，這里同樣設置X-ray球管電壓 50kVp、電流0. 95mA、積分時間為0. 5秒、外觸發(fā)模式、間隔0. 75度采集一幅圖像，對小動物采集480幀圖像；最終進行micro-CT數(shù)據(jù)重建，并利用實驗室開發(fā)的3DMed軟件結合閾值分割的方法將造影增強對比度的數(shù)據(jù)把血管分割出來。通過步驟(6)中不同時間點的成像結果可以觀測微血管網(wǎng)絡的密度變化情況。另外，在對干細胞的定量分析中，采用小動物缺血模型術后12小時成像并重建光源總能量的方法確立干細胞與光源重建總能量的定量關系。步驟(6)與步驟(4)在相同時間點的缺血部位血管新生情況則需要利用micro-CT系統(tǒng)對微血管網(wǎng)絡進行在體成像。(7)由小動物缺血模型和干細胞移植后的不同時間點的干預組和對照組的血管鑄型以及血管鑄型的電鏡掃描結果來驗證micro-CT對微血管網(wǎng)絡密度變化的
成像結果，即采用血管鑄型的方法對微血管網(wǎng)絡的密度變化情況與micro-CT的成像結果進行對比驗證，為進一步證實微血管網(wǎng)絡密度變化情況以及血管的新生情況則采用掃描電鏡的方法對血管的超微結構進行觀測，確定是否有血管發(fā)芽現(xiàn)象。結合附圖對本發(fā)明進行詳細說明
圖1所示缺血模型多模態(tài)分子成像監(jiān)測方法流程圖說明了該方法的主要步驟，首先步驟101開始對缺血型動物模型進行多模態(tài)分子成像的監(jiān)測方法；步驟102為干細胞的分離和培養(yǎng)，這些干細胞取自于帶有穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白和熒光素酶的轉基因動物；步驟 103為缺血動物模型構建，本實施例中以構建小鼠下肢缺血模型為例；步驟104將干細胞移植到缺血組織，為下一步的多模態(tài)成像和離體鑒定做好準備工作；步驟105利用生物斷層成像示蹤干細胞，進行定量和三維可視化分析；步驟106為離體鑒定干細胞在缺血組織中的存在情況，對生物發(fā)光斷層成像的結果進行驗證；步驟107利用micro-CT系統(tǒng)對微血管網(wǎng)絡造影成像，觀測干細胞干預后不同時間點微血管網(wǎng)絡密度是否發(fā)生了變化；步驟108 利用血管鑄型及掃描電鏡分別對micro-CT成像監(jiān)測到的微血管網(wǎng)絡密度情況以及進一步是否有血管發(fā)芽現(xiàn)象進行驗證。步驟109結束缺血模型多模態(tài)分子成像監(jiān)測方法。圖2是根據(jù)本發(fā)明中的多模態(tài)分子成像方法中的穩(wěn)定表達熒光素酶 (Iuciferase)和綠色熒光蛋白(GFP)的脂肪來源間充質干細胞顯微成像的結果。從細胞的形態(tài)上可以鑒定細胞的可靠性。圖3所示的小鼠下肢股動脈結扎造模圖，是通過顯微鏡下操作建立缺血型動物模型，需要結扎小鼠的股動脈中間部位，這樣可以保證小鼠在缺血期間不會造成下肢壞死同時可以得到明顯的缺血效果；每只小鼠缺血模型的股動脈結扎部位相同以保證大批小動物缺血模型的一致性。小鼠下肢缺血模型構建成功后，還要在構建的動物模型的缺血區(qū)域注射干細胞； 對于構建的小鼠下肢缺血模型，采用在缺血區(qū)域距離結扎點3毫米的位置在三個點肌肉注射的方式實施干細胞移植。圖4所示的是生物發(fā)光斷層成像與micro-CT融合定位的過程圖。其流程步驟包括
步驟301 生物發(fā)光斷層成像干細胞重建
利用生物發(fā)光斷層成像系統(tǒng)對缺血模型中移植的干細胞在不同的時間點進行示蹤、觀測干細胞的存活情況和三維定位、定量信息。首先，將缺血動物模型在成像前10分鐘注射熒光素底物D-Luciferin (每千克體重注射熒光素底物150mg，濃度為150ug/ml)。其次，將小動物放置到生物發(fā)光斷層成像系統(tǒng)的小動物支架上，用小動物麻醉機通過異氟烷氣體麻醉(異氟烷2%，氧氣300ml/min)，并密閉暗箱。再次，調節(jié)系統(tǒng)的成像參數(shù)，曝光時間設置為5分鐘、根據(jù)生物發(fā)光信號的強度設置科學級CXD相機的光圈范圍為1. 0至8. 0，采集圖像的binning值設置為4或者8。間隔 90度拍攝小動物體表的4個位置的生物發(fā)光信號，并在小動物體表間隔90度放置直徑為Imm的尼龍球作為標志物，并同樣用CCD相機采集四個位置的照片，用于生物發(fā)光斷層成像系統(tǒng)與micro-CT系統(tǒng)的雙模態(tài)配準。步驟302 :micro-CT對小鼠下肢缺血模型重建，得到其解剖結構信息
獲得動物模型的解剖結構信息對于生物發(fā)光斷層成像的發(fā)光光源重建過程中的不同組織賦予準確的光學參數(shù)，有利于精確的重建光源。另外，解剖結構信息對于三維可視化提供了精確的空間位置信息。具體實施步驟如下
設置與生物發(fā)光斷層成像系統(tǒng)垂直安裝的micro-CT系統(tǒng)的X-ray球管電壓50kVp、電流0. 95mA、積分時間為0. 5秒、外觸發(fā)模式、間隔0. 75度采集一幅圖像，對小動物采集480 幀圖像；然后，通過micro-CT系統(tǒng)采集鋼珠幾何仿體(間隔2度采集180幀)、暗電流以及空掃數(shù)據(jù)(各采集50幀)，用于小動物的micro-CT位置校準和重建。最后，重建小鼠的下肢缺血模型得到其三維解剖結構信息。步驟303 生物發(fā)光斷層成像與解剖結構信息相融合
micro-CT重建后的解剖結構信息與利用前面采集的四個位置的生物發(fā)光信號相結合重建得到的干細胞的生物發(fā)光光源空間位置和總能量，這種融合是基于前面數(shù)據(jù)采集過程中的四個直徑約Imm的小球標記點的配準實現(xiàn)的。這樣就得到穩(wěn)定表達熒光素酶的干細胞發(fā)光的三維空間位置和光源能量的定量信息。圖5所示的生物發(fā)光斷層成像對下肢缺血模型移植干細胞的定量分析圖，顯示在定量分析過程中，首先是同時對多只不同小鼠下肢缺血模型注射不同數(shù)量的干細胞，12小時之后對注射不同數(shù)量干細胞的小鼠缺血模型進行生物發(fā)光斷層成像，并重建得到干細胞在底物作用下所發(fā)光源的總能量，如圖5 (a)所示。通過分析多只小鼠模型重建的干細胞總能量與細胞數(shù)量的線性擬合關系可以看出系統(tǒng)重建的總能量與細胞的數(shù)量有很好的線性關系(R2=O. 9927)，如圖5 (b)所示。該定量方法對小鼠下肢缺血模型長程的觀測可以看到干細胞在小鼠下肢中的存活和凋亡情況，如圖5 (c)所示。圖6所示的熒光顯微圖像是通過GFP抗體染色的冰凍切片的觀測來驗證干細胞在缺血區(qū)域的存在。本實施例中的干細胞是由穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白(GFP)和熒光素酶 (Iuciferase)的轉基因鼠分離脂肪組織得到的脂肪來源的干細胞，在制作小鼠下肢缺血模型并移植干細胞的第1天、第7天、第14天、第21天、第觀天、第35天、第42天等分別處死小動物缺血模型取缺血區(qū)域的肌肉組織，制作冰凍切片并用抗GFP抗體染色，以在熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀測GFP染色的綠色干細胞，就可以證明干細胞在缺血組織中的存在，如圖6所示。圖7所示micro-CT微血管網(wǎng)絡造影成像及微血管密度對比結果，觀測微血管網(wǎng)絡密度的變化情況的目的就是觀測干細胞干預后血管的新生情況。前面已說明通過生物發(fā)光斷層成像可以示蹤到干細胞在缺血部位的存在，但是還需要觀察與示蹤干細胞相同時間點缺血部位的血管新生情況，本發(fā)明采用活體情況下的micro-CT系統(tǒng)對微血管網(wǎng)絡進行成像。首先，在micro-CT掃描前，通過小動物尾靜脈注射AuroViSt-15nm造影劑，注射完造影劑后立即將小動物固定到支架上并用異氟烷氣體麻醉機(異氟烷洲，氧氣300ml/ min)保持小動物在成像期間穩(wěn)定呼吸以避免在micro-CT數(shù)據(jù)重建中產(chǎn)生運動偽影，設置 micro-CT的參數(shù)為X_ray球管電壓50kVp、電流0. 95mA、積分時間為0. 5秒、外觸發(fā)模式、間隔0. 75度采集一幅圖像，對小動物采集480幀圖像。其次，對micro-CT數(shù)據(jù)重建，并利用3DMed軟件用閾值分割的方法將造影增強對比度的血管分割出來。從圖7可以看到圖7 (a)是構建小鼠缺血模型當天并注射了干細胞的成像結果，圖7 (b)是構建小鼠缺血模型后14天的成像結果，可以觀測微血管網(wǎng)絡密度明顯變得稠密。圖8所示的是血管鑄型對缺血模型小鼠下肢微血管密度的對比結果。采用血管鑄型的方法對微血管網(wǎng)絡的密度變化情況與micro-CT的成像結果進行對比驗證。從圖8(a) 是在構建小鼠下肢缺血模型并注射細胞的第一天微血管網(wǎng)絡的鑄型結果，圖8 (b)中是移植干細胞后第14天的血管鑄型結果。在做血管鑄型之前，先將小鼠下肢缺血模型麻醉(戊巴比妥鈉，2%，45mg/kg體重)， 然后將小鼠的心尖開一個小口，用玻璃管插入到心房中并用細線將心尖與玻璃管尖端綁牢，將抽取IOml溫肝素鹽水(1000單位/500ml的0. 9%鹽水)的注射器通過橡膠管連接到玻璃管上，并持續(xù)用力注射溫肝素鹽水，將心室外的靜脈竇剪開使排出來的血液能順利流出。再次，將抽取鑄型劑的注射器和玻璃管通過橡膠管連接并持續(xù)以一定的壓力注射，在 2小時后持續(xù)補助2-3次；低溫儲存靜置M小時。最后，用濃燒堿溶液或者鹽酸溶液腐蝕除血管之外的組織，并用清水沖洗去掉腐蝕組織，留下完整的血管；拍照獲得血管鑄型的圖像。比較圖8 (a)構建模型并移植干細胞的第1天與圖8 (b)構建模型并移植干細胞的第 14天，可以明顯的看出第14天的微血管網(wǎng)絡比第1天的明顯增多，與micro-CT的成像結果一致。圖9所示的是掃描電鏡對血管鑄型的微觀掃描結果。為進一步證實微血管網(wǎng)絡密度變化后的血管新生情況，采用掃描電鏡的方法對血管的超微結構進行觀測，觀測血管發(fā)芽現(xiàn)象，以及發(fā)芽數(shù)量的多少。首先，將前面獲取的血管鑄型在空氣中風干；然后，將血管鑄型固定到掃描電鏡的固定螺母座上；再次，將鑄型表面均勻噴涂一層金用于掃描電鏡成像。 最后，將樣品放入掃描電鏡樣品腔中，開展電鏡掃描。電鏡掃描結果從圖9可以觀察到干預組在第14天的成像結果比對照組第1天的成像結果有明顯的血管新生發(fā)芽現(xiàn)象，圖9 (a) 和(d)分別是對照組和干預組在放大10倍情況下的總體血管網(wǎng)情況，圖9 (b)和(e)分別是放大50倍情況下觀測到的血管新生發(fā)芽情況，從發(fā)芽數(shù)量上可以明顯看出干預組的血管新生發(fā)芽更多一些。在圖9 (c)和(f)中可以更清晰的看出血管發(fā)芽的細節(jié)信息。這些發(fā)芽的尺寸在十幾個微米左右。通過圖8和圖9也可以證實微血管網(wǎng)絡在干預后14天明顯變得更加稠密。利用光學探針標記的干細胞通過生物發(fā)光斷層成像(Bioluminescence Tomography, BLT)實現(xiàn)定位和定量分析的方法，能夠示蹤干細胞的存活以及細胞數(shù)量的信息，并可以得到清晰的三維可視化效果；在觀測血管新生方面采用新型的Aur0ViSt-15nm 造影劑造影增強的方法，利用micro-CT對小動物微血管網(wǎng)絡進行成像，可以發(fā)現(xiàn)微血管網(wǎng)絡的密度變化情況，有效的避免了對動物模型的處死檢驗；從而可以實現(xiàn)連續(xù)長程地觀測小動物缺血模型的干細胞存活和在體內的三維定位、定量信息，以及干細胞干預后動物模型的血管新生情況。
權利要求
1.缺血模型多模態(tài)分子成像監(jiān)測方法，其特征在于所述的監(jiān)測步驟為(1)穩(wěn)定表達熒光素酶和綠色熒光蛋白的干細胞的分離和培養(yǎng)；(2)構建缺血動物模型；(3)移植步驟(1)中培養(yǎng)的干細胞到步驟(2)所構建的動物模型的缺血損傷區(qū)域；(4)在第1天、第7天、第14天、第21天、第觀天、第35天、第42天用生物發(fā)光斷層成像系統(tǒng)進行成像，觀測時間點直到看不到發(fā)光的干細胞為止；從而可以定位干細胞在小動物體內存在的三維空間位置和示蹤干細胞的存活情況，通過干細胞定量方法觀測干細胞在體內不同時間點的存活數(shù)量；(5)通過穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的干細胞進行抗綠色熒光蛋白的抗體染色，處死動物模型并在注射干細胞的區(qū)域取肌肉組織制作冰凍切片，用熒光顯微鏡做干細胞在缺血組織中的存在性驗證；(6)在第1天、第7天、第14天、第21天、第28天、第35天、第42天用micro-CT成像系統(tǒng)對動物缺血模型的微血管網(wǎng)絡成像，觀測微血管網(wǎng)絡密度是否發(fā)生了變化；(7)由小動物缺血模型和干細胞移植后的不同時間點的干預組和對照組的血管鑄型以及血管鑄型的電鏡掃描結果來驗證micro-CT對微血管網(wǎng)絡密度變化的成像結果。
2.根據(jù)權利要求1所述的缺血模型多模態(tài)分子成像監(jiān)測方法，其特征在于在步驟(1) 中的干細胞是由穩(wěn)定表達熒光素酶和綠色熒光蛋白的轉基因動物分離出來的，通過穩(wěn)定表達熒光素酶在底物熒光素和氧以及三磷酸腺苷的作用下在動物體內產(chǎn)生生物發(fā)光，并采用光學分子成像設備探測到生物發(fā)光穿透生物組織，通過光信號的強度確定熒光素酶標記的干細胞的分布密度或干細胞的數(shù)量。
3.根據(jù)權利要求1所述的缺血模型多模態(tài)分子成像監(jiān)測方法，其特征在于在步驟(2) 中成功建立小動物缺血模型，結扎小動物目標區(qū)域動脈的中間部位，并且有微弱的側枝循環(huán)以保證缺血的效果既不能使缺血區(qū)域壞死，又要保持多只動物缺血模型的一致性。
4.根據(jù)權利要求1所述的缺血模型多模態(tài)分子成像監(jiān)測方法，其特征在于所述的移植干細胞到所構建的動物模型缺血損傷區(qū)域，將脂肪來源的間充質干細胞多點肌肉注射到缺血損傷區(qū)域，注射的多點個數(shù)為3-5個，注射點距離血管結扎部位l_3mm。
5.根據(jù)權利要求1所述的缺血模型多模態(tài)分子成像監(jiān)測方法，其特征在于在步驟(4) 中利用生物發(fā)光斷層成像系統(tǒng)對動物缺血模型中移植的干細胞進行示蹤、觀測存活情況， 首先，在成像前10分鐘對缺血動物模型注射熒光素底物每千克體重注射熒光素底物150 mg至450mg，濃度為150 ug/ml至450ug/ml，然后，將小動物放置到生物發(fā)光斷層成像系統(tǒng)的支架上，用裝有異氟烷的動物麻醉機通過氣體麻醉，并密閉暗箱，調節(jié)系統(tǒng)的成像參數(shù)，曝光時間設置為3至10分鐘、根據(jù)生物發(fā)光信號的強度設置科學級CCD相機的光圈范圍為1至8，采集圖像的binning值設置為4或者8，間隔90度拍攝小動物體表的4個位置的生物發(fā)光信號，并在動物體表間隔90度放置直徑為Imm的尼龍球作為標志物，并同樣用 CCD相機采集四個位置的照片，用于生物發(fā)光斷層成像系統(tǒng)與micro-CT系統(tǒng)的雙模態(tài)配準融合，對于缺血模型還要通過與生物發(fā)光斷層成像系統(tǒng)垂直安裝的micro-CT系統(tǒng)獲得缺血模型的解剖結構信息；對這些解剖結構信息賦予光學參數(shù)后，進行生物發(fā)光信號的體內光源重建；設置micro-CT系統(tǒng)的X-ray球管電壓為50kVp、電流為0. 95mA、積分時間為0. 5 秒、采用外觸發(fā)模式、間隔0.6度或0. 75度采集一幅圖像，對動物采集360幀或480幀圖像，物和附著在動物體表的標記點取下，通過micro-CT采集180幀鋼珠幾何仿體、暗電流以及空掃數(shù)據(jù)，用于動物的micro-CT的校準和三維重建；從而得到動物模型的三維解剖結構信息，micro-CT重建后的解剖結構信息與前面采集的四個位置的生物發(fā)光信號相結合即可以重建得到穩(wěn)定表達熒光素酶的干細胞發(fā)光的三維空間位置和光源能量的定量信息。
6.根據(jù)權利要求1所述的缺血模型多模態(tài)分子成像監(jiān)測方法，其特征在于對步驟(5) 中的干細胞在缺血組織中的存在情況進行驗證，通過處死缺血模型取缺血區(qū)域的肌肉組織，制作冰凍切片并用抗綠色熒光蛋白抗體染色，通過熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察染色后的冰凍切片來證明干細胞在缺血組織中的存在。
7.根據(jù)權利要求1所述的缺血模型多模態(tài)分子成像監(jiān)測方法，其特征在于在步驟(6) 中觀測干細胞干預后微血管網(wǎng)絡密度是否發(fā)生了變化，通過生物發(fā)光斷層成像系統(tǒng)示蹤干細胞在缺血部位的存在，與步驟(4)相同時間點對缺血部分的血管新生情況的觀測則需要利用micro-CT系統(tǒng)對微血管網(wǎng)絡進行造影成像，在步驟(6)中，首先在micro-CT掃描前， 通過動物的靜脈注射Aur0ViSt-15nm造影劑，注射完造影劑后立即將動物固定到支架上并用異氟烷氣體麻醉機保持動物在成像期間穩(wěn)定呼吸、身體平穩(wěn)，這里同樣設置X-ray球管電壓50kVp、電流0. 95mA、積分時間為0. 5秒、外觸發(fā)模式、間隔0. 6度或0. 75度采集一幅圖像，對小動物采集360幀或480圖像；最終進行micro-CT數(shù)據(jù)重建，并利用3DMed軟件結合閾值分割的方法將血管從造影增強對比度的數(shù)據(jù)中分割出來，通過步驟(6)中不同時間點的成像結果可以觀測微血管網(wǎng)絡的密度變化情況；在對干細胞定量的分析中，采用動物缺血模型術后12小時成像并重建光源總能量的方法確立干細胞與光源重建總能量的線性定量關系。
8.根據(jù)權利要求1所述的缺血模型多模態(tài)分子成像監(jiān)測方法，其特征在于在步驟(7) 中微血管網(wǎng)絡密度變化情況以及血管的新生情況采用掃描電鏡的方法對血管的超微結構進行觀測，確定是否有血管發(fā)芽現(xiàn)象，進而明確微血管網(wǎng)絡密度變化情況的根由是由血管新生造成的。
全文摘要
本發(fā)明涉及多模態(tài)分子成像技術領域，具體涉及一種缺血模型多模態(tài)分子成像監(jiān)測方法。通過干細胞示蹤、血管新生的觀測方法以及驗證手段，可以證實本發(fā)明在活體情況下采用的生物發(fā)光斷層成像方法以及micro-CT血管造影的方法，通過干細胞的存活、三維定位定量觀測以及微血管網(wǎng)絡的密度變化情況來分析血管新生的情況，這一套方法避免了在不同時間點處死小動物模型的缺點，可以對動物連續(xù)長程地觀測。
文檔編號A61B5/00GK102389297SQ201110258049
公開日2012年3月28日 申請日期2011年9月2日 優(yōu)先權日2011年9月2日
發(fā)明者劉俊廷, 曹豐, 梁繼民, 田捷, 范偉偉 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學, 西安電子科技大學