專利名稱：烷基化重組人血清白蛋白及其藥學組合物的制備和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，涉及一種生物可降解兩親性重組人血清白蛋白衍生物作為藥物載體，本發(fā)明還涉及該載體的制備方法及其應用。
背景技術(shù)：
人源血清白蛋白(human serum albumin, HSA)，是血漿中含量最多的蛋白質(zhì)(每升血清含有30 50g)，約占其總蛋白質(zhì)量的55%，相對分子質(zhì)量約為66500。它在人體內(nèi)的平均半衰期為19d，它是由585個氨基酸殘基組成的多肽單鏈，分子中含17個二硫鍵和1 個游離的巰基，不含糖組分。它的等電點為4. 7 4. 9，是一種酸性蛋白質(zhì)，易溶于水。在 pH 4 9的水性介質(zhì)中是穩(wěn)定的，在體積分數(shù)為40%乙醇中可以溶解，可加熱到60°C維持 IOh仍然不會對身體有害。人源血清蛋白(HSA)作為藥物增溶載體，主要基于以下優(yōu)點①HSA為人體內(nèi)源性物質(zhì)，無任何毒性及免疫原性，同時具有良好的穩(wěn)定性，不會因人體內(nèi)環(huán)境的變化或免疫反應而變性或降解；②HSA多肽鏈上帶有較多的極性基團及疏水性氨基酸，對70%的小分子藥物、特別是難溶性藥物具有高度的親和力，且可發(fā)生可逆結(jié)合，為其有效負載和釋藥提供可能；白蛋白二級結(jié)構(gòu)中含有約48%的α-螺旋結(jié)構(gòu)，15% β-折疊結(jié)構(gòu)，其余為無規(guī)線團結(jié)構(gòu)，因此具有很多的網(wǎng)狀空隙，為攜帶藥物創(chuàng)造了有利的空間條件；③HSA對腫瘤和炎癥組織具有被動和主動靶向的作用。研究發(fā)現(xiàn)，實體瘤和炎癥組織血管豐富、通透性大，但是淋巴回流缺失，造成大分子類物質(zhì)和脂質(zhì)顆粒具有選擇性高通透性和滯留性(enhanced permeability andretention (EPR) effect)；其次，腫瘤組織中分解血漿蛋白的行為過度表達，表明大量增生的腫瘤組織會蓄積白蛋白，并將其作為主要能量及新生蛋白質(zhì)合成的氮源，通過這個天然的生物學途徑為自身的快速生長提供營養(yǎng)和能量。白蛋白被腫瘤及炎癥組織優(yōu)先攝取的特性使其成為抗腫瘤藥物及抗炎藥物傳遞系統(tǒng)的理想載體。Chen等利用去溶劑法，在2% 4%的HSA溶液中加入丙酮，使兩者的體積比為 5 4，然后在75°C下振蕩固化至少15min，冷凍干燥，制備成直徑為200 500nm的白蛋白微球(Chen CO, Lin W, Coombes AG, et al. Preparation of human serum albumin microspherers by aacetone-heat denaturarion method[J]. JMicroencapsul, 1994, 11 (4) :395-407.) 0 Hickstein等，為了避免MTX作為免疫抑制劑使用時對胃腸道和骨髓細胞的嚴重不良反應，將MTX與HSA通過化學鍵結(jié)合制成MTX-HSA ；大鼠腎移植免疫實驗表明，MTX-HSA 組的存活率顯著提高(Hickstein H, Wolff D, Stange J, et al. Prolonged survival of renal allograft in rats bymethotrexate-albumin conjugates as immunosuppressive therapy [J]. Transplant Proc，2008，40 (10) :3725-3727.)。闞和平等將抗人肝癌單克隆抗體HAblS通過異型雙功能交聯(lián)劑與載多柔比星(ADR)的人血清白蛋白納米球偶聯(lián)，制備成抗人肝癌免疫白蛋白納米球。它能與人肝癌細胞株SMMC-7721特異性結(jié)合，其體外殺傷SMMC-7721細胞的IC5tl顯著降低，人肝癌裸鼠模型顯示抑瘤率顯著增強 (闞和平，劉正軍，譚永法等.抗人肝癌免疫毫微球的制備及其抗癌效果觀察[J].南方醫(yī)科大學學報，2008，觀(8) :1053-1055.)。Abraxane 是美國生物科學公司研制的一種注射用紫杉醇白蛋白微粒，于2005年獲得美國FDA批準上市，并于2008年進口中國。該制劑采用HSA為載體制備成平均粒徑為130nm的微粒系統(tǒng)，利用HSA的表面電性及立體結(jié)構(gòu)來阻止紫杉醇納米粒的聚集。該制劑利用了腫瘤細胞攝取營養(yǎng)物質(zhì)的途徑，將白蛋白傳送的營養(yǎng)物質(zhì)替換成抗腫瘤藥紫杉醇，不僅避免了表面活性劑(聚氧乙烯蓖麻油)的使用，減少了由此帶來的過敏反應，同時使藥物富集于腫瘤病灶部位(陳辰，何軍，陸偉根等.白蛋白作為注射用難溶性藥物載體的研究進展[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2010，41(1) :51巧4.)。專利CN 101220093A和CN 101543630A公開了一類疏水或親水改性的HSA衍生物，即在HSA分子鏈上引入一定的疏水或親水基團，發(fā)現(xiàn)其在水性介質(zhì)中可自組裝形成納米膠束，對難溶性藥物有很好的增溶效果。但是，HSA作為藥物載體材料存在如下方面的缺陷1)血液中存在各種傳染性疾病病原的潛在危險，尤其是艾滋病、乙肝等病毒的蔓延，來自人源血漿的血清白蛋白在純化過程中難免將這些病毒帶入終產(chǎn)品；2)臨床上使用的人血清白蛋白主要靠收集人的血液通過分級過濾獲得，因此其來源受到血漿和胎盤的限制。目前人們利用各種技術(shù)表達重組人血清白蛋白(Recombinant human serum albumin，rHSA)，其結(jié)構(gòu)和功能與血漿來源的血清白蛋白相似。rHSA具有無酶活性、無免疫原性和抗氧化性等特點，廣泛用于血漿容量擴充劑，還可用為賦形劑和穩(wěn)定劑，用于各種藥物制劑及無血清細胞培養(yǎng)基的組分。與HSA相比，rHSA作為藥物載體材料可避免潛在疾病或病毒傳播的危險，來源更加廣泛。因此，本專利利用rHSA分子鏈上大量的活性氨基，在rHSA分子鏈中引入合適的疏水基團，形成兩親性大分子衍生物，作為藥物載體材料。該rHSA兩親性衍生物具有以下特點1)在水溶液中可自組裝形成納米膠束，包裹難溶性藥物，避免了大量有機溶劑、表面活性劑、交聯(lián)劑或加熱條件的使用；2)與未修飾的rHSA相比，該rHSA兩親性衍生物顯著提高了藥物的載藥量和穩(wěn)定時間，提延長了藥物在體內(nèi)的循環(huán)時間，有利于腫瘤組織的靶向性。該類基于rHSA自組裝納米膠束尚未見任何文獻和專利報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可生物降解的rHSA兩親性衍生物。該衍生物在水性介質(zhì)中可自組裝形成納米膠束，可避免化學交聯(lián)劑、大量有機溶劑以及加熱條件的使用，且制備工藝簡單；并利用白蛋白分子鏈以及疏水基團和藥物的雙重作用包裹藥。該載體具有來源廣泛、可避免潛在病毒傳播的危險、載藥量高、穩(wěn)定性好、體內(nèi)長循環(huán)等特征。本發(fā)明的另一個目的是提供上述載體的制備方法。本發(fā)明的還有一個目的是提供上述載體在制劑中的應用。為了達到上述目的，本發(fā)明提供一種新型藥物增溶載體，該載體是在白蛋白分子的游離氨基上引入疏水基團，使其具有兩親性性質(zhì)，在水中可以自組裝形成膠束。所述的藥物增溶載體，其選用的rHSA表達系統(tǒng)包括原核表達系統(tǒng)(例如，大腸桿菌表達系統(tǒng)，枯草桿菌表達系統(tǒng))、酵母表達系統(tǒng)(例如，釀酒酵母表達系統(tǒng)、克魯維氏酵母表達系統(tǒng)、漢遜酵母表達系統(tǒng)、畢赤酵母表達系統(tǒng)、轉(zhuǎn)基因動物表達系統(tǒng)(例如，蠶絲表達系統(tǒng))、轉(zhuǎn)基植物表達系統(tǒng)(例如，馬鈴薯表達系統(tǒng)、水稻胚乳細胞表達系統(tǒng))。所述的藥物增溶載體，其中疏水基團碳原子數(shù)不小于2的烷(酰)基，主要取代在白蛋白賴氨酸的游離氨基，一個白蛋白分子鏈引入1 70個烷(酰)基。所述的藥物增溶載體的制備方法，包括如下步驟將rHSA溶解或分散在水和或有機溶劑的混合溶劑中，采用提供疏水基團的物質(zhì)進一步與白蛋白分子鏈上的游離氨基進行取代反應，所得rHSA衍生物即具有良好的兩親性，在水中可自發(fā)形成納米膠束。一個rHSA分子鏈中引入1 70個疏水性基團即可。所述的制備方法，其中提供疏水基團的物質(zhì)是碳原子數(shù)均不小于2的鹵代烷、烷基醛、脂肪酸酐、脂肪酰鹵等。所述的藥物增溶載體的應用，其特征在于可以用于血管內(nèi)或肌肉注射或口服、腔道或外用的藥學活性或藥理活性分子的載體。其中該藥學活性或藥理活性分子主要包括 紫杉烷類、環(huán)孢素類、喜樹堿類、黃酮類、二氫吡啶類、小檗堿類、長春堿類、蒽醌類、鬼臼毒素類抗腫瘤藥物、留體類和非留體抗炎藥物、心血管藥物、抗生素抗真菌藥物、抗病毒藥物、 免疫調(diào)節(jié)劑中的任一(多)種或其衍生物。該藥物增溶載體的制備操作步驟如下將rHSA兩親性衍生物與水按重量比1 50 1000的比例溶解，得到空白納米膠束；將治療有效量的難溶或微溶于水的藥物用藥學上可接受溶劑溶解后，與所述空白納米膠束混合后，經(jīng)超聲或高壓均質(zhì)處理，溶液用透析袋或蒸餾或超濾等方法除去有機溶劑和未包裹的藥物，凍干，即得到粒徑為1 IOOOnm的載藥納米膠束。具體方案如下 在rHSA的氨基上引入疏水性基團(烷基或脂肪?；?，使其具有兩親性性質(zhì)，在水性介質(zhì)中可組裝形成納米膠束，相對疏水的烷基或脂肪?；奂纬蓛?nèi)核，可增溶難溶性藥物，相對親水的rHSA形成外殼，可穩(wěn)定膠束，實現(xiàn)體內(nèi)長循環(huán)。該膠束作為藥物載體，粒徑在1 lOOOnm，表面光滑，均勻度好，顆粒規(guī)則無粘連，載藥量和包封率高。該藥物載體可用于血管或肌肉注射、口服、腔道和外用。生物可降解rHSA兩親性衍生物的合成及藥學或生理學活性組合物制備方法詳細說明如下一、生物可降解rHSA兩親性衍生物的合成1)與鹵代烷反應將rHSA配制成一定濃度的水溶液，加入鹵代烷，40 70°C反應0. 5 12h，調(diào)節(jié)反應溶液致PH 7.0，反應用溶液置于PBS (pH 7.4)緩沖溶液透析3d，凍干即得。合成路線圖解如下
/ \ NaBH4 / \ rHSA-NH2 + CH3"! ^2-^ rHSA-NH- ( CH2 J ^-CH32)與烷基醛反應將rHSA配制成一定濃度的水溶液，加入烷基醛，反應0. 5 12h，加入一定濃度的 NaBH4水溶液，繼續(xù)攪拌12 Mh，稀HCl溶液調(diào)節(jié)溶液pH值7. 0，反應用溶液置于PBS (pH 7. 4)溶液緩沖透析3d，凍干。合成路線圖解如下
權(quán)利要求
1.一種藥物增溶載體，其特征在于該載體是在重組人血清白蛋白分子的氨基上引入疏水烷基鏈，使其具有兩親性性質(zhì)，在水中可以自組裝為納米膠束。
2.根據(jù)權(quán)利1所述的藥物增溶載體，其特征在于，重組人血清白蛋白表達系統(tǒng)包括原核表達系統(tǒng)(例如，大腸桿菌表達系統(tǒng)，枯草桿菌表達系統(tǒng))、酵母表達系統(tǒng)(例如，釀酒酵母表達系統(tǒng)、克魯維氏酵母表達系統(tǒng)、漢遜酵母表達系統(tǒng)、畢赤酵母表達系統(tǒng)、轉(zhuǎn)基因動物表達系統(tǒng)(例如，蠶絲表達系統(tǒng))、轉(zhuǎn)基植物表達系統(tǒng)(例如，馬鈴薯表達系統(tǒng)、水稻胚乳細胞表達系統(tǒng))。
3.根據(jù)權(quán)利1所述的藥物增溶載體，其特征在于，疏水烷(酰)基鏈碳原子數(shù)大于2， 引入量為1 70個烷(酰)基/白蛋白分子。
4.權(quán)利要求1-3所述的藥物增溶載體的制備方法，其特征在于包括下列步驟將重組人血清白蛋白溶于或者分散于水或有機溶劑的混合溶劑中，采用提供疏水基團的物質(zhì)與重組人血清白蛋白分子鏈上的氨基進行反應，所得白蛋白衍生物具有良好的兩親性，在水性介質(zhì)中可以自發(fā)形成納米膠束；一個重組人血清白蛋白分子鏈上引入1 70個疏水基團即可。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于提供疏水基團的物質(zhì)包括碳原子數(shù)大于2的鹵代烴、烷基醛、脂肪酸酐、脂肪酰鹵。
6.權(quán)利要求1所述的藥物增溶載體的應用，其特征在于可以用于血管內(nèi)或肌肉注射或口服、外用的藥物活性或藥理活性分子的載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應用，其特征在于所述的藥學活性或藥理活性分子選自紫杉烷類、環(huán)孢素類、喜樹堿類、黃酮類、二氫吡啶類、小檗堿類、長春堿類、蒽醌類、鬼白毒素類抗腫瘤藥、留體類或非留體抗炎藥物、心血管藥物、抗生素、抗真菌藥物、抗病毒藥物、免疫調(diào)節(jié)劑中的任何一(多)種物質(zhì)或其衍生物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應用，其特征在于該藥物增溶載體的使用方法是將所述的烷基化重組人血清白蛋白衍生物與水按重量比1 50 1000的比例溶解，得到兩親性重組人血清白蛋白衍生物納米膠束。將治療有效量的藥物用藥學上可接受溶劑溶解后，與所述的兩親性重組人血清白蛋白納米膠束混合后，經(jīng)超聲或高壓均質(zhì)處理，溶液用透析袋透析或蒸餾或超濾等法除去有機溶液和小分子，凍干制得粒徑為1 IOOOnm的納米級載藥膠束ο
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物可降解重組人血清白蛋白兩親性衍生物及其藥學組合物的制備和應用。這類衍生物在重組人血清白蛋白骨架上引入烷基，使其具有兩親性，在水中自組裝形成納米膠束，其特征包括可通過疏水烷(酰)基鏈和重組人血清白蛋白分子疏水鏈與藥物的雙重相互作用將藥物包裹，顯著提高重組人血清白蛋白包裹藥物的能力。該輔料安全性高，蛋白來源可避免疾病的傳播，可以作為有機藥物、水不溶性或難溶性藥物和兩親性藥物的載體，用于血管內(nèi)或肌肉注射、口服、腔道或外用給藥。本發(fā)明制備方法簡單，工藝成熟，適用于大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)。
文檔編號A61K47/42GK102172404SQ201110046498
公開日2011年9月7日 申請日期2011年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月28日
發(fā)明者周建平, 尹曉強, 崔蓓, 彭小玲, 李靜, 王競, 鄒愛峰, 霍美蓉 申請人:中國藥科大學