專利名稱：Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑在制備促進(jìn)細(xì)胞凋亡的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳生物學(xué)領(lǐng)域，涉及Wnt/ii-catenin信號(hào)通路抑制劑在制備促進(jìn)細(xì)胞凋亡的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
β -連環(huán)蛋白(β -catenin)作為Wnt信號(hào)通路中的核心轉(zhuǎn)錄因子，在卵巢發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其表達(dá)缺失或者突變都會(huì)引起Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂，從而對(duì)機(jī)體組織或細(xì)胞產(chǎn)生重要影響。敲除Wnt4可導(dǎo)致小鼠在出生前部分的性反轉(zhuǎn)以及卵母細(xì)胞的衰竭，在敲除β-catenin的小鼠顆粒細(xì)胞中形成內(nèi)含紊亂和多形性粒層細(xì)胞的卵泡樣結(jié)構(gòu)，可導(dǎo)致顆粒細(xì)胞癌的發(fā)生。以上這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明Wnt/β -catenin對(duì)顆粒細(xì)胞的增殖、分化以及存活有深刻的影響，進(jìn)而對(duì)卵巢正常功能的維持有著重要的作用。然而，這一結(jié)論還需要更多的實(shí)驗(yàn)支持。目前，本領(lǐng)域?qū)τ谠隗w外實(shí)驗(yàn)中，β -catenin是促進(jìn)細(xì)胞凋亡還是抗凋亡還存在著爭(zhēng)議。但過(guò)表達(dá)β-catenin可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡已有以下報(bào)道KW0nse0p Kim等發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)β-catenin將會(huì)誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的不同程度的凋亡，Marc S. Raab等發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)β -catenin將會(huì)誘導(dǎo)MM和HeLa細(xì)胞的凋亡。關(guān)于β -catenin是通過(guò)何種機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的爭(zhēng)論比較大，一些研究認(rèn)為 P53信號(hào)通路，pl4ARF，cyclinDl，而一些研究認(rèn)為L(zhǎng)EF-I和細(xì)胞周期蛋白Gl沒有參與 β -catenin誘導(dǎo)的凋亡，最新的研究表明，β -catenin還了能通過(guò)C-Jun/p73調(diào)節(jié)一些腫瘤細(xì)胞的凋亡。而關(guān)于β-catenin是通過(guò)何種機(jī)制在卵巢顆粒細(xì)胞里誘導(dǎo)凋亡還不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供Wnt/ β -catenin信號(hào)通路抑制劑在制備促進(jìn)細(xì)胞凋亡的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的是提供一種促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡的方法。本本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑在制備促進(jìn)細(xì)胞凋亡的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選所述的Wnt/ β -catenin信號(hào)通路抑制劑在制備促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡的藥物中的應(yīng)用。其中，所述的Wnt/β -catenin信號(hào)通路抑制劑優(yōu)選β -catenin的siRNA。進(jìn)一步優(yōu)選正義鏈序列為SEQ ID No. 1，反義鏈序列為SEQ ID No. 2的β -catenin 的 siRNA，用 β-catenin-siRNA 表示。一種促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡的方法，是用正義鏈序列為SEQ ID No. 1，反義鏈序列為 SEQ ID No. 2的β -catenin的siRNA轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞。其中siRNA濃度優(yōu)選75nM，轉(zhuǎn)染時(shí)間優(yōu)選36h。
有益效果本發(fā)明針對(duì)β -catenin基因設(shè)計(jì)化學(xué)合成β -catenin-siRNA，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞以敲減豬卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)的β-catenin基因。經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)摸索，確定了最有效干擾鏈，以及干擾濃度為75nM，作用時(shí)間為36小時(shí)。利用Armexin-V/PI雙染流式細(xì)胞儀測(cè)定75ηΜ β-catenin-siRNA轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞時(shí)，轉(zhuǎn)染效率為64. 49%。并通過(guò)熒光定量 PCR 和 Westen blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染 β -catenin_siRNA36 小時(shí)后 β -catenin 基因 mRNA 和蛋白表達(dá)量，來(lái)進(jìn)一步確認(rèn)β-catenin-siRNA的干擾效率。結(jié)果顯示，同空白對(duì)照組相比FAM-siRNA轉(zhuǎn)染組β -catenin基因mRNA表達(dá)水平下調(diào)59. 93%，蛋白水平下調(diào)，差異顯著(P <0.05)，而陰性對(duì)照組差異不顯著。由此可以說(shuō)明β-catenin-siRNA能夠有效地抑制β -catenin基因的表達(dá)，從而抑制Wnt/ β -catenin信號(hào)通路。利用Annexin-V/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染β -catenin-siRNA的顆粒細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示，當(dāng)β -catenin 表達(dá)被抑制后，與空白組相比，實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加由8. 80%上升到15. 85%，差異顯著(P < 0. 05)。說(shuō)明β -catenin-siRNA作為Wnt/β -catenin信號(hào)通路抑制劑，能夠促進(jìn)顆粒細(xì)胞的凋亡。Bax和BCL-2分別屬于BCL-2家族的原凋亡基因和抗凋亡基因，是線粒體凋亡通路中的主要調(diào)節(jié)者。本發(fā)明利用real time RT-PCR驗(yàn)檢測(cè)兩個(gè)跟凋亡相關(guān)的基因Bax和BCL-2在β -catenin誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡過(guò)程中的變化，結(jié)果顯示，在敲減 β -catenin的豬卵巢顆粒細(xì)胞里，BCL_2mRNA的表達(dá)量下降了 44. 28%,Bax的mRNA表達(dá)量上調(diào)了 32. 76%。


圖IFAM-SiRNA轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞48h熒光顯微鏡㈧和光鏡⑶觀察結(jié)果Q00X)。圖2流式細(xì)胞術(shù)分析FAM-siRNA轉(zhuǎn)染效率；A 空白對(duì)照組；B =FAM轉(zhuǎn)染組。圖3real time RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA后β-catenin mRNA的表達(dá)變化，數(shù)據(jù)用 means士S. D表示，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，并至少獨(dú)立實(shí)驗(yàn)3次。與空白對(duì)照組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異用*(P < 0. 05)表示。圖 Western Blotting 檢測(cè) β-catenin 蛋白的表達(dá)變化。圖5細(xì)胞凋亡散點(diǎn)分布圖，A 空白對(duì)照組B =NCsiRNA陰性對(duì)照組C β -catenin-siRNA 實(shí)驗(yàn)組。圖6沉默β -catenin對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)的影響，差異顯著用*表示P < 0. 05。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11. 1豬卵巢的采集與卵泡的選擇采集新鮮豬卵巢，置于含有慶大霉素的生理鹽水，在37°C的環(huán)境下運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室， 選擇健康的卵巢為實(shí)驗(yàn)材料。1. 2顆粒細(xì)胞分離及培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)之前，將細(xì)胞培養(yǎng)基和PBS置于無(wú)菌細(xì)胞室中的水浴鍋中37°C預(yù)熱，并將實(shí)驗(yàn)所需器材放入細(xì)胞間滅菌，培養(yǎng)瓶和高壓滅菌過(guò)的離心管以及ImL槍頭放入超凈工作臺(tái)；將卵巢用含雙抗生理鹽水沖洗2次，用PBS清洗3-4次，用酒精棉擦洗兩次，選擇直徑為2-5mm的卵泡進(jìn)行顆粒細(xì)胞采集；使用帶有20g針頭的注射器抽取2_8mm直徑卵泡的卵泡液及卵泡壁上的顆粒細(xì)胞，并用無(wú)菌的鋼制濾網(wǎng)(孔徑100 μ m)濾掉其中的卵母細(xì)胞，800g 離心;3min ；棄上清，將余下的顆粒細(xì)胞用DMEM/F12培養(yǎng)基清洗一次，再離心(SOOgdmin)； 用DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，0. 2%臺(tái)盼蘭染色測(cè)定細(xì)胞活力。用DMEM/F12培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素)稀釋細(xì)胞，并以血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)；將細(xì)胞以IO6個(gè)/mL密度接種于培養(yǎng)瓶中，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞分散均勻， 置于37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；細(xì)胞每天換一次培養(yǎng)基。1. 3細(xì)胞傳代(1)當(dāng)細(xì)胞匯合達(dá)75% -95%時(shí)，即可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代。(2)輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使瓶?jī)?nèi)未貼壁的細(xì)胞脫落，倒掉培養(yǎng)基。加入aiiLPBS緩沖液，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，充分洗去殘留的培養(yǎng)基。重復(fù)一次。(3)緩緩向細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入ImLO. 25%胰蛋白酶(不含0. 02% EDTA)消化液，并輕輕晃動(dòng)，使胰蛋白酶溶液均勻地覆蓋瓶底。(4)快速將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱Ι-aiiin后取出，顯微鏡下觀察，待大多數(shù)細(xì)胞游離后，立即用2-3ml含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化。(5)分瓶擴(kuò)大培養(yǎng)原代細(xì)胞按1 2-3傳代。1. 4siRNA的設(shè)計(jì)合成根據(jù)GenBank提供的豬β -catenin基因序列(序列號(hào)NM_214367. 1)，分別針對(duì) 964、854、365 位點(diǎn)設(shè)計(jì) β -catenin 的 siRNA(命名為 β -catenin-siRNA)，不帶有熒光標(biāo) i己，分另U稱為 β -catenin-siRNA-964> β _catenin_siRNA_854、β _catenin_siRNA_365,由上海吉瑪公司化學(xué)合成。熒光標(biāo)記的無(wú)義序列為FAM-NC-siRNA。表1 siRNA 序列
權(quán)利要求
1.ffnt/^-catenin信號(hào)通路抑制劑在制備促進(jìn)細(xì)胞凋亡的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的Wnt/β -catenin信號(hào)通路抑制劑在制備促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡的藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑為 β -catenin 的 siRNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的β-catenin的siRNA正義鏈序列為 SEQ ID No. 1，反義鏈序列為 SEQ IDNo. 2。
5.一種促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡的方法，其特征在于用正義鏈序列為SEQ ID No. 1，反義鏈序列為SEQ ID No. 2的β -catenin的siRNA轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的β-catenin的siRNA濃度為75nM， 轉(zhuǎn)染時(shí)間為36h。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子遺傳生物學(xué)領(lǐng)域，公開了Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑在制備促進(jìn)細(xì)胞凋亡的藥物中的應(yīng)用。其中，所述的Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑優(yōu)選β-catenin的siRNA。本發(fā)明針對(duì)β-catenin基因設(shè)計(jì)化學(xué)合成β-catenin-siRNA，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞以敲減豬卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)的β-catenin基因。結(jié)果顯示，當(dāng)β-catenin表達(dá)被抑制后，與空白組相比，實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加由8.80％上升到15.85％，差異顯著，說(shuō)明β-catenin-siRNA能夠促進(jìn)顆粒細(xì)胞的凋亡。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102266561SQ201110197240
公開日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2011年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月14日
發(fā)明者侯艷君, 張寶樂, 徐銀學(xué), 王莉 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)