專利名稱：一種墨旱蓮提取物的制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬中藥領(lǐng)域，尤其涉及一種墨旱蓮提取物的制備方法及用途。
背景技術(shù)：
墨旱蓮為菊科鱧腸屬植物鱧腸(Mclipta pro strata )的干燥地上部分，是傳統(tǒng)中藥，具有滋補肝腎，涼血止血之功效，主治牙齒松動，須發(fā)早白，眩暈耳鳴，腰膝酸軟，陰虛血熱，吐血，衄血，尿血，血痢，崩漏下血，外傷出血。墨旱蓮常作為復(fù)方用藥，如傳統(tǒng)名方二至丸來源于明王三才《醫(yī)便》，由女貞子及墨旱蓮二味藥等量組成，功能補益肝腎， 滋陰止血，主治肝腎陰虛所致的眩暈耳鳴，口鼻干燥，煩熱失眠，吐血血，崩中漏下，須發(fā)早白等，臨床主要用于治神經(jīng)衰弱、慢性虛弱疾病、慢性肝炎等癥。現(xiàn)代研究表明，墨旱蓮具有抗炎、保肝、增強免疫、抗缺氧等多種藥理作用，從該植物分離鑒定的主要化學(xué)成分包括三萜皂苷類，如旱蓮皂苷A、鱧腸皂苷B、鱧腸皂苷C、 刺囊酸和齊墩果酸等；蟛其菊內(nèi)酯類，如蟛其菊內(nèi)酯、去甲基蟛其菊內(nèi)酯、去甲基蟛其菊內(nèi)酯-7-菊萄糖苷；黃酮類，如芹菜素、木犀草素、芹菜素-3-0-葡萄糖苷和木犀草素-3-0-葡萄糖苷，以及噻吩類、留醇類、硬脂酸等，詳參營大禮“墨旱蓮化學(xué)成分、藥理作用及臨床應(yīng)用研究進展”[中國藥房，2008，19(36)，2876-2878] —文。林朝朋、芮漢明等“應(yīng)用大孔吸附樹脂吸附分離墨旱蓮總黃酮的研究”[河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2005，26 (1)， 50-54]公開了一種墨旱蓮總黃酮的大孔吸附樹脂制備工藝，主要采用HPD-700樹脂和40% 乙醇溶液洗脫獲得。陳啟源、萬玉華等“一種墨旱蓮皂苷類化合物的提取方法”(專利申請?zhí)朇N200810031092. 4)公開了一種墨旱蓮皂苷類化合物的提取方法，其主要步驟為(1)墨旱蓮粗粉末采用70%的乙醇微波提取3次，回收乙醇，得到墨旱蓮提取濃縮液；(2)將上述墨旱蓮濃縮液加水稀釋，裝于泡沫逆流色譜儀中，用正丁醇連續(xù)萃取，收集正丁醇泡沫流出部分，回收，得墨旱蓮總皂苷粗品；(3)利用大孔吸附樹脂純化墨旱蓮總皂苷；(4)選用反滲透膜對得到的總皂苷進行過濾，進一步去除水溶性雜質(zhì)，得到高純度的總皂苷類化合物。但該法需使用特別設(shè)備和有機溶劑處理，不適于工業(yè)化生產(chǎn)使用；另一方面，該皂苷類化合物的成份組成和比例并未確定?，F(xiàn)有技術(shù)方案中組成穩(wěn)定、工藝可控性好的墨旱蓮提取物尚未公開。本發(fā)明人在臨床實踐中，發(fā)現(xiàn)二至丸方具有較好的降血脂作用。藥理篩選結(jié)果表明，該方的墨旱蓮提取物和女貞子總?cè)铺崛∥锞哂薪笛钚?。通過對墨旱蓮皂苷提取物的進一步研究，明確了其中的化學(xué)組成和制備工藝，從而完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種組成穩(wěn)定、工藝可控的墨旱蓮提取物的制備方法及用途。墨旱蓮提取物的制備方法的步驟如下
1)選取鱧腸屬植物墨旱蓮，用體積百比濃度為5 95%的乙醇/水浸泡0. 5小時后，乙醇/水是墨旱蓮藥材20倍重量的提取Ih和乙醇/水是墨旱蓮藥材16倍重量的提取0. 5h， 合并提取液，提取液濃縮成0. 25 1. Og生藥/mL，靜置6h，過濾，得到墨旱蓮提取液；
2)墨旱蓮提取液采用預(yù)處理好的大孔樹脂進行吸附，墨旱蓮提取液與大孔樹脂的重量比為1:1 1:5上樣流速1 3 BV/h，樹脂柱徑高比1:4 1:7，吸附后先用水洗3 6 BV，洗脫流速為2 4BV/h，水洗脫液棄去；再用體積百比濃度為20-90%乙醇/水洗脫3 6 BV，流速為2 4BV/h，收集乙醇/水洗脫液，濃縮，干燥，得到墨旱蓮提取物。所述步驟1)中藥材為鱧腸屬植物墨旱蓮；提取溶劑為乙醇/水的體積百比濃度為 5 95%中任意一種醇類溶劑；提取方法為冷浸、滲漉、煎煮、超聲提取、加熱回流、微波提取中的任意一種。所述步驟2)墨旱蓮提取液的大孔樹脂為非極性或弱極性大孔樹脂，如D101、 AB-8、HPD450、LX60 等。所述步驟2)洗脫溶媒優(yōu)選體積百分比濃度50 75%乙醇/水洗脫。所述的墨旱蓮提取物用于制備降血脂保健品或藥物。所述的降血脂保健品或藥物為墨旱蓮提取物與女貞子總?cè)铺崛∥锏慕M合。所述的墨旱蓮提取物主要含有旱蓮皂苷B、旱蓮皂苷A、旱蓮皂苷C、旱蓮皂苷D、墨旱蓮黃酮類成分及蟛其菊內(nèi)酯類成分，其中墨旱蓮皂苷B的質(zhì)量百分比含量不低于10%。所述的墨旱蓮黃酮類成分包括芹菜素、木犀草素、芹菜素-3-0-葡萄糖苷和木犀草素-3-0-葡萄糖苷。 所述的女貞子總?cè)铺崛∥?，包括齊墩果酸、熊果酸、乙酰齊墩果酸、2 α -羥基齊墩果酸、 2 α -羥基-3 β -反式對羥基肉桂酰氧基齊墩果酸。本發(fā)明通過墨旱蓮提取物工藝研究，采用優(yōu)選大孔樹脂進行選擇性洗脫，獲得墨旱蓮皂苷提取物中總皂苷質(zhì)量百分比含量不低于40%;同時明確了該提取物中主要的指標(biāo)性成份含量，以及四種化學(xué)成分及其組成，為其質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。該生產(chǎn)工藝降低了純化成本，容易實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，并且對環(huán)境無污染。


附圖為墨旱蓮皂苷提取物的液相色譜圖。圖中，色譜峰1、2、3依次為旱蓮皂苷B、 旱蓮皂苷C和旱蓮皂苷Α。
具體實施例方式墨旱蓮提取物的制備方法的步驟如下
1)選取鱧腸屬植物墨旱蓮，用體積百比濃度為5 95%的乙醇/水浸泡0.5小時后，乙醇/水是墨旱蓮藥材20倍重量的提取Ih和乙醇/水是墨旱蓮藥材16倍重量的提取0. 5h， 合并提取液，提取液濃縮成0. 25 1. Og生藥/mL，靜置6h，過濾，得到墨旱蓮提取液；
2)墨旱蓮提取液采用預(yù)處理好的大孔樹脂進行吸附，墨旱蓮提取液與大孔樹脂的重量比為1:1 1:5上樣流速1 3 BV/h，樹脂柱徑高比1:4 1:7，吸附后先用水洗3 6 BV, 洗脫流速為2 4BV/h，水洗脫液棄去；再用體積百比濃度為20 90%乙醇/水洗脫3 6 BV，流速為2 4BV/h，收集乙醇/水洗脫液，濃縮，干燥，得到墨旱蓮提取物。所述步驟1)中藥材為鱧腸屬植物墨旱蓮；提取溶劑為乙醇/水的體積百比濃度為5-95%中任意一種醇類溶劑；提取方法為冷浸、滲漉、煎煮、超聲提取、加熱回流、微波提取中的任意一種。所述步驟2)墨旱蓮提取液的大孔樹脂為非極性或弱極性大孔樹脂，如D101、 AB-8、HPD450、LX60 等。所述步驟2)洗脫溶媒優(yōu)選體積百分比濃度50 75%乙醇/水洗脫。所述的墨旱蓮提取物用于制備降血脂保健品或藥物。所述的降血脂保健品或藥物為墨旱蓮提取物與女貞子總?cè)铺崛∥锏慕M合。所述的墨旱蓮提取物主要含有旱蓮皂苷B、旱蓮皂苷A、旱蓮皂苷C、旱蓮皂苷D、墨旱蓮黃酮類成分及蟛其菊內(nèi)酯類成分，其中墨旱蓮皂苷B的質(zhì)量百分比含量不低于10%。所述的墨旱蓮黃酮類成分包括芹菜素、木犀草素、芹菜素-3-0-葡萄糖苷和木犀草素-3-0-葡萄糖苷。 所述的女貞子總?cè)铺崛∥?，包括齊墩果酸、熊果酸、乙酰齊墩果酸、2 α -羥基齊墩果酸、
2α -羥基-3 β -反式對羥基肉桂酰氧基齊墩果酸。本發(fā)明同時對墨旱蓮提取物及其組合物的降血脂作用進行了考察。研究結(jié)果1) 高脂血癥大鼠模型試驗結(jié)果表明，所述墨旱蓮提取物(150，300mg/kg)和二至新方(墨旱蓮提取物和女貞子總?cè)?5 :65，150mg/kg)劑量組在給藥6 W后能顯著降低高血脂模型大鼠 TC、TG和LDL-C含量，并且其作用呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。結(jié)果表明，所述墨旱蓮提取物及其組合物具有較好的降血脂作用，可以根據(jù)使用需要應(yīng)用于不同的食品和藥品中。2)體外活性篩選試驗結(jié)果表明，墨旱蓮提取物對HMG-CoA還原酶、脂蛋白脂酶 LPL、脂肪酸合成酶的IC50值依次為18.5、83.2、11.8 μ g/ml，墨旱蓮提取物和女貞子總?cè)?65 35)對該 3 種酶的 IC50 值依次為 12. 5、13. 3,7. 0 μ g/ml。下面實驗例用于進一步說明但不限于本發(fā)明。實施例1 墨旱蓮提取物的制備
墨旱蓮藥材10kg，用體積百比濃度為5%乙醇/水浸泡0. 5小時，乙醇/水是墨旱蓮藥材20倍重量的提取Ih和乙醇/水是墨旱蓮藥材16倍重量的提取0. 5h，合并提取液，提取液濃縮成0. 25 g生藥/mL，靜置6h，過濾，得到墨旱蓮提取液；墨旱蓮提取液通過AB-8大孔樹脂，墨旱蓮提取液與大孔樹脂的重量比為1:1，上樣流速1 BV/h，樹脂柱徑高比1:4，吸附后先用水洗3BV，洗脫流速為2BV/h，水洗脫液棄去；再用體積百比濃度為20%乙醇/水洗脫
3BV,流速為2BV/h，收集體積百比濃度為20%的乙醇/水的洗脫液，濃縮，干燥，得到墨旱蓮提取物。測得墨旱蓮提取物中旱蓮皂苷B和A、C的質(zhì)量百分比含量分別為32. 7%,6. 2%, 5. 7%，三者總和44. 6% ο實施例2 墨旱蓮提取物的制備
墨旱蓮藥材10kg，用體積百比濃度為95%乙醇/水浸泡0. 5小時，乙醇/水是墨旱蓮藥材20倍重量的提取Ih和乙醇/水是墨旱蓮藥材16倍重量的提取0. 5h，合并提取液，提取液濃縮成1. 0 g生藥/mL，靜置6h，過濾，得到墨旱蓮提取液；墨旱蓮提取液通過LX60大孔樹脂，墨旱蓮提取液與大孔樹脂的重量比為1:5，上樣流速3BV/h，樹脂柱徑高比1:7，吸附后先用水洗6BV，洗脫流速為4BV/h，水洗脫液棄去；再用體積百比濃度為90%乙醇/水洗脫 6 BV,流速為4BV/h，收集體積百比濃度為90%的乙醇/水的洗脫液，濃縮，干燥，得到墨旱蓮提取物。測得墨旱蓮提取物中旱蓮皂苷B和A、C的質(zhì)量百分比含量分別為34. 1%,6.8%, 5. 2%，三者總和46. 1% ο實施例3 墨旱蓮提取物的制備墨旱蓮藥材10kg，用體積百比濃度為50%乙醇/水浸泡0. 5小時，乙醇/水是墨旱蓮藥材20倍重量的提取Ih和乙醇/水是墨旱蓮藥材16倍重量的提取0. 5h，合并提取液，提取液濃縮成0. 5 g生藥/mL，靜置6h，過濾，得到墨旱蓮提取液；墨旱蓮提取液通過AB-8大孔樹脂，墨旱蓮提取液與大孔樹脂的重量比為1:3，上樣流速2BV/h，樹脂柱徑高比1:5，吸附后先用水洗5BV，洗脫流速為3BV/h，水洗脫液棄去；再用體積百比濃度為50%乙醇/水洗脫 5 BV,流速為3BV/h，收集體積百比濃度為50%的乙醇/水的洗脫液，濃縮，干燥，得到墨旱蓮提取物。測得墨旱蓮提取物中旱蓮皂苷B和A、C的質(zhì)量百分比含量分別為40. 3%,7. 5%, 6. 3%，三者總和54. 1% ο

實施例4 墨旱蓮提取物中成分的分離鑒定
取實施例1所得墨旱蓮提取物40g，經(jīng)減壓硅膠H柱色譜粗分，氯仿-甲醇(100 5至 70 30)梯度洗脫，TLC檢識合并為6個部分，其中Fr-2經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜及半制備高效液相分離純化，得到化合物1(14.9 mg)，2 (13.4 mg);Fr_3經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜及S印hadex LH-20純化，得到化合物3 (82.5 mg)，F(xiàn)r_4經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜及S印hadex LH-20純化，得到化合物4 (12. 5 mg)。化合物1 (旱蓮皂苷A)白色結(jié)晶性粉末，F(xiàn)AB-MS 657 [M+Na]+。IHNMR (300 MHz, C5D5N, δ ) 0. 83, 0. 96, 0. 99, 1. 03, 1. 15, 1. 25, 1. 83 (各 3Η，s, 7 X CH3)， 3. 38(lH，m, 18-H), 3. 58 (1H, br d, 10. 2, 3_H)，4. 91 (1H, d, 7.6，3-Glc-l—H)，5. 22 (1H, br s, 16-H), 5. 61 (1Η, br s, 12—Η)。化合物2 (旱蓮皂苷D)白色結(jié)晶性粉末，F(xiàn)AB-MS 819 [M+Na]+。IHNMR (300 MHz, C5D5N, δ) 0.85, 0.97, 0.97, 1.01, 1. 10, 1. 25, 1.81(各3氏 s, 7 X CH3)， 3. 37(lH，m, 18-H), 3. 48 (1H, br d, 9.9，3_H)，4. 90 (1H, d, 7.7，3-Glc-l—H)，5. 27 (1H, br s, 16-H), 5. 58 (1Η, br s, 12—Η)?；衔? (旱蓮皂苷C)白色結(jié)晶性粉末，F(xiàn)AB-MS 819 [M+Na]+。IHNMR (300 MHz, C5D5N, δ) 0.85, 0.97, 0.97, 1.01, 1. 10, 1. 25, 1.81(各3氏 s, 7 X CH3)， 3. 37(lH，m, 18-H), 3. 48 (1H, br d, 9.9，3_H)，4. 90 (1H, d, 7.7，3-Glc-l—H)，5. 27 (1H, br s, 16-H), 5. 58 (1Η, br s, 12—Η), 6. 28 (1Η, d, 8.0，28-Glc-l—H)。化合物4 (旱蓮皂苷B)白色結(jié)晶性粉末，F(xiàn)AB-MS 981 [M+Na]+。IHNMR (300 MHz, C5D5N, δ ) 0. 83, 0. 97, 1. 00, 1. 06, 1. 09, 1. 22, 1. 79 (各 3Η，s, 7 X CH3)， 3. 25(lH，m, 18-H), 3. 42 (1H, br d，11. 0, 3_H)，4. 87 (1H, d, 7.5，3-Glc-l—H)，4. 87 (1H, d, 7.5，3-Glc-l-H), 5. 30 (1H, br s, 16-H), 5. 33 (1H, d, 7.5，3-Glc_4' -Glc -1-H), 5. 58 (1H, br s, 12—H), 6. 30 (1H, d, 8.0，28-Glc-l—H)。實驗例5 墨旱蓮提取物及其組合物的降血脂作用試驗
本試驗考察墨旱蓮提取物、二至新方(墨旱蓮提取物和女貞子總?cè)铺崛∥?5 :35組成)的降血脂作用。其中女貞子總?cè)铺崛∥餅樽灾?，包括齊墩果酸、熊果酸、乙酰齊墩果酸、2 α -羥基齊墩果酸、2 α -羥基-3 β -反式對羥基肉桂酰氧基齊墩果酸等成分，采用 HPLC-ELSD面積歸一化法分析總?cè)瀑|(zhì)量百分比含量按齊墩果酸計為67. 1%。高脂血癥大鼠模型的建立給200g左右雄性Wistar大鼠飼喂高脂飼料，自由進食和飲水。另設(shè)飼喂正常飼料的大鼠作陰性對照。兩周后從眼睛取血測定血脂含量，以判斷模型成功。
分組和給藥將血脂代謝異常大鼠隨機分為模型對照組、供試墨旱蓮提取物A組 (150mg/kg)和 B 組(300mg/kg)、二至新方 C 組(150mg/kg)、和陽性藥血脂康組(600mg/kg) 對照組，每組5只，分別給予相應(yīng)的藥物或溶劑兩周后，從眼睛取血。血脂含量測定血脂四項，包括總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白 (LDL)和高密度脂蛋白(HDL)，由全自動生化儀測定。試驗結(jié)果見表1和2。表1 二至降脂膠囊對高血脂模型大鼠TC、TG含量影響(n=5)
權(quán)利要求
1.一種墨旱蓮提取物的制備方法，其特征在于它的步驟如下1)選取鱧腸屬植物墨旱蓮藥材，用體積百比濃度為5 95%的乙醇/水浸泡0.5小時后，乙醇/水是墨旱蓮藥材20倍重量的提取Ih和乙醇/水是墨旱蓮藥材16倍重量的提取 0. 5h，合并提取液，提取液濃縮成0. 25 1 g生藥/mL，靜置6h，過濾，得到墨旱蓮提取液；2)墨旱蓮提取液采用預(yù)處理好的大孔樹脂進行吸附，墨旱蓮提取液與大孔樹脂的重量比為1:1 1:5上樣流速1 3 BV/h，樹脂柱徑高比1:4 1:7，吸附后先用水洗3 6 BV, 洗脫流速為2 4BV/h，水洗脫液棄去；再用體積百比濃度為20 90%乙醇/水洗脫3 6 BV，流速為2 4BV/h，收集乙醇/水洗脫液，濃縮，干燥，得到墨旱蓮提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種墨旱蓮提取物的制備方法，其特征在于所述提取溶媒優(yōu)選體積百分比濃度50 80%乙醇/水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種墨旱蓮提取物的制備方法，其特征在于所述的大孔樹脂為非極性或弱極性大孔樹脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種墨旱蓮提取物的制備方法，其特征在于所述洗脫溶媒優(yōu)選體積百分比濃度50 75%乙醇/水洗脫。
5.一種如權(quán)利要求1所述方法制備的墨旱蓮提取物的用途，其特征在于用于制備降血脂保健品或藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種墨旱蓮提取物的用途，其特征在于所述的降血脂保健品或藥物為墨旱蓮提取物與女貞子總?cè)铺崛∥锏慕M合。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種墨旱蓮提取物的用途，其特征在于所述的墨旱蓮提取物主要含有旱蓮皂苷B、旱蓮皂苷A、旱蓮皂苷C、旱蓮皂苷D、墨旱蓮黃酮類成分及蟛其菊內(nèi)酯類成分，其中墨旱蓮皂苷B的質(zhì)量百分比含量不低于10%。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種墨旱蓮提取物的用途，其特征在于所述的墨旱蓮黃酮類成分包括芹菜素、木犀草素、芹菜素-3-0-葡萄糖苷和木犀草素-3-0-葡萄糖苷。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種墨旱蓮提取物的用途，其特征在于所述的女貞子總?cè)铺崛∥?，包括齊墩果酸、熊果酸、乙酰齊墩果酸、2 α -羥基齊墩果酸、2 α -羥基-3 β -反式對羥基肉桂酰氧基齊墩果酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種墨旱蓮提取物的制備方法及用途。它的步驟如下1)選取鱧腸屬植物墨旱蓮，用體積百比濃度為5～95%的乙醇/水浸泡0.5小時后，乙醇/水是墨旱蓮藥材20倍重量的提取1h和乙醇/水是墨旱蓮藥材16倍重量的提取0.5h，合并提取液，提取液濃縮成0.25～1.0g生藥/mL，靜置6h，過濾，得到墨旱蓮提取液；2)墨旱蓮提取液采用預(yù)處理好的大孔樹脂進行吸附，墨旱蓮提取液與大孔樹脂的重量比為1:1～1:5上樣流速1～3BV/h，樹脂柱徑高比1:4～1:7，吸附后先用水洗3～6BV，洗脫流速為2～4BV/h，水洗脫液棄去；再用體積百分比濃度為20～90%乙醇/水洗脫3～6BV，流速為2～4BV/h，收集乙醇/水洗脫液，濃縮，干燥，得到墨旱蓮提取物。本發(fā)明降低了純化成本，容易實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，并且對環(huán)境無污染。
文檔編號A61P3/06GK102247420SQ201110184589
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月4日
發(fā)明者傅之容, 戚中杰, 李錫敏, 田景奎, 鄭雯, 馬魯豫 申請人:浙江大學(xué)