專利名稱：黃秋葵果實(shí)中兩個(gè)活性黃酮苷的制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于提取分離技術(shù)領(lǐng)域，具體為黃秋葵果實(shí)中兩個(gè)活性黃酮苷的制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
黃秋葵為錦葵科秋葵屬植物，在我國(guó)南北方地區(qū)均有栽培。黃秋葵被許多國(guó)家定為運(yùn)動(dòng)員的首選蔬菜及老年人的保健食物，在美國(guó)和日本等國(guó)家被稱為“植物偉哥”及“綠色人參”，是一種具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的優(yōu)良的食療保健蔬菜。黃秋葵中含有黃酮、多糖、果膠、微量元素、氨基酸等多種功效成分，具有抗疲勞、 增強(qiáng)人體免疫力，保肝強(qiáng)腎，抗衰老、降低血糖、幫助消化、清火明目、健胃潤(rùn)腸等方面的作用。黃秋葵因其良好的功能和保健作用越來(lái)越受到人們的喜愛(ài)。對(duì)黃秋葵進(jìn)行深加工可以提高其附加值。但黃秋葵果實(shí)的采收具有一定的季節(jié)性，嫩果作為保健蔬菜存在保質(zhì)期短， 不便長(zhǎng)期保存的弊端。因此需要將黃秋葵嫩果進(jìn)行精深加工、以提高其附加值及資源利用率。黃秋葵果實(shí)中含有大量的黃酮類成分，已知黃酮類化合物是一類存在于植物界的重要的生物活性物質(zhì)，據(jù)研究報(bào)道，它不僅能作為防治心腦血管疾病的藥物，而且有明顯的抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抗衰老、清除自由基，降血脂、降低膽固醇、降血糖，抗癌防癌、免疫調(diào)節(jié)等生理活性，是一種在人類的營(yíng)養(yǎng)、健康和防治疾病方面有著廣闊應(yīng)用前景的藥物，也是應(yīng)用廣泛的天然抗氧劑和防腐劑，可用于保健食品和化妝品，因此具有很好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。目前未見(jiàn)有對(duì)黃秋葵果實(shí)進(jìn)行其黃酮苷類化合物的分離鑒定及生物活性研究的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種黃秋葵果實(shí)中兩個(gè)活性黃酮苷的制備方法及其用途的技術(shù)方案，具有工藝操作簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低、收得率及純度高，無(wú)污染、易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，制得的兩個(gè)黃酮苷具有很好抗氧化及抑菌活性，適合用做中藥化學(xué)對(duì)照品、醫(yī)藥原料，也可用做保健品、食品添加劑等。所述的黃秋葵果實(shí)中兩個(gè)活性黃酮苷的制備方法，其特征在于包括以下步驟
1)原料的處理取黃秋葵嫩果，以橫段面切片后曬干或風(fēng)干，備用；
2)滲漉提取將干燥的片狀黃秋葵果實(shí)裝入滲漉筒中，用折合黃秋葵干燥果實(shí)1 2倍量的40% 70%含水乙醇浸潤(rùn)4飛小時(shí)后裝入滲漉桶中，用折合黃秋葵干燥果實(shí)10 18 倍量的50% 70%含水乙醇進(jìn)行滲漉提取，調(diào)節(jié)流速，以8 15 mL/min流速收集滲漉提取液；
3)閃蒸濃縮將滲漉提取液在水浴溫度60 70°C，真空度為0.090 Mpa 0. 095 Mpa 的條件下采用真空薄膜濃縮裝置進(jìn)行閃蒸濃縮，調(diào)節(jié)待濃縮液的進(jìn)液速度，以150 350 mL · HiirT1的流量反復(fù)濃縮，得到折合每毫升濃縮液含0. 5 1. 0克原藥材的濃縮液；
4)脫色除雜處理將濃縮液用石油醚萃取脫色除雜3 4次，每次用量為濃縮液與石油醚的體積比為1:1 1:3，將石油醚萃取液合并后進(jìn)行真空濃縮，回收石油醚，萃取脫色后得到的濃縮液備用；
5)醇沉轉(zhuǎn)移出多糖與果膠在上述濃縮液中加入95%的工業(yè)酒精調(diào)整至濃縮液中乙醇濃度達(dá)到70% 80%，放置過(guò)夜，析出多糖與果膠沉淀，將沉淀物轉(zhuǎn)移出去另行利用，得到除糖后的濃縮液；
6)繼續(xù)真空濃縮得到除糖后的濃縮液繼續(xù)在50°C以下真空閃蒸濃縮，得到折合每毫升濃縮液含1. 5 2. 0克原藥材的濃縮液；
7)大孔樹(shù)脂分離富集得到的濃縮液通過(guò)DiaionHP-20大孔吸附樹(shù)脂柱色譜分離富集，然后先用H2O洗脫，再依次用10% 70%含水甲醇或含水乙醇進(jìn)行梯度洗脫，最后用70% 丙酮洗脫，分別收集3倍柱體積的各部位洗脫液，合并20%飛0%含水甲醇或含水乙醇部位的洗脫液，將合并的洗脫液在50°C以下真空閃蒸濃縮，得到洗脫濃縮液；
8)凝膠樹(shù)脂分離純化將上述合并的洗脫濃縮液繼續(xù)通過(guò)ToyopearlHW-40柱色譜， 以H20、20%含水甲醇或含水乙醇、40%含水甲醇或含水乙醇、60%含水甲醇或含水乙醇、70% 丙酮梯度洗脫；
9)步驟8)中20%含水甲醇或含水乙醇洗脫部位減壓濃縮干燥后，溶于少量水后通過(guò) MCI gel CHP-20 P柱色譜，以H2O及不同濃度的含水甲醇或含水乙醇梯度洗脫，TLC檢識(shí)， 相同流分合并，得化合物2的淺黃色結(jié)晶；
10)步驟8)中40%含水甲醇或含水乙醇部位通過(guò)kphadexLH-20柱色譜，以水及不同濃度的含水甲醇梯度洗脫，TLC檢識(shí)，相同流分合并，得化合物1的的淺黃色粗品。
所述的黃秋葵果實(shí)中兩個(gè)活性黃酮苷的制備方法，其特征在于所述的化合物1為 5, 7,3' ,4'-四羥基-4' ‘ -0 -甲基-3-0-β-D-葡萄糖黃酮苷，其結(jié)構(gòu)式為
權(quán)利要求
1.黃秋葵果實(shí)中兩個(gè)活性黃酮苷的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)原料的處理取黃秋葵嫩果，以橫段面切片后曬干或風(fēng)干，備用；2)滲漉提取將干燥的片狀黃秋葵果實(shí)裝入滲漉筒中，用折合黃秋葵干燥果實(shí)1 2倍量的40% 70%含水乙醇浸潤(rùn)4飛小時(shí)后裝入滲漉桶中，用折合黃秋葵干燥果實(shí)10 18 倍量的50% 70%含水乙醇進(jìn)行滲漉提取，調(diào)節(jié)流速，以8 15 mL/min流速收集滲漉提取液；3)閃蒸濃縮將滲漉提取液在水浴溫度60 70°C，真空度為0.090 Mpa 0. 095 Mpa 的條件下采用真空薄膜濃縮裝置進(jìn)行閃蒸濃縮，調(diào)節(jié)待濃縮液的進(jìn)液速度，以150 350 mL · HiirT1的流量反復(fù)濃縮，得到折合每毫升濃縮液含0. 5 1. 0克原藥材的濃縮液；4)脫色除雜處理將濃縮液用石油醚萃取脫色除雜3 4次，每次用量為濃縮液與石油醚的體積比為1:1 1:3，將石油醚萃取液合并后進(jìn)行真空濃縮，回收石油醚，萃取脫色后得到的濃縮液備用；5)醇沉轉(zhuǎn)移出多糖與果膠在上述濃縮液中加入95%的工業(yè)酒精調(diào)整至濃縮液中乙醇濃度達(dá)到70% 80%，放置過(guò)夜，析出多糖與果膠沉淀，將沉淀物轉(zhuǎn)移出去另行利用，得到除糖后的濃縮液；6)繼續(xù)真空濃縮得到除糖后的濃縮液繼續(xù)在50°C以下真空閃蒸濃縮，得到折合每毫升濃縮液含1. 5 2. 0克原藥材的濃縮液；7)大孔樹(shù)脂分離富集得到的濃縮液通過(guò)DiaionHP-20大孔吸附樹(shù)脂柱色譜分離富集，然后先用H2O洗脫，再依次用10% 70%含水甲醇或含水乙醇進(jìn)行梯度洗脫，最后用70% 丙酮洗脫，分別收集3倍柱體積的各部位洗脫液，合并20%飛0%含水甲醇或含水乙醇部位的洗脫液，將合并的洗脫液在50°C以下真空閃蒸濃縮，得到洗脫濃縮液；8)凝膠樹(shù)脂分離純化將上述合并的洗脫濃縮液繼續(xù)通過(guò)ToyopearlHW-40柱色譜， 以H20、20%含水甲醇或含水乙醇、40%含水甲醇或含水乙醇、60%含水甲醇或含水乙醇、70% 丙酮梯度洗脫；9)步驟8)中20%含水甲醇或含水乙醇洗脫部位減壓濃縮干燥后，溶于少量水后通過(guò) MCI gel CHP-20 P柱色譜，以H2O及不同濃度的含水甲醇或含水乙醇梯度洗脫，TLC檢識(shí)， 相同流分合并，得化合物2的淺黃色結(jié)晶；10)步驟8)中40%含水甲醇或含水乙醇部位通過(guò)kphadexLH-20柱色譜，以水及不同濃度的含水甲醇梯度洗脫，TLC檢識(shí)，相同流分合并，得化合物1的的淺黃色粗品。
2.如權(quán)利要求1所述的黃秋葵果實(shí)中兩個(gè)活性黃酮苷的制備方法，其特征在于所述的化合物1為5，7，3' ,4'-四羥基-4' ‘ -0 -甲基-3-0-β-D-葡萄糖黃酮苷，其結(jié)構(gòu)式為
3.如權(quán)利要求1所述的黃秋葵果實(shí)中兩個(gè)活性黃酮苷的制備方法，其特征在于所述的化合物2為5，7，3' ,4'-四羥基-3-0-[β-D-葡萄糖基-(1 — 6)]-β-D-葡萄糖黃酮苷， 其結(jié)構(gòu)式為
4.如權(quán)利要求1所述的黃秋葵果實(shí)中兩個(gè)活性黃酮苷的制備方法，其特征在于步驟2) 中浸潤(rùn)所用的含水乙醇濃度為45% 65%，優(yōu)選50% 60% ；滲漉提取時(shí)所用的含水乙醇濃度為55% 65%，優(yōu)選58% 60%;滲漉提取時(shí)流速為l(Tl4mL/min，優(yōu)選1廣12 mL/mirio
5.如權(quán)利要求1所述的黃秋葵果實(shí)中兩個(gè)活性黃酮苷的制備方法，其特征在于步驟3) 中進(jìn)液速度為 200 300 mL · min_1,220 洸0 mL · mirT1。
6.如權(quán)利要求1所述的黃秋葵果實(shí)中兩個(gè)活性黃酮苷的制備方法，其特征在于步驟4) 中濃縮液與石油醚的體積比為1:1 1:2。
7.如權(quán)利要求1所述的黃秋葵果實(shí)中兩個(gè)活性黃酮苷的制備方法，其特征在于步驟7) 中先用H2O洗脫，再依次用10%含水甲醇或含水乙醇、20%含水甲醇或含水乙醇、40%含水甲醇或含水乙醇、60%含水甲醇或含水乙醇、70%含水甲醇或含水乙醇進(jìn)行梯度洗脫，最后用70%丙酮洗脫，分別收集3倍柱體積的各部位洗脫液，合并20%含水甲醇或含水乙醇、40% 含水甲醇或含水乙醇、60%含水甲醇或含水乙醇部位的洗脫液。
8.如權(quán)利要求1所述的黃秋葵果實(shí)中兩個(gè)活性黃酮苷的制備方法，其特征在于步驟7) 中先用H2O洗脫，再依次用10%含水甲醇或含水乙醇、25%含水甲醇或含水乙醇、45%含水甲醇或含水乙醇、65%含水甲醇或含水乙醇、70%含水甲醇或含水乙醇進(jìn)行梯度洗脫，最后用70%丙酮洗脫，分別收集3倍柱體積的各部位洗脫液，合并25%含水甲醇或含水乙醇、45% 含水甲醇或含水乙醇、65%含水甲醇或含水乙醇部位的洗脫液。
9.如權(quán)利要求1所述的黃秋葵果實(shí)中兩個(gè)活性黃酮苷的制備方法，其特征在于步驟7) 中先用H2O洗脫，再依次用15%含水甲醇或含水乙醇、30%含水甲醇或含水乙醇、40%含水甲醇或含水乙醇、55%含水甲醇或含水乙醇、70%含水甲醇或含水乙醇進(jìn)行梯度洗脫，最后用70%丙酮洗脫，分別收集3倍柱體積的各部位洗脫液，合并15%含水甲醇或含水乙醇、30% 含水甲醇或含水乙醇、40%含水甲醇或含水乙醇部位的洗脫液。
10.如權(quán)利要求1所述的黃秋葵果實(shí)中兩個(gè)活性黃酮苷在制備防治抗氧化試驗(yàn)、抑菌制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
黃秋葵果實(shí)中兩個(gè)活性黃酮苷的制備方法及其用途,屬于提取分離技術(shù)領(lǐng)域。以黃秋葵果實(shí)為原料，采用滲漉提取、閃蒸濃縮、萃取脫色、醇沉轉(zhuǎn)移出多糖及果膠，繼續(xù)真空濃縮、通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂柱分離富集、再結(jié)合凝膠樹(shù)脂柱色譜技術(shù)從中分離得到5,7,3′,4′-四羥基-4′′-O-甲基-3-O-β-D-葡萄糖黃酮苷和5,7,3′,4′-四羥基-3-O-[β-D-葡萄糖基-(1→2)]-β-D-葡萄糖黃酮苷兩個(gè)單體化合物，提取率分別為3.62％~8.66%和8.01％～12.98%，純度均達(dá)到95％以上。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低，制得的兩個(gè)黃酮苷具有很好抗氧化及抑菌活性。
文檔編號(hào)A61K31/7048GK102250170SQ201110129709
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月19日
發(fā)明者廖海兵, 林曉春, 殷明文, 袁珂 申請(qǐng)人:浙江農(nóng)林大學(xué)