專利名稱：甲魚肽在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甲魚肽的用途，尤其是涉及在抑制腫瘤藥物領(lǐng)域中的用途。
背景技術(shù)：
腫瘤分為良性腫瘤和惡性腫瘤，一般所說的癌即指惡性腫瘤，世界每年死于癌癥的人數(shù)多達數(shù)百萬人，而自1997年以來，癌癥成為中國人的第一死因，每年有近130萬人死于癌癥，現(xiàn)在抑制癌細胞的生長與轉(zhuǎn)移的方法主要有手術(shù)，化療和放療，一般對身體的傷害較大，容易使人的免疫力下降。申請?zhí)?01010103157. 9專利文獻中公開了甲魚小分子多肽的制備方法；《中國食品學(xué)報》2008，02:徐懷德等“甲魚蛋白酶解產(chǎn)物體外ACE抑制和抗氧化活性研究”公開了體外實驗證實甲魚蛋白酶解物ACE抑制和抗氧化活性的作用；現(xiàn)有技術(shù)和專利中均未述及甲魚低聚肽關(guān)于輔助抑制腫瘤細胞生長或轉(zhuǎn)移應(yīng)用的報導(dǎo)，也沒有關(guān)于分子量在1000以下的甲魚低聚肽在治療和預(yù)防抗腫瘤方面的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供甲魚肽的新用途，即在制藥中的新應(yīng)用；本發(fā)明的另一目的是提供一種能抑制癌細胞生長和轉(zhuǎn)移，有較高的營養(yǎng)價值，吸收率高，不妨害人體身體健康的藥物或保健食品。本發(fā)明甲魚肽是以甲魚為主要原料，分子量分布在lOOOODalton以內(nèi)的小分子肽，其中140-1000Dalton分子量范圍占50%以上。本發(fā)明還涉及甲魚肽在作為制備防治腫瘤疾病的藥中的應(yīng)用。涉及分子量分布在lOOOODalton以內(nèi)的甲魚肽在作為制備防治腫瘤疾病的藥中的應(yīng)用。涉及分子量分布在2000DaltOn以內(nèi)的甲魚肽在作為制備防治腫瘤疾病的藥中的應(yīng)用。涉及分子量分布在140 lOOODalton范圍以內(nèi)的甲魚肽在作為制備防治腫瘤疾病的藥中的應(yīng)用。
涉及分子量分布在300 700Dalton范圍以內(nèi)的甲魚肽在作為制備防治腫瘤疾病的藥中的應(yīng)用。本發(fā)明的甲魚肽是鱉科動物鱉Trionyx sinensis Wiegmann的全體為原料制備的。為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面將用分子量在140 lOOOODalton的甲魚低聚肽的藥理實驗及結(jié)果來說明其在制藥領(lǐng)域的新用途。分子量小于lOOOODalton的甲魚肽抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移的功效研究。1.材料與方法1.1樣品來源及處理受試藥為甲魚肽口服液干粉，Ig甲魚肽/干粉，由江中藥業(yè)股份有限公司提供，人臨床服用量為4g甲魚肽/d，100ml/do1.2實驗動物及環(huán)境清潔級健康昆明種小鼠，雌雄各半，體重18_22g，江西中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號SCXK(贛)2006 — 0001。動物飼養(yǎng)于江西中醫(yī)學(xué)院動物室，環(huán)境許可證SYXK (贛)2004-0001，飼養(yǎng)環(huán)境溫度21 23 °C，相對濕度50 60%。1.3實驗方法
1.3.1動物分組根據(jù)體重隨機分為4組，每組10只。設(shè)立空白對照組、甲魚肽口服液低、中、高劑量組。1. 3. 2劑量設(shè)計甲魚肽口服液每人每日推薦攝入量為4. 0g/60kg體重。由此推算出小鼠每日攝入量為低劑量組，3. 33g生藥/kg體重；中劑量組，6. 67g生藥/kg體重； 高劑量組，13. 34g生藥/kg體重，分別相當(dāng)于人每日攝入量的5、10和20倍。將樣品以蒸餾水配制成相應(yīng)濃度(0. 1665g干粉/ml、0. 3335g干粉/ml、0. 667g干粉/ml)的灌胃液進行實驗，小鼠灌胃量按0.2ml/10g體重計算。每日灌胃1次，連續(xù)30天。各組小鼠均飼以普通飼料，自由進食、飲水。30天后對各亞組小鼠進行輔助抑制腫瘤功能檢驗。1. 3. 3甲魚肽對小鼠肉瘤S180的抑瘤作用將腹腔接種小鼠肉瘤S180細胞后8 天的昆明小鼠頸椎脫白處死，無菌條件下取出腹水，用生理鹽水1:2稀釋，給每只小鼠腋窩皮下接種瘤液0. 2ml。接種后次日，甲魚肽口服液低、中、高劑量給分別按3. 33g生藥/kg體重、6. 67g生藥/kg體重、13. 34g生藥/kg體重灌胃低、中、高濃度的甲魚肽藥液，每天1次， 連續(xù)給藥30天。末次給藥后24小時，頸椎脫白處死動物，分別稱體重、瘤重，計算腫瘤生長抑制率(％)，計算公式為
腫瘤生長抑制率％ =(對照均組平均瘤重-治療組平瘤重)+對照組平均瘤重X
100% ο1.3.4甲魚肽對小鼠移植性腫瘤Lewis肺癌的抑瘤作用用小鼠移植性腫瘤 Lewis肺癌生長良好的瘤源，無菌條件下取荷瘤動物的實體瘤組織，用剪刀剪成小碎塊，用套管針移植或用玻璃勻漿器加無菌生理鹽水磨成勻漿，計數(shù)每ml勻漿液中的瘤細胞數(shù)，給每只動物皮下接種2X106細胞。接種后24小時分組給藥，甲魚肽口服液低、中、高劑量給分別按3. 33g生藥/kg體重、6. 67g生藥/kg體重、13. 34g生藥/kg體重灌胃低、中、高濃度的甲魚肽藥液，每天1次，連續(xù)給藥30天。末次給藥后24小時，頸椎脫白處死動物，分別稱體重、瘤重，計算腫瘤生長抑制率(％)，計算公式為
腫瘤生長抑制率％ =(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)+對照組平均瘤重X
100% ο1. 3. 5 甲魚肽對S180小鼠、Lewis肺癌小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響接種瘤液與給藥同1. 3. 3和1. 3. 4。末次給藥后24小時取脾臟，分別在篩網(wǎng)上研磨、離心、計數(shù)單個細胞，配成終濃度，頸椎脫臼處死動物。無菌條件下取出脾為2. 5X IO6個細胞/ml，分別加入96孔板中，同時設(shè)空白對照孔。置37°C 5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時，培養(yǎng)結(jié)束前6 小時向每孔加入[3H]_TdR，終濃度為1 μ Ci/孔。多頭收集器將細胞收集于玻璃纖維濾紙上， 烤干，放入加有4ml閃爍液的測量瓶中，液閃儀上測定每個樣品的cpm值。1.3.6 甲魚肽對S180小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的影響接種瘤液與給藥同1. 3. 3末次給藥后24小時處死小鼠，按4 mL/只腹腔注射含小牛血清Hank’ s液，輕輕按摩腹部20次，以充分洗出腹腔巨噬細胞，然后將腹壁剪開一個小口，用膠頭吸管吸取腹腔洗液2ml于試管內(nèi)(或用注射器)，用Iml加樣器吸取腹腔洗液0. 5ml加入盛有0. 5mll% 雞血紅細胞懸液的試管內(nèi)，混勻，用注射器(裝大針頭)吸取0. 5ml混合液，加入玻片的瓊脂圈內(nèi)，放置孵箱內(nèi)37°C孵育15 20min，孵育結(jié)束 后迅速用生理鹽水將未貼壁細胞沖掉，于甲醇液中固定lmin，姬姆薩液染色15min，用蒸餾水沖洗干凈，晾干，油鏡下計數(shù)巨噬細胞， 每張片計數(shù)100個，按下式計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)，以吞噬百分率或吞噬指數(shù)表示小鼠巨噬細胞的吞噬能力。吞噬百分率％ =(吞噬雞紅細胞的巨噬數(shù)/計數(shù)巨噬細胞數(shù))X 100% 吞噬指數(shù)=被吞噬雞紅細胞數(shù)/吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)。1.3.7 甲魚肽對Lewis肺癌小鼠碳粒廓清實驗的影響接種瘤液與給藥同 1. 3. 4。小鼠末次給藥后，從尾靜脈注入用生理鹽水稀釋3-4倍印度墨汁0. lml/10g體重，分別于注入墨汁后2 min和10 min時分別從小鼠眼內(nèi)眥靜脈叢取血20 yL，并立即加到2 mLO. l%Na2C03溶液中，混勻，在600 nm波長處測光密度值(OD)，以0. l%Na2C03溶液作為空白對照。將小鼠處死，取肝臟和脾臟，用濾紙擦干，
分別稱重，計算胸腺/體重和脾臟/體重。以吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清的能力。1. 3. 7甲魚肽對Lewis肺癌小鼠NK細胞活性的影響(乳酸脫氫酶測定法) 接種瘤液與給藥同1.3. 4。小鼠末次給藥后，頸椎脫白處死小鼠，無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank’ s液的小平皿中，研磨脾臟，制成單細胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，用Hank’ s 液洗2次，每次離心IOmin (IOOOr · min _ ”，棄上清液將細胞漿彈起，加入015mL滅菌水20s，裂解紅細胞后再加入0. 5mL 2倍Hank，s液及8mLHank，s液，離心IOmin (IOOOr -min _ O，用ImL 10 %小牛血清RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸，用1 %乙酸稀釋后計數(shù)，臺盼藍染色計數(shù)活細胞數(shù)(均在95 %以上)，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為2 XlO7個/ mL。試驗前24h將靶細胞(YAC21細胞)傳代培養(yǎng)，應(yīng)用前以Hank's 液洗3次，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為4 X IO5個/ mL。取YAC21細胞和脾細胞各100 μ L (效靶比50 1)加入U型96孔培養(yǎng)板中，YAC21細胞自然釋放孔加 YAC21細胞和培養(yǎng)液各100 μ L，上述各項設(shè)3個平行孔，于37 °C、5 %C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，然后將96孔培養(yǎng)板以1500r · min _ 1離心5min，每孔吸取上清液100 μ L置平底96孔培養(yǎng)板中，同時加入LDH基質(zhì)液100 μ L，反應(yīng)8min，每孔加入lmol _1的 HCl 30yL ,在酶標儀490nm處測定光密度值。1.3.84統(tǒng)計方法實驗數(shù)據(jù)以 i±S表示，采用單因素方差分析，比較模型對照組、甲魚伏組之間的差異，P<0. 05判斷為差
異具有顯著性。2 結(jié)果
2. 1甲魚肽口服液對小鼠肉瘤S180的抑瘤作用
甲魚肽口服液中、高劑量對小鼠肉瘤S180有較強的抑制作用，抑制率分別為30. 86% 和 46. 91% (Ρ<0· 05)，見表 1。表1甲魚肽口服液對小鼠肉瘤S180的抑瘤作用的影響(_ )
權(quán)利要求
1.甲魚肽在制備防治腫瘤疾病的藥中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲魚肽，其特征在于甲魚肽分子量分布在lOOOODalton以內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的甲魚肽，其特征在于甲魚肽分子量分布在2000DaltOn以內(nèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的甲魚肽，其特征在于甲魚肽分子量分布在140 IOOODalton范圍以內(nèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的甲魚肽，其特征在于甲魚肽分子量分布在300 700DaltOn 范圍以內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種甲魚肽的新用途，即在制藥中的新應(yīng)用；本發(fā)明的另一目的是提供一種能抑制癌細胞生長和轉(zhuǎn)移，有較高的營養(yǎng)價值，吸收率高，不妨害人體身體健康的藥物或保健食品，本發(fā)明甲魚低聚肽是以甲魚為主要原料，分子量分布在10000Dalton以內(nèi)的小分子肽，其中140-1000分子量范圍占50%以上。
文檔編號A61P35/00GK102319419SQ20111023623
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月18日
發(fā)明者劉根云, 盧建中, 易敏之, 鐘虹光, 馬莉 申請人:江中藥業(yè)股份有限公司