專利名稱：一種鳳尾草提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種鳳尾草提取物，本發(fā)明同時涉及該提取物的制備方法和用途。
背景技術：
鳳尾草(Pteris multifida Poir.)為鳳尾蕨科鳳尾草屬植物,又名山雞尾、井口邊草、鐵腳雞等，生于陰濕巖壁及墻垣、石縫處，在全世界溫帶地區(qū)廣泛分布。中國傳統(tǒng)醫(yī)學認為鳳尾草性寒味微苦，具有消腫解毒、清熱利濕、涼血止血之功效，主治痢疾、泄瀉、淋濁、帶下、黃疸、扁桃體炎、腮腺炎、乳腺炎、吐血、衄血、尿血、便血及外傷出血等癥,臨床應用于治療傳染性肝炎、急性細菌性痢疾等疾病?，F(xiàn)代化學研究其主要成份為黃酮類、蕨素類倍半萜、貝殼杉烷型二萜等，從鳳尾草中已發(fā)現(xiàn)的黃酮類成份包括芹菜素、芹菜素-7-0- ^ -D-葡萄糖苷、芳:菜素_3' _0_ 0-D-匍萄糖苷、芳:菜素-7-0-0-D-匍萄糖_4' H3-a-L_鼠李糖苷、木犀草素、木犀草素-7-0- 3 -D-匍萄糖苷、木犀草素-7-0- 3 -D-匍萄糖苷等[孫海 燕等.中藥鳳尾草的研究進展.中國獸醫(yī)寄生蟲病2007，15(3) :422-6]。其它鳳尾草同屬植物功效和化學成份相似，如鳳尾蕨(Pteris cretica var. nervosa)、半鳳尾蕨(Pterisdispar)、半邊旗(Pteris semipinnata)等,詳參《中華本草》卷二,上?？萍汲霭嫔?，1999 :115-126。鳳尾草是我國特色民間草藥，相關文獻集中在我國。朱大元、向貴等(從鳳尾草中分離洋芹子素衍生物及它們的用途，申請?zhí)朇N200510024554. 6)公開了鳳尾草中的洋芹子素-4' -a-L-鼠李糖苷、洋芹子素-4' -a-L-鼠李糖-7-P-D-葡萄苷、木犀草素、棕櫚酸和山崳酸對體外培養(yǎng)的前列腺細胞增殖有抑制作用，可用于治療前列腺肥大和前列腺炎藥物中；該發(fā)明所述洋芹子素衍生物的制備方法主要采用20-40%乙醇提取、大孔樹脂或聚酰胺柱精制、不同濃度乙醇-水梯度洗脫的工藝路線，并進一步采用硅膠、凝膠柱層析獲得所述單體成份；但該發(fā)明未涉及鳳尾草總黃酮的含量和成份組成。劉建群等[大孔樹脂對鳳尾草水部位總黃酮的富集作用研究.江西中醫(yī)學院學報2009，21 (4) :49-51.]采用70%乙醇提取鳳尾草，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取后分部位萃取后，得水部位，利用LSA40大孔樹脂對鳳尾草中水部位的總黃酮進行富集，總黃酮含量為27%。夏玉葉等(鳳尾草總黃酮的新應用，專利號CN200610027926. 5)公開了一種鳳尾草總黃酮在制備防治缺血性疾病藥物中的新應用，該發(fā)明所述總黃酮采用70%乙醇提取、石油醚脫脂后水液經大孔樹脂精制等步驟獲得。黃運鳳、劉國凌[大孔樹脂對鳳尾草黃酮吸附分離特性研究的影響 貴州農業(yè)科學，2010，38 (6) :57-59.]對4種大孔吸附樹脂HPD100, HPD600、HPD700、HPD722和AB-8進行比較，結果表明，HPD700樹脂較適宜于鳳尾草黃酮的提純，經純化后鳳尾草黃酮純度可達51.8%。張樹祥等(一種鳳尾草黃酮類化合物的提取方法，申請?zhí)朇N200810101749. X)公開了一種提取鳳尾草藥材中黃酮類化合物的方法，鳳尾草藥材經乙醇提取、石油醚脫脂后，用乙酸乙酯-正丁醇混合溶劑系統(tǒng)萃取富集黃酮類化合物，所得萃取物膏經堿溶酸沉，即得黃酮類化合物，純度可達60%以上?，F(xiàn)有鳳尾草總黃酮的大孔樹脂制備技術中，優(yōu)化工藝的總黃酮純度為51. 8%，一般均采用有機溶劑脫脂處理，但該法不適于工業(yè)化生產使用。另一方面，現(xiàn)有技術對產品中鳳尾草總黃酮的成份組成并不確定，因而實際生產中難以獲得組成穩(wěn)定、工藝可控性好的產品。本發(fā)明人在臨床實踐中，調研發(fā)現(xiàn)蘇州、太倉等地民間有使用鳳尾草單味草藥治療前列腺增生、前列腺炎的經驗，因而在1999-2006年期間首次進行了臨床驗證[薛波新等.鳳尾草顆粒劑治療良性前列腺增生癥的臨床療效評價.中國中西醫(yī)結合雜志2008，28(5) :456-458 ;單玉喜等.單味中藥鳳尾草顆粒劑治療慢性前列腺炎(III A型)87例.中醫(yī)雜志，49(6) :549.]。經中國科學院上海藥物研究所研究，發(fā)現(xiàn)從鳳尾草中得到的芹菜素-4' -0-鼠李糖苷、芹菜素-7-0-葡萄糖-4' -0-鼠李糖苷、山崳酸等成份對培養(yǎng)的前列腺細胞增殖有強的抑制作用，有望發(fā)展成治療前列腺增生和前列腺炎新藥[秦波，朱大元，向貴等.鳳尾草的化學成分及其對體外大鼠前列腺上皮細胞的抑制效應.中國天然藥物2006，10 (6) =428-431.]。本發(fā)明內容是前期研究基礎上的后續(xù)發(fā)現(xiàn)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種組成成份穩(wěn)定、工藝和質量可控的鳳尾草提取物。 本發(fā)明的另一目的是提供該提取物在抗炎作用的食品或藥品中的應用。本發(fā)明提供的制備鳳尾草提取物的方法包括以下工藝步驟(I)選取鳳尾草屬植物藥材，采用水或乙醇-水混合溶媒進行提取，濃縮為濃縮液，加適量水稀釋，一定方式下靜置6-24小時，過濾，得鳳尾草溶液；(2)由(I)所得鳳尾草溶液，采用預處理好的大孔樹脂進行吸附，先用水洗，再用乙醇-水混合溶媒按10-30%、50-95%乙醇梯度洗脫，收集50-95%乙醇洗脫部位洗脫液，濃縮，干燥，即得。所述工藝步驟(I)中藥材選用鳳尾草屬植物全草，其中優(yōu)選鳳尾草或具有相似總黃酮組成的同屬植物。提取溶媒可采用常規(guī)的水或乙醇一7jc (50-75% )混合溶媒提取，提取液合并，常法濃縮得濃縮液，再加適量水稀釋，過濾，得鳳尾草溶液。為進一步提高提取液中總黃酮含量，可優(yōu)選采用一次水沉處理，即濃縮液再加入適量水(為按藥材干重計的1-5倍，優(yōu)選1-3倍)，室溫或冷藏條件下靜置6-24小時(優(yōu)選8-16小時)，再過濾，得鳳尾草溶液。所述工藝步驟(2)中，所述大孔樹脂優(yōu)選非極性或弱極性大孔樹脂，更優(yōu)選弱極性大孔樹脂。大孔樹脂柱梯度洗脫時更優(yōu)選按10-30 %、60-75%乙醇梯度洗脫并收集60-75%乙醇洗脫部位洗脫液獲得鳳尾草提取物。所述提取物中主要含有黃酮類成份，其中主要成份芹菜素-7-0-0 -D-葡萄糖-4' -0- a -L-鼠李糖苷和木犀草素-7-0-0 -D-葡萄糖苷的總含量大于20%。該提取物中還含有木犀草素-7-0-0-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-0-0 -D-葡萄糖苷、芹菜素-3' -O-^-D-葡萄糖苷、芹菜素、木犀草素等成份中的至少一種以上。采用亞硝酸鈉-氯化鋁比色法、蘆丁對照，測得所述提取物中總黃酮含量平均為 58%。本發(fā)明通過鳳尾草提取物工藝研究，采用優(yōu)選大孔樹脂進行選擇性梯度洗脫，結合水沉處理工序，獲得提取物中總黃酮含量大于55% ;同時明確了該提取物中主要的兩種指標性成份及其總含量，為其質量控制提供了參考依據(jù)。該生產工藝降低了純化成本，容易實現(xiàn)工業(yè)化生產，并且對環(huán)境無污染。
本發(fā)明同時對該提取物的抗炎、抗前列腺炎和抑制前連腺增生作用進行了考察。研究結果(I) 二甲苯致小鼠急性耳腫脹試驗結果表明，所述提取物灌藥給藥(500mg/kg)具有一定的抗炎作用；(2)百白破疫苗致小鼠前列腺炎試驗表明，鳳尾草醇提物組(12g生藥/kg)、鳳尾草提取物組(300mg/kg、150mg/kg)原前列腺炎性組織中浸潤的淋巴細胞、楽；細胞均減少，表明鳳尾草提取物具有抗前列腺炎作用；(3)丙酸睪酮致小鼠前列腺增生試驗表明，鳳尾草醇 提物組(12g生藥/kg)、鳳尾草提取物組(300mg/kg、150mg/kg)、保列治對照組給藥30天后病理切片觀察前列腺增生緩解。結果表明，所述提取物具有較好的抗炎活性、抗前列腺炎和抗前連腺增生作用，可以根據(jù)使用需要應用于不同的功能食品和藥品中。本發(fā)明內容是通過大量實驗研究、進行工藝優(yōu)化分析完成的，以下述具體實施例進行說明。


附圖為鳳尾草提取物的液相色譜圖(檢測波長340nm)。圖中，色譜峰1、2 (保留時間分別為11. 7、12. 8分鐘)依次為木犀草素-7-0-0 -D-葡萄糖苷、芹菜素-7-0-0 -D-葡萄糖-4' -0-a-L-鼠李糖苷。
具體實施例方式本發(fā)明所述的鳳尾草提取物是按如下實施例所表示的方法制造，所涉及到的方法是本領域的技術人員能夠掌握和運用的技術手段。但以下實施例不得理解為任何意義上的對本發(fā)明權利要求的限制。實施例I :鳳尾草提取物的制備本課題組對鳳尾草總黃酮的大孔樹脂精制工藝進行了系統(tǒng)研究，研究內容包括靜態(tài)吸附法、動態(tài)吸附法評價篩選不同樹脂種類，對優(yōu)選的AB-8樹脂進行了吸附等溫線、飽和吸附泄漏曲線、上樣濃度、梯度洗脫條件、流速、柱徑高比等優(yōu)化考察，獲得鳳尾草總黃酮有效部位。主要工藝過程如下鳳尾草藥材20kg，用70%乙醇回流提取二次，每次I. 5小時，合并提取液，減壓濃縮至20L，加入20L水靜置過夜，過濾，溶液上樣于已處理好的AB-8樹脂柱內，分別用水、20%乙醇、70%、95%乙醇各3BV進行梯度洗脫，70%乙醇洗脫部位經減壓濃縮、干燥，獲得鳳尾草提取物(PM-Fl)黃色粉末160. 0g，得率0. 8%。HPLC法測定PM-Fl中指標成份含量采用木犀草素+O- ^ -D-葡萄糖苷(I)、芹菜素_7_0_ 0-D-葡萄糖-4' H3-a-L-鼠李糖苷(2)自制對照品，測定原料中指標成份含量。色譜條件20%乙腈-(0. I %乙酸-水)為流動相等度洗脫，檢測波長340nm，柱溫30°C。分析結果測得PM-Fl中化合物1、2的含量分別為9. 8%U2. 5%，二者總和22. 3%。比色法測定組合物中總黃酮含量精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品約5. Omg,甲醇定容至25.0mL。分別移取上述溶液0、0. 3、0. 6、0. 9、1.2、1.5、1.8、2. lmL，置于IOmL容量瓶中，加水補至5mL，加5%亞硝酸鈉0. 3mL,靜置6分鐘；加10%硝酸鋁0. 3mL,靜置6分鐘；加4%氫氧化鈉2mL，加水定容至10mL，15分鐘后于500nm處測溶液吸光度A。以A與蘆丁含量進行線性回歸，所得方程為A = I. 07m+0. 0095 (r2 = 0. 9995)，線性范圍0. 129-0. 903 u go取測試品適量，以蘆丁為對照,測定試樣中總黃酮含量為56. 1%。
鳳尾草提取物樣品的HPLC圖譜參見附圖。實驗例I :鳳尾草提取物的抗炎作用試驗取20_25g小鼠40只，分為鳳尾草醇提物(12g生藥/kg)、鳳尾草提取物(300mg/kg)組、對照組和模型組四組，預灌藥一周。最后一次灌藥2小時后，用二甲苯25微升均勻涂于小鼠右耳，半小時后處死小鼠，用直徑6mm打孔器，取小鼠的左右耳相同部位，用分析天平稱重。取下的右耳減去左耳重量為腫脹度，計算對照組和給藥組的均值與標準差，t檢驗比較組間差異顯著性。按下式求出腫脹抑制率腫脹抑制率(％ ) = [I-給藥組平均腫脹度/模型組平均腫脹度]X 100%結果鳳尾草醇提物(12g生藥/kg)、鳳尾草提取物(300mg/kg)對二甲苯所致小鼠耳廓急性炎癥的腫脹抑制率分別為57. 8,51.3(% )，二組間比較無明顯差異(P < 0. 5)，表明二者均有一定的抑制作用。 實驗例2 :鳳尾草提取物的抗前列腺炎作用試驗選擇體重20 25g雄性小鼠90只，隨機分為正常組、模型組、鳳尾草醇提物組(12g生藥/kg)、鳳尾草提取物組(300mg/kg、150mg/kg)、生理鹽水對照組共6組,正常對照組皮下注射油酸乙酯5ml/kg/d，其余小鼠全部腹腔注射百白破疫苗0. 1ml，多點皮內注射大鼠前列腺蛋白提純液和完全弗氏佐劑(比例為I : I的混懸液)0.4ml，分別于0、30d進行2次注射。連續(xù)給藥30天后，處死各組小鼠，檢查前列腺病理變化情況。結果造模后30天的小鼠產生不同程度的慢性炎癥的病理表現(xiàn)；鳳尾草醇提物組(12g生藥/kg)、鳳尾草提取物組(300mg/kg、150mg/kg)原前列腺炎性組織中浸潤的淋巴細胞、漿細胞均減少，表明鳳尾草提取物具有抗前列腺炎作用。實驗例3 :鳳尾草提取物的抑制前列腺增生作用試驗選擇體重20 25g雄性小鼠105只，隨機分為正常組、模型組、鳳尾草醇提物組(12g生藥/kg)、鳳尾草提取物組(300mg/kg、150mg/kg)、保列治對照組和生理鹽水對照組共7組，正常對照組皮下注射油酸乙酯5ml/kg/d，其余小鼠全部皮下注射丙酸睪酮5mg/kg/d，連續(xù)給藥21天后，處死對照組及丙睪模型組小鼠，檢查前列腺增生情況；給藥組分別繼續(xù)灌胃生理鹽水、鳳尾草制劑及保列治連續(xù)30天，每天I次，最后一次給藥24h后，剖檢各小鼠的前列腺組織病變情況。結果正常對照組病理切片觀察前列腺組織，腺上皮為單層柱狀，單核，橢圓形，位于基底部；腺腔大小基本一致，腔內無或有少許分泌物。模型組腺上皮漸變?yōu)楦咧鶢?，細胞排列緊密，部分腺上皮呈乳頭狀增生，個別細胞可見2 3個橢圓形核。腺腔密集，大小不一，腔明顯擴大，腔內分泌物顯著增加，前列腺增生顯著。鳳尾草醇提物組(12g生藥/kg)、鳳尾草提取物組(300mg/kg、150mg/kg)、保列治對照組給藥30天后病理切片觀察前列腺增生緩解。
權利要求
1.一種鳳尾草提取物，其特征在于該提取物中含有芹菜素-7-0-β-D-葡萄糖-4' -O- a -L-鼠李糖苷和木犀草素-7-0-β-D-匍萄糖苷,所述鳳尾草提取物的制備方法如下 (1)選取鳳尾草屬植物藥材，采用水或こ醇-水混合溶媒進行提取，濃縮為濃縮液，加適量水稀釋，一定方式下靜置6-24小時，過濾，得鳳尾草溶液； (2)由(I)所得鳳尾草溶液，采用預處理好的大孔樹脂進行吸附，先用水洗，再用こ醇-水混合溶媒按10-30%、50-95%こ醇梯度洗脫，收集50-95%こ醇洗脫部位洗脫液，濃縮，干燥，即得。
2.根據(jù)權利要求I所述鳳尾草提取物的制備方法，其特征在于其制備方法步驟(I)中所選取鳳尾草屬植物為鳳尾草(Pteris multifida)。
3.根據(jù)權利要求I所述鳳尾草提取物的制備方法，其特征在于其制備方法步驟(I)中所加適量水為按藥材干重計的1-5倍，所述靜置方式為室溫或冷蔵，靜置時間優(yōu)選8-16小時。
4.根據(jù)權利要求I所述鳳尾草提取物的制備方法，其特征在于其制備方法步驟(2)中所述大孔樹脂優(yōu)選弱極性大孔樹脂，所述こ醇-水混合溶媒優(yōu)選按15-25 %、60-75%こ醇梯度洗脫。
5.根據(jù)權利要求I至4所述鳳尾草提取物，其特征在于該提取物中含有芹菜素-7-0- β -D-葡萄糖-4' -O- a -L-鼠李糖苷和木犀草素-7-0- β -D-葡萄糖苷，二者總含量大于20%。
6.根據(jù)權利要求5所述鳳尾草提取物，其特征在于該提取物中還含有木犀草素-7-0- β -D-匍萄糖苷、芳:菜素-7-0- β -D-匍萄糖苷、芳:菜素-3' -O- β -D-匍萄糖苷、芳菜素、木犀草素等成份中的至少ー種以上。所述提取物中總黃酮含量大于50%。
7.根據(jù)權利要求I所述鳳尾草提取物在食品和藥品中的應用。
8.根據(jù)權利要求7所述鳳尾草提取物在食品和藥品中的應用，特征在于該組合物具有抗炎作用。
9.根據(jù)權利要求7所述鳳尾草提取物在食品和藥品中的應用，特征在于該組合物具有抗前列腺炎作用。
10.根據(jù)權利要求7所述鳳尾草提取物在食品和藥品中的應用，特征在于該組合物具有抑制前列腺增生作用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鳳尾草提取物，該提取物由鳳尾草屬植物提取獲得，其中主要含有黃酮類成份，包括芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖-4′-O-α-L-鼠李糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷等成分。本發(fā)明同時公開了所述鳳尾草提取物的制備方法，主要特征在于該提取物物由鳳尾草屬植物經乙醇提取、水沉處理、大孔樹脂柱精制等工序處理獲得，其中所述大孔樹脂優(yōu)選弱極性大孔樹脂。本發(fā)明同時公開了該鳳尾草提取物在藥品和食品方面的用途，主要特征在于該提取物具有抗炎作用，尤其具有抗前列腺炎或抑制前列腺增生作用。
文檔編號A61P13/08GK102688261SQ20111006698
公開日2012年9月26日 申請日期2011年3月21日 優(yōu)先權日2011年3月21日
發(fā)明者劉志遠, 劉江云, 劉艷麗, 單玉喜, 向貴, 楊世林, 王益, 王蓉, 薛波新 申請人:蘇州世林醫(yī)藥技術發(fā)展有限公司