專利名稱：一種可降低血糖的藥物制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物制劑的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可降低血糖的藥物制劑，具體是一種以脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)域(gAd)和胰高血糖素樣肽-1 (GLP-I)為主要成分的藥物制劑。
背景技術(shù)：
胰島素抵抗 Gnsulin resistant，IR)是2 型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus, T2DM)、冠心病、高血壓、血脂異常、肥胖等多種代謝相關(guān)疾病的共同病理生理基礎(chǔ)(Fang J, Alderman ΜΗ. Serum uric acid and cardiovascular mortality the NHANES I epidemiologic follow-up study, 1971-1992. National Health and Nutrition Examination Survey [J], JAMA. 2000，283 (18) : 2404-2410·)。因此，如何改善 IR 成為臨床醫(yī)學(xué)亟待解決的現(xiàn)實(shí)問(wèn)題。頂是指胰島素作用的靶器官對(duì)胰島素作用的敏感性下降， 即正常劑量的胰島素產(chǎn)生低于正常生物學(xué)效應(yīng)的一種代謝狀態(tài)，其根本原因?yàn)橐葝u素信號(hào)傳遞受阻或減弱。頂發(fā)生的相關(guān)因素可以分為遺傳及環(huán)境兩類。前者與胰島素信號(hào)傳導(dǎo)的各個(gè)環(huán)節(jié)、調(diào)控糖脂代謝的多種基因多態(tài)性和基因突變有關(guān)；環(huán)境因素主要是攝食過(guò)多 (尤其攝入脂肪過(guò)多)，體力活動(dòng)過(guò)少，體內(nèi)脂肪堆積引起的一系列代謝變化及一些細(xì)胞因子的表達(dá)異常(Montague CTj 0' Rahilly S. The perils of portliness: causes and consequences of visceral adiposity [J]. Diabetes. 2000, 49 (6) :883—888.)。巨前臨床上降低血糖是通過(guò)多次注射不同種類的藥物實(shí)現(xiàn)的，操作繁瑣，患者痛苦，意外感染的風(fēng)險(xiǎn)較大。脂聯(lián)素(Adiponectin)是脂肪細(xì)胞分泌的一種內(nèi)源性生物活性多肽，研究表明其在肥胖、T2DM、胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化患者血漿其含量是減低的。脂聯(lián)素具有改善脂代謝紊亂，改善胰島素抵抗，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的作用。脂聯(lián)素的球狀結(jié)構(gòu)域(Globular domain of adiponectin，gAd)是脂聯(lián)素的活性部位，具有與全長(zhǎng)脂聯(lián)素相同的生物學(xué)活性。在肌組織，gAd通過(guò)激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-acti-vated protein kinase,AMPK) 和過(guò)氧化物酶體增值物活化受體-Y (PPAR-γ )，增加脂肪酸的氧化，減少甘油三酯的含量， 改善肌肉組織的頂。胰高血糖素樣肽-1 (glucagon-like peptide 1，GLP-1)在生理狀態(tài)下從腸內(nèi)釋放，進(jìn)入血液循環(huán)中后可以增強(qiáng)葡萄糖依賴性胰島素分泌，顯示出降低血糖作用，是目前治療糖尿病的一種有效藥，可在控制血糖的同時(shí)降低患者的體質(zhì)量。目前，gAd尚處于研發(fā)階段，GLP-I已用于臨床，但是尚無(wú)配伍藥物。通過(guò)gAd和GLP-I的合理配伍，在有效強(qiáng)化臨床治療效果的同時(shí)，可減少臨床操作環(huán)節(jié)，減輕患者痛苦，降低意外感染的風(fēng)險(xiǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了解決臨床降低血糖時(shí)多種藥物多次注射、使用繁瑣且給病人帶來(lái)很大痛苦的問(wèn)題，提供了一種由gAd和GLP-I為主要成份的穩(wěn)定的可降低血糖的藥物制劑，通過(guò)gAd和GLP-I的合理配伍，強(qiáng)化了臨床治療效果。本發(fā)明可通過(guò)如下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
可降低血糖的藥物制劑，其特征在于其是以gAd和GLP-I為主要成分，包括濃度為 200ng/mL 到 2000ng/mL 的 gAd、3μ
g/mL到15 μ g/mL的GLP-1、藥用緩沖液、穩(wěn)定劑以及水，pH為7. 4。藥用緩沖液為檸檬酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、甘露醇緩沖液中的一種或多種。藥物緩沖液在本發(fā)明所述藥物制劑中的濃度為檸檬酸鹽緩沖液0. 02、. 05mmol/L、磷酸鹽緩沖液0. 005 0. 02mmol/L、甘露醇緩沖液5 15% (V/V)。穩(wěn)定劑為EDTA、苯甲醇、間甲酚或辛酸納。穩(wěn)定劑在本發(fā)明所述藥物制劑中的濃度為EDTA為0. 03 0. 06mol/L、苯甲醇0. 5 1. 0% (V/V)、間甲酚0. 5 1. 0% (V/V)、辛酸納 0.2 0.5% (V/V)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕松獲知本發(fā)明所述藥物制劑中的藥用緩沖液和穩(wěn)定劑的化學(xué)成分和配制方法。本發(fā)明所述的制劑形式為凍干劑型或液體劑型。凍干劑型或液體劑型的制備方法都是常規(guī)方法。本發(fā)明的特點(diǎn)在于(1) 一種既能緩解機(jī)體組織的頂狀態(tài)，又能激發(fā)機(jī)體胰島素分泌的新型降血糖藥物；(2)藥物配伍種類少；(3)便于臨床推廣使用。


圖1 :3T3_L1細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定。圖2 本發(fā)明所述藥物降低糖尿病大鼠血糖效果。
具體實(shí)施例方式通過(guò)以下的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說(shuō)明，這些是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。0. Olmmol/L磷酸鹽緩沖液為例，穩(wěn)定劑的濃度和種類以0. 03mol/L EDTA為例實(shí)施例1 可降低血糖的藥物制劑，包括濃度為200ng/mL的gAd、μ g/mL的GLP-1、
0. Olmmol/L的磷酸鹽緩沖液和0. 03mol/L EDTA，其余為水，pH為7. 4。制備方法1)、藥用緩沖液的制備稱取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4, 0. 24g KH2P04、12g EDTA*2Na溶于800ml蒸餾水中，最后加蒸餾水定容至800mL，即可獲得 0. Olmmol/L磷酸鹽緩沖液、穩(wěn)定劑0. 03mol/L EDTA混合液，即為本發(fā)明所述藥用緩沖液 (因?yàn)楸緦?shí)施例以制備IOOOmL藥物液體針劑為目的，故需要給添加gAd和GLP-I留出一定的體積)。2)、使用步驟1)獲得的藥用緩沖液，采用常規(guī)操作方法將gAd、GLP-l蛋白(或其水溶液)分別配制為濃縮液，然后分別常規(guī)測(cè)定gAd濃縮液和GLP-I濃縮液的蛋白濃度。如， 本實(shí)施例中測(cè)得的gAd濃縮液濃度為166 μ g/mL, GLP-I濃縮液濃度為210 μ g/mL。3)、取1. 205mL步驟2)獲得的gAd濃縮液和64. 677mL步驟2)獲得的GLP-I濃縮液與步驟1)獲得的SOOmL藥用緩沖液混勻，使用水定容至997mL (預(yù)留3mL用于調(diào)整pH)。4)、使用濃HCl或濃NaOH溶液，常規(guī)操作，調(diào)節(jié)步驟3)獲得的997mL溶液，pH至7. 4 ；再使用水定容至IOOOmL,即獲得本發(fā)明所述藥液1000mL。實(shí)施例2 可降低血糖的藥物制劑，包括濃度為800ng/mL的gAd、3 μ g/mL的 GLP-1，磷酸鹽緩沖液0. 02mmol/L和苯甲醇0.5% (V/V)，其余為水，pH為7. 4。制備方法參照實(shí)施例1，本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕松獲知，藥用緩沖液為磷酸鹽緩沖液，穩(wěn)定劑為苯甲醇。實(shí)施例3 可降低血糖的藥物制劑，包括濃度為2000ng/mL的gAd、15 μ g/mL的 GLP-1，甘露醇緩沖液10% (V/V)和間甲酚1. 0% (V/V)，其余為水，pH為7. 4。制備方法參照實(shí)施例1，本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕松獲知，藥用緩沖液為甘露醇緩沖液，穩(wěn)定劑為間甲酚。實(shí)施例4 可降低血糖的藥物制劑，包括濃度為lOOOng/mL的gAd S μ g mL的 GLP-I，檸檬酸緩沖液0. 05mmol/L和辛酸納0. 5% (V/V)，其余為水，pH為7. 4。制備方法參照實(shí)施例1，本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕松獲知，藥用緩沖液為檸檬酸緩沖液，穩(wěn)定劑為辛酸納。試驗(yàn)例1
本發(fā)明所述藥物(具體為上述實(shí)施例1所述的藥物)可增強(qiáng)3T3-L1細(xì)胞的葡萄糖攝取能力，從而可降低培養(yǎng)液中的葡萄糖濃度。取液氮凍存的3T3-L1前脂肪細(xì)胞株解凍，無(wú)菌臺(tái)下將其加入裝有5ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基的離心管中，lOOOr/min離心5min，棄上清，加入8ml DMEM高糖完全培養(yǎng)基，吹吸混勻后接種于培養(yǎng)瓶中，置于37°C、5%0)2孵箱中孵育。第二天換液并于倒置顯微鏡下觀察其生長(zhǎng)情況及生物學(xué)性狀，此后每日觀察，隔天換液，待細(xì)胞融合達(dá)90%左右時(shí)以胰酶消化并傳代， 傳代至細(xì)胞數(shù)量達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需數(shù)量時(shí)將細(xì)胞以5X IO5-I X IOVcm2左右的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)l-2d后根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況換分化培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化，先用含IBMX的分化培養(yǎng)液[方法將 IlOmg 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-l-methylxanthine，IBMX) 加入Iml 二甲基亞砜(Diphenylamine，DMSO)中，充分溶解后將其加入IOOOml分化培養(yǎng)基中，即可得到IBMX終濃度為0. 5mmol/L的分化培養(yǎng)基，0. 22 μ m濾膜過(guò)濾滅菌，用時(shí)現(xiàn)配] 培養(yǎng)4d，每天觀察并換液，再用不含IBMX的分化培養(yǎng)液培養(yǎng)6d，每天觀察并換液。細(xì)胞分化成熟后用油紅O染色法進(jìn)行脂質(zhì)鑒定。吸棄培養(yǎng)板里的分化培養(yǎng)基； IXPBS沖洗細(xì)胞2-3次；加入10%的甲醛磷酸鹽緩沖液細(xì)1/孔，室溫固定Ih ；吸棄固定液；加入油紅0溶液，室溫染色池；吸棄染色劑；無(wú)菌三蒸水沖洗2次，洗去未著色染料；顯微鏡下觀察，照相。見(jiàn)本發(fā)明附圖1。附圖1中，A:前脂肪細(xì)胞(10X15);B:分化早期細(xì)胞 (10 X 25) ;C:分化成熟細(xì)胞(10 X 25) ;D 油紅0染色鑒定(10 X 25)。3T3-L1前脂肪細(xì)胞株接種后24h左右貼壁，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞呈梭形，與成纖維細(xì)胞形態(tài)相似，細(xì)胞突觸伸展于細(xì)胞間隙呈網(wǎng)狀(見(jiàn)圖1 A)。后細(xì)胞逐漸融合，4-6d融合達(dá)90%以上。融合達(dá)90%以上后2d (第Od)開(kāi)始誘導(dǎo)分化，第2d細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始變化，細(xì)胞逐漸由梭形變?yōu)閳A形，胞體變大變圓，胞質(zhì)中逐漸出現(xiàn)脂滴。脂滴先出現(xiàn)在細(xì)胞核周?chē)?，逐漸增多呈“花換狀”、“串珠狀” (見(jiàn)圖1 B)，后脂滴體積增大并逐漸融合(見(jiàn)圖1 C)。油紅0染色脂滴被染成亮紅色(見(jiàn)圖1 D)，證實(shí)脂肪細(xì)胞已分化成熟。開(kāi)始干預(yù)前成熟脂肪細(xì)胞達(dá)85%以上。棄去已分化成熟的3T3-L1細(xì)胞的培養(yǎng)基，用IXPBS液沖洗2-3遍，后用含 0. 2%BSA的基礎(chǔ)培養(yǎng)基孵育過(guò)夜。孵育結(jié)束后棄去培養(yǎng)基，用1 XPBS液沖洗2_3遍，用本發(fā)
5明所述制備的藥液與含1 BSA的高糖DMEM培養(yǎng)基的混合液干預(yù)，二者配比如表1所示。

表1 本發(fā)明所述藥液干預(yù)成熟3T3-L1細(xì)胞的試劑組成
權(quán)利要求
1.一種可降低血糖的藥物制劑，其特征在于其是以脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)域(gAd)和胰高血糖素樣肽-1 (GLP-I)為主要成分，包括濃度為200ng/mL到2000ng/mL的gAd、3 μ 8 mL到15 μ g/mL的GLP-1、藥用緩沖液、穩(wěn)定劑以及水，pH為7. 4。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種可降低血糖的藥物制劑，其特征在于藥用緩沖液為檸檬酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、甘露醇緩沖液中的一種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種可降低血糖的藥物制劑，其特征在于穩(wěn)定劑為 EDTA、苯甲醇、間甲酚或辛酸納。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種可降低血糖的藥物制劑，其特征在于所述的制劑形式為凍干劑型或液體劑型。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥物制劑的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可降低血糖的藥物制劑，解決臨床降低血糖時(shí)多種藥物多次注射、使用繁瑣且給病人帶來(lái)很大痛苦的問(wèn)題，可降低血糖的藥物制劑，其特征在于其是以脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)域(gAd)和胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)為主要成分，包括濃度為200ng/ml到2000ng/ml的gAd、3μg/ml到15μg/ml的GLP-1、藥用緩沖液、穩(wěn)定劑以及水，pH為7.4。本發(fā)明的特點(diǎn)在于(1)一種既能緩解機(jī)體組織的IR狀態(tài)，又能激發(fā)機(jī)體胰島素分泌的新型降血糖藥物；(2)藥物配伍種類少；(3)便于臨床推廣使用。
文檔編號(hào)A61P3/10GK102294021SQ20111021369
公開(kāi)日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2011年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月28日
發(fā)明者廉如, 楊靜, 王彥, 陳思思, 陳顯久, 高婷婷, 黃敏 申請(qǐng)人:山西醫(yī)科大學(xué)