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一種小干擾rna藥物的給藥系統(tǒng)和制劑的制作方法

文檔序號(hào):1207243閱讀:585來源:國知局
專利名稱:一種小干擾rna藥物的給藥系統(tǒng)和制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種聚乙二醇-聚乳酸或者聚乙二醇-聚(乳酸-乙醇酸)兩嵌段/三嵌段共聚物(兩親性高分子聚合物)和陽離子脂質(zhì)材料共同制備的小干擾RNA(SiRNA)的給藥系統(tǒng)和制劑。
背景技術(shù)
小干擾RNA具有特異性抑制致病基因表達(dá)的能力以及高效、多樣化的特征,近年來已經(jīng)在肝炎、艾滋病、老年性黃斑病變、禽流感以及癌癥等大量疾病的治療中顯示出良好的應(yīng)用前景。例如Calendo制藥公司研發(fā)的基于RNA干擾的CALAA-Ol制劑經(jīng)系統(tǒng)給藥后
在一期臨床試驗(yàn)中顯示出治療癌癥的效果。有理由相信,基于siRNA的RNA干擾療法在不久的將來就可能用于臨床治療。然而,在以治療人類疾病為目的的體內(nèi)siRNA給藥方面面臨著巨大挑戰(zhàn)。由于siRNA分子本身穿透細(xì)胞膜的能力極差,也不具備靶向功能,而且在生理環(huán)境中極不穩(wěn)定,因此目前siRNA藥物研發(fā)的瓶頸在于siRNA的給藥系統(tǒng)和技術(shù)。如何增強(qiáng)siRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性和穿透細(xì)胞膜的能力,以及增強(qiáng)疾病治療的細(xì)胞和組織靶向性等都是siRNA給藥系統(tǒng)急切需要解決的問題。因此siRNA的體內(nèi)給藥系統(tǒng)也已成為發(fā)展和實(shí)施RNA干擾療法的一個(gè)關(guān)鍵所在。目前用于siRNA給藥系統(tǒng)構(gòu)建的材料包括聚乙烯亞胺(PEI)、去了端肽的精制膠原、一些陽離子脂質(zhì)體,和化學(xué)合成的各種陽離子高分子等。這些載體分子與siRNA溶液互混后通過電荷相互作用得到二者的復(fù)合物,從而實(shí)現(xiàn)傳遞siRNA的目的。這類給藥系統(tǒng)面臨難以放大規(guī)模的問題,重復(fù)性較差。除了通過電荷相互作用與siRNA形成復(fù)合物從而實(shí)現(xiàn)siRNA給藥的系統(tǒng)和技術(shù)外,有部分研究報(bào)道了將siRNA包載在高分子中制備納米尺度制劑的方法,來實(shí)現(xiàn)siRNA的體內(nèi)給藥。這類納米顆粒一般利用聚乳酸、聚乙醇酸或者二者的共聚物來制備,不足之處在于siRNA的包封率非常低(低于30% ),載藥量很低,難以滿足臨床應(yīng)用的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種核酸藥物給藥載體,具體涉及一種利用兩親性高分子聚合物和陽離子脂質(zhì)材料共同制備的核酸藥物的給藥載體、載體制備方法和藥物組合物。這一給藥載體組合物具有極高的siRNA包封率,載藥量也大為提高。本發(fā)明將siRNA加入到可降解兩親性高分子載體和陽離子脂質(zhì)的溶液中,通過雙乳化的方法將siRNA包埋在納米顆粒中。加入的陽離子脂質(zhì)將siRNA的包封率提高到90%以上。這種方法不但可以制備高效包載siRNA納米顆粒,而且納米顆粒能有效進(jìn)入細(xì)胞,并從內(nèi)涵體逃逸,從而有效沉默致病靶基因的表達(dá),并在體內(nèi)抑制乳腺癌的生長。本發(fā)明所述的核酸藥物給藥載體由兩親性高分子共聚物和陽離子脂質(zhì)材料共同制備而成。所述兩親性高分子聚合物是指在一個(gè)大分子鏈上同時(shí)含有親水性和疏水性鏈段。所述兩親性嵌段共聚物中的親水性鏈段可以是聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺類、聚甲基丙烯酸氨基酯類、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸中的一種或兩種以上形成的任意均聚物或共聚物。所述兩親性嵌段共聚物中的疏水性鏈段可以是聚乳酸、聚己內(nèi)酯、聚乙交酯、聚氨基酸和聚磷腈中的一種或兩種以上形成的任意均聚物或共聚物。在一種較佳的實(shí)施方式中,兩親性高分子共聚物為聚乙二醇-聚乳酸或聚乙二醇-聚(乳酸-乙醇酸)兩嵌段/三嵌段共聚物,共聚物形式可以為PEG-PLA、PEG-PLGA、PLA-PEG-PLA、PLGA-PEG-PLGA。這種嵌段共聚物能夠在水介質(zhì)中自組裝成膠束或納米粒,相對(duì)疏水性的PLA或PLGA聚集成疏水性的核,PEG嵌段組裝成親水性的殼,具有穩(wěn)定膠束、有效躲避生物體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)的捕捉和蛋白質(zhì)吸附的作用。陽離子脂質(zhì)在此給藥系統(tǒng)中的主要作用是通過靜電相互作用提高核酸藥物在載體中的載藥量和包封率。在一較佳的實(shí)施方案中,陽離子脂質(zhì)材料優(yōu)選為銨鹽型的兩親性脂質(zhì)材料,例如可以為二甲基二(十八烷基)溴化銨鹽(DDAB) >1,2- 二肉蘧酸基-3- 二甲基銨丙燒、1,2- 二油酸基-3- 二甲基銨丙燒(DOTAP) ,1,2- 二油酰基-3-三甲基銨丙烷甲基硫酸鹽、I,2- 二棕櫚?;?3 —三甲基銨丙烷、1,2_ 二硬脂酰基-3-三甲基銨丙烷、N-(l-(2,3-二油酰氧基)丙基)_N,N,N-三甲基 氯化銨(DOTMA)、二肉豆蘧?;趸谆u基乙基溴化銨鹽(DMRIE)、二油酰氧基丙基二甲基羥基乙基溴化銨(DORIE)、二甲基二(十二烷基)溴化銨、N-(a-三甲基銨基乙?;?_ 二(十二燒基)-D-谷氨酸胺鹽酸鹽、N-(a_ 二甲基銨基乙酸基)-0,0’ -雙-(1H, 1H,2H, 2H-全氟癸燒基)-L-谷氨酸胺鹽酸鹽、0, 0’ -二(十二燒酸基)-N-(a_ 二甲基銨基乙酰基)二乙醇胺鹽酸鹽、甲基烯丙基二(十二烷基)溴化銨、N-{p-(w-三甲基銨基丁基氧基)_苯甲?;?十二燒基)~L 一谷氨酰胺鹽酸鹽、9-(w- 二甲基銨基丁基)-3,6-雙(十二烷?;?咔唑溴化物、二甲基二(十八烷基)銨鹽酸鹽、N-W-三甲基銨基癸酰基-二(十六烷基)-D-谷氨酰胺溴化物、N- {p- (w-三甲基銨基己基氧基)-苯甲?;鶀 - 二(十四烷基)-L 一谷氨酰胺溴化物、P- (w-三甲基銨基癸基氧基)-p’ -辛氧基偶氮苯溴化物鹽(MC-1-0810), p-{w-(b-羥基乙基)二甲基-銨基-癸基氧基}-P ’ -辛氧基偶氮苯溴化物鹽(MC-3-0810)、0,0’,0”,_三(十二烷酰基)-N-(w-三甲基-銨基癸?;?-三(羥基甲基)氨基甲烷澳化物鹽(TC-1-12),I,2- 二月桂基-甘油-3-乙基磷酸膽堿、I,2- 二肉豆蘧?;?甘油-3-乙基磷酸膽堿、I,2- 二棕櫚?;?甘油-3-乙基磷酸膽堿、I,2- 二硬脂?;?甘油-3-乙基磷酸膽堿、I,2- 二油?;?甘油-3-乙基磷酸膽堿、I-棕櫚?;?2-油酰基-甘油-3-乙基磷酸膽堿等。在本發(fā)明的更佳的實(shí)施方案中,陽離子脂質(zhì)優(yōu)選為N,N-二羥乙基-N-甲基-N-2-(膽固醇氧羰基氨基)乙基溴化銨(記為BHEM-Chol)、(2,3- 二油氧基丙基)三甲基氯化銨(記為D0TAP)等。所述聚乙二醇單嵌段的數(shù)均分子量為550 10000g/mol,聚乳酸或聚(乳酸-乙醇酸)嵌段的數(shù)均分子量為4800 51000g/mol。所述聚(乳酸-乙醇酸)嵌段中丙交酯/乙交酯單體的聚合度比例可為75/25 50/50。所述陽離子脂質(zhì)BHEM-Chol分子量為655. 5g/mol,所述陽離子脂質(zhì)DOTAP分子量為698. 5g/mol,所述陽尚子脂質(zhì)DOTMA分子量為670. 6g/mol。本發(fā)明基于這三種陽尚子脂質(zhì),而不限于這三種脂質(zhì),類似陽離子脂質(zhì)均可用于制備本發(fā)明所述的核酸藥物給藥載體,實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。上述嵌段共聚物,可為PEG55tl-PLA
28600、PEG2ooo—PLA125oo ^ PEG5000_PLA5000、PEGgggg-PLA25OOO'' PEGgggg-PLAg1Qgg-, PEG1Qggg-PLA15Qgg-, PEGjgggg-PLGAjggggfgg/gg) >PEG1Qggg-PLGAggggg (75/25)、PLAg3Qg-PEG1 gQO^LAgggg > PLA48Qg-PEGgggg-PLA48Qg > PLA48Qg-PEGlQggg-PLA48Qg,
但不限于上述組成。由上述兩親性高分子聚合物和陽離子脂質(zhì)材料共同制備的給藥載體能夠形成納米顆粒,所述納米顆粒的直徑為50-250nm。在較佳的實(shí)施方式中,本發(fā)明的納米顆粒表面可進(jìn)行化學(xué)修飾、抗體修飾或者配體修飾。本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物適用的核酸,對(duì)其種類或結(jié)構(gòu)沒有特殊的限定。作為該核酸的具體例,可以為siRNA,mRNA, tRNA, rRNA, cDNA, miRNA(微RNA)、核酶、反義寡核普酸、質(zhì)粒DNA、肽核酸、三鏈形成型寡核普酸(Triplex Forming Oligonucleotide,TF0)、基因等。其中,本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物在將siRNA向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)方面特別有效。本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體適用的核酸,可以是來自人、動(dòng)物、植物、細(xì)菌、病毒等的核酸,另外,也可以是通過化學(xué)合成制備的核酸。進(jìn)而,上述核酸可以是單鏈、雙鏈、三鏈中的任一 種,并且對(duì)其分子量也沒有特殊的限定。另外,本發(fā)明中,核酸可以為被化學(xué)、酶或肽修飾的核酸。本發(fā)明中,核酸可以單獨(dú)使用I種,也可以2種以上適當(dāng)?shù)亟M合使用。在一較佳的實(shí)施方式中,本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物優(yōu)選轉(zhuǎn)運(yùn)小干擾核酸(siRNA)或其類似物。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物,該組合物包含上述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物及核酸。藥物組合物中適用的核酸,對(duì)其種類或結(jié)構(gòu)沒有特殊的限定。作為該核酸的具體例,可以為siRNA、mRNA、tRNA、rRNA、cDNA、miRNA(微RNA)、核酶、反義寡核普酸、質(zhì)粒DNA、肽核酸、三鏈形成型寡核普酸(Triplex Forming Oligonucleotide,TF0)、基因等。在一較佳的實(shí)施方式中,優(yōu)選為小干擾核酸(siRNA)。在藥物組合物中,所述核酸、陽離子脂質(zhì)、兩親性高分子聚合物的用量為0. 2/1. 0/25. 0 I. 8/1. 0/25. 0,優(yōu)選為0. 2/1. 0/25. O。上述藥物組合物中,除核酸類藥物外,還可同時(shí)包載其它具有協(xié)同治療作用或者降低毒副作用的藥物。本發(fā)明還提供了上述藥物組合物的制備方法,所述方法包括如下步驟將兩親性嵌段共聚物和陽離子脂質(zhì)溶于油相(氯仿等)中,加入siRNA水溶液后超聲(80瓦,30秒)形成初始乳液,將初始乳液加入到水相中并再次超聲(80瓦,2分鐘)乳化,將乳液加入到水相中,減壓(1000帕)下除去有機(jī)溶劑,離心(4°C,30000g,lh)收集納米顆粒。本發(fā)明還提供了一種核酸導(dǎo)入方法,通過使上述藥物組合物與細(xì)胞接觸,將核酸導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)。所述細(xì)胞優(yōu)選為哺乳動(dòng)物細(xì)胞,更優(yōu)選為病理狀態(tài)下或非正常生理狀態(tài)下的哺乳動(dòng)物細(xì)胞,所述核酸優(yōu)選為小干擾核酸(siRNA)。本發(fā)明還提供了兩親性高分子聚合物和陽離子脂質(zhì)的組合在制備核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物中的用途及核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用,所述腫瘤優(yōu)選為乳腺腫瘤或者肝臟腫瘤。本發(fā)明使用的嵌段共聚物具有良好的生物相容性和可降解性,其物理、化學(xué)性能可通過調(diào)節(jié)聚合物的組成而調(diào)節(jié)。例如,增加聚合物中PLA比例時(shí),納米顆粒輸運(yùn)siRNA進(jìn)入細(xì)胞能力增加。有益效果本發(fā)明提供了一種利用兩親性嵌段聚合物通過雙乳化的方法制備包載siRNA的給藥系統(tǒng)和制劑。制備得到的納米顆粒具有良好的穩(wěn)定性,制備方法簡單,siRNA包封率和載藥量高,能保護(hù)siRNA免于降解,并能將核酸藥物高效率地轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)。另外,由于本發(fā)明提供的核酸藥物給藥載體具有較高的生物相容性和可降解性,因此對(duì)生物體的潛在毒性較低,具有高的生物安全性。該給藥系統(tǒng)和制劑主要適用于小干擾RNA和類似小核酸藥物的給藥制劑等領(lǐng)域。本發(fā)明利用上述給藥系統(tǒng)和制劑,輸送特異性siRNA,在細(xì)胞和動(dòng)物水平證明了其沉默靶基因表達(dá)的功效,以及沉默癌基因Plkl表達(dá)并抑制乳腺癌生長的效果。


圖I為聚合物和陽離子脂質(zhì)通過雙乳化方法制備得到的給藥系統(tǒng)的生物相容性檢測。圖2為包載FAM-siRNA的納米顆粒與IfepG2細(xì)胞培養(yǎng)2小時(shí)后在細(xì)胞內(nèi)分布的激光共聚焦顯微鏡照片。其中細(xì)胞內(nèi)紅色熒光來源于Alexa 568-phalloidin標(biāo)記的細(xì)胞骨架;綠色熒光來源于FAM-siRNA ;藍(lán)色熒光來源于DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核。圖3為包載SiPlkl的納米顆粒進(jìn)入HepG2細(xì)胞后下調(diào)Plkl的mRNA水平的效果圖。圖4為給藥系統(tǒng)在動(dòng)物水平的生物效應(yīng)評(píng)價(jià)效果圖。圖(A)為尾靜脈注射包載SiLuci的給藥系統(tǒng)抑制肝癌原位種植模型小鼠表達(dá)Iuciferase的效果圖;圖(B)為尾靜脈注射包載SiPlkl的給藥系統(tǒng)抑制小鼠原位植入乳腺癌生長的效果圖。圖5為半乳糖修飾的靶向給藥系統(tǒng)的構(gòu)建以及生物效應(yīng)評(píng)價(jià)的效果圖。圖(A)為H00C-PEG5_-PLA21Q3(^PGal-PEG5cicici-PLA21tl3c^ 1H NMR分析圖譜;圖⑶為流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢驗(yàn)革巴向給藥系統(tǒng)在Hepa 1-6細(xì)胞的內(nèi)吞;圖(C)為包載siapoB的祀向給藥系統(tǒng)進(jìn)入Hepal-6細(xì)胞后下調(diào)apoB的mRNA水平的效果圖;圖(D)為包載siapoB的祀向給藥系統(tǒng)輸運(yùn)siRNA沉默小鼠肝細(xì)胞apoB蛋白表達(dá)的效果圖。圖6為單鏈片段抗體修飾的靶向給藥系統(tǒng)的構(gòu)建以及生物效應(yīng)評(píng)價(jià)的效果圖。圖(A)為Mal-PEG5_-PLA22Q7Q的1H NMR分析圖譜;圖⑶為流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢驗(yàn)靶向給藥系統(tǒng)在BT474細(xì)胞的內(nèi)吞;圖(C)為包載SiPlkl的靶向給藥系統(tǒng)進(jìn)入BT474細(xì)胞后下調(diào)Plkl的mRNA水平的效果圖;圖(D)為尾靜脈注射包載SiPlkl的的靶向給藥系統(tǒng)抑制小鼠原位植入乳腺癌生長的效果圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述的核酸藥物給藥載體由兩親性高分子共聚物(A成分)和陽離子脂質(zhì)材料(B成分)共同制備而成。所述兩親性高分子聚合物是指在一個(gè)大分子鏈上同時(shí)含有親水性和疏水性鏈段。所述兩親性嵌段共聚物中的親水性鏈段可以是聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺類、聚甲基丙烯酸氨基酯類、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸中的一種或兩種以上形成的任意均聚物或共聚物。所述兩親性嵌段共聚物中的疏水性鏈段可以是聚乳酸、聚己內(nèi)酯、聚乙交酯、聚氨基酸和聚磷腈中的一種或兩種以上形成的任意均聚物或共聚物。這種嵌段共聚物能夠在水介質(zhì)中自組裝成膠束或納米粒,相對(duì)疏水性鏈段聚集成疏水性的核,相對(duì)親水性鏈段組裝成親水性的殼,具有穩(wěn)定納米顆粒、有效躲避生物體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)的捕捉和蛋白質(zhì)吸附的作用。陽離子脂質(zhì)在此給藥系統(tǒng)中的主要作用是通過靜電相互作用提高核酸藥物在載體中的載藥量和包封效率。作為本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物中使用的銨鹽型陽離子性脂質(zhì)(以下,有時(shí)也表示為“B成分”),只要在藥理學(xué)上允許即可,沒有特殊限制。作為其具體例,可以舉出二甲基二(十八烷基)溴化銨鹽(DDAB)、1,2- 二肉ii蘧酸基-3- 二甲基銨丙燒、1,2- 二油酸基-3- 二甲基銨丙燒(DOTAP)、I, 2- 二油?;?3-三甲基銨丙烷甲基硫酸鹽、I,2- 二棕櫚?;?3 —三甲基銨丙烷、I,2- 二硬脂?;?3-三甲基銨丙烷、N-(l-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨(D0TMA)、二肉豆蘧酰基氧基丙基二甲基羥基乙基溴化銨鹽(DMRIE)、二油酰氧基丙基二甲基羥基乙基溴化銨(DORIE)、二甲基二(十二烷基)溴化銨、N-(a-三甲基銨基乙酰基)-二(十二烷基)-D-谷氨酸胺鹽酸鹽、N- (a- 二甲基銨基乙酸基)-0, 0’ -雙-(1H, 1H, 2H, 2H-全氟癸燒基)-L-谷氨酰胺鹽酸鹽、0,0’-二(十二燒酰基)-N-(a_ 二甲基銨基乙?;?二乙醇胺鹽酸鹽、甲基烯丙基二(十二烷基)溴化 銨、N-{p-(w-三甲基銨基丁基氧基)-苯甲?;鶀-二(十二烷基)-L 一谷氨酰胺鹽酸鹽、9-(w-三甲基銨基丁基)-3,6-雙(十二烷酰基)咔唑溴化物、二甲基二(十八燒基)銨鹽酸鹽、Ni-二甲基銨基癸?;?二(十六燒基)-D-谷氨酰胺溴化物、N-{p-(w-三甲基銨基己基氧基)-苯甲?;鶀 - 二(十四烷基)-L 一谷氨酰胺溴化物、p-(w-三甲基銨基癸基氧基)_p’_辛氧基偶氮苯溴化物鹽(MC-1-0810)、p-{w-(b-輕基乙基)二甲基-銨基-癸基氧基}_p’ -辛氧基偶氮苯溴化物鹽(MC-3-0810)、0,0’,0”,-三(十二烷?;?-N-(w-三甲基-銨基癸酰基)-三(羥基甲基)氨基甲烷澳化物鹽(TC-1-12) >1,2- _■月桂基_甘油_3-乙基憐酸膽喊、I,2_ _■肉ii蓮酸基_甘油_3-乙基憐酸膽堿、I,2- 二棕櫚酰基-甘油-3-乙基磷酸膽堿、I,2- 二硬脂?;?甘油-3-乙基磷酸膽堿、I,2- 二油?;?甘油-3-乙基磷酸膽堿、I-棕櫚酰基-2-油?;?甘油-3-乙基磷酸膽堿等。上述銨鹽型陽離子性脂質(zhì)可以單獨(dú)使用I種,也可以任意組合2種以上使用。另外,本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物中,對(duì)(A)成分和(B)成分的配合比率沒有特殊的限制,從將核酸有效地轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的觀點(diǎn)考慮,相對(duì)于100重量份(A)成分,⑶成分可以為0-50重量份。另外,相對(duì)于本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體的總量,(A)成分和(B)成分的總量例如可以為10-99. 999重量%。本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物,除上述(A)及⑶成分之外,還可以含有油性基劑(以下,有時(shí)也稱為(C)成分)。配合油性基劑,利用其特性,由此能夠控制核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物的核酸導(dǎo)入效率。例如通過配合油性基劑調(diào)整核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物的比重,可以控制細(xì)胞和核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物的接觸性,改善體外的導(dǎo)入效率。另外,例如通過配合具有溫度感受性功能的油劑作為油性基劑,能夠在規(guī)定的溫度條件下使核酸載體的芯破碎,誘發(fā)細(xì)胞表面的波動(dòng),提高核酸的導(dǎo)入效率。進(jìn)而,例如通過配合具有外部刺激破碎性的油劑作為油性基劑,可以通過外部刺激使核酸載體組合物的芯破碎,誘發(fā)細(xì)胞表面的波動(dòng),提高核酸的導(dǎo)入效率。作為本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物中配合的油性基材,例如可以舉出,全氟化碳、全氟戊烷、溴代全氟辛烷、全氟己烷、全氟三丁基胺、大豆油、精制大豆油、氫化大豆油、大豆油非皂化物、角鯊烯、蓖麻油、丁香油、三油酸脫水山梨糖醇酯、松節(jié)油、紅花油、紅花油脂肪酸、油酸、棕櫚油、菜子油、雜醇油、橄欖油、亞麻仁油、芝麻油、葉綠素油、巴豆油、佛手油、雪松油、橙油、茴香油、桉樹油、玉米油、熏衣草油、馬郁蘭油、檸檬油、棉籽油、椰子油、蛋黃油、玫瑰花油、松油、杏仁油、花生油、山茶油、白樟油、春黃菊油、桂皮油、薄荷油、酯化玉米油、生姜油、羅馬春黃菊油、蛇油、留蘭香油、向日葵油、可可脂、小麥胚芽油、氧化鋅油、氫化油、氫化植物油、輕質(zhì)液體石蠟、液體石蠟、中鏈脂肪酸三甘油酯、貂油、苦橙油、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氫化蓖麻油、聚氧乙烯氫化蓖麻油10、聚氧乙烯氫化蓖麻油100、聚氧乙烯氫化蓖麻油20、聚氧乙烯氫化蓖麻油40、聚氧乙烯氫化蓖麻油5、聚氧乙烯氫化蓖麻油50、聚氧乙烯氫化蓖麻油60、聚氧基35蓖麻油、操作油等。上述油性基劑中,全氟戊烷具有溫度感受性,具有在29. 5°C下通過沸騰氣化的特性。另外,全氟己烷、溴代全氟辛烷、及全氟三丁基胺具有下述特性,即具有外部刺激破碎性,在由超聲波照射產(chǎn)生的刺激等來自外部的刺激作用下,使載體組合物的芯產(chǎn)生空腔,使其破碎。含有該油性基劑時(shí),作為該油性基劑的比例,只要不妨礙本發(fā)明的效果即可,沒有特殊的限制,例如可以為下述比例,即相對(duì)于100重量份上述(A)成分及(B)成分的總量, 該油性基材為0. 1-50重量份,優(yōu)選為1-30重量份,更優(yōu)選為5-20重量份。進(jìn)而,本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物中根據(jù)需要也可以含有膜融合性脂質(zhì)(輔助脂質(zhì))。通過含有上述膜融合性脂質(zhì),能夠進(jìn)一步提高核酸向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)效率。作為上述膜融合性脂質(zhì),例如可以舉出,二油?;字R掖及贰⒍王;字D憠A、反式磷脂酰基乙醇胺,1,2-雙(10,12- 二十三烷二?;?-磷酸乙醇胺、1,2- 二反油?;姿嵋掖及?、1,2_二(十六烷基)磷酸乙醇胺、1,2_二己?;姿嵋掖及?、1,2_二月桂酰基磷酸乙醇胺、1,2-二亞油?;姿嵋掖及?、1,2-二肉豆蘧?;姿嵋掖及?、1,2-二油?;姿嵋掖及?、1,2- 二棕櫚油?;姿嵋掖及贰?,2- 二棕櫚酰基磷酸乙醇胺、1,2- 二植烷酰磷酸乙醇胺、1,2- 二硬脂?;姿嵋掖及?,I-棕櫚酰基-2-油?;姿嵋掖及罚琁-棕櫚?;?2- (10,12- 二十三烷二?;?磷酸乙醇胺、I,2- 二油?;姿嵋掖及?N-己酰胺、I,2- 二棕櫚酰基磷酸乙醇胺-N —己酰胺、N,N- 二甲基-1,2- 二油酰基磷酸乙醇胺、N,N- 二甲基一 1,2- 二棕櫚?;姿嵋掖及?N-十二烷?;?1,2- 二棕櫚?;姿嵋掖及贰-十二烷?;?1,2- 二油?;姿嵋掖及贰?,2- 二油?;姿嵋掖及?N-十二烷基胺、1,2- 二棕櫚?;姿嵋掖及?N-十二烷基胺、1,2- 二油?;姿嵋掖及?N-戊二酰、1,2- 二棕櫚?;姿嵋掖及?N-戊二酰、I,2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-乳糖、I,2-二油?;姿嵋掖及?N-[4 (p—馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-羧酸鹽]、二棕櫚酰磷酸乙醇胺-N_[4(p-馬來酸亞胺甲基)環(huán)己烷-羧酸鹽]、1,2_ 二棕櫚?;姿嵋掖及?N-[4 (p-馬來酰亞胺苯基)丁酰胺]、1,2_ 二油?;姿嵋掖及?N-[4(p-馬來酰亞胺苯基)丁酸鹽]、N-甲基-1,2- 二油?;姿嵋掖及?、N-甲基-二棕櫚酰基磷酸乙醇胺、1,2_ 二油酰基磷酸乙醇胺-N-[3-(2-吡啶二硫)丙酸鹽、1,2 — - 二棕櫚酰基磷酸乙醇胺-N-[3-(2-吡啶二硫)丙酸鹽]、N-(琥珀酰)-1,2- 二油?;姿嵋掖及?、N-(琥珀酰)-1,2_ 二棕櫚?;姿嵋掖及返?。其中,在本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物中優(yōu)選使用二油酰基磷脂酰乙醇胺。含有該膜融合性脂質(zhì)時(shí),作為該膜融合性脂質(zhì)的比例,只要不妨礙本發(fā)明的效果即可,沒有特殊的限制,可以舉出下述比例,即相對(duì)于100重量份上述(A)成分及⑶成分的總量,該膜融合性脂質(zhì)為1-500重量份,優(yōu)選為10-250重量份,更優(yōu)選為25-100重量份。根據(jù)使用形態(tài),本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物可以含有等滲劑、賦形劑、稀釋齊U、增稠劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、保存劑等各種添加劑。上述添加劑的配合量,可以根據(jù)核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體的使用形態(tài)適當(dāng)?shù)卦O(shè)定。本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物通過混合上述(A)成分、(B)成分、及根據(jù)需要混合其他成分而制造。
本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物適用的核酸,對(duì)其種類或結(jié)構(gòu)沒有特殊的限定。作為該核酸的具體例,可以為siRNA、mRNA、tRNA,rRNA, cDNA、miRNA(微RNA)、核酶、反義寡核普酸、質(zhì)粒DNA、肽核酸、三鏈形成型寡核酸(Triplex Forming Oligonucleotide, TFO)、基因等。其中,本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物在將siRNA向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)方面特別有用。本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體適用的核酸,可以是來自人、動(dòng)物、植物、細(xì)菌、病毒等的核酸,另外,也可以是通過 化學(xué)合成制備的核酸。進(jìn)而,上述核酸可以是單鏈、雙鏈、三鏈中的任一種,并且對(duì)其分子量也沒有特殊的限定。另外,本發(fā)明中,核酸可以為被化學(xué)、酶或肽修飾的核酸。本發(fā)明中,核酸可以單獨(dú)使用I種,也可以2種以上適當(dāng)?shù)亟M合使用。聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚(乳酸-乙醇酸)或其三嵌段聚合物具有兩親性,和陽離子脂質(zhì)通過雙乳化方法形成納米尺度的顆粒,這類納米顆粒具有親水性的聚乙二醇外殼,而且顆粒的尺寸與共聚物的組成相關(guān),可以調(diào)控。有意義的是,加入陽離子脂質(zhì)顯著提高siRNA的包封率和載藥量。采用這種納米顆粒作為載體實(shí)現(xiàn)了包載siRNA納米顆粒的內(nèi)吞,并達(dá)到基因沉默的效果。包載siRNA的納米顆粒通過雙乳化的方法制備將兩嵌段共聚物和陽離子脂質(zhì)溶于油相(例如氯仿)中,加入siRNA溶液后超聲下形成初始乳液后,將初始乳液加入到1%PVA水溶液中并再次超聲乳化,將乳液加入到0.3% PVA水溶液中,減壓下(IOOOpa)除去有機(jī)溶劑,離心收集納米顆粒。下面將結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解,列舉這些實(shí)施例只是為了起說明作用,而并不是用來限制本發(fā)明的范圍。除非特別說明,本發(fā)明所用到的試劑、培養(yǎng)基均為市售商品。實(shí)施例中所用原料來源及處理方法外消旋丙交脂(d, 1-LA),純度彡99%,使用前減壓下升華純化。PEG55O-PLA286OO> PEG2__PLA12500、PEG10000_PLA15000、PLA6300_PEG1200_PLA6300、PLA480O-PEGgggg-PLA48OO> PLA48OO-PEGlQggg-PLA48OO 購于 Polymer Source 公司。PEG5tl。。-PLA25000、PEG5_-PLA51_ 購于 Alkermes 公司。PEG5cicici-PLA5qciq 購于 Aldrich 公司 PEG
Ioooo-PLGA1OOOO(so/so)、
pEGicicicici-PLGA5cicicici(75/25)購于濟(jì)南fSS公司。一端基為羧基一端基為輕基的異官能團(tuán)的PEG(Mn為5000g/mol,H00C-PEG5_-0H),一端基為馬來酰亞胺另一端基為羥基的異官能團(tuán)的 PEG (Mn 為 5000g/mol,Mal-PEG5000-OH)購于 Creative PEGfforks 公司。N,N,-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC),N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),4_ 二甲氨基吡啶(DMAP)購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、氨基半乳糖(Gal-NH2)、4’,6- 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購于Aldrich公司。聚乙烯醇(PVA,88*%hydrolyzed, Mw = 22000)購于 Acros Organics 公司。DOTAP 和 DOTMA 購于 Avanti Polar Lipids 公司。BHEM-Chol為本發(fā)明合成,具體合成步驟如下在500毫升單口瓶加入2_溴乙胺氫溴酸鹽(17. 4g,85. Ommol)、氯甲酸膽固醇酯(34. Ig, 77. 3mmol),溶解于_30°C的氯仿溶液中,然后將三乙胺(24mL,172mmol)滴加到上述溶液中。在室溫下反應(yīng)過夜后,用IM鹽酸的飽和氯化鈉溶液(150mL)洗滌三次并用飽和氯化鈉溶液洗滌一次(150mL)。有機(jī)相用無水硫酸鎂干燥并在減壓下除去有機(jī)溶劑。粗產(chǎn)物用乙醇和丙酮各重結(jié)晶(結(jié)晶條件)一次后得到產(chǎn)物N-(2-溴乙基)氨基甲酸膽固醇酯,產(chǎn)率為73%。將得到的N-(2-溴乙基)氨基甲酸膽固醇酯(4. 8g, 7. 8mmol)和N-甲基二乙醇胺(I. 2g,9. 7mmol)加入到50毫升干燥的甲苯中,回流過夜。反應(yīng)溶液沉淀到大量的乙醚中,過濾后收集沉淀并真空干燥。粗產(chǎn)物在乙醇中重結(jié)晶(結(jié)晶條件)兩次后得到白色固體,產(chǎn)率為62%。異辛酸亞錫(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),先用對(duì)二甲苯共沸兩次,然后再減壓蒸餾,收集152°C (20 40Pa)的餾分用于聚合反應(yīng)。Alexa 568-phalloidin、Lipofectamine 2000 購于 Invitrogen 公司。RNeasymini-kits購于 Qiagen 公司。RimeScript 1st Strand cDNA Synthesis kit、SYBR*PremixEx Taq購于Takara公司。脂蛋白B(apoB)定量檢測試劑盒購于R&D systems公司。D-Iuciferin 購于 Xenogen 公司。穩(wěn)定表達(dá)Iuciferase的H印G2細(xì)胞、MDA_MB_435s、BT474細(xì)胞(HER2受體高表達(dá)細(xì)胞系)細(xì)胞購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。siRNA是一種由二十多個(gè)核苷酸組成的雙鏈小分子RNA,帶有負(fù)電荷。以下實(shí)驗(yàn)使用中的siPlkl,對(duì)應(yīng)反義鏈序列為UAAGGAGGGUGAUCUUCUUCAdTdT。siLuciI,對(duì)應(yīng)反義鏈序列為CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT。siapoB,對(duì)應(yīng)反義鏈序列為AUUGGUAUUCAGUGUGAUGACACdTdT對(duì)照陰性siRNA(siN. C.),對(duì)應(yīng)反義鏈序列為AACCACUCAACUUUUUCCCAAdTdT。FAM-siRNA 為熒光染料 FAM 標(biāo)記的 siN. C.。以上siRNA均由蘇州瑞博制藥技術(shù)有限公司合成。未經(jīng)說明的其它試劑直接使用。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法,如無特殊說明,均為常規(guī)方法。實(shí)施例I、siRNA給藥系統(tǒng)和制劑的制備通過利用兩親性嵌段聚合物和陽離子脂質(zhì)通過雙乳化方法制備包載SiRNA的納米顆粒。使用的聚乙二醇-聚乳酸或者聚乙二醇-聚(乳酸乙醇酸)兩嵌段/三嵌段共聚物為上述的聚合物PEG55tl-PLA
28600、PeG2OOO-PLA125OO、PEGgggg-PLA5000、PEGgggg-PLA25OOO、PEGgggg-PLAg1Qgg、PEG1Qggg-PLA15Qgg-, PEG1Qggg-PLGA1Qggg (50/50)、P^G j gggg_P LGAggggg ( g/g 5)、P LA63QQ_PEG ! 2(|(|_P LAg30(|、
PLA4800-PEg5000-PLA4800、PLA4800-PeG10000-PLA4800 (下標(biāo)為分子量和比例)。使用的陽離子脂質(zhì)分別為上述的BHEM-Chol、DOTAP, D0TMA。通過改變加入的陽離子脂質(zhì)質(zhì)量、加入的siRNA質(zhì)量、使用的聚合物種類、使用的陽離子脂質(zhì)種類來制備得到具有不同性質(zhì)的siRNA給藥系統(tǒng)。I、陽離子脂質(zhì)BHEM-Chol質(zhì)量對(duì)包載siRNA納米顆粒的影響通過雙乳化的方法使用不同質(zhì)量的陽離子脂質(zhì)BHEM-Chol制備包載siRNA的納米顆粒。其中,使用的聚合物為25mg WPEG5cicici-PLA25cicic^P siRNA為0. 2mg作為實(shí)例。制備時(shí),加入的陽離子脂質(zhì)質(zhì)量分別為0. 0mg、0. lmg、0. 5mg、l. 0mg、2. 5mg、5. Omg,以研究加入不同質(zhì)量的陽離子脂質(zhì)對(duì)制備得到的包載siRNA納米顆粒的性能影響。通過雙乳化的方法制備包載siRNA的納米顆粒,具體方法為將聚合物PEG5000-PLA25000 ( 25mg)和不同質(zhì)量 BHEM-Chol 溶于 0. 5mL 氯仿中,加入 siRNA (0. 025mL,0. 2mg)溶液后超聲下(80瓦,30秒)形成初始乳液后,將初始乳液加入到I. 5mL I % PVA水溶液中并再次超聲乳化(80瓦,2分鐘),將乳液加入到25mL的0. 3% PVA水溶液中,減壓下(1000帕)揮發(fā)有機(jī)溶劑,離心(4°C,30000g,lh)收集納米顆粒;并用水重懸2次并離心收集以除去PVA,樣品凍干。a) siRNA包封率的測定將制備的包載FAM-siRNA納米顆粒的離心后,收集并精確定量上清液體積,記為V上清。通過高效液相色譜(HPLC)來檢測上清液中FAM-siRNA的濃度,記為C±清。HPLC由Watersl525雙向泵、Waters 2475突光檢測器、1500柱溫箱及Symmetry C18分離柱組成,流動(dòng)相為乙腈/三乙胺乙酸緩沖液(0. 1M,pH 7. 4),流動(dòng)相比例為28 72(v/v),流速為0. 5mL mirT1,檢測器溫度30°C,突光檢測器激發(fā)波長為485nm,發(fā)射波長為535nm。通過Breeze軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,各組成納米顆粒的載藥率與載藥效率見表I。包封率(100%) = (1-C上清 XV上清/M總邏A) X 100% 載藥量(100%) = (M總邏A-C上清XV上清)/M納米麵X 100%M,6siENA表示制備中加入的總的siRNA的質(zhì)量,Mm表示納米顆粒的總質(zhì)量。從表I可見,不加入陽離子脂質(zhì)時(shí),siRNA的包封率僅為26. 2%,而加入陽離子脂質(zhì)后,siRNA包封率明顯增加。譬如,加入I. Omg BHEM-Chol時(shí),siRNA包封率增加到95. 7%。繼續(xù)增加陽離子脂質(zhì)時(shí),siRNA包封率保持在95%以上。b)納米顆粒的粒徑和zeta電勢利用型號(hào)為Malvern Zetasizer Nanao ZS90的動(dòng)態(tài)光散射儀檢測包載siRNA的納米顆粒的粒徑與粒徑分布,納米顆粒濃度為0. lmg/mL。從表I可見,改變加入的SiRNA和陽離子脂質(zhì)的量時(shí),制備得到的納米顆粒的粒徑基本不變,在160nm-180nm之間。表I.不同BHEM-Chol制備的包載siRNA納米顆粒各個(gè)組份具體組成及性質(zhì)
權(quán)利要求
1.一種核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物,含有兩親性高分子聚合物和陽離子脂質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物,其中陽離子脂質(zhì)為銨鹽型的陽離子脂質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2任一項(xiàng)所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物,其特征在于兩親性高分子聚合物和陽離子脂質(zhì)的含量范圍為 兩親性高分子聚合物100重量份 陽離子脂質(zhì)0-20重量份。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物,其特征在于兩親性高分子聚合物和陽離子脂質(zhì)的含量范圍為 兩親性高分子聚合物100重量份 陽離子脂質(zhì)0.001-10重量份。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物,其中陽離子脂質(zhì)選自N,N-二羥乙基-N-甲基-N-2-(膽固醇氧羰基氨基)乙基溴化銨、(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化銨、N-(I-(2,3- 二油酰氧基)丙基)_N,N,N-三甲基氯化銨中的至少一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物,其中兩親性高分子聚合物選自聚乙二醇-聚乳酸兩嵌段或三嵌段共聚物或聚乙二醇-聚(乳酸乙醇酸)兩嵌段或三嵌段共聚物中的至少一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物,所述聚乙二醇嵌段分子量范圍為550 10000。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物,聚乳酸嵌段數(shù)均分子量范圍為4800 51000g/mol。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物,聚(乳酸乙醇酸)嵌段數(shù)均分子量范圍為 10000 50000g/mol。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物,其特征在于所述組合物形成直徑為50-250納米的納米顆粒。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物,其特征在于所述納米顆粒表面進(jìn)行化學(xué)修飾、抗體修飾或配體修飾。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物,所述核酸為小干擾核酸(siRNA)。
13.一種藥物組合物,含有核酸及上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物組合物,其特征在于核酸、陽離子脂質(zhì)、兩親性高分子聚合物的質(zhì)量比為 0. 04/0. 0/100. 0 7. 2/20. 0/100. O。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的藥物組合物,所述核酸為小干擾核酸(siRNA)。
16.根據(jù)權(quán)利要求13-15任一項(xiàng)所述的藥物組合物,還含有其他藥物。
17.權(quán)利要求14所述藥物組合物的制備方法,將兩親性嵌段共聚物和陽離子脂質(zhì)溶于油相中,加入siRNA水溶液后超聲(80瓦,30秒)形成初始乳液,將初始乳液加入到水相中并再次超聲(80瓦,2分鐘)乳化,將乳液加入到水相中,減壓(1000帕)下除去有機(jī)溶劑,離心(4°C,30000g,Ih)收集納米顆粒。
18.一種核酸導(dǎo)入方法,其特征在于,通過使權(quán)利要求13-15任一項(xiàng)所述的藥物組合物與細(xì)胞接觸,使核酸導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)。
19.權(quán)利要求18所述的核酸導(dǎo)入方法,其特征在于所述核酸為小干擾核酸(siRNA)。
20.兩親性高分子聚合物及陽離子脂質(zhì)的組合在制備核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物中的用途。
21.權(quán)利要求20所述的兩親性高分子聚合物及陽離子脂質(zhì)的組合的用途,其特征在于所述核酸為小干擾核酸(siRNA)。
22.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的應(yīng)用,其特征在于所述腫瘤為肝臟腫瘤或乳腺腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種siRNA的給藥系統(tǒng)和制劑,它的活性成分是聚合物和陽離子脂質(zhì)形成的包載siRNA的納米顆粒,該聚合物可為聚乙二醇-聚乳酸或聚乙二醇-聚(乳酸-乙醇酸)的兩嵌段或三嵌段共聚物;該陽離子脂質(zhì)可為N,N-二羥乙基-N-甲基-N-2-(膽固醇氧羰基氨基)乙基溴化銨或(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化銨。這種納米顆粒和制劑能夠?qū)iRNA很好的輸運(yùn)到細(xì)胞中,并有效沉默靶基因的表達(dá)。并且,此siRNA給藥體系通過配體或者抗體修飾后,在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平都能夠更好的沉默靶基因。因而此給藥體系在siRNA和類似小核酸藥物的給藥用于疾病治療中具有良好的前景。
文檔編號(hào)A61K47/34GK102727907SQ20111009291
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2011年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月13日
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