專利名稱：一種從老鸛草中提取的老鸛草素在制備抗皰疹病毒藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從老鸛草中提取的老鸛草素在制備抗皰疹病毒藥物中的應(yīng)用，屬于植物藥開發(fā)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
老鸛草[Geranium sibiricum Linne]別名老鸛嘴、老鴉嘴、貫筋、老貫筋、老牛筋，屬于櫳牛兒苗科老鸛草屬多年生草本植物，生于山坡、草地及路旁，分布于我國(guó)遼寧、吉林、黑龍江、河北、江蘇、安徽、浙江、湖南、四川、貴州和云南等地。老鸛草能夠祛諸風(fēng)皮膚發(fā)癢，治筋骨疼痛，痰火痿軟，手足筋攣，麻木，利小便，瀉膀胱積熱，攻散諸瘡腫毒，退癆熱發(fā)燒，治風(fēng)火蟲牙痘疹疥癩等癥(《滇南本草》)。去風(fēng)，疏經(jīng)活血，健筋骨，通絡(luò)脈。治損傷，痹癥， 麻木，皮風(fēng)，浸酒常飲(《綱目拾遺》)。止久痢，厚腸胃，調(diào)中健脾(《現(xiàn)代實(shí)用中藥》)。治跌打損傷，止刀傷出血，又可止咳，益肺氣(《貴州民間方藥集》)。清熱解毒。治熱病消渴，癰疽瘡腫(《藥材學(xué)》)。國(guó)內(nèi)已有眾多文獻(xiàn)介紹了老鸛草中組成成分的藥理活性老鸛草主要化學(xué)成分為鞣質(zhì)、黃酮、有機(jī)酸和揮發(fā)油等成分，具有抗菌、抗病毒、止瀉、抗氧化、降血糖等藥理作用(雷志勇，2002)。老鸛草為臨床常用藥，具有多種藥理作用，其中黃酮類化合物作為主要成分，是一大類從高等植物中提取的可食用的多酚類物質(zhì)，具有抗氧化和自由基清除活性，對(duì)人體具有營(yíng)養(yǎng)及醫(yī)療價(jià)值，如抗病毒、抗癌、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等(刑濤，2009)。老鸛草素作為老鸛草中的主要活性成分，其抗腫瘤活性已被深入研究(李長(zhǎng)龍，2008)，但是其抗皰疫病毒活性尚未見報(bào)道。病毒是最小的病原微生物，但病毒的傳播最廣，是目前世界上發(fā)病率最高的傳染性疾病之一。在臨床上較多的疾病與病毒感染有關(guān)。近3/4的傳染病是由病毒引起的,不同的病毒感染引起不同的疾患，需要不同的針對(duì)該病毒的抗病毒藥物治療，但目前世界上有效的抗病毒藥物只有20多種。HSVOferpes simplex virus)是一種單純皰疹病毒，是皰疹病毒科的典型代表。HSV分為兩種類型=HSV-I和HSV-2，HSV-I感染可引起嬰幼兒、兒童及成人的唇皰疹、角膜炎、皰疹性腦炎、腦膜炎等；HSV-2主要通過直接接觸病灶(性接觸)而傳播，并導(dǎo)致皮膚病變，可引起早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、胎兒畸形以及智力低下等，并與子宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，特別在艾滋病、器官移植和惡性腫瘤等免疫抑制病人常并發(fā)嚴(yán)重的HSV感染(尚小紅，2005 ;伍偉禎，2004)。HSV在人群中感染較為普遍，一旦感染，治愈性較差且具有復(fù)發(fā)性。近年來新的抗病毒藥不斷出現(xiàn)，但是病毒性感染的發(fā)病率仍持續(xù)不衰，特別是20世紀(jì)80年代艾滋病及其病原病毒的出現(xiàn)，對(duì)抗病毒藥的研究開發(fā)提出了緊迫的要求，隨著臨床應(yīng)用的日益廣泛，醫(yī)生和患者對(duì)抗病毒藥的要求越來越高，因此抗病毒藥的研究成為當(dāng)前國(guó)際研究的熱點(diǎn)之一。從1975年發(fā)現(xiàn)阿糖腺苷，特別是1977年阿昔洛韋(ACV，無環(huán)鳥苷)問世后，抗病毒藥物才真正起步。目前市場(chǎng)上已有一些抗HSV中成藥和西藥，中成藥普遍存在服用周期長(zhǎng)、療效不突出的問題，患者需要長(zhǎng)時(shí)間忍受病毒的折磨，西藥存在價(jià)格高、副作用大等問題。目前阿昔洛韋(ACV)和泛昔洛韋(FCV)是目前世界上用量較大的第二代廣譜抗病毒藥物，但是對(duì)新生兒或老年人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的皰疹病毒感染，其結(jié)果仍不理想，而且對(duì)皰疹病毒潛伏期和復(fù)發(fā)次數(shù)沒有多大影響，同時(shí)具有神經(jīng)毒性樣的副作用，因而，低毒、高 效抗病毒天然產(chǎn)物類藥物的開發(fā)將會(huì)具有廣闊的市場(chǎng)前景。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的與意義本發(fā)明的目的與意義在于提供了一種從老鸛草中提取的老鸛草素在制備抗皰疹病毒藥物中的應(yīng)用途徑，并為低毒、高效抗病毒天然產(chǎn)物類藥物的開發(fā)提供了廣闊的市場(chǎng)前景。發(fā)明技術(shù)解決方案本發(fā)明以單純皰疹病毒I型(HSV-I)、單純皰疹病毒II型(HSV-2)毒株和非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察從老鸛草中提取的老鸛草素抗單純皰疹病毒I型和II型的活性。結(jié)果證明(I)老鸛草素對(duì)HSV-I及HSV-2感染的細(xì)胞具有預(yù)防作用；(2)老鸛草素對(duì)HSV-I及HSV-2感染的細(xì)胞具有治療作用；(3)老鸛草素可降低HSV-I及HSV-2的感染性；(4)老鸛草素對(duì)HSV-I及HSV-2有直接殺傷作用，使HSV-I及HSV-2感染的Vero細(xì)胞的活性下降。(5)老鸛草素在體內(nèi)對(duì)HSV-I及HSV-2感染具有治療作用。基于上述研究結(jié)果，本發(fā)明證實(shí)了從老鸛草中提取的老鸛草素具有預(yù)防及治療皰疹病毒感染引起的疾病的新用途，可用于制備抗皰疹病毒的藥物。本發(fā)明可以純化的形式與藥學(xué)上適當(dāng)?shù)妮d體一起被使用?？芍瞥傻乃幬飫┬桶ㄆ瑒?、膠囊、外用搽劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、軟膏劑、□服液、或針劑，還可以采用現(xiàn)代制藥界所公認(rèn)的控釋或緩釋劑型。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的給藥途徑可以是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員普遍知道的任何一種?？梢酝ㄟ^任何適當(dāng)?shù)姆绞浇o藥，包括非腸道、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹腔內(nèi)給藥，或者也可以通過用導(dǎo)管直接灌注給藥。給藥的劑量和頻率依據(jù)年齡、性別、病人狀態(tài)，同時(shí)服用其它藥物、不良反應(yīng)和臨床醫(yī)師考慮到的其它因素而定。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)(I)老鸛草素具有低毒不易產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)；(2)老鸛草素在體外具有很好的抗皰疹病毒活性；(3)老鸛草素在體內(nèi)對(duì)皰疹病毒具有治療作用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :I、從老鸛草中提取的老鸛草素的細(xì)胞毒分析(I)細(xì)胞培養(yǎng)Vero細(xì)胞在含有5%胎牛血清和均為100mg/mL青霉素與鏈霉素的DMEM單層培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。細(xì)胞融合時(shí)傳代。細(xì)胞置24孔和6孔板上分別進(jìn)行細(xì)胞毒和抗病毒分析。(2)病毒孵育HSV-I，HSV-2病毒株購自武漢大學(xué)病毒研究所。當(dāng)Veix)細(xì)胞長(zhǎng)成單層后接種病毒，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到90%以上時(shí)，放入-80°c冰箱內(nèi)。反復(fù)凍融3次后合并。
(3)細(xì)胞毒分析A.將細(xì)胞置96孔板上，37°C培養(yǎng)24h。B.移去培養(yǎng)基，加入含有適當(dāng)稀釋度的老鸛草素，每濃度8個(gè)重復(fù)。含2%oDMSO而無藥物的200 u L培養(yǎng)基作為對(duì)照。C.培養(yǎng)3d后，移去培養(yǎng)基，各孔加入200 ii L MTT，37°C培養(yǎng)4h，棄去，各孔加入200 u LDMSO, 37°C培養(yǎng)0. 5h，在混合器中混勻5min，540nm處測(cè)OD值，計(jì)算藥物最大無毒濃度(TDtl)。(4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果老鸛草素對(duì)Vero細(xì)胞的最大無毒濃度(TDtl)為12. 8 ii g/mL,等同為0. 013 U M。2、從老鸛草中提取的老鸛草素體外抗皰疹病毒活性分析(I)老鸛草素抗HSV半數(shù)抑制濃度(IC5tl)測(cè)定A.采用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)Vero細(xì)胞，制成IX IO5HiL細(xì)胞懸液，每孔加入200 u L細(xì)胞液，于5% CO2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)24h。B.棄生長(zhǎng)液，加100TCID5QHSV-1，HSV_2病毒液200 ilL，37°C吸附lh，吸出病毒液，加用維持液稀釋的不同稀釋度的化合物200 u L，每組8個(gè)復(fù)孔，置5% CO2培養(yǎng)箱中37°C繼續(xù)培養(yǎng)72h。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照、病毒對(duì)照。C.當(dāng)病毒對(duì)照細(xì)胞病變達(dá)75%以上，MTT法測(cè)吸光值，計(jì)算不同老鸛草素濃度的抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取3次實(shí)驗(yàn)的平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(2)抗病毒模式為了確定老鸛草素抗病毒的模式，分為以下四組A.預(yù)處理病毒用老鸛草素預(yù)處理病毒，二者室溫下孵育lh，加入到96孔板上，37°C培養(yǎng)Ih后，加入覆蓋培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。B.病毒吸附將老鸛草素與病毒共同加入到96孔板上，37°C培養(yǎng)Ih后，加入覆蓋培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。C.病毒復(fù)制將病毒直接加到96孔板上，37°C培養(yǎng)Ih后，同時(shí)加入覆蓋培養(yǎng)基和老鸛草素，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。D.預(yù)處理細(xì)胞在病毒感染前用老鸛草素預(yù)處理細(xì)胞，37°C培養(yǎng)Ih后，加入病毒，37°C培養(yǎng)Ih后，加入覆蓋培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同濃度老鸛草素IC5tl見表1，老鸛草中老鸛草素抗HSV效果及模式分析見表2，表3。表I老鸛草素對(duì)HSV-I和HSV-2的IC5tl
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及了一種從老鸛草中提取的老鸛草素在制備抗皰疹病毒藥物中的應(yīng)用，老鸛草素加入不同的賦形劑后可加工成任何一種藥劑學(xué)上所說的劑型。
2.權(quán)利要求I所述的一種從老鸛草中提取的老鸛草素在制備抗皰疹病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的皰疹病毒包括單純皰疹病毒I型(HSV-I)和單純皰疹病毒II型(HSV-I)。
3.權(quán)利要求I所述的一種從老鸛草中提取的老鸛草素在制備抗皰疹病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的劑型包括片劑、膠囊、外用搽劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、軟膏劑、口服液或針劑，以及現(xiàn)代制藥界所公認(rèn)的控釋或緩釋劑型。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種從老鸛草中提取的老鸛草素在制備抗皰疹病毒藥物中的應(yīng)用。老鸛草素對(duì)于皰疹病毒屬的單純皰疹病毒工型(HSV-1)和單純皰疹病毒II型(HSV-2)具有明顯的抑制能力。老鸛草素加入不同的賦形劑后可加工成任何一種藥劑學(xué)上所說的劑型。由于老鸛草素具有毒副作用小，療效確切，安全可靠等特點(diǎn)，而且老鸛草資源豐富，因此該發(fā)明將為低毒、高效抗病毒天然產(chǎn)物類藥物的開發(fā)提供了廣闊的市場(chǎng)前景。
文檔編號(hào)A61K31/7024GK102727503SQ20111009163
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2011年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月13日
發(fā)明者付玉杰, 彭霄, 王薇, 祖元?jiǎng)? 趙春健 申請(qǐng)人:東北林業(yè)大學(xué), 付玉杰