專利名稱：Stc2基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種基因的應(yīng)用，特別是涉及ー種STC2基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝癌嚴(yán)重威脅著我國人民的生命健康。肝癌的診斷，尤其早期診斷是臨床診療和預(yù)后的關(guān)鍵。目前，在我國肝癌的定性診斷仍以檢測血清AFP(甲胎蛋白)為主，呈現(xiàn)如下特點(diǎn)60%以上的肝癌病例血清AFP > 400 μ g/L ;目前還沒有其他腫瘤標(biāo)志物的特異性可與AFP相媲美；AFP檢測較少依賴影像學(xué)設(shè)備和新技木。AFP是目前全球應(yīng)用最為廣泛的肝 癌腫瘤標(biāo)志物，已經(jīng)應(yīng)用了數(shù)十年，其敏感性為40% 65%，特異性為76% 96%，如此的敏感性和特異性均不令人滿意。因此，發(fā)現(xiàn)靈敏度和特異性高的新的腫瘤標(biāo)志物將是提高肝癌早期診斷水平的關(guān)鍵。除AFPタト，近年來用于肝癌檢測的其他血清標(biāo)志物還包括甲胎蛋白異質(zhì)體、Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶同エ酶II (GGT-II)、堿性磷酸酶同エ酶I、醛縮酶同エ酶A(ALD-A)、巖藻糖苷酶(AFU)、抗胰蛋白酶I、異常凝血酶原、鐵蛋白與酸性鐵蛋白等。AFP異質(zhì)體和異常凝血酶原的應(yīng)用提高了肝癌患者的檢出率，但早期診斷和指導(dǎo)個(gè)性化治療的分子分型診斷仍是我們面臨的極大挑戰(zhàn)。一般認(rèn)為以下四類生物分子常作為原發(fā)性肝癌標(biāo)志物1、癌胚和糖蛋白抗原；2、酶和同エ酶；3、細(xì)胞因子；4、基因。肝癌的治療在過去20年來已取得很大的進(jìn)展，外科手術(shù)切除及肝臟移植屬于“根治性”治療，仍是肝癌治療的首要選擇。隨著肝癌早期診斷水平的提高及腫瘤治療生物學(xué)概念的改變，腫瘤局部非手術(shù)治療在肝癌治療中的地位日益提高。經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈內(nèi)化療栓塞(TACE)已成為不能切除肝癌治療的首選方法，是中晚期肝癌治療的重要手段。該方法可使90%以上的肝癌患者受益，但總體療效有待提高。此外，經(jīng)皮肝穿刺瘤內(nèi)無水こ醇治療(PEI)也是較常用的局部化療方法，對癌直徑< 3cm的肝癌及門靜脈癌栓的治療有一定價(jià)值。但目前肝癌的化療藥物基本沿用其他腫瘤的治療藥物，針對性差，療效不佳，因此，迫切需要尋找新的作用靶點(diǎn)，研究和開發(fā)肝癌特異的新藥物，提高化療的特異性和有效性。近幾年來隨著對肝癌基礎(chǔ)研究的深入，生物治療在肝癌的綜合治療中取得了較大進(jìn)展，成了繼手術(shù)、放療、化療后腫瘤治療的第四大療法，如免疫治療、基因治療，包括抗血管生成、自殺基因治療、腫瘤疫苗治療、siRNA技術(shù)等。但許多生物治療的臨床療效仍不十分滿意，且絕大多數(shù)還處在實(shí)驗(yàn)研究階段，相關(guān)的關(guān)鍵理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)仍需進(jìn)ー步研究和發(fā)展。STC2是ー種糖蛋白激素，在人體多種組織廣泛表達(dá)，并可能有自分泌或旁分泌功能。STC2具有調(diào)節(jié)鈣磷代謝平衡的作用，有研究顯示STC2抑制鈉磷協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白啟動(dòng)子的活性，從而抑制了腎細(xì)胞系對磷酸鹽的攝取。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂時(shí)，可以通過 PERK-ATF4 途徑誘導(dǎo) STC2 的表達(dá)(Ito D, Walker JR, et al. Characterization ofstanniocalcin 2， anovel target of the mammalian unfolaed protein response withcytoprotectiveproperties. Mol Cell Biol，2004，24 (21) :9456-69) 此外，在氧化性應(yīng)激和缺氧時(shí)可以通過HIF-I的介導(dǎo)使STC2表達(dá)，而不依賴PERK-ATF4途徑(Law AY，WongCK. Stanniocalcin~21s a HIF-I target gene that promotes ceil proliferation inhypoxia. Exp Cell Res. 2010,316(3) :466-76)。有關(guān)STC2基因的研究文獻(xiàn)報(bào)道較少，特別是STC2基因與肝癌的關(guān)系研究還未見文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之ー是提供ー種STC2基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備診斷肝癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之ニ是提供ー種STC2基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之三是提供ー對特異擴(kuò)增STC2基因的引物，該引物可用于制備用RT-PCR或?qū)崟r(shí)定量PCR診斷肝癌的產(chǎn)品。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之四是提供兩對STC2基因的siRNA，該兩對siRNA可用于制備治療肝癌的藥物。 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)在本發(fā)明的一方面，提供了ー種STC2基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備診斷肝癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。所述診斷肝癌的產(chǎn)品包括用RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢測、原位雜交或基因芯片診斷肝癌的產(chǎn)品。在本發(fā)明中，所述用RT-PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括ー對特異擴(kuò)增STC2基因的引物。所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括ー對特異擴(kuò)增STC2基因的引物。所述用免疫檢測診斷肝癌的產(chǎn)品包括 與STC2蛋白特異性結(jié)合的抗體，包括多克隆抗體和單克隆抗體。所述用原位雜交診斷肝癌的產(chǎn)品包括與STC2基因的核酸序列雜交的探針。所述用基因芯片診斷肝癌的產(chǎn)品包括 與STC2基因的核酸序列雜交的探針。在本發(fā)明中，可以使用一系列本領(lǐng)域已知的方法來制備針對STC2蛋白特異的抗體。例如，將提純的人STC2基因產(chǎn)物或它的抗原片段注射入動(dòng)物體內(nèi)以產(chǎn)生多克隆抗體。同樣，表達(dá)人STC2蛋白或它的抗原的細(xì)胞也可以用來對動(dòng)物致免疫而產(chǎn)生抗體。根據(jù)本發(fā)明制備的抗體可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可用雜交瘤及時(shí)制備。本發(fā)明的抗體包括可以阻抑STC2功能的抗體，也可以是不影響人STC2功能的抗體。每ー類抗體都可以通過對人STC2基因產(chǎn)物的片段或功能域致免疫而產(chǎn)生，而人STC2基因產(chǎn)物及其片段可以用重組方法產(chǎn)生或用多肽合成儀進(jìn)行合成。與非修飾形式的STC2基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體，可以利用在原核細(xì)胞例如E. coli中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而得到。與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化STC2蛋白或多肽結(jié)合的抗體，可以利用在真核細(xì)胞如酵母或昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而得到。在本發(fā)明中，所述探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其他衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合，任何長度都可以。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個(gè)堿基長度。同樣，所述探針的長度可長至60、80、100、150、300個(gè)堿基對或更長，甚至整個(gè)基因。由于不同的探針長度對雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個(gè)堿基對，最長一般不超過30個(gè)堿基對，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長度以15-25個(gè)堿基對最佳。所述探針自身互補(bǔ)最好少于4個(gè)堿基對，以免影響雜交效率。在本發(fā)明的一方面，提供用于制備用RT-PCR或?qū)崟r(shí)定量PCR診斷肝癌產(chǎn)品的ー對特異擴(kuò)增STC2基因的引物，所述引物的上游引物序列具有如SEQ ID NO :1所示的序列或其互補(bǔ)序列，所述引物對的下游引物序列具有如SEQ ID NO :2所示的序列或其互補(bǔ)序列。在本發(fā)明的另一方面，提供了ー種STC2基因在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。所述治療肝癌的藥物包括通過RNA干擾抑制STC2基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸，或用于抑制STC2蛋白活性的蛋白質(zhì)。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明中STC2基因作為制備肝癌治療藥物的靶點(diǎn)，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
I.化學(xué)合成雙鏈核糖核酸分子，其序列特異性針對STC2基因序列，利用脂質(zhì)體包裹遞送至肝癌細(xì)胞內(nèi)，干擾STC2基因的表達(dá)，CCK-8法測量肝癌細(xì)胞Huh-7，H印3B，MHCC-97H，MHCC-97L生長活性。本發(fā)明中實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明特異性針對STC2基因的小核糖核酸分子能夠抑制肝癌細(xì)胞體外的生長，說明STC2基因可用作制備肝癌治療藥物的靶基因。本發(fā)明中用于特異性干擾STC2基因的小核糖核酸序列設(shè)計(jì)原則如下(I)從轉(zhuǎn)錄本(mRNA)的AUG起始密碼開始，尋找“AA” ニ連序列，并記下其3’端的19個(gè)堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。有研究結(jié)果顯示GC含量在45% -55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。Tuschl等建議在設(shè)計(jì)siRNA時(shí)不要針對5’和3’端的非編碼區(qū)(untranslatedregions, UTRs)，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會(huì)影響siRNA核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果。(2)將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(人，或者小鼠，大鼠等等)進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列，例如使用BLAST(www. ncbi.nlm.nih. gov/BLAST/)。(3)選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常ー個(gè)基因需要設(shè)計(jì)多個(gè)靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列體外評估干擾STC2基因表達(dá)。2.體外評估干擾STC2基因表達(dá)，肝癌細(xì)胞克隆形成能力、軟瓊脂克隆形成能力、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等細(xì)胞生物學(xué)特性的改變。3.利用各種載體,包括DAN載體、腺病毒、腺相關(guān)病毒載體來干擾STC2基因的表達(dá)，達(dá)到體內(nèi)干擾STC2基因的效果，檢測它們對裸鼠皮下移植瘤、肝臟原位接種瘤的治療效果，從而實(shí)現(xiàn)抑制肝癌細(xì)胞體內(nèi)増殖的目的。4.獲得能夠特異性抑制STC2基因激酶活性的多肽、單克隆抗體，達(dá)到抑制STC2活性的目的，從而實(shí)現(xiàn)抑制肝癌細(xì)胞體內(nèi)増殖的目的。在本發(fā)明中，可以使用一系列本領(lǐng)域已知的方法來制備針對STC2蛋白特異的抗體。例如，將提純的人STC2基因產(chǎn)物或它的抗原片段注射入動(dòng)物體內(nèi)以產(chǎn)生多克隆抗體。同樣，表達(dá)人STC2蛋白或它的抗原的細(xì)胞也可以用來對動(dòng)物致免疫而產(chǎn)生抗體。根據(jù)本發(fā)明制備的抗體可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可用雜交瘤及時(shí)制備。本發(fā)明的抗體包括可以阻抑STC2功能的抗體，也可以是不影響人STC2功能的抗體。每ー類抗體都可以通過對人STC2基因產(chǎn)物的片段或功能域致免疫而產(chǎn)生，而人STC2基因產(chǎn)物及其片段可以用重組方法產(chǎn)生或用多肽合成儀進(jìn)行合成。與非修飾形式的STC2基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體，可以利用在原核細(xì)胞例如E. coli中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而得到。與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化STC2蛋白或多肽結(jié)合的抗體，可以利用在真核細(xì)胞如酵母或昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而得到。5.獲得能夠特異性抑制STC2基因激酶活性的化合物，達(dá)到抑制STC2激酶活性的目的，從而現(xiàn)實(shí)抑制肝癌細(xì)胞増殖的目的。在本發(fā)明的另一方面，提供用于制備治療肝癌藥物的STC2基因的兩對siRNA，分別為siRNA-1548與siRNA-1779。其中，siRNA-1548的正義鏈具有如SEQ ID NO. 7所示序列，siRNA-1548的反義鏈具有如SEQ ID NO. 8所示序列。siRNA-1779的正義鏈具有如SEQID NO. 9所示序列，siRNA-1779的反義鏈具有如SEQ ID NO. 10所示序列。
本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證實(shí)STC2基因在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，并且通過STC2基因序列特異性siRNA干擾可以顯著抑制肝癌細(xì)胞的生長，因此STC2基因及其表達(dá)產(chǎn)物可作為診斷肝癌的標(biāo)志物和用于肝癌治療的藥物靶點(diǎn)，使肝癌診斷更加準(zhǔn)確、快速，并提供了新的肝癌治療的基因靶點(diǎn)?？傊?，本發(fā)明STC2基因?yàn)榉乐胃伟┨峁┝诵碌闹委煱悬c(diǎn)和有效新藥。


下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)ー步詳細(xì)的說明圖I為實(shí)施例I中RT-PCR驗(yàn)證STC2基因在40例肝癌病人癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況示意圖，在圖I中，“N”指癌旁組織，“C”指肝癌組織；結(jié)果顯示23例(57. 5% )病例癌組織中STC2基因表達(dá)量高于相應(yīng)癌旁組織中。圖2為實(shí)施例2中實(shí)時(shí)定量PCR檢測STC2基因在人肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況示意圖，癌組織中STC2基因表達(dá)量顯著高于癌旁組織中(P <0.001)；圖3為實(shí)施例5中在肝癌細(xì)胞YY-8103中干擾STC2基因表達(dá)，檢測細(xì)胞生長曲線示意圖，結(jié)果顯示序列特異性針對STC2基因的兩條siRNAs能夠有效沉默STC2基因的mRNA水平(圖3A)，同時(shí)肝癌細(xì)胞YY-8103生長受到顯著地抑制(圖3B);圖4為實(shí)施例5中在肝癌細(xì)胞Focus中干擾STC2基因表達(dá)，檢測細(xì)胞生長曲線示意圖；結(jié)果顯示序列特異性針對STC2基因的兩條siRNAs能夠有效沉默STC2基因的mRNA水平(見圖4A)，同時(shí)肝癌細(xì)胞Focus生長受到顯著地抑制(見圖4B)；圖5為實(shí)施例6中在肝癌細(xì)胞Focus中干擾STC2基因表達(dá)，分析細(xì)胞克隆形成能カ結(jié)果示意圖；其中，圖5A表示定量PCR檢測shRNA干擾STC2基因沉默效果；圖58是細(xì)胞克隆形成的照片；圖5C表示克隆計(jì)數(shù)。圖6為實(shí)施例7中STC2基因過表達(dá)對肝癌細(xì)胞PLC克隆形成能力的影響，其中，圖6A是PCR檢測STC2基因在肝癌細(xì)胞PLC過表達(dá)情況；圖6B是細(xì)胞克隆形成的照片；圖6C是克隆計(jì)數(shù)。圖7為實(shí)施例8中定量PCR檢測STC2基因在正常成人各組織的表達(dá)情況。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)ー步詳細(xì)的說明。
以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人,分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊· (NewYork ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例IRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測STC2基因在肝癌組織中的表達(dá)情況逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)實(shí)驗(yàn)檢查STC2基因在肝癌組織中的表達(dá)情況。RT-PCR 是指將逆轉(zhuǎn)錄(Reverse Transcription ；RT)反應(yīng)和 PCR(Polymerase ChainReaction)反應(yīng)組合在一起的方法。RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結(jié)合在一起，提供了ー種分析基因表達(dá)的快速靈敏的方法。RT-PCR用于對表達(dá)信息進(jìn)行檢測或定量。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護(hù)分析、原位雜交及SI核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技木，更靈敏，更易于操作。RT-PCR的模板可以為總RNA或poly(A)選擇性RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶，以隨機(jī)引物、oligo (dT)或基因特異性的引物起始。RT-PCR可以 一歩法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中，每ー步都在最佳條件下進(jìn)行。cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進(jìn)行，然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR。I、組織分離實(shí)驗(yàn)用組織來源于原發(fā)性肝癌的手術(shù)病人。手術(shù)切除的肝臟ー經(jīng)離體，迅速切取病灶及周圍5公分外癌旁組織，放入液氮中(_80°C )保存。癌和癌旁的診斷均以病理診斷為最終依據(jù)。2、總核糖核酸(RNA)的抽提試劑盒抽提總核糖核酸(RNA)采用TRIZOL(Invitrogen),該試劑是基于酸性酹ー步抽提法生產(chǎn)的。TRIZOL試劑是直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細(xì)胞時(shí)能保持RNA的完整性。加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機(jī)層。RNA存在于水樣層中。收集上面的水樣層后，RNA可以通過異丙醇沉淀來還原。用于抽提總核糖核酸(RNA)所用的器皿和水均進(jìn)行核糖核酸酶滅活處理，以保證實(shí)驗(yàn)中無核糖核酸酶的環(huán)境。3、核糖核酸(RNA)抽提步驟RNA提取的一般步驟是破碎組織一分離RNA —沉淀RNA —洗滌RNA —融解RNA —保存RNA。破碎組織和滅活RNA酶可以同步進(jìn)行，可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎組織，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。分離RNA—半用酚、氯仿等有機(jī)溶剤，加入少量異戊醇，經(jīng)過此步，離心，RNA—般分布于上層，與蛋白層分開。沉淀RNA—般用こ醇、3Μ NaAc (pH-5. 2)或異丙醇。洗滌RNA使用70%こ醇洗滌，有時(shí)，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干こ醇，但是不能過于干燥，否則不易溶解。融解RNA一般使用TE。保存RNA應(yīng)該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品(如胰臟、肝臟)中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA，對于長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存ー個(gè)星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩(wěn)定。另外，長度大于4kb的轉(zhuǎn)錄本對于痕量RNase的降解比小轉(zhuǎn)錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70°C。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當(dāng)準(zhǔn)備使用RNA時(shí)，可以使用下列方法沉淀RNA :加入NaAc 至 O. 3M, 12，OOOXg 離心 5 分鐘。
4、cDNA 的合成(I)冰浴離心管里面加入模板RNA 4yL(lyg/yL)，隨機(jī)引物2yL(20pmol/μ L),去離子水5 μ L,混勻，離心3-5秒；(2)70°C水浴5分鐘，冰浴30秒(此處是為了使引物和模板正確配對);(3)加入5 X M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶第一鏈緩沖液4 μ L (200U/ μ I), RNase抑制劑I μ L (Ribonuclease Inhibitor, 40U/ μ I，TaKaRa)，dNTP 2 μ L (2. 5mM, TaKaRa)(這些應(yīng)該先配好，然后分再裝到每一管)，混勻；(4) 37°C水浴5分鐘，加入I μ L M-MLV RT反轉(zhuǎn)錄酶(200U/ μ I)，混勻；
(5)37°C水浴I小時(shí)(此步是反轉(zhuǎn)錄過程)；(6) 700C，10分鐘結(jié)束反應(yīng)(此處是滅活酶活性，避免對后續(xù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾)，產(chǎn)物置冰上進(jìn)行下一歩PCR實(shí)驗(yàn)，余下的-70°C保存。 5、RT-PCR的弓丨物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增理想的引物對只同目的序列兩側(cè)的単一序列而非其他序列退火。設(shè)計(jì)糟糕的引物可能會(huì)同擴(kuò)增其他的非目的序列。設(shè)計(jì)理想的引物都有以下共同的特點(diǎn)典型的引物18到24個(gè)核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨(dú)特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會(huì)與錯(cuò)誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。選擇GC含量為40%到60%或GC含量反映模板GC含量的引物。設(shè)計(jì)5’端和中間區(qū)為G或C的引物。這會(huì)增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。避免引物對3’末端存在互補(bǔ)序列，這會(huì)形成引物ニ聚體，抑制擴(kuò)增。避免3’末端富含GC。設(shè)計(jì)引物時(shí)保證在最后5個(gè)核苷中含有3個(gè)A或T。避免3’末端的錯(cuò)誤配對。3’端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。避免存在可能會(huì)產(chǎn)生內(nèi)部ニ級結(jié)構(gòu)的序列，這會(huì)破壞引物退火穩(wěn)定性。因此，本實(shí)施例中設(shè)計(jì)的引物具體如下STC2(F) :5，-ATGCTACCTCAAGCACGACC-3’ (SEQ ID NO 1)；STC2 (R) :5，-TCTGCTCACACTGAACCTGC-3，(SEQ ID NO 2)；β -actin(F) :5，-CATCCTGCGTCTGGACCT-3，(SEQ ID NO :3)；β -actin(R) :5，-GTACTTGCGCTCAGGAGGAG-3J (SEQ ID NO :4)。以β-actin作為內(nèi)對照，反應(yīng)混合物中各成分為β-actin(F)、β -actin(R) >STC2(F)、STC2 (R) UOXPCR buffer、MgcI2、dNTP、Taq DNA 聚合酶(TaKaRa Taq ) cDNA 模板分別為0· 2,0. 2,0. 4,0. 4,1. 0,1. 0,0. 2,0. I和5 μ LcDNA模板，最后補(bǔ)充ddH20使反應(yīng)體系為10 μしPCR的反應(yīng)條件如下94°C，5分鐘預(yù)變性；94°C，30秒變性；55°C，30秒退火；720C，30秒延伸；35個(gè)循環(huán)，電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。6、實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，STC2基因在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織中的表達(dá)水平(見圖I)，在40例肝癌病例中，23例癌組織中STC2基因的表達(dá)量高于癌旁組織，占57. 5%的比例。在圖I中，“N”指癌旁組織，“C”指肝癌組織。7、根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可通過RT-PCR診斷肝癌設(shè)計(jì)STC2基因的PCR引物，檢測腫瘤組織中STC2基因RNA的含量，RNA含量高則說明患肝癌的可能高，反之則低。實(shí)施例2實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)采用相對定量法檢測STC2基因在肝癌樣本中的表達(dá)差異(Thermal CyclerDice RealTime System TP800, Takara ； SYBR Premix Ex Taq , Takar a)。突光定量PCR(real-timePCR)反應(yīng)體系如下總體積 20μ L，SYBR Premix Ex Taq 10yL，上下游引物(10 μ mol/L)各0· 4 μ L，cDNA I μ L，ddH20 8. 2 μ L,混勻試劑，離心后放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為95°C變性5秒，68°C退火延伸30秒，40循環(huán)。儀器使用按廠家的說明操作。本實(shí)施例中設(shè)計(jì)的引物具體如下STC2所用引物與半定量RT-PCR所用STC2引物一致，上游引物為5’-ATGCTACCTCAAGCACGACC-3’(SEQ ID NO :1);下游引物為5’ -TCTGCTCACACTGAACCTGC-3’ (SEQ ID NO :2)。管家基因β-actin作為內(nèi)參，其上游引物為AATCGTGCGTGACATTAAG GAG(SEQ IDNO :5)，下游引物ACTGTGTTGGC GTACAGGTCTT (SEQ ID NO :6)。實(shí)時(shí)定量PCR檢測表明，STC2基因在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織中的表達(dá)水平，經(jīng)t檢驗(yàn)，P < O. 001 (見圖2)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，可通過實(shí)時(shí)定量PCR診斷肝癌設(shè)計(jì)STC2基因的PCR引物，檢測腫瘤組織中STC2基因RNA的含量，RNA含量高則說明患肝癌的可能性高，反之則低。實(shí)施例3原位雜交用STC2基因探針，與腫瘤切片進(jìn)行原位雜交，陽性雜交信號越強(qiáng)，患肝癌的可能性越高。實(shí)驗(yàn)步驟為將肝臟腫瘤組織取材后OCT包埋、液氮速凍，恒冷冰凍切片，該冰凍切片進(jìn)ー步用于原位雜交。實(shí)施步驟如下(I)冰凍切片與雜交前預(yù)處理I).將樣品從_80°C取出，用OCT包埋，在-23°C (切片機(jī)腔體溫度)平衡至少30min。將包埋好的樣品固定在樣品頭上，切ΙΟμπι厚的連續(xù)組織切片，平鋪于涂有多聚賴氨酸(lmg/ml)的玻片上(玻片預(yù)先經(jīng)180°C干烤6小吋)，保存于-70°C冰柜備用。2).冰凍切片經(jīng)室溫干燥IOmin后，在4%的多聚甲醛-PBS (pH7. 4)固定lOmin。3).活躍的 DEPC-PBS (未高壓的 O. I % DEPC-I X PBS 溶液)洗 2 次，每次 5min。4).在O. 2M的鹽酸作用中作用IOmin后，重復(fù)步驟4)。5).在切片上滴加蛋白酶1((0.14 8/1111)，37で孵育151^11，重復(fù)步驟4)。6).經(jīng)O. IM TEA (三こ醇胺)作用5min后，再在新配制的O. 25% ΑΑ/0. IM TEA (こ酸酐/三こ醇胺，pH8. O)中こ酰化IOmin (在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中，步驟4，5，6省略)。7). 5XSSC 中平衡 15min。(2)雜交I).在脫水后的玻片上滴加預(yù)雜交液(約100 μ L/玻片)，置于放有濕盒液(50%甲酰胺 ν/ν ;0. 3Μ NaCl ；lmM EDTA ;IOmM Tris-Cl，pH8. O)的濕盒中，55 58°C下的烘箱中預(yù)雜交2h。2).甩掉預(yù)雜交液，地高辛標(biāo)記的反義或正義cRNA探針(濃度l-2ng/l·! L)經(jīng)70°C變性10分鐘，置冰上lmin，玻片上滴加預(yù)雜交液(約60 μ L/玻片)，覆蓋parafilm膜，放濕盒中在48 58°C下雜交18-30h。(3)雜交后處理I).取出玻片，小心去掉Parafilm膜，甩掉雜交液，用52°C預(yù)熱的5XSSC洗30mino2).在無 DNA 的 RNA 酶 Α(20μ g/ml)溶液中 37°C下孵育 30min。3).分別依次用 52°C預(yù)熱的 2 X SSC, IXSSC O. I X SSC 洗 2 次，每次 30min。(4)雜交信號檢測I).在緩沖液 A(0. IM Tris-HCl pH7. 5,0. 15Μ NaCl)中平衡 5min。2).在玻片上滴加堿性磷酸酶的抗地高辛抗體(I 500 I : 2000稀釋于含O. 5%阻斷液的緩沖液A中)，室溫反應(yīng)2h。3).用緩沖液A洗2次，毎次15min。
4).在緩沖液 B (O. IM Tris-HCl ；0. IM NaCl ；0. 05M MgCl2, ρΗ9· 5)中平衡 5min。5).硝基四氮唑藍(lán)(NBT)和5-溴_4_氯_3_吲哚氧磷酸鹽(BCIP)溶于緩沖液B中，每ml緩沖液B含有4. 5 μ L NBT和3. 5 μ L BCIP0在玻片上滴加混合染液在濕盒中顯色過夜。6).充分顯色后，用 EDTA(lmM EDTA, ρΗ8. O)洗 15min 終止反應(yīng)。7).在95%こ醇中洗Ih以除去非特異的背景。8).用蒸餾水洗15min除去可能存在的結(jié)晶體。9).脫水、透明，用中性樹膠封片。10).充分干燥后在顯微鏡下觀察、照相。實(shí)施例4免疫檢測I.抗原蛋白獲得(I)利用基因工程表達(dá)可從Genebank數(shù)據(jù)庫中獲得人STC2基因的cDNA序列，通過PCR擴(kuò)增獲得編碼框，插入原核生物或真核生物表達(dá)載體中，表達(dá)STC2蛋白，并按基因工程表達(dá)產(chǎn)物的純化體系純化蛋白。2、抗體制備可采用以下幾種方法制備抗體(I)細(xì)胞融合法用上述制備的STC2蛋白免疫動(dòng)物(包括兔子、山羊等)，獲得脾臟細(xì)胞，再與骨髄瘤細(xì)胞融合，并按常規(guī)單克隆抗體制備技術(shù)制備單克隆抗體。(2)利用噬菌體表面展示庫，克隆免疫動(dòng)物的脾臟IgG可變區(qū)并表達(dá)成基因工程單克隆抗體。(3)利用純化的蛋白免疫動(dòng)物，制備多抗血清。3、檢測(I)用制備的抗體(多抗或單抗)，用組織化學(xué)方法進(jìn)行肝癌的病理檢測，陽性信號為肝癌。(2)取患者血清，用ELISA方法檢測，陽性反應(yīng)為肝癌可疑病人。(3)將STC2抗體作為蛋白質(zhì)芯片的探針之一，用于多種腫瘤診斷。實(shí)施例5STC2基因的小干擾核糖核酸(SiRNA)體外化學(xué)合成小干擾核糖核酸(SiRNA)具有快速、簡單和特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，在抗腫瘤治療等方面有廣泛的應(yīng)用前景。針對STC2基因mRNA設(shè)計(jì)合成兩對siRNA序列，分別是siRNA-1548和siRNA_1779，序列分別如下siRNA-1548 :正義鏈，5’-GGCUUACAUGGGAUUUGCAUGACdTdT-3’ (SEQ ID NO :7);反義鏈，5’-AAGUCAUGCAAAUCCCAUGUAAGdCdC-3’ (SEQ ID NO :8)；siRNA-1779 :正義鏈，5’-GUGGAGAUGAUCCAUUUCAdTdT-3’ (SEQ ID NO :9);反義鏈，5’-UGAAAUGGAUCAUCUCCACdTdT-3’ (SEQ ID NO :10)。另外設(shè)置無關(guān)序列作為陰性對照SiRNA，其序列如下正義鏈，5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’(SEQ ID NO :11)；反義鏈，5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’(SEQ ID NO :12)。在96孔板中每孔接種3X IO3肝癌細(xì)胞系YY-8103和Focus細(xì)胞(均源自中國科學(xué)院細(xì)胞庫)，待細(xì)胞密度達(dá)到40%左右吋，利用脂質(zhì)體(Lipofectamine 2000)轉(zhuǎn)染試劑分別將上述3種siRNA按終濃度50nmol/L轉(zhuǎn)染進(jìn)YY-8103和Focus細(xì)胞中，4h后換成含10%胎牛血清的DMEM。以24h為I個(gè)檢測單位培養(yǎng)7d，每天檢測I次該細(xì)胞密度。每孔待 測細(xì)胞液中加10 μ L CCK-8，37°C孵育lh。利用酶標(biāo)儀在450nm波長下檢測其吸光度以代表細(xì)胞存活能力，繪制生長曲線(見圖3和圖4)。如圖3和圖4所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明特異性干擾STC2基因表達(dá)的小干擾核糖核酸(siRNA) siRNA-1548與siRNA-1779能夠有效沉默STC2基因的mRNA水平，同時(shí)能夠抑制肝癌細(xì)胞系YY-8103和Focus的生長，肝癌細(xì)胞的存活率明顯低于對照組的細(xì)胞，說明人STC2基因的表達(dá)下調(diào)能在一定程度上抑制肝癌細(xì)胞生長。實(shí)施例6shRNAs干擾STC2基因抑制肝癌細(xì)胞生長將構(gòu)建好的質(zhì)粒pSUPER質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后48小時(shí)后抽提細(xì)胞株RNA，定量PCR鑒定RNA干擾的效果，確認(rèn)質(zhì)粒能夠發(fā)揮RNAi效應(yīng)后，與pcDNA3. I (質(zhì)粒質(zhì)量比5 : I)共轉(zhuǎn)染，將細(xì)胞重新接種于IOcm大盤中培養(yǎng)，同時(shí)培養(yǎng)液中加入新霉素G418進(jìn)行篩選培養(yǎng)4 6周，去除培養(yǎng)液，IXPBS漂洗兩遍后結(jié)晶紫染色后拍照計(jì)數(shù)。結(jié)果如圖5所示，定量PCR檢測shRNAs有效沉默STC2基因的表達(dá)(見圖5A)，并且顯著抑制細(xì)胞克隆形成能力(見圖5B，圖5C)。實(shí)施例7STC2基因過量表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長I.構(gòu)建pcDNA3. 1B-STC2質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增相應(yīng)片段，酶切后連接到空質(zhì)粒pcDNA3. IB上，測序。2.細(xì)胞克隆形成分析I)轉(zhuǎn)染采用 LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染細(xì)胞；2) 35mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)24小時(shí)后消化計(jì)數(shù)，接種5 10 X IO4細(xì)胞至IOOmm培養(yǎng)皿，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，再加G418至終濃度600-1000mg/ml (根據(jù)不同細(xì)胞的敏感度而不同)
培養(yǎng)2 3星期直至有克隆形成，期間每隔三天換液；3)吸去培養(yǎng)皿內(nèi)的培液，IXPBS洗兩次，用結(jié)晶紫染色液染色2-4小時(shí)；4)按照相同的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)每個(gè)培養(yǎng)皿上的細(xì)胞克隆數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，定量PCR檢測STC2基因在質(zhì)粒pcDNA3. 1B-STC2轉(zhuǎn)染PLC/PRF/5細(xì)胞中的過量表達(dá)(見圖6A)，同時(shí)克隆形成形成顯示STC2基因顯著促進(jìn)細(xì)胞克隆形成能力(見圖6B，圖6C)。實(shí)施例8PCR實(shí)驗(yàn)檢測STC2基因在正常人體組織中的表達(dá)情況用常規(guī)PCR的方法檢測STC2基因在正常成人組織中的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示STC2在胚胎肝臟中表達(dá)，在成熟肝臟中不表達(dá)(見圖7)，進(jìn)ー步表明STC2基因的表達(dá)可用于準(zhǔn)確診斷肝癌。序列表〈110〉上海人類基因組研究中心<120>STC2基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用<130>CPC-NP-11-15118<160>12 <170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>20<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_feature〈223〉引物<400>1atgctacctc aagcacgacc 20<210>2<211>20<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_feature〈223〉引物<400>2tctgctcaca ctgaacctgc 20<210>3<211>18<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_feature〈223〉引物<400>3catcctgcgt ctggacct18<210>4<211>20<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉
<221>misc_feature〈223〉引物<400>4gtacttgcgc tcaggaggag20<210>5<211>22<212>DNA
〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_feature〈223〉引物〈400>5aatcgtgcgt gacattaagg ag 22<210>6<211>22<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_feature〈223〉引物<400>6actgtgttgg cgtacaggtc tt 22<210>7<211>25<212>RNA〈213〉人工序列<220><221>misc_RNA〈222〉(I) ·· (25)<223>siRNA<400>7ggcuuacaug ggauuugcau gactt 25<210>8<211>25<212>RNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_RNA〈222〉(I) ·· (25)
<223>siRNA<400>8aagucaugca aaucccaugu aagcc 25<210>9<211>21<212>RNA〈213〉人工序列 〈220〉<221>misc_RNA〈222〉(I) ·· (21)<223>siRNA<400>9guggagauga uccauuucat t 21<210>10<211>21<212>RNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_RNA〈222〉(I) ·· (21)<223>siRNA〈400〉10ugaaauggau caucuccact t 21<210>11<211>21<212>RNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_RNA〈222〉(I) ·· (21)<223>siRNA〈400〉11uucuccgaac gugucacgut t 21<210>12<211>21<212>RNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_RNA
〈222〉(I) ·· (21)<223>siRNA
<400>12acgugacacg uucggagaat t 2權(quán)利要求
1.ー種STC2基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用，其特征在于，所述STC2基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備診斷肝癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述診斷肝癌的產(chǎn)品包括用RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢測、原位雜交或基因芯片診斷肝癌的產(chǎn)品。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用RT-PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴(kuò)增STC2基因的引物。
4.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括ー對特異擴(kuò)增STC2基因的引物。
5.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用免疫檢測診斷肝癌的產(chǎn)品包括與STC2蛋白特異性結(jié)合的抗體。
6.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用原位雜交診斷肝癌的產(chǎn)品包括與STC2基因的核酸序列雜交的探針。
7.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用基因芯片診斷肝癌的產(chǎn)品包括與STC2基因的核酸序列雜交的探針。
8.—種STC2基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用，其特征在于，所述STC2基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述治療肝癌的藥物包括通過RNA干擾抑制STC2基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸，或用于抑制STC2蛋白活性的蛋白質(zhì)。
10.用于制備用RT-PCR或?qū)崟r(shí)定量PCR診斷肝癌產(chǎn)品的ー對特異擴(kuò)增STC2基因的引物，其特征在于所述引物的上游引物序列具有如SEQ ID NO 1所示的序列或其互補(bǔ)序列，所述引物對的下游引物序列具有如SEQ ID NO :2所示的序列或其互補(bǔ)序列。
11.用于制備治療肝癌藥物的ー對STC2基因的siRNA，其特征在于所述siRNA的正義鏈具有如SEQ ID NO. 7所示序列，所述siRNA的反義鏈具有如SEQ ID NO. 8所示序列。
12.用于制備治療肝癌藥物的ー對STC2基因的siRNA，其特征在于所述siRNA的正義鏈具有如SEQ ID NO. 9所示序列，所述siRNA的反義鏈具有如SEQ ID NO. 10所示序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種STC2基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用，用于制備肝癌診斷及治療的產(chǎn)品。本發(fā)明的STC2基因及其表達(dá)產(chǎn)物，可作為診斷肝癌的特異性標(biāo)志基因，使肝癌診斷更加準(zhǔn)確、快速；本發(fā)明的STC2基因及其表達(dá)產(chǎn)物可作為制備治療肝癌藥物的靶基因，提供新的肝癌治療途徑。
文檔編號A61K38/00GK102690870SQ20111007006
公開日2012年9月26日 申請日期2011年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月23日
發(fā)明者王海嘯, 蔡兵, 鄧慶, 韓澤廣 申請人:上海人類基因組研究中心