專利名稱：一種rolGLP-HV工程菌的構(gòu)建方法及應(yīng)用技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種rolGLP_HV(長(zhǎng)效促胰島素-水蛭素)工程菌的構(gòu)建方法及應(yīng)用技術(shù)，屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
糖尿病(diabetes mellitus)是胰島素絕對(duì)或相對(duì)分泌不足以及機(jī)體對(duì)胰島素敏感性降低所引起的代謝紊亂，其主要臨床特點(diǎn)是血糖高、糖尿、多尿、多飲、多食、消瘦、疲乏等，是最常見(jiàn)的慢性病之一。目前，隨著人們生活水平的提高，人口老齡化以及肥胖發(fā)生率的增加，糖尿病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，并有向低齡化發(fā)展的趨向。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)已確診的糖尿病患者達(dá)4000萬(wàn)，并以每年100萬(wàn)的速度遞增，預(yù)計(jì)到2025年將達(dá)到6000萬(wàn)。
如今，糖尿病被許多學(xué)者說(shuō)成是“百病之源”，是因?yàn)槿籼悄虿〉貌坏接行У闹委?，?huì)引起多種并發(fā)癥。糖尿病的并發(fā)癥可達(dá)百種以上，主要有腸胃功能紊亂(大便干稀不定)、眼病(視力模糊，眼底出血，視網(wǎng)膜病變及脫落，白內(nèi)障等)、腦血管病(腦動(dòng)脈硬化，腦出血，腦血栓，失眠)、心血管病(冠心病，心律不齊，心跳過(guò)速等)、腎病(尿蛋白，腎炎，腎蟀，尿毒癥等)等等。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，糖尿病患者死亡率最高的為心腦血管病變，占50%，糖尿病人患腦血栓的發(fā)病率為非糖尿病人的12倍。因此，尋找一種治療糖尿病同時(shí)又能有效預(yù)防和治療其嚴(yán)重的并發(fā)癥特別是心腦血管疾病的治療方法或藥物至關(guān)重要。胰高血糖素樣肽-I (glucagon-like peptide-1,GLP-1),由胰升糖素原衍生而來(lái)，為30個(gè)氨基酸的多肽，大量研究證實(shí)GLP-I能刺激胰島素分泌，且血糖越高，GLP-I的促胰島素作用越強(qiáng)；如果血糖濃度恢復(fù)至正常值時(shí)，GLP-I就不會(huì)再繼續(xù)作用，因而不會(huì)產(chǎn)生低血糖現(xiàn)象，被稱為聰明的降糖藥物；GLP-1還能減少胰島細(xì)胞損傷，改善胰島細(xì)胞結(jié)構(gòu)，修復(fù)胰島β細(xì)胞功能，促進(jìn)胰島β細(xì)胞再生，提高胰島細(xì)胞活力并延長(zhǎng)其壽命，抑制胰升糖素的釋放，調(diào)控胰腺β細(xì)胞特異基因表達(dá)并通過(guò)這種基因調(diào)控改善葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，提高β細(xì)胞對(duì)葡萄糖的反應(yīng)性以及降低食欲和抑制胃的排空等功能(Gastroenterology,2002,122 :531-544, Endocr Rev, 1995,16 :390-410, Curr Diab Rep, 2003, 3 :365-372,Diabetologia, 1992, 35 :701-711, Digestion, 1994, 55 :22-28, Endocrinol,1992,130 159-166, Euro J Endocrinol,2000,143 :717-725, J Clin Invest,1993,91 :301-307,Diabetes, 1989，38 :902-909, J Clin Invest, 2000，105 :955-965, Diabetes,1999，48 2270-2276,Gastroenterology, 1994，107 :1948-1955)。GLP-1 被認(rèn)為是可從根本上治療糖尿病的一種“治標(biāo)治本”的藥物，對(duì)于糖尿病的治療具有重要意義。水蛭素(Hirudin, HV)是從醫(yī)蛭(Hirudomedieinalis)唾液腺中分離提純的一類酸性小分子蛋白質(zhì)，一般由65-66個(gè)氨基酸組成，有很多酸性氨基酸。水蛭素的分子量大約在7kDa左右。水蛭素是目前最好的凝血酶抑制劑，對(duì)于治療和預(yù)防彌散性血管內(nèi)凝結(jié)(DIC)、心及腦血管栓塞具有很大的應(yīng)用價(jià)值。水蛭素能夠阻止凝血酶對(duì)纖維蛋白原的作用，起到凝血作用，同時(shí)又能抑制血小板凝集，加速血栓溶解，降低血液黏稠度，對(duì)心腦血管疾病患者因血液流變性異常而出現(xiàn)的濃、黏、聚狀態(tài)有較好的改善作用；水蛭素能明顯降低血脂，調(diào)節(jié)血漿中的PGI和TXB的相對(duì)平衡，維持血管內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，從而起到預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和高血脂的功效，是治療心腦血管疾病的首選良藥(Biomed Biochim Acta, 1985,44 :1007-1013，Biochem. J. 1994，300 :643-650, Thromb Rest,2003,109 :S17_S22，JPharSci,2000,89(5) :579-585, Thromb Res, 2002,106 V275-V284, Semin Thromb Hemost,2001,27(5) :543-9, Circulation,2001,103 :1479-1484, N Engl J Med，1995，332(20)1330-1335)。在預(yù)防和治療糖尿病過(guò)程中，關(guān)注其并發(fā)癥特別是血栓的預(yù)防和治療十分必要。因此，本發(fā)明將rolGLP-Ι基因和IflV1基因通過(guò)平端連接進(jìn)行融合，使其在大腸桿菌中高效表達(dá)，純化獲得的rolGLP-HV 口服后可被胃腸道中的胰蛋白酶切成兩種功能性藥物，起到治療糖尿病及其血栓并發(fā)癥的雙重功能，為治療糖尿病及心腦血管疾病提供一種新的方法和藥物。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)將rolGLP-Ι和訊^兩種基因融合表達(dá)以及rolGLP-HV大腸桿菌工程菌的報(bào)道
發(fā)明內(nèi)容
·本發(fā)明的目的是I)構(gòu)建一種含有rolGLP-Ι和！"HV1編碼序列的融合基因rolGLP-HV。2)構(gòu)建一種含有roIGLP-HV融合基因的載體pNK-EC-rolGLP_HV和高表達(dá)roIGLP-HV 的大腸桿菌工程菌 NK-rolGLP-HV_E007。3) NK-rolGLP-HV-E007誘導(dǎo)表達(dá)，可獲得糖尿病與血栓雙功能口服藥物roIGLP-HV。4)純化的roIGLP-HV可進(jìn)行糖尿病及血栓并發(fā)癥的治療。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的首先，本發(fā)明提供了一種融合基因rolGLP-HV，該基因包含一段胰高血糖素樣多肽-I基因rolGLP-Ι和一段水蛭素基因！"HV1，其基因序列如圖I所示。在本發(fā)明提供的融合基因rolGLP-HV中，所述的胰高血糖素樣多肽-I基因GLP-1，其基因內(nèi)的二肽酶IV和胰蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)已被去除，第8位的Ala被Ser取代，第26位和34位的Lys分別被Gln和Asp取代；所述的水蛭素基因是水蛭素變異體_1基因！"HV1 ；rolGLP-Ι基因和IflV1基因直接首尾串聯(lián)連接，獲得融合基因rolGLP-HV。利用rolGLP-1的C端最后氨基酸為Arg(恰好為胰蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn))的特點(diǎn)，進(jìn)而保證其表達(dá)產(chǎn)物!■olGLP-HV在體內(nèi)可被胰蛋白酶切割成具有完整N端的ioIGLP-1和!"HV1單體而發(fā)揮作用。融合基因rolGLP-HV的構(gòu)建過(guò)程通過(guò)對(duì)合成的寡核苷酸片段磷酸化處理、Pfu補(bǔ)平、T4連接酶連接獲得!"HV1基因；通過(guò)PCR獲得rolGLP-Ι基因。通過(guò)平端直接連接的方法將二者融合，獲得rolGLP-HV融合基因。將其克隆到pMD18T-Simple載體，獲得pMD18T-Simple-rolGLP_HV，該載體即包含本發(fā)明圖I所示的融合基因rolGLP-HV的基因序列。其次，本發(fā)明提供了一種大腸表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含以上所述的融合基因rolGLP-HV，具體是指大腸桿菌表達(dá)載體——pNK-EC-ro IGLP-HV。其構(gòu)建過(guò)程如下將上述得到的克隆載體pMD18T-Simple-rolGLP-HV中的融合基因rolGLP-HV進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的融合基因用HindIII內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，回收后連入pET_22b (+)載體，構(gòu)建得到大腸桿菌表達(dá)載體pNK-EC-ro IGLP-HV。第三，本發(fā)明提供了一種大腸桿菌工程菌株NK-rolGLP-HV-E007，該菌株是用以上所述的表達(dá)載體pNK-EC-roIGLP-HV轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)所篩選得到的工程菌株。第四，用本發(fā)明所提供的基因工程菌NK-rolGLP-HV-E007進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)及產(chǎn)物純化，可大量獲得高純度的rolGLP-HV。采以上所述方法獲得的rolGLP-HV，可應(yīng)用于預(yù)防和治療糖尿病及其血栓并發(fā)癥。胡氏血栓小鼠模型的建立(皮下注射50mg/kg的卡拉膠導(dǎo)致尾部出現(xiàn)血栓構(gòu)建血栓小鼠模型)。將上述純化后得到的rolGLP-HV對(duì)胡氏血栓模型小鼠進(jìn)行灌胃處理，觀察小鼠尾部血栓出現(xiàn)的時(shí)間以及相對(duì)長(zhǎng)度。證明rolGLP-HV可有效延緩模型小鼠尾部血栓出現(xiàn)的時(shí)間，并使其血栓的相對(duì)長(zhǎng)度明顯降低。 糖尿病小鼠模型的建立(腹腔注射150mg/kg的鏈脲佐菌素并輔以高脂高糖飼料喂養(yǎng)誘發(fā)小鼠發(fā)生2型糖尿病)。用純化的ioIGLP-HV對(duì)糖尿病模型小鼠進(jìn)行灌胃10天(I次/天)，隔5天檢測(cè)小鼠的血糖水平。證明rolGLP-HV可明顯降低模型小鼠的血糖水平，并可改善模型小鼠的多飲、多食、多尿等糖尿病癥狀。本發(fā)明的有益效果運(yùn)用基因操作技術(shù)，獲得了 rolGLP-HV融合基因，將其克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pNK-EC-roIGLP-HV構(gòu)建了大腸桿菌工程菌株NK-rolGLP-HV-E007，對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得高純度rolGLP-HV。胡氏血栓模型小鼠灌胃本發(fā)明提供的rolGLP-HV，可明顯延緩和改善模型小鼠的血栓癥狀；糖尿病模型小鼠灌胃本發(fā)明獲得的rolGLP-HV，可明顯降低糖尿病小鼠血糖水平并改善其糖尿病癥狀，證明rolGLP-HV具有治療糖尿病及血栓的雙功能，可用于糖尿病及其血栓并發(fā)癥的預(yù)防和治療。


圖I融合基因roGLP-HV的DNA序列。圖2大腸桿菌表達(dá)載體pNK-EC-roIGLP-HV的構(gòu)建過(guò)程。圖SrHV1基因的克隆。㈧為！"HV1基因克隆過(guò)程；(B)rHV1基因的PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果。M為Marker，1,2,3泳道為！"HV1基因的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。圖4roIGLP-HV融合基因的PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果。M為Marker，I，2泳道為roIGLP-HV融合基因的PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果。圖5pNK-EC-roIGLP-HV載體的轉(zhuǎn)化子菌液PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果。M為Marker, 1-4泳道為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的菌液PCR結(jié)果。圖6大腸桿菌工程菌NK-rolGLP-HV_E007的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及Western Blot分析結(jié)果。(A)為誘導(dǎo)表達(dá)后的Tricine-SDS-PAGE，(B)為純化處理后的Tricine-SDS-PAGE，(C)為 roIGLP-HV 的 Western Blot 分析結(jié)果。圖7小鼠尾部血栓長(zhǎng)度測(cè)量。I為正常組小鼠，2為灌胃ddH20對(duì)照組小鼠，3為灌胃roIGLP-HV組小鼠。圖8連續(xù)灌胃rolGLP-HV十天后對(duì)小鼠空腹血糖影響的測(cè)定結(jié)果。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下面實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例I一種融合基因rolGLP-HV的構(gòu)建。包括如下步驟(I)以pMD-GLP為模板(其rolGLP_l的基因序列已由本發(fā)明人申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專利，專利公開(kāi)號(hào)為CN 101824388A)，通過(guò)PCR(用Pfu酶)，獲得rolGLP-Ι基因片段。實(shí)驗(yàn)所用的PCR引物是根據(jù)rolGLP-Ι的序列設(shè)計(jì)的Pl 5/ -CATTCTGAGGGTACTTTCACTTCTG-3'P2 5/ -TCTACCATCAACCAACCAAGCGATG-3'(2)采用基因半合成法，獲得!"HV1基因片段(圖3A)。首先根據(jù)！"HV1的基因序列合成四個(gè)寡核苷酸片段P3，P4，P5，P6 ·P3 5/ -GTTGTCTACACTGACTGTACTGAATCTGGTCAAAACTTGTGTTTGTGTGAAGGTTCCAACGTTTGTGGTCAAGGTAACAAGTGTATCTT-3'P4 5/ -TTACTGGTGAGGGTACTCCTAAGCCACAATCCCATAACGACGGTGACTTCGAGGAGATTCCAGAGGAATACTTGCAATAAAAGCTTGGG-3'P5 5 ' -GGCTTAGGAGTACCCTCACCAGTAACACATTGGTTCTTCTCACCGTCAGAACCCAAGATACACTTGTTACCTTGACCAC-3'P6 5/ ~CCCAAGCTTTTATTGCAAGTATTCCTCTG~3/下劃線部分為HindIII酶切位點(diǎn)。將上述四個(gè)寡核苷酸片段分別在50 μ L體系的磷酸化混合液中進(jìn)行磷酸化處理?；旌弦褐邪ê铣傻囊锲?，5 μ L IOX激酶bufffer，5yL 10mmol/LATP, I μ L T4磷酸激酶(2U) ,34 μ L ddH20。混合液至于37°C保溫60分鐘，然后100°C加熱I分鐘終止反應(yīng)。冰浴。將磷酸化的寡核苷酸片段用冰凍乙醇沉淀30分鐘，離心后將沉淀用75%乙醇清洗兩次，將沉淀干燥，分別用10 μ L ddH20溶解。將磷酸化后的片段進(jìn)行Pfu酶補(bǔ)平，配制50 μ L體系。混合液中包含磷酸化的Ρ3、Ρ4、Ρ5、Ρ6 片段各 10μ L，I μ L lOmmol/LdNTP, 5 μ L IOXbufffer, I. 5μ L Pfu 酶，2.5yLddH20?；靹蛞褐糜谒≈?4°C 3分鐘，55°C 2分鐘，72°C 5分鐘。然后冰凍乙醇沉淀30分鐘，離心后將沉淀用75%乙醇清洗兩次，將沉淀干燥，用20 μ L ddH20溶解。用上述補(bǔ)平片段進(jìn)行T4連接酶缺口連接反應(yīng)。配制25yL連接體系?；旌弦褐邪a(bǔ)平片段 20μ L，2. 5μ L 10Xbufffer,lyL 1\連接酶，1.5yL ddH20。16°C 反應(yīng)過(guò)夜。連接產(chǎn)物中加入等體積氯仿異戊醇抽提雜蛋白，乙醇沉淀獲得!"HV1基因。用引物P6和P7，上述獲得的！"HV1基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR，獲得用于平端連接的！"HV1模板(圖3B)。其中P7序列如下P7 5/ -GTTGTCTACACTGACTGTACTGAATCTGG-3'。將上述用Pfu酶分別擴(kuò)增得到的rolGLP-Ι基因片段和！"HV1基因片段混合，加入T4連接酶進(jìn)行平端連接。反應(yīng)結(jié)束后，使用引物Pl和P6進(jìn)行PCR擴(kuò)增。配制50 μ L反應(yīng)體系?；旌弦褐邪琁 μ L平端連接反應(yīng)產(chǎn)物，Pl和Ρ6引物各I μ L，5 μ L IOXbufffer,0. 5μ L Taq 酶，4 μ L 2. 5mmol/L dNTP,37. 5μ L ddH20。PCR 反應(yīng)條件為94°C 預(yù)變性 10 分鐘；94°C I分鐘，58°C 30秒，72°C I分鐘，循環(huán)30次；72°C延伸10分鐘，4°C保溫。獲得融合基因 roIGLP-HV (圖 4)。實(shí)施例2一種含有rolGLP-HV融合基因的大腸桿菌表達(dá)載體pNK-EC_rolGLP-HV的構(gòu)建。用HindIII消化rolGLP-HV基因片段。質(zhì)粒pET_22b (+)用Nco I酶切后，用Pfu酶補(bǔ)平，然后用HindIII對(duì)載體大片段進(jìn)行酶切處理。將酶切后的載體和基因片段進(jìn)行連接(圖2)。挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子即為本發(fā)明中所用的表達(dá)載體，含有rolGLP-HV融合基因的大腸桿菌表達(dá)載體pNK-EC-roIGLP-HV (圖5)。實(shí)施例3 大腸桿菌工程菌NK-rolGLP-HV-E007的誘導(dǎo)表達(dá)及rolGLP-HV的純化。選取NK-rolGLP-HV-E007 菌株，37°C、230r 搖瓶培養(yǎng)到 OD6tltl 為 O. 6 O. 8 時(shí)添加終濃度為lmmol/L誘導(dǎo)劑IPTG，在25°C條件下誘導(dǎo)12h，離心取菌體進(jìn)行超聲破碎，抽提蛋白進(jìn)行Tricine-SDS電泳檢測(cè)證明成功表達(dá)rolGLP-HV (圖6A)。超聲處理后的上清液進(jìn)行親和層析(Ni-NTA層析柱)純化處理，獲得高純度的rolGLP-HV(圖6B)。Western blot結(jié)果(圖6C)表明，構(gòu)建的大腸桿菌已成功表達(dá)rolGLP-HV。實(shí)施例4rolGLP-HV用于血栓的預(yù)防和治療。(I)血栓小鼠模型的建立在小鼠背部皮下注射卡拉膠可以誘使小鼠在24h之內(nèi)尾部出現(xiàn)明顯的血栓。選擇50mg/kg的劑量在昆明小鼠(清潔級(jí))后背后皮下注射卡拉膠稀釋液，雙功能融合蛋白處理組在注射卡拉膠的同時(shí)口服灌胃20mg/Kg劑量的rolGLP-HV，然后觀察小鼠尾部皮膚變化情況，根據(jù)其顏色變化時(shí)間、變化程度以及尾部血栓出現(xiàn)的程度(即相對(duì)長(zhǎng)度)來(lái)判斷血栓形成情況及roIGLP-HV的抗血栓活性(表I和表2)。(2)結(jié)果表明，灌胃rolGLP-HV可有效發(fā)揮抗血栓、延緩血栓出現(xiàn)的功效，使小鼠尾部血栓形成時(shí)間從一般的24h延遲至32h，尾部血栓相對(duì)長(zhǎng)度從37. 5%減少至25%左右(圖 7)。表I表不不同處理的小鼠尾部出現(xiàn)血栓的時(shí)間。
權(quán)利要求
1.一種rolGLP-HV融合基因，該融合基因包含長(zhǎng)效胰高血糖素-l(rolGLP-l)基因和水蛭素rHVl基因,其DNA堿基序列為 1020304050607080 CAHCTGAGG GTACITTCAC πΟ Α ΓΤ TOCTOCTACT TGGAGGGTCA GGCTGCTCM GAGTTCATOG CTTGGTTGGT GTMGACTOC CATGAMGTG MGACTACM AGGAGGATGA A0CT00CAGT OOGAOGAGn CTCMGTAGC GMOCMOCA 90 100110120130140150 160 TGATGGTAGA GTTGTCTACA CTGACTGTAC TGMTCTGGT CAAMCTTGT GTTTGTGTGA AGCTTOCMC GTTTGTGGTC ACTA0CATCT CMCAGATGT GACTGACATG ACTTAGAOCA GTTTTGMCA CAMCACACT TOCMGGTTG CAMCAOCAG 170 180190200210220230 240MGGTMCM GTGTATCTTG GCTTCTGAOG GTGAGMGM OCMTGTGH ACTGGTGAGG GTACTOCTM GCCACMTOCποοΑτταπ cacatagmc ocmgactgc cactcttctt gghacacm tgaocactoc catgaggah oggiuttagg 250 260270280290300310320CATAACGACG GTGACTTCGA GGAGATTCCA GAGGAATACT TGCAAGTATTGCTGC CACTGAAGCT CCTCTAAGGT CTCCTTATGA ACGTT編碼的氨基酸序列為[His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-The-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Gln-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Asp-Gly-Arg-Val-Val-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Lys-Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-IIe-Leu-Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-CyS-Val-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-IIe-Pro-Glu-GLu-Tyr-Leu-Glη]
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的rolGLP-HV融合基因，其特征在于融合基因中rolGLP-Ι基因編碼產(chǎn)物C端的最后一個(gè)氨基酸是Arg，其恰好是胰蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)，保證ioIGLP-HV 口服后被胃腸道內(nèi)胰蛋白酶無(wú)損失切割為完整的rolGLP-Ι和IflV1獨(dú)立發(fā)揮功能。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的rolGLP-HV融合基因，其特征在于利用DNA合成技術(shù)將天然胰高血糖素樣肽-I的第8、26、34位Ala、Lys、Lys分被替換為Ser、Gln、Asp,從而消除了基因內(nèi)部的二肽酶IV和胰蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)。
4.一種表達(dá)載體,其特征在于該表達(dá)載體包含權(quán)利要求I所述的融合基因rolGLP-HV,具體是指大腸桿菌表達(dá)載體pNK-EC-roIGLP-HV。
5.一種工程菌株，其特征在于，是用權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體pNK-EC-roIGLP-HV轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)所獲得的工程菌株NK-rolGLP-HV-E007。
6.一種含有權(quán)利要求I所述rolGLP-HV融合基因的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于該方法包括 1)通過(guò)平端相連的方法獲得權(quán)利要求I所述的融合基因rolGLP-HV； 2)將rolGLP-HV融合基因克隆到表達(dá)載體pET22b(+)中獲得權(quán)力要求4所述的大腸桿菌表達(dá)載體 pNK-EC-roIGLP-HV ； 3)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，通過(guò)篩選得到權(quán)利要求5中所述的高表達(dá)工程菌株NK-rolGLP-HV-E007o
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述，rolGLP-HV可作為一種用于預(yù)防和治療2型糖尿病及其引發(fā)的血栓并發(fā)癥的雙功能口服藥物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所示用途，用于糖尿病及其并發(fā)癥患者的預(yù)防和治療方法，或者作為藥物組合的一個(gè)組分。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)治療糖尿病及血栓并發(fā)癥的雙功能藥物(rolGLP-HV)工程菌的構(gòu)建、制備方法和應(yīng)用技術(shù)。將對(duì)2型糖尿病具有“治標(biāo)治本”療效的長(zhǎng)效促胰島素rolGLP-1與有效防治其心腦血管并發(fā)癥的水蛭素rHV1融合，使其具有預(yù)防和治療糖尿病及血栓并發(fā)癥的雙重功能。具體來(lái)說(shuō)，應(yīng)用基因工程技術(shù)獲得rolGLP-1和rHV1的融合基因rolGLP-HV，并將其克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET22b(+)，構(gòu)建表達(dá)載體pNK-EC-rolGLP-HV，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得高表達(dá)rolGLP-HV的工程菌NK-rolGLP-HV-E007。該菌株通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)和純化可獲得高純度rolGLP-HV。胡氏血栓模型小鼠灌胃rolGLP-HV，可顯著減緩其尾部血栓出現(xiàn)的時(shí)間和程度；糖尿病模型小鼠灌胃rolGLP-HV，可明顯降低血糖水平并改善糖尿病癥狀，因此，本發(fā)明可用于開(kāi)發(fā)同時(shí)治療糖尿病及其血栓并發(fā)癥的雙功能藥物。
文檔編號(hào)A61P7/02GK102839185SQ20111016653
公開(kāi)日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2011年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月21日
發(fā)明者李明剛, 衛(wèi)一鳴, 王維婧, 馬百成, 胡曉宇, 張耀方, 喬坤艷, 李寵, 馬志華 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)