專利名稱：基于hca587抗原的長肽及其在制備抗腫瘤藥物方面的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學腫瘤學技術領域，具體涉及一種基于HCA587抗原的長肽及其在制備抗腫瘤藥物方面的應用。
背景技術：
腫瘤發(fā)病率、死亡率呈逐年上升趨勢，目前癌癥已經(jīng)成為嚴重威脅人類健康的頭號殺手。盡管腫瘤的手術治療、化療和放射治療不斷取得進展，但仍然有相當比例的患者不治。近年來，隨著人們對腫瘤的分子機理和免疫機制的不斷揭示，腫瘤特異的免疫治療日益受到重視。要進行腫瘤的免疫治療，首先需要得到腫瘤抗原。在二十世紀的最后十年，隨著免疫學理論方法和分子生物學方法的飛速發(fā)展，克隆腫瘤抗原已成為腫瘤免疫研究及治療的重要方面。大量可以誘導機體免疫應答的腫瘤抗原的發(fā)現(xiàn)，為腫瘤的免疫治療開辟了新的紀元。目前鑒定的大部分腫瘤抗原既表達于腫瘤組織，也表達于正常組織，屬于腫瘤相關抗原。只有極少部分的腫瘤抗原屬于腫瘤特異性抗原，這類腫瘤抗原是免疫治療的理想候選抗原。近年發(fā)現(xiàn)的腫瘤組織特異表達的腫瘤-睪丸抗原(cancer-testis antigen,CT 抗原)是一類新的腫瘤特異抗原，它在腫瘤組織廣泛表達，在正常組織只表達于睪丸，而睪丸屬于免疫豁免區(qū)，所以此類腫瘤抗原具有潛在的臨床應用價值，已成為當前腫瘤免疫學的研究熱點。常用的疫苗種類包括蛋白疫苗、表位疫苗、DC疫苗等。新近興起的長肽疫苗備受矚目，已有動物實驗證實長肽疫苗具有良好的抗腫瘤作用，臨床試驗也顯示長肽疫苗用于腫瘤患者治療，無嚴重毒性作用，且能誘導患者產(chǎn)生很好的免疫應答。在HPV16誘導的宮頸癌臨床前研究中，分別給予小鼠HPV16 E743-77長肽疫苗和HPV16 E7 49_57Tc表位肽治療， E7 43-77長肽疫苗治療可清除HPV16陽性的腫瘤細胞，而使用表位肽疫苗治療并不能使腫瘤消退。在長肽疫苗的臨床I/II期試驗中，給予術后晚期宮頸癌患者13條長肽(每條長肽為27-35個氨基酸，覆蓋HPV16 E6和E7全長)與ISA51的乳化物，全部患者均可檢測到 HPV16 E6和/或HPV16 E7特異的⑶4和⑶8T細胞免疫應答，這些特異的細胞免疫應答可在體內(nèi)維持較長時間，在末次免疫后的第12個月仍能檢測到細胞免疫應答的存在。在應用 P53長肽疫苗治療轉(zhuǎn)移性結直腸癌的臨床I/II期試驗中，在治療的9/10個患者中均可檢測到P53特異的細胞免疫應答。以上臨床試驗中所有受試患者均未出現(xiàn)明顯的毒性反應。長肽疫苗中的多肽片段一般是由大于20個氨基酸的肽段組成，較表位肽長(I類分子表位肽通常為9-10個氨基酸，II類分子表位肽一般為13-15個氨基酸)，所以長肽進入體內(nèi)后必須經(jīng)活化的專職APC加工提呈使T細胞有效活化，而不能像表位肽那樣可直接結合在表達MHC分子的細胞上，這樣可以減少免疫耐受的發(fā)生。長肽片段中存在多個表位，同時含有Tc和Th表位，有利于CD4、CD8T細胞和樹突狀細胞(DC)之間的相互作用，更有效的產(chǎn)生特異、持久的細胞免疫應答。此外，長肽疫苗能克服表位肽疫苗應用受人群MHC型別限制的不足，擴大了長肽疫苗在人群中的應用范圍。由于長肽疫苗具有表位肽疫苗無法比擬的優(yōu)勢，將有可能取代表位疫苗用于腫瘤患者的免疫治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的 在于提供一種基于HCA587抗原的長肽。本發(fā)明的目的還在于提供一種基于HCA587抗原的長肽疫苗。本發(fā)明的目的還在于提供一種基于HCA587抗原的長肽在制備抗腫瘤藥物方面的應用。一種基于HCA587抗原的長肽，其特征在于，所述長肽誘導分泌IFN- γ的Thl型細胞免疫應答和體液免疫應答。所述長肽的氨基酸序列如SEQ ID No. USEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、 SEQ ID No. 5,SEQ ID No. 6,SEQ ID No. 7,SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9,SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 13 或 SEQ ID No. 14 所示。一種基于HCA587抗原的長肽疫苗，其特征在于，由權利要求1_2所述任一長肽與完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、ISCOM佐劑、CpG 0DN-1826中的一種或多種混合乳化構成。所述長肽疫苗的總體積為100-200 μ 1，其中，長肽的用量為20-50 μ g，ISCOM佐劑的用量為 12 μ g, CpG 0DN-1826 的用量為 12 μ g、20 μ g 或 50 μ g。一種基于HCA587抗原的長肽在制備抗腫瘤藥物方面的應用。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的長肽在CFA和CpG1826的共同作用下能誘導產(chǎn)生 HCA587特異的CD4T細胞應答，并且能夠?qū)57BL/6荷瘤小鼠產(chǎn)生抗腫瘤效果，抑制腫瘤的生長和延長小鼠的生存期，HCA587長肽免疫誘導產(chǎn)生的特異性⑶4T細胞分泌的IFN- γ在其抗腫瘤的保護作用中發(fā)揮了極其重要的作用，本發(fā)明為HCA587長肽疫苗的臨床應用奠定了科學基礎。


圖1免疫后小鼠脾細胞產(chǎn)生IFN-Y的細胞頻數(shù)；圖中，HIV-對照肽、OVA-對照蛋白、HCA587-HCA587蛋白、SLP-HCA587 長肽、 SLP+CFA+CpG-HCA587長肽加弗氏完全佐劑加CpG免疫組、SLP+IFA+CpG_HCA587長肽加不完全弗氏佐劑加CpG免疫組、SLP+ISC0M+CpG-HCA587長肽加ISCOM加CpG免疫組、SLP+CpG-HCA587長肽加CpG免疫組、SLP+CFA-HCA587長肽加弗氏完全佐劑免疫組、 SLP+IFA-HCA587長肽加不完全弗氏佐劑免疫組。圖2免疫后小鼠脾細胞分泌IFN- γ的⑶4細胞頻率；圖中，HIV-對照肽、OVA-對照蛋白、HCA587-HCA587 蛋白、SLP-HCA587 長肽。圖3免疫后小鼠脾細胞分泌IFN- γ的⑶8細胞頻率；圖中，HIV-對照肽、OVA-對照蛋白、HCA587-HCA587 蛋白、SLP-HCA587 長肽。圖4接受不同免疫方案的小鼠血清中抗HCA587抗體的檢測；圖中，SLP+CFA+CpG_HCA587長肽加弗氏完全佐劑加CpG免疫組、 SLP+IFA+CpG-HCA587長肽加不完全弗氏佐劑加CpG免疫組、SLP+ISC0M+CpG_HCA587長肽加 ISCOM加CpG免疫組、SLP+CpG-HCA587長肽加CpG免疫組、SLP+CFA-HCA587長肽加弗氏完全佐劑免疫組、SLP+IFA-HCA587長肽加不完全弗氏佐劑免疫組。圖5荷瘤小鼠給予長肽疫苗治療后生存期的監(jiān)測；圖中，untreated-未治療組，control-佐劑對照組，SLP-HCA587長肽組。圖6荷瘤小鼠給予長肽疫苗治療后腫瘤生長速度的監(jiān)測；圖中，untreated-未治療組，control-佐劑對照組，SLP-HCA587長肽組。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。以下實施例所用的C57BL/6小鼠由北京大學醫(yī)學部動物中心飼養(yǎng)繁育；小鼠黑色素瘤細胞系B16的穩(wěn)定表達HCA587的D12細胞培養(yǎng)傳代于10% FBSDMEM ；長肽(SLP)由杭州中肽公司和上海吉爾公司合成；完全(CFA)弗式佐劑和不完全弗式佐劑(IFA)購自 Sigma-Aldrich 公司；具有免疫刺激活性的 CpG 0DN-1826 (5，-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3，) 由上海生工技術公司合成；免疫刺激復合物ISCOM AbISGOa-100購自瑞典的ISCONOVAAB 公司；熒光標記的抗小鼠的⑶8抗體和⑶4抗體購自美國的BD公司；PE標記的抗小鼠 IFN-Y抗體來自Biolegend公司；胞內(nèi)染色所需的固定通透試劑Fixation buffer和 IOXpermeabilization buffer 購自 Biolegend 公司；ELISpot 實驗中所用的抗小鼠 γ-干擾素(IFNy)抗體、生物素標記的抗小鼠IFNy 二抗、堿性磷酸酶標記的鏈霉親和素購自 MABTECH公司；HR標記的抗小鼠IgG購自Promega公司。實施例1基于HCA587抗原的長肽疫苗免疫方案1、長肽(SLP)的合成、溶解與配制根據(jù)HCA587蛋白的序列信息(AF239802)，設計覆蓋HCA587第136至373位氨基酸的14條長肽，每條長肽為25-35個氨基酸，人工合成這些序列，合成序列為SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3，SEQ ID No. 5，SEQ ID No. 7，SEQ IDNo. 8，SEQ ID No. 9，SEQ ID No. 14 的長月太用 DMSO 溶解為 20μ g/ml，序列為 SEQ ID No. 10，SEQ ID No. 11，SEQ ID No. 12，SEQ ID No. 13的長肽用無菌PBS溶解為10 μ g/ml，序列為SEQ ID No. 2的長肽用無菌PBS溶解為 2. 5 μ g/ml，序列為 SEQ ID No. 4，SEQ ID No. 6 的長肽用無菌 PBS 溶解為 5 μ g/ml。2、長肽疫苗的制備及免疫方案方案一將SLP配成100 μ 1體積(每條長肽為20或50 μ g)，與100 μ 1的CFA或IFA乳化，制成長肽疫苗。首先給予6-8周的C57BL/6小鼠背部皮下注射20或50 μ g的CpG，同時皮下免疫200 μ 1的SLP與CFA/IFA的乳化物。21天后，小鼠再次皮下注射20或50 μ g的 CpG,同時皮下免疫200 μ 1的SLP與IFA的乳化物。在不含CpG的免疫方案中，僅給予SLP 與FA的乳化物，配制及免疫程序同上。二次免疫后第10天取小鼠脾臟檢測免疫應答情況。 方案二將SLP配成50 μ 1體積(每條長肽為20 μ g)，ISCOM為12 μ g，CpG為12 μ g，總體積為100μ 1的混合物，制成長肽疫苗，于小鼠尾根部皮下注射該長肽疫苗。21天后再次給予小鼠同樣的免疫。二次免疫后第10天檢測小鼠的免疫應答情況。方案三將SLP配成50 μ 1體積(每條長肽為20 μ g)，CFA、IFA或ISCOM為12 μ g，總體積為ΙΟΟμ 1的混合物，制成長肽疫苗，于小鼠尾根部皮下注射該長肽疫苗。21天后再次給予小鼠相同的免疫。二次免疫后第10天檢測小鼠的免疫應答情況。3、檢測IFN-Y分泌的酶聯(lián)免疫斑點實驗(ELISpot)包被96孔硝酸纖維素板先經(jīng)70%乙醇處理(15 μ 1/孔)，無菌水(100 μ 1/孔) 洗兩遍，再加入已稀釋好的包被抗體。將抗小鼠IFNy單克隆抗體ANlSWl 200稀釋至包被液，75 μ 1/孔，即0.375 μ g/孔的包被抗體。4°C包被過夜，避光。封閉將包被抗體甩掉，200 μ 1 0.05% PBST/孔洗板，洗3遍，加入250 μ 110% FBS RPMI1640/ 孔，37°C孵育 2 小時。樣品制備i細胞對照及肽免疫后小鼠處死，取脾，研磨，裂解紅細胞，10% FBSRPMI1640重懸，計數(shù)。每組小鼠的脾細胞按等比例混合，制備成5 X IO5全脾細胞/ΙΟΟμ 1 10 % FBS RPMI1640/孔的細胞懸液。 長肽(SLP)及HCA587的稀釋來源于HCA587的長肽按照方法1溶解后，用無血清RPMI1640將其稀釋至每個長肽2. 5 μ g/ml, 100 μ 1/孔，終濃度為1. 25 μ g/ml ；對照肽 HIV用無血清RPMI1640配成20 μ g/ml, 100 μ 1/孔，終濃度為10 μ g/ml ；HCA587和對照蛋白OVA用無血清RPMI1640配成20 μ g/ml，100 μ 1/孔，終濃度為10 μ g/ml。將封閉好的板子中的培基甩掉，按照實驗設計，分別加入制備好的細胞懸液和稀釋好的肽溶液。置37°C孵箱孵育20小時。檢測IFN Y分泌i生物素標記IFN γ檢測抗體將板中的樣品甩掉，200 μ 1 0. 05% PBST/孔洗板， 洗6遍，將生物素標記的抗小鼠IFNy檢測抗體R4-6A2-Biotin以1 1000稀釋至PBS， 100 μ 1/孔，即0. 1 μ g/孔。37°C孵育2小時。 鏈霉親和素標記的堿性磷酸酶將板中的抗體甩掉，200 μ 1 0. 05% PBST/孔洗板，洗6遍，將鏈霉親和素標記的堿性磷酸酶以1 1000稀釋至PBS，100 μ 1/孔，室溫孵育 1小時。iii顯色將板中的液體甩掉，200 μ 1 0. 05 % PBST/孔洗板，洗8遍，將 5_溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氮藍四唑(BCIP-NBT)底物顯色藥片溶于IOml雙蒸水中， 100 μ 1/孔，室溫孵育5min，看到藍色的點后，甩掉板中的顯色液，流水洗板，終止顯色。將板子置于干燥通風避光處，待干透后使用ELISpot斑點計數(shù)儀分析結果。4、胞內(nèi)細胞因子染色檢測IFN-Y的分泌體外肽刺激肽免疫的小鼠取脾，研磨，裂解紅細胞，10% FBS RPMI1640重懸，計數(shù)。每組小鼠的脾細胞按等比例混合，制備成5X106全脾細胞/ml。24孔板培養(yǎng)細胞，每孔加入5X IO6細胞，再以每個長肽1.25 μ g/ml的濃度加入細胞，6小時后，以1 1000的濃度加入BFA以封閉細胞因子的分泌。18小時后收獲細胞，進行下一步的染色步驟。表面染色收獲細胞，PBS 洗一遍，離心棄上清，ΙΟΟμ 1 PBS重懸細胞，1 300稀釋加入 CD4-PercP，CD8-FITC，4°C孵育 20min。固定表面染色結束后，PBS洗一遍，離心棄上清，500 μ 1 fixation buffer重懸細胞，室溫固定20min。通透固定結束后，離心棄上清，500 μ 1 IXpermeabilization buffer重懸細胞，室溫通透IOmin。胞內(nèi)IFN-Y 染色通透結束后，離心棄上清，PE標記的抗小鼠IFN-Y抗體以 1 800稀釋加入樣品，100μ 1/樣品，4°C孵育30min。染色結束后，PBS洗一遍，離心棄上清，PBS重懸，流式檢測。5、ELISA檢測免疫小鼠HCA587抗體的水平包被將HCA587蛋白稀釋至包被液，1 μ g/ml，100 μ 1/孔，即0. 1 μ g/孔，4°C包被過夜，避光。封閉將包被液體甩掉，200 μ 1 0. 05% PBST/孔洗板，洗3遍，加入含1 % BSA的 PBS 200μ 1/孔，37°C孵育 2 小時。血清樣本的稀釋及加樣將各小鼠血清按1 1000，1 5000,1 25000的比例稀釋至PBS中。將稀釋好的血清樣本按100 μ 1/孔加入板中。37°C孵育2小時。加入抗小鼠IgG-HRP 將樣本甩掉，200 μ 1 0. 05% PBST/孔洗板，洗6遍，HR標記的抗小鼠IgGWl 2500稀釋至PBS，200y 1/孔，37°C孵育1.5小時。顯色將二抗甩掉，200 μ 1 0.05% PBST/孔洗板，洗6遍，TMB顯色液100 μ 1/孔， 孵育1-2分鐘，陽性對照明顯可見，陰性對照未見時，加入2Μ H2SO4IOO μ 1/孔終止顯色。不同佐劑輔助SLP免疫應答的效果在小鼠二次接受長肽免疫后第10天檢測，收獲免疫小鼠的脾細胞，按照方法3的酶聯(lián)免疫斑點實驗(ELISpot)操作，結果見圖1，SLP在 CpG1826和CFA兩種佐劑的共同輔助下產(chǎn)生較強的SLP特異性的細胞免疫應答，同時也可檢測到較強的針對HCA587蛋白的特異細胞反應，免疫反應強度顯著高于HCA587SLP與CFA聯(lián)合使用或HCA587SLP與CpG1826聯(lián)用組；SLP在單獨的IFA的輔助下產(chǎn)生的分泌SLP特異性IFN- γ的細胞頻數(shù)較低，即使SLP在IFA及CpG1826的聯(lián)合作用下，也很難提高SLP特異性反應細胞的頻數(shù)，這就表明在我們的實驗體系中IFA對HCA587長肽的免疫應答的輔助作用較弱；對HCA587蛋白免疫應答有極佳作用的ISCOM佐劑對誘導長肽的免疫應答的效果亦不如CFA和CpG1826聯(lián)用效果好。這些結果表明HCA587長肽與CFA和CpG1826的聯(lián)合應用是最佳組合，能在體內(nèi)誘導產(chǎn)生強烈的免疫應答。小鼠在接受SLP與FA和CpG1826 二次免疫后第10天，取脾，胞內(nèi)細胞因子染色檢測CD4和CD8細胞分泌IFN- γ的情況。結果見圖2和圖3，免疫后小鼠的CD4細胞中有約3%的細胞在HCA587SLP刺激下分泌IFN- γ ,0. 79%的細胞在HCA587蛋白的刺激下產(chǎn)生 IFN-γ。而⑶8細胞中幾乎沒有檢測到IFN-Y的分泌。這個結果表明HCA587的長肽在 CFA和CpG1826的輔助作用下，誘導產(chǎn)生分泌IFN- γ的Thl型細胞免疫應答。對接受不同免疫方案的C57B6小鼠的血清抗HCA587抗體進行了檢測。結果見圖 4，HCA587SLP 與 CFA 和 CpG1826 聯(lián)用、HCA587SLP 與 CFA 組合、HCA587SLP 與 IFA 組合及 HCA587SLP與ISCOM和CpG1826聯(lián)用均可誘導較強的HCA587蛋白特異的體液免疫應答； HCA587SLP僅與CPG組合或HCA587SLP僅與IFA組合誘導產(chǎn)生的抗體應答均較弱。實施例2基于HCA587抗原的長肽在制備抗腫瘤藥物方面的應用1、SLP+CFA+CpG免疫方案的腫瘤治療模型6-8周的C57BL/6小鼠接種1. 5X104D12細胞，于第2天皮下給予20 μ g或50 μ g 的CpG及20 μ g SLP和CFA的乳化物，即第一次長肽免疫；第一次免疫后的21天，再次皮下給予20 μ g或50 μ g的CpG，20 yg SLP和IFA的乳化物。每隔一天觀測各組小鼠，測量腫瘤時記錄最長徑和最短徑。2、SLP+ISCOM+CpG免疫方案的腫瘤治療模型6-8周 的C57BL/6小鼠接種1. 5 X 104D12，于第7天尾根部皮下給予20 μ gSLP， 12 μ g ISCOM和12 μ g CpG的混合物，即第一次長肽免疫；第一次免疫后的21天，即28天， 再次尾根部皮下給予同第一次肽免疫的混合物。每隔一天觀測各組小鼠，測量腫瘤時記錄最長徑和最短徑。統(tǒng)計學分析采用log-rank檢驗方法分析不同治療的小鼠生存期；兩組小鼠腫瘤大小的比較采用非配對t檢驗。在接種腫瘤后第2天和22天給予SLP+CFA+CpG治療可降低小鼠的成瘤率且能顯著延長小鼠的生存期(如圖5所示)，SLP治療除了能改善小鼠的生存期，還可以控制腫瘤的大小，見圖6。實驗結果表明HCA587SLP在CFA和CpG1826兩種佐劑的輔助下，可以產(chǎn)生明顯的抗腫瘤作用。
權利要求
1.一種基于HCA587抗原的長肽，其特征在于，所述長肽誘導分泌IFN-γ的Thl型細胞免疫應答和體液免疫應答。
2.根據(jù)權利要求1所述一種基于HCA587抗原的長肽，其特征在于，所述長肽的氨基酸序列如 SEQ ID No. USEQ ID No. 2,SEQ ID No. 3,SEQ ID No. 4,SEQ ID No. 5,SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 12、 SEQ ID No. 13 或 SEQ ID No. 14 所示。
3.一種基于HCA587抗原的長肽疫苗，其特征在于，由權利要求1-2所述任一長肽與完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、ISCOM佐劑、CpG 0DN-1826中的一種或多種混合乳化構成。
4.根據(jù)權利要求3所述一種基于HCA587抗原的長肽疫苗，其特征在于，所述長肽疫苗的總體積為100-200 μ 1，其中，長肽的用量為20-50 μ g，ISCOM佐劑的用量為12 μ g，CpG 0DN-1826 的用量為 12 μ g、20 μ g 或 50 μ g。
5.一種基于HCA587抗原的長肽在制備抗腫瘤藥物方面的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于醫(yī)學腫瘤學技術領域的一種基于HCA587抗原的長肽及其在制備抗腫瘤藥物方面的應用。該長肽可誘導分泌IFN-γ的Th1型細胞免疫應答和體液免疫應答。本發(fā)明進一步公開了這些長肽在制備長肽疫苗及在制備抗腫瘤藥物方面的應用。
文檔編號A61K39/00GK102219835SQ20111010134
公開日2011年10月19日 申請日期2011年4月22日 優(yōu)先權日2011年4月22日
發(fā)明者尹艷慧, 張麗潔, 張毓 申請人:北京大學