專利名稱：猴腺病毒和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及猴腺病毒和用于使猴腺病毒生長的方法，所述方法使得這些猴腺病毒能夠用于多種應(yīng)用中，包括治療和預(yù)防人類疾病。
背景技術(shù)：
對于許多研究者和臨床醫(yī)生，重組真核病毒載體已經(jīng)成為基因轉(zhuǎn)移的優(yōu)選手段。體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移是施用核酸(通常為DNA形式)以實現(xiàn)所轉(zhuǎn)移基因在有益于接受者的位置表達(dá)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的一項策略。該益處可以是誘導(dǎo)針對該基因產(chǎn)物的免疫應(yīng)答，即為治療性目的接種或修飾祀細(xì)胞的遺傳庫(genetic repertoire)。這可以使用編碼所謂“轉(zhuǎn)基因”的重組腺病毒載體高效地完成。腺病毒載體具有優(yōu)于通常用于基因轉(zhuǎn)移(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)的其他載體的優(yōu)點，原因在于腺病毒載體(i)可以以高滴度(即，多達(dá)IO13個病毒顆粒/ml)產(chǎn)生；(ii)它們將基因高效轉(zhuǎn)移至不復(fù)制以及復(fù)制的細(xì)胞；(iii)幾乎不重組；(iv)盡管人感染腺病毒常見，但沒有人惡性腫瘤與腺病毒感染的已知關(guān)聯(lián)；(V)可操作腺病毒基因組以容納尺寸不定的外源基因；(vi)腺病毒載體不將其DNA插入細(xì)胞的染色體中，因此它的作用是非永久性的并且不可能干擾細(xì)胞的正常功能；和(vii)具有復(fù)制能力作為基本特征的活腺病毒已經(jīng)安全地用作人類疫苗(Straus,引自Adenoviruses, PienanPress, New York, N. Y. , 451-496 (1984) ；Horwitz 等，引自 Virology,第 2 版，F(xiàn)ields 等編著，Raven Press, New York, N. Y. , 1679-1721(1990) ；Berkner, BioTechniques, 6:616 (1988) ;Chanock 等，ΙΑΜΑ, 195:151(1966) ;HajAhmad 等，J. Virol, 57:267 (1986);和 Ballay等，EMBO J，4:3861 (1985))。人腺病毒是當(dāng)前病毒載體疫苗和基因治療方案中使用最廣泛的重組病毒載體之一。就一般結(jié)構(gòu)而言，迄今檢驗過的全部腺病毒均是直徑約65至80納米的無包膜規(guī)則二十面體。腺病毒由與核心蛋白復(fù)合并且由腺病毒衣殼包圍的線性雙鏈DNA組成。衣殼的蛋白質(zhì)是中和抗體的靶，并且不同的血清型在處于病毒顆粒外部上的衣殼蛋白中具有不同的氨基酸序列。腺病毒屬于腺病毒科，該科分為5個屬哺乳動物腺病毒屬(Mastadenovirus)、腺胸病毒屬(Atadenovirus)、唾液酸酶腺病毒屬(Siadenovirus)、禽腺病毒屬(Aviadenovirus)和美洲白鱘腺病毒屬(Ichtadenovirus)。哺乳動物腺病毒屬中的腺病毒僅感染哺乳動物并且包括人腺病毒、黑猩猩腺病毒和猴腺病毒。
腺病毒提供了將轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中的精巧和高效手段。然而，在腺病毒載體用于體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移時遭遇的一個問題是存在針對腺病毒的先存免疫力，其由接受者因自然暴露于腺病毒而獲得。主要地，腺病毒感染在一生中誘導(dǎo)針對腺病毒衣殼蛋白上抗原表位的抗體產(chǎn)生。如果滴度足夠，則該抗體能夠限制腺病毒基因轉(zhuǎn)移載體的效力。此夕卜，腺病毒載體的施用可能誘導(dǎo)免疫力；因此，可能使用腺病毒不超過一次作為有效基因轉(zhuǎn)移運載體。例如，動物研究顯示，靜脈內(nèi)或局部施用(例如，至肺、心臟或腹膜)2型或5型腺病毒基因轉(zhuǎn)移載體可導(dǎo)致產(chǎn)生針對該載體的抗體，這防止來自I至2周稍后施用的相同血清型載體的表達(dá)(見，例如，Yei等，Gene Therapy, 1:192-200 (1994)；Zabner 等，Nat. Gen.，6 : 75-83 (1994) ； Setoguchi 等，Am. J. Respir. Cell. Mol.Biol, 10:369-377(1994) ;Kass_Eisler 等，Gene Therapy, 1:395-402(1994) ；Kass-Eisler等，Gene Therapy, 3:154-162 (1996)) 0這是腺病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的一個缺點，原因是腺病毒載體的許多用途(例如，用于誘導(dǎo)或增強(qiáng)針對病原體的免疫應(yīng)答或提供治療劑的二次給藥)需要反復(fù)施用。針對腺病毒的抗體能夠防止或減少腺病毒編碼基因表達(dá)的機(jī)理是不清楚的。然而，這種現(xiàn)象被寬松地稱作“中和作用”，并且起到這種作用的抗體稱作“中和抗體”。因此，為了充分利用腺病毒載體用于體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移，需要這樣的新型腺病毒，其(I)不 易受由針對另一個類型腺病毒的抗體引起的中和作用的影響，和(2)不易受由人群體中通常存在的抗體弓I起的中和作用的影響。 存在從廣泛的動物宿主中分離的許多不同的腺病毒，并且腺病毒由從中首次分離的宿主命名。已經(jīng)從中分離出腺病毒的宿主動物包括哺乳動物、鳥類、蛇類、蛙類和魚類。哺乳動物宿主包括靈長類等如猴、人和黑猩猩。人和黑猩猩的親緣關(guān)系極為接近并且一起被歸類為人科動物。相反，猴不與人和黑猩猩歸類，因為它們之間存在顯著較大的進(jìn)化距離。猴在2500和3500萬年前之間與人科動物趨異，而人和黑猩猩腺僅在700萬年前趨異(Samonte和Eichier, Nature ReviewsGenetics, 3:65-72(2002)) 0人、黑猩猩和猴之間的這些相似性和差異與文獻(xiàn)記錄的腺病毒
宿主范圍限制一致。存在宿主范圍限制的許多不同方式。例如，野生型人腺病毒不在猴細(xì)胞上大量生長。在被野生型人腺病毒感染的猴細(xì)胞中，病毒早期基因恰當(dāng)?shù)乇磉_(dá)(Feldman等，JBacterial. , 91:813-8 (1966) ；Van der Vliet 和 Levine, Nature, 246:170-4 (1973)),并且病毒 DNA 復(fù)制正常進(jìn)行(Rapp 等，J. Bacterial.，92:931-6 (1966) ；Reich等,PNAS, 55:336-41(1966) ；Friedman 等,J. Virol, 5:586-97 (1970)) 然而，幾種晚期病毒蛋白質(zhì)的表達(dá)減少。對晚期基因表達(dá)的阻斷似乎歸咎于病毒晚期mRNA的異常產(chǎn)生(Klessig 和 Anderson, J. Virol. , 16:1650-68 (1975))，并且這種阻斷可以由腺病毒 DNA 結(jié)合蛋白(DBF)的單一突變來克服(Klessig 和 Grodzicker, Cell, 17:957-66(1979))。在DBF中含有這種單一突變的人腺病毒在猴細(xì)胞上大量生長，從而表明猴/人阻斷的關(guān)鍵在于DBF在腺病毒生命周期期間的作用。與猴/人阻斷相反，觀察到從黑猩猩分離的腺病毒在人細(xì)胞中沒有限制并且可以高效地增殖(W. P, Rowe 等，Proc. Soc. Exp, Biol. Med.，97 (2) : 465-470 (1958)；W. D.Hillis 等,American Journal of Epidemiology, 90 (4):344-353(1969) ；N. Rogers等，Nature, 216:446-449 (1967))。具體而言，發(fā)現(xiàn)一些黑猩猩腺病毒分離株的復(fù)制在人中比在猴細(xì)胞中更高效(M. Basnight 等，American Journal of Epidemiology, 94 (2) : 166-17I (1971))。最近已經(jīng)表明從其他大猿類物種如大猩猩(gorillas)和倭猩猩(bonobos)分離的腺病毒在人細(xì)胞中生長(S. Roy等，PLoS Pathogens, 5 (7) : el 000503 (2009))。由于表達(dá)El的細(xì)胞系(例如，人胚腎293細(xì)胞、人視網(wǎng)膜PER. C6細(xì)胞)和不表達(dá)El的細(xì)胞系(A549人肺上皮癌細(xì)胞)已經(jīng)用于野生型黑猩猩腺病毒的增殖，因此它們在人細(xì)胞中復(fù)制不需要人腺病毒互補(bǔ)因子的表達(dá)(美國專利6, 083, 716 ；S. F. Farina等,Journal of Virology, 74(23) :1603-11613(2001) ;S. Roy 等，Virology, 324:361-372 (2004) ;S. Roy等，Human GeneTherapy,15:519-530(2004) ；E.Fattori 等,Gene Therapy,13(14):1088-1096(2006)；J. Skog 等，Molecular Therapy, 15(12) :2140-2145(2007) ；D. Peruzzi 等，Vaccine，27 (9) : 1293-1300 (2009))。不存在復(fù)制阻斷與人和黑猩猩譜系之間密切的進(jìn)化距離是一致的，它們在僅在約700萬年前趨異(Saraonte和Eichier, Nature ReviewsGenetics, 3:65-72(2002))。與更大的宿主趨異性一致，已經(jīng)描述了猴腺病毒在人細(xì)胞上生長的宿主范圍限制(Am. J. Hyg. , 68: 31 (1958) ；Virology, 35:248(1968) ； Savitskaya等,Doklady Biochemistry, 375:242 (2000) ；Alstein 等,JVi, 2:488 (1968)；Genetiki，39(6) : 725-31 (2003年6月))，并且已經(jīng)假設(shè)決定因素部分地是E4并且可能是E2。Savitskaya等在上文報道，猴腺病毒SV7 (C8)(現(xiàn)在稱作SV16 (ICTV第8次報告，第220頁)不在人胚腎(HEK)細(xì)胞系293上生長。因此，來自人腺病毒的El區(qū)不足以減輕對復(fù)制的阻斷。病毒可以在插入Ad5E4區(qū)的HEK-293細(xì)胞(VK-10-9細(xì)胞)上生長。然而，VK-10-9細(xì)胞僅提供復(fù)制阻斷的部分減輕，因為復(fù)制比CVl細(xì)胞(綠猴腎的連續(xù)細(xì)胞系)上低40倍。這表明VK-10-9細(xì)胞中仍存在對猴病毒復(fù)制的阻斷。這些作者基于E40RF蛋白質(zhì)水平得出結(jié)論E4 表達(dá)太低(Krougliak 和 Graham, Hum. Gene Then, 6:1575 (1995))并且可能需要病毒特異性產(chǎn)物(Savitskaya等，上文)。這些作者隨后提出該產(chǎn)物可能由E2A基因編碼，盡管將需要額外的研究來澄清這個問題。Savitskaya等在上文還指出，低E4表達(dá)可能是原因或者可能需要來自E2A的額外因子以完全免除復(fù)制阻斷，并且需要額外研究來限定 原因。有趣地，雖然據(jù)報道VK-10-9細(xì)胞中的E4表達(dá)水平較野生型Ad5復(fù)制期間顯著更低，但是該水平對于E4缺失的人腺病毒病毒5型復(fù)制到與HEK-293細(xì)胞中野生型人Ad5相同的水平是足夠高的(Krougliak和Graham 1995),這進(jìn)一步表明E4的表達(dá)水平不是物種特異性阻斷的充分解釋。因此，雖然認(rèn)為需要更多E4表達(dá)和/或E2A產(chǎn)物，但二者均不需要。另外，顯然，對于病毒生長所需要的Ad5E4功能與克服猴腺病毒在人細(xì)胞上的宿主范圍限制所需要的功能無關(guān)，原因是用于生長的E4需求是與用于決定宿主范圍的E4需求不相同的。因此，Savitskaya等在上文表明，腺病毒El區(qū)和E4區(qū)可能不足以用于減輕物種阻斷并且其他區(qū)域(尤其編碼DBP(E2A)的區(qū)域)是重要的。此外，在另一項研究中，顯示人Ad2和SA7(C8)的腺病毒-腺病毒雜合體是復(fù)制缺陷型的，表明人E和猴E4是不相容的，并且人腺病毒El不足以克服宿主范圍限制，這與其中從細(xì)胞表達(dá)的人El不改變宿主范圍的上述結(jié)果一致(Alstein等，JVi，2:488(1968)；Savitskaya等，上文)。Ad2和SA7 (C8)之間的不同腺病毒雜合體通過在阻止Ad2增殖的選擇條件下使這兩種病毒生長而產(chǎn)生(Grinenko等，Molecular Genetics, Microbiologyand Virology, 5:25(2004)) o在人細(xì)胞(HEK-293)上生長和選擇雜合病毒產(chǎn)生已經(jīng)僅并入SA7 (C8)的L3區(qū)的缺陷型病毒。這些作者指出Ad2E4和E2A (編碼DNA結(jié)合蛋白)在缺陷型雜合體中存在并且完好無損，并且聲稱基因E4以及有可能E2A參與決定物種特異性宿主范圍，這與需要不止E4以減輕宿主范圍限制的較早結(jié)論一致。這些結(jié)果顯示，為了在人細(xì)胞上培育猴-人腺病毒雜合體，僅可以移除10%的Ad2基因組，留下90%的Ad2基因組含有宿主范圍決定因子。因此，這種雜合體沒有進(jìn)一步闡明猴腺病毒在人細(xì)胞上生長所需要的人腺病毒產(chǎn)物。總而言之，這些報道表明E4在宿主范圍決定方面發(fā)揮作用，但是其他腺病毒基因也發(fā)揮作用。另外，E4區(qū)由至少5種已知蛋白質(zhì)產(chǎn)物組成，并且盡管進(jìn)行過這些研究，但是沒有鑒定出對部分減輕宿主范圍阻斷可能必需的E4的組分或多種組分。因此，對這樣的方法存在需求，所述方法可以減輕并且甚至移除防止猴腺病毒在人細(xì)胞上高效增殖或復(fù)制的物種特異性阻斷或宿主范圍限制。還對能夠繞過對人類中抗腺病毒的先存免疫力的腺病毒和腺病毒載體存在需求。本發(fā)明提供了此類方法、腺病毒和載體，以及使用它們的方法。發(fā)明簡述
本發(fā)明提供一種猴腺病毒。所述猴腺病毒能夠在包含人腺病毒的一種或多種基因產(chǎn)物的細(xì)胞中增殖。本發(fā)明還提供一種用于在細(xì)胞中增殖猴腺病毒的方法，其中所述細(xì)胞包含人腺病毒的基因產(chǎn)物(和/或編碼核酸序列)。在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種細(xì)胞，其包含(a)人腺病毒El區(qū)的至少一個核酸序列，和(b)人腺病毒E4區(qū)的至少一個核酸序列。在另一個實施方案中，提一種增殖猴腺病毒的方法，該方法包括使細(xì)胞與所述猴腺病毒接觸。所述細(xì)胞表達(dá)由人腺病毒ElA區(qū)和ElB區(qū)中一者或兩者編碼的基因產(chǎn)物和由基本上由人腺病毒E4 0RF6組成的E4區(qū)的一部分編碼的基因產(chǎn)物，由此所述猴腺病毒在所述細(xì)胞中增殖。本發(fā)明還提供一種用于在細(xì)胞中增殖猴腺病毒的方法，其中所述猴腺病毒包含編碼人腺病毒基因產(chǎn)物的核酸序列。在一個實施方案中，所述猴腺病毒包含(a)人腺病毒El區(qū)的至少一個核酸序列和(b)人腺病毒E4區(qū)的至少一個核酸序列。在另一個實施方案中，提一種增殖猴腺病毒的方法，該方法包括使細(xì)胞與所述猴腺病毒接觸。在一些實施方案中，所述猴腺病毒包含編碼人腺病毒的一種或多種基因產(chǎn)物的核酸序列，其中所述一種或多種基因產(chǎn)物包括由負(fù)責(zé)減輕或克服人細(xì)胞中宿主復(fù)制阻斷的E4區(qū)的一部分編碼的基因產(chǎn)物，所述部分基本上由E4 0RF6組成，并且由此所述猴腺病毒在所述細(xì)胞中增殖。在一些實施方案中，所述一種或多種基因產(chǎn)物還包括由人腺病毒ElA區(qū)和ElB區(qū)中一者或兩者編碼的基因廣物。本發(fā)明還提供一種通過本文所述的此類增殖方法獲得的猴腺病毒。在另一個方面，其中所述猴腺病毒增殖的細(xì)胞優(yōu)選地是人細(xì)胞，并且在某些實施方案中的猴腺病毒是復(fù)制缺陷型的。人腺病毒優(yōu)選地是種類C人腺病毒。本發(fā)明提供了優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的眾多優(yōu)點，包括用于解決人類中對人腺病毒的先存免疫力顧慮的手段。本發(fā)明還提供了用于減輕或克服針對猴腺病毒在人細(xì)胞中增殖或復(fù)制的宿主范圍限制或阻斷的明顯改進(jìn)的方法。本發(fā)明因此使得能夠使猴腺病毒大量生長并且將猴腺病毒用于各種目的，最突出地包括治療和預(yù)防人類中的疾病。附圖
簡述圖I是說明靈長目分類的圖。
圖2A和圖2B是說明在單次裂解條件下產(chǎn)生猴腺病毒子代的圖。圖2A描述了在表達(dá)的Ad5因子方面不同的人細(xì)胞系中的產(chǎn)生(A549=無Ad5因子，A549+Ad5 E40RF6=Ad5E40RF6 因子，293-0RF6=Ad5El 和 E40RF6 因子)。圖 2B 描述了在具有 Ad5El (293 細(xì)胞)、Ad5El+Ad5E40RF6的人細(xì)胞系中或在猴細(xì)胞系(BSC-I)中的產(chǎn)生。數(shù)據(jù)是平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖3是示意圖，其說明構(gòu)建具有替換El的表達(dá)盒的猴腺病毒的方法。帶有所標(biāo)識的主要區(qū)域的猴腺病毒基因組(SV)(未按比例)點畫框=ITR，W=包裝信號，TATA=Ela啟動子的TATAA框，和Ela、Elb、pIX、E3及E4的編碼區(qū)。B是受體質(zhì)粒，其包含由在pIX編碼序列和ITR之間線性化的CMV啟動子(箭頭)、開放閱讀框(orf)和SV40聚腺苷酸化信號(SV)組成的表達(dá)盒、細(xì)菌復(fù)制起點(Ori)和編碼卡那霉素(Kan)耐藥性的基因。SV基因組和質(zhì)粒B之間的同源重組(X)導(dǎo)致CMV-orf表達(dá)盒替換El啟動子和ElA和ElB編碼序列。通過用這兩種DNA轉(zhuǎn)化重組感受態(tài)細(xì)菌BJ5183產(chǎn)生同源重組，從而產(chǎn)生質(zhì)粒C。篩選耐受 Kan的細(xì)菌，并且通過限制性消化和測序鑒定質(zhì)粒C。在病毒基因組轉(zhuǎn)染至293-0RF6細(xì)胞中以產(chǎn)生病毒顆粒之前，用識別病毒基因組外部的位點(R)的核酸內(nèi)切酶限制性消化質(zhì)粒C0發(fā)明詳述本發(fā)明總體上提供了減輕或克服防止猴腺病毒在人細(xì)胞中高效增殖或復(fù)制的物種特異性阻斷或宿主范圍限制的方法。本發(fā)明總體上還提供一種猴腺病毒，其使用伴有在人群體中不存在針對猴腺病毒的先存免疫カ的優(yōu)點。在ー個方面，本發(fā)明提供用于在細(xì)胞中增殖猴腺病毒的方法，其中所述細(xì)胞表達(dá)人腺病毒的ー種或多種基因產(chǎn)物，和/或其中所述猴腺病毒包含編碼人腺病毒基因產(chǎn)物的核酸序列。在第二方面，本發(fā)明提供了通過此類増殖方法獲得的猴腺病毒。在第三方面，本發(fā)明提供了所述猴腺病毒作為載體的用途。本發(fā)明提供ー種增殖猴腺病毒的方法，所述方法包括使細(xì)胞(轉(zhuǎn)化此細(xì)胞)與該腺病毒接觸。在一個實施方案中，該細(xì)胞包含由人腺病毒的ElA區(qū)、ElB區(qū)和E4區(qū)中一者或多者編碼的基因產(chǎn)物。在另ー個實施方案中，該細(xì)胞包含有負(fù)責(zé)減輕或克服猴腺病毒在人細(xì)胞中的宿主復(fù)制阻斷的基因產(chǎn)物(和/或其編碼性核酸序列)。在另ー個實施方案中，該方法包括使細(xì)胞與猴腺病毒接觸，其中該細(xì)胞表達(dá)由人腺病毒ElA區(qū)和ElB區(qū)中一者或兩者編碼的基因產(chǎn)物，和由負(fù)責(zé)減輕或克服人細(xì)胞中宿主復(fù)制阻斷的E4區(qū)的一部分編碼的基因產(chǎn)物，所述部分基本上由E40RF6組成，并且由此猴腺病毒在所述細(xì)胞中増殖。在另ー個實施方案中，該方法包括使細(xì)胞與猴腺病毒接觸，其中猴腺病毒包含編碼人腺病毒基因產(chǎn)物的核酸序列，所述人腺病毒基因產(chǎn)物可以包括由人腺病毒的ElA區(qū)、ElB區(qū)和E4區(qū)中一者或多者編碼的基因產(chǎn)物，并且將包括負(fù)責(zé)減輕或克服人細(xì)胞中宿主復(fù)制阻斷的E4區(qū)的部分編碼的基因產(chǎn)物。在另ー個實施方案中，提供ー種增埴猴腺病毒的方法，該方法包括使細(xì)胞與所述猴腺病毒接觸。所述猴腺病毒包含編碼人腺病毒的ー種或多種基因產(chǎn)物的核酸序列，其中所述ー種或多種基因產(chǎn)物包括由負(fù)責(zé)減輕或克服人細(xì)胞中宿主復(fù)制阻斷的E4區(qū)的一部分編碼的基因產(chǎn)物，所述部分基本上由E40RF6組成，并且由此所述猴腺病毒在所述細(xì)胞中増殖。在一些實施方案中，所述細(xì)胞表達(dá)負(fù)責(zé)減輕或克服物種特異性阻斷的E4區(qū)。在一些實施方案中，表達(dá)的E4區(qū)包含0RF6。在一些實施方案中，表達(dá)的E4區(qū)基本上由0RF6組成。在一些實施方案中，表達(dá)的E4區(qū)由0RF6組成并且沒有E4區(qū)的其他0RF。在一個實施方案中，接觸猴腺病毒的細(xì)胞優(yōu)選地表達(dá)人腺病毒C種類的一種或多種基因產(chǎn)物，所述種類C人腺病毒包括眾多的人腺病毒，包括優(yōu)選的人血清型5腺病毒。人細(xì)胞優(yōu)選用于增殖猴腺病毒，并且優(yōu)選的人細(xì)胞包括HEK-293細(xì)胞或PerC. 6細(xì)胞。猴腺病毒也可以是復(fù)制缺陷型的。當(dāng)為復(fù)制缺陷型時，所述腺病毒需要該腺病毒的ElA區(qū)、ElB區(qū)和E4區(qū)中一者或多者的互補(bǔ)作用以用于増殖。在一個實施方案中，所述猴腺病毒包含在腺病毒基因組的El區(qū)內(nèi)的缺陷和E4區(qū)至少一部分內(nèi)的缺陷。在又ー個實 施方案中，該腺病毒還包含在腺病毒基因組E3區(qū)內(nèi)的缺陷。在另ー個實施方案中，該猴腺病毒可以包含異源核酸序列，包括編碼抗原的核酸序列。所述猴腺病毒優(yōu)選地包含腺病毒El區(qū)的缺失并且更優(yōu)選地還包含腺病毒E4區(qū)的至少一部分的缺失，并且所述異源核酸序列插入該腺病毒缺失的El區(qū)或缺失的E4區(qū)中。所述猴腺病毒可以具有已知或未來發(fā)現(xiàn)的多種血清型，包括以下已知的血清型I、
3、7、11、16、18、19、20、27、33、38、39 或其組合。如本文所用，術(shù)語“猴”指新世界猴和舊世界猴，并且不包括人科(Hominidae)的任何成員(例如，人、黒猩猩、大猩猩和猩猩(orangutans)，它們又稱作“巨猿”)。新世界猴包括狨猴科(Cattitrichidae)(例如,絨猴(marmoset)和絹毛猴(tamarin))、卷尾猴科(Cebidae)(例如，僧帽猴(capuchin)和松鼠猴(squirrel monkey))、青猴科(Aotidae)(例如，夜猴或桌猴(douroucouli))、僧面猴科(Pitheciidae)(例如,絨(絹毛猴)(titis)、粗尾猴(sakis)和秀猴(uakaris))和蜘蛛猴科(Atelidae)(例如，吼猴、蜘蛛猴和絨毛猴)(見，例如，Hershkovitz (編著)，Living New World Monkeys (Platyrrhini),第 I卷，University of Chicago Press (1977))。舊世界猴包括稱猴亞科中的動物,例如稱猴、狒狒和白眉猴(見，例如，Whitehead編著，Old World Monkeys, Cambridge UniversityPress (2002)) 0術(shù)語“猴(monkey) ”還在本文中與術(shù)語“猴(simian) ”同義使用。圖I中說明靈長目分類。腺病毒血清型基于中和測定法劃分。血清型定義為與其他類型不顯示交叉反應(yīng)或顯示有限交叉反應(yīng)的類型(見，F(xiàn)auquet等(編著)，Virus Taxonomy:The Eighth Reportof the International Committee on Taxonomy oi Viruses, Academic Press,果 21d 頁(2005))。血清學(xué)上可區(qū)分的血清型(也稱作腺病毒“型”)劃分成種。習(xí)慣上，種名稱反映首次描述的宿主。缺少交叉中和，同時計算的系統(tǒng)發(fā)生距離大于10%，可將兩個血清型區(qū)分成兩個不同種。此外，種命名取決于腺病毒血清型之間不同的其他特征，包括宿主范圍、DNA雜交、RFLP分析、基因組中的GC百分?jǐn)?shù)、嚙齒類中的致瘤性、生長特征、重組概率、VA RNA基因數(shù)目、血凝性、E3區(qū)的遺傳構(gòu)成及宿主范圍。從猴分離的猴腺病毒距人腺病毒和黒猩猩腺病毒更遠(yuǎn)。黒猩猩腺病毒與常見人腺病毒種類B和E親緣關(guān)系密切，如此相似以致于將黑猩猩腺病毒劃歸于人種類B和E。對猴腺病毒的有限系統(tǒng)發(fā)生重構(gòu)掲示，猴腺病毒與常見的黑猩猩病毒和人腺病毒相當(dāng)不同(Virus Taxonomy:Vlllth Iteport of the InternationalCommittee on Taxonomy of Viruses (2005))。感染靈長類的腺病毒的系統(tǒng)發(fā)生在例如Roy等，PLoS Pathog.，5 (7) :el00050. doi : 10. 1371/journal, ppat. 1000503 (2009)中公開。多種起源、血清型或血清型混合物可以用作猴腺病毒載體的病毒基因組來源(如在例如，美國專利7，247，472和7，491，508中描述那些)。例如，猴腺病毒可以具有血清型1、3、6、7、11、16、18、19、20、27、33、38、39、48、49、50或任何其他猴腺病毒血清型?？梢酝ㄟ^使用本領(lǐng)域已知的任何合適的縮寫例如SV、SAdV或SAV來指稱猴腺病毒。在一些實施方案中，猴腺病毒載體是血清型3、6、7、11、16、18、19、20、27、33、38或39的猴腺病毒載體。在一些實施方案中，猴腺病毒載體是血清型7、11、16、18或38。在一個實施方式中,猴腺病毒載體是血清型7。從猴分離的這些猴腺病毒與人血清型5腺病毒具有低序列同源性，并且雖然與腸F和G血清型腺病毒相當(dāng)不同，但是與其更密切相關(guān)。它們含有兩個不同的纖維基因(長纖維和短纖維)，而不是一個纖維基因，這表明它們可以靶向腸粘膜，類似于嗜腸性人腺病毒，在那里它們預(yù)期刺激粘膜免疫應(yīng)答。此外，病毒六鄰體蛋白之間的比較表明，猴腺病毒血清型7、11、16和38與人腺病毒關(guān)系較遠(yuǎn)，并且更密切地歸類為嗜腸腺病毒(人 Ad40、41和52)而不劃入其他組。使用任何適合的方法，可以分離任何血清型的野生型猴腺病毒。例如，使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法，可以從猴活檢和身體分泌物(包括腸活檢、糞便洗液、鼻洗液、肺洗液和其他身體分泌物)分離猴腺病毒。野生型猴腺病毒也可從商業(yè)來源如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，馬納薩斯，弗吉尼亞州)獲得。在一些實施方案中，猴腺病毒來自狒狒(例如，ATCC-VR 275)或恒河猴(或非洲綠猴(例如，ATCC-VR 196、ATCC-VR 201, ATCC-VR 209, ATCC-VR 353, ATCC-VR 355, ATCC-VR541、ATCC-VR 941、ATCC-VR 942 和 ATCC-VR 943)。本發(fā)明提供了猴腺病毒在人細(xì)胞中増加的復(fù)制，同時在大部分情況下優(yōu)選地完全減輕宿主范圍阻斷。本文中提出的數(shù)據(jù)證實，猴腺病毒在人細(xì)胞上不生長，并且與猴細(xì)胞相比，表明猴腺病毒在具有人腺病毒組分的人細(xì)胞上相等或甚至優(yōu)越的生長(見實施例I)。實施例I顯示了猴腺病毒子代在具有最少人腺病毒組分的人細(xì)胞系上的高生產(chǎn)率，與猴細(xì)胞上可比較或甚至更高，這與上文Savitskaya等中所報道的少40倍相反。在一些實施方案中，可以通過在腺病毒感染期間表達(dá)人腺病毒E40RF6蛋白(34K)的同時在人胚腎細(xì)胞系293 (HEK-293)上增殖猴病毒來移除宿主范圍限制。令人驚訝的是，實施例I中34k蛋白在HEK-293細(xì)胞中的表達(dá)太低，以致于不能檢測到，這令人想起先前對V-10-9細(xì)胞所報道的情況(Krougliak 和 Graham, Hum. Gene Ther.，6:1575 (1995))。因此，出乎意料的是，實施例I中的人細(xì)胞系如同猴細(xì)胞容許猴腺病毒那樣同等地容許猴腺病毒(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，根據(jù)本發(fā)明，為了克服猴腺病毒在人細(xì)胞上生長的宿主范圍限制，必須在細(xì)胞中病毒復(fù)制期間表達(dá)人腺病毒E4的子類或部分，而不是整個E4區(qū)，原因是E4克服人細(xì)胞中復(fù)制阻斷的功能存在于0RF6內(nèi)部。VK-10-9細(xì)胞不能充分支持猴腺病毒生長的原因可能是在插入細(xì)胞的人E4序列內(nèi)存在抑制功能。因此，宿主范圍決定因素不包括全部E4，并且不包括E2A。相反，宿主范圍決定因素是E40RF6，并且顯然不是単獨或組合的在E4內(nèi)部編碼的其他因子之一。尤其，根據(jù)E40RF6足夠使用的發(fā)現(xiàn)，可以再解釋Savitskaya等上文中的數(shù)據(jù)，即，需要更少而非更多的E4并且抑制猴腺病毒在人細(xì)胞中生長的組分可能存在于VK-10-9細(xì)胞中所包含的人腺病毒E4內(nèi)。
鑒定出允許猴腺病毒在人細(xì)胞上復(fù)制的人腺病毒組分具有許多優(yōu)點，例如，但不限于，可行地制造基于猴腺病毒的產(chǎn)品。此外，與需要全部E4相比，能夠減少為減輕對人細(xì)胞上猴腺病毒的宿主范圍阻斷所需要的E4組分的能力具有明顯的優(yōu)點。簡化E4需求允許更容易地操作DNA序列和恰當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)E4序列的表達(dá)。這允許更容易地設(shè)計允許猴病毒在人細(xì)胞上増殖的系統(tǒng)。例如，人腺病毒E4序列的子類可以被包含于猴腺病毒基因組中，整合至細(xì)胞的基因組中，或者既不作為人細(xì)胞的部分，也不作為猴腺病毒的部分而在染色體額外地存在。僅用包含E40RF6的E4序列子類操作允許更容易和更可靠地調(diào)節(jié)這些序列的表達(dá)。這種增強(qiáng)的控制導(dǎo)致更高產(chǎn)量的猴腺病毒，這將允許降低商品的成本并且擴(kuò)展可以使用猴腺病毒的商業(yè)及科學(xué)應(yīng)用。鑒定到足以允許猴腺病毒在人細(xì)胞上復(fù)制的人腺病毒組分的另ー個優(yōu)點是能夠產(chǎn)生條件復(fù)制性腺病毒(CRAD)。例如，在猴腺病毒中納入處于對給定疾病、綜合征、病狀、組織或細(xì)胞類型特異性的表達(dá)控制元件下的人腺病毒El和E40RF6序列允許猴病毒僅在需要時以受控方式復(fù)制。CRAD的應(yīng)用是眾多的并且包括，例如裂解腫瘤細(xì)胞、僅在病毒載體復(fù)制的條件下表達(dá)治療性基因和有限復(fù)制型疫苗。
鑒定到足以使猴腺病毒在人細(xì)胞上顯著復(fù)制的人腺病毒組分的另ー個優(yōu)點是能夠產(chǎn)生其中轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒并入猴腺病毒基因組中的腺病毒基因轉(zhuǎn)移載體。源自人細(xì)胞系-人腺病毒系統(tǒng)上所增殖猴腺病毒的腺病毒載體具有以下優(yōu)點(I)在人群體中不存在針對猴腺病毒的先存免疫力，(2)對復(fù)制的物種特異性阻斷以增強(qiáng)人群安全性，和(3)避免因在非人細(xì)胞系上制造所致的不確定性異種病原體風(fēng)險。例如，發(fā)現(xiàn)猴多瘤病毒SV40污染在猴細(xì)胞上制造的多批人疫苗產(chǎn)品。用于產(chǎn)生猴腺病毒載體的互補(bǔ)性細(xì)胞系包括，但不限于293細(xì)胞(其在例如，Graham等，J. Gen. Virol, 36:59-72(1977)中描述)、PER. C6細(xì)胞(其在例如，國際專利申請公開WO 97/00326和美國專利5，994，128和6，033，908中描述)和293-0RF6細(xì)胞(其在例如，國際專利申請公開WO 95/34671和Brough等，J. Virol, 71:9206-9213 (1997)中描述)。另外的互補(bǔ)性細(xì)胞在例如美國專利6，677，156和6，682，929以及國際專利申請公開WO 03/20879中描述。在一些情況下，細(xì)胞基因組不需要包含基因產(chǎn)物補(bǔ)足復(fù)制缺陷型腺病毒載體全部缺陷的核酸序列。在復(fù)制缺陷型腺病毒載體中缺少的一項或多項復(fù)制必需基因功能可以由輔助病毒(例如，反式提供對于所需腺病毒載體復(fù)制所需要的ー項或多項必需基因功能的腺病毒載體)提供。經(jīng)常將輔助病毒工程化以防止感染性輔助病毒的包裝。例如，腺病毒基因組的El區(qū)的一項或多項復(fù)制必需基因功能由互補(bǔ)性細(xì)胞提供，而腺病毒基因組的E4區(qū)的一項或多項復(fù)制必需基因功能由輔助病毒提供。理想地，復(fù)制缺陷型猴腺病毒載體存在于基本上沒有可復(fù)制性腺病毒(RCA)污染的組合物中，例如,藥物組合物，(例如基于該組合物中的總腺病毒,該組合物包含小于約1%的可復(fù)制性腺病毒)。最希望的是，該組合物不含RCA。美國專利5，944，106、美國專利申請公開2002/0110545A1和國際專利申請WO 95/34671中描述了無RCA的腺病毒載體組合物和原液。如果猴腺病毒載體不是復(fù)制缺陷型的，則理想地操縱猴腺病毒載體以使該載體的復(fù)制限于靶組織內(nèi)部。例如，所述猴腺病毒載體可以是條件復(fù)制型腺病毒載體，所述載體經(jīng)工程化以在執(zhí)業(yè)醫(yī)師所預(yù)定的條件下復(fù)制。例如，復(fù)制必需基因功能，例如，由腺病毒早期區(qū)域編碼的基因功能，可以與誘導(dǎo)型、阻遏型或組織特異性轉(zhuǎn)錄控制序列(例如啟動子)可操作地連接。在該實施方案中，復(fù)制需要存在或不存在與轉(zhuǎn)錄控制序列相互作用的特定因子。在治療病毒感染時，例如，可能有利的是控制腺病毒載體例如在淋巴結(jié)中復(fù)制以獲得連續(xù)的抗原產(chǎn)生并且控制免疫細(xì)胞產(chǎn)生。條件復(fù)制型腺病毒載體進(jìn)一歩在美國專利5，998，205 中描述。猴腺病毒的用途之ー是將蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的部分遞送至細(xì)胞。遞送蛋白質(zhì)的ー種方法是將它們系留至病毒衣殼的ー種外殼蛋白。可以修飾衣殼以促進(jìn)這種系留。存在修飾病毒衣殼以將非腺病毒物質(zhì)系留至該衣殼的眾多實例。一些修飾在本質(zhì)上是蛋白質(zhì)性質(zhì)的，而其他則不是?？梢耘c腺病毒衣殼連接的物質(zhì)的實例包括抗體、受體、PEG和交聯(lián)化學(xué)品。病毒衣殼基因也可以進(jìn)行基因修飾以包含外源基因或其部分，從而所述外源基因產(chǎn)物是病毒衣殼蛋白的部分，所述病毒衣殼蛋白變成病毒顆粒的部分。該蛋白質(zhì)的作用可以在 該蛋白質(zhì)內(nèi)化或不內(nèi)化的情況下施加于細(xì)胞。如果該蛋白質(zhì)不內(nèi)化，它可能激活或失活細(xì)胞途徑，導(dǎo)致想要的結(jié)果。此外，如果猴病毒內(nèi)化，則該蛋白質(zhì)可以對細(xì)胞施加作用。該蛋白質(zhì)還可能刺激可能針對蛋白質(zhì)本身的免疫應(yīng)答。已經(jīng)顯示衣殼蛋白纖維、六鄰體、PlX和五鄰體均能夠被修飾以包含非腺病毒蛋白質(zhì)或其部分和或非蛋白質(zhì)物質(zhì)。修飾病毒衣殼可以具有另外的益處。可以改變病毒的天然嗜性?？赡苁乖摬《驹僦赶蛞环N新受體，可以廢除病毒與其正常受體的相互作用，或可以增強(qiáng)病毒與其正常受體的相互作用。猴腺病毒的再指向可以通過將病毒指向想要的細(xì)胞類型而增加病毒的期望活性，或這可以幫助避開可能產(chǎn)生不期望后果的細(xì)胞類型。修飾作用也可以導(dǎo)致逃避免疫系統(tǒng)?？梢酝瑫r修飾多種衣殼蛋白?？梢圆僮飨俨《镜耐鈿さ鞍滓愿淖兿俨《緦撛谒拗骷?xì)胞上受體的結(jié)合特異性或識別。對于腺病毒，此類操作可以包括缺失腺病毒外殼蛋白的區(qū)域(例如，纖維、五鄰體或六鄰體)、將多種天然或非天然配體插入到外殼蛋白的部分等。對外殼蛋白的操作可以拓寬受腺病毒感染的細(xì)胞的范圍或使得能夠?qū)⑾俨《景邢蛑撂囟?xì)胞類型?？梢圆僮飨俨《据d體以改變腺病毒對潛在宿主細(xì)胞上受體的結(jié)合特異性或識別。對于腺病毒，此類操作可以包括缺失腺病毒外殼蛋白的區(qū)域(例如，纖維、五鄰體或六鄰體)、將多種天然或非天然配體插入到外殼蛋白的部分等。對外殼蛋白的操作可以拓寬受猴腺病毒載體感染的細(xì)胞的范圍或使得能夠?qū)⒑锵俨《据d體靶向至特定細(xì)胞類型。這也可以避免與存在于血液中的蛋白質(zhì)如凝血因子X(FX)相互作用，這種相互作用可能影響腺病毒載體生物學(xué)。六鄰體的修飾是避免與FX相互作用的優(yōu)選方法?？梢允褂糜糜诟淖兣c宿主細(xì)胞的天然結(jié)合(如纖維蛋白與其細(xì)胞受體的天然結(jié)合)的任何適合技木。例如，變動纖維長度可以用來減弱與細(xì)胞的天然結(jié)合。這任選地可以通過將結(jié)合序列添加至五鄰體基部或纖維結(jié)節(jié)來完成。可以通過雙特異性或多特異性結(jié)合序列直接或間接地進(jìn)行結(jié)合序列的這種添加。在備選實施方案中，可以修飾腺病毒纖維蛋白以減少纖維柄部內(nèi)氨基酸的數(shù)目，從而產(chǎn)生“短柄”纖維(如例如美國專利5，962，311中所描述的)。包含短柄腺病毒纖維基因的腺病毒的使用降低了腺病毒纖維與其細(xì)胞表面受體結(jié)合的水平或效率并且增加腺病毒五鄰體基部與其細(xì)胞表面受體的結(jié)合，從而增加腺病毒與給定細(xì)胞結(jié)合的特異性。備選地，通過將非天然氨基酸序列導(dǎo)入五鄰體基部或纖維結(jié)節(jié)中，包含短柄纖維的猴腺病毒載體的使用使得能夠?qū)⒑锵俨《据d體靶向至期望的細(xì)胞表面受體。在又一個實施方案中，可以改變、補(bǔ)充或缺失編碼與天然基底結(jié)合相關(guān)的氨基酸殘基的核酸殘基(見，例如，國際專利申請公開WO 00/15823，Einfeld等，J.Virol，75(23) :11284-11291(2001)和 van Beusechem 等，J. Virol, 76(6) : 2753-2762 (2002))，以致于并入突變的核酸殘基(或因此具有其所編碼的纖維蛋白)的猴腺病毒載體更難以能夠結(jié)合其天然基底。可以突變或移除纖維蛋白中介導(dǎo)或輔助該結(jié)節(jié)與天然細(xì)胞受體之間相互作用的任何適合的氨基酸殘基，只要纖維蛋白能夠三聚化。類似地，可以將氨基酸添加至纖突節(jié)，只要纖維蛋白保持三聚化能力。合適的殘基包括在纖突節(jié)結(jié)構(gòu)域的暴露環(huán)(例如AB環(huán)、DE環(huán)、FG環(huán)和HI環(huán))內(nèi)部的氨基酸?？梢酝蛔兓蛞瞥遴忬w基底蛋白中介導(dǎo)或輔助五鄰體基底蛋白與整聯(lián)蛋白之間相互作用的任何合適的氨基酸殘基。合適的殘基包括例如位于猴腺病毒五鄰體基底蛋白的 高變區(qū)內(nèi)的R⑶氨基酸序列基序。也可以通過以下方式破壞五鄰體基底蛋白上的天然整聯(lián)蛋白結(jié)合位點修飾編碼天然RGD基序的核酸序列，從而天然RGD氨基酸序列在構(gòu)象上無法用于與整聯(lián)蛋白受體結(jié)合，如將DNA序列插入編碼腺病毒五鄰體基底蛋白的核酸序列中或與其毗鄰。猴腺病毒載體可以包含不與其相應(yīng)的天然細(xì)胞結(jié)合位點結(jié)合的纖維蛋白和五鄰體基底蛋白。備選地，猴腺病毒載體包含與其相應(yīng)的天然細(xì)胞結(jié)合位點結(jié)合，但親和カ小于相應(yīng)野生型外殼蛋白的纖維蛋白和五鄰體基底蛋白。如果修飾的腺病毒纖維蛋白和五鄰體基底蛋白與它們相應(yīng)的天然細(xì)胞結(jié)合位點以比相同血清型的未修飾的腺病毒纖維蛋白和五鄰體基底蛋白低至少約5倍、10倍、20倍、30倍、50倍或100倍的親和カ結(jié)合，那么猴腺病毒載體顯示出與天然細(xì)胞結(jié)合位點減低的結(jié)合。猴腺病毒載體也可以包含嵌合外殼蛋白，所述嵌合外殼蛋白包含結(jié)合基底(即，配體)(如除天然細(xì)胞受體之外的細(xì)胞受體)的非天然氨基酸序列。嵌合腺病毒外殼蛋白的非天然氨基酸序列允許包含嵌合外殼蛋白的猴腺病毒載體結(jié)合并且期望地感染不被不含所述非天然氨基酸序列的相應(yīng)腺病毒天然感染的宿主細(xì)胞(即，不被相應(yīng)野生型腺病毒感染的宿主細(xì)胞)，與被相應(yīng)野生型腺病毒天然感染的宿主細(xì)胞以比不含所述非天然氨基酸序列的相應(yīng)腺病毒更大的親和カ結(jié)合，或與特定靶細(xì)胞以比非靶細(xì)胞更大的親和カ結(jié)合?！胺翘烊坏摹卑被嵝蛄锌梢园ú惶烊淮嬖谟谙俨《就鈿さ鞍字械陌被嵝蛄谢虼嬖谟谙俨《就鈿ぶ械俏挥谝職?nèi)的非天然位置的氨基酸序列。所謂“優(yōu)先地結(jié)合”意指非天然氨基酸序列以比非天然配體結(jié)合不同受體(例如a I整聯(lián)蛋白)大至少約3倍(例如，至少約5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、35倍、45倍或50倍的親和カ)的親和カ結(jié)合受體，如例如a 3整聯(lián)蛋白。猴腺病毒載體可以包含含有非天然氨基酸序列的嵌合外殼蛋白，所述的非天然氨基酸序列賦予該嵌合外殼蛋白比野生型腺病毒外殼蛋白與免疫細(xì)胞更高效結(jié)合的能力。特別地，猴腺病毒載體可以包含嵌合腺病毒纖維蛋白，所述嵌合腺病毒纖維蛋白包含促進(jìn)猴腺病毒載體由免疫細(xì)胞、優(yōu)選地抗原呈遞細(xì)胞如樹枝狀細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞攝入的非天然氨基酸序列。在優(yōu)選的實施方案中，猴腺病毒載體包含嵌合纖維蛋白，所述嵌合腺病毒纖維蛋白包含含有RGD基序的氨基酸序列(例如，非天然氨基酸序列)，所述RGD基序增加猴腺病毒載體進(jìn)入樹枝狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。將RGD基序或任何非天然氨基酸序列優(yōu)選地插入至腺病毒纖突結(jié)區(qū)域中，理想地在腺病毒結(jié)節(jié)的暴露環(huán)如HI環(huán)中。也可以將非天然氨基酸序列附加至腺病毒纖維蛋白的C末端，任選地通過間隔序列附加。間隔序列優(yōu)選地包含介于ー個至二百個之間的氨基酸，并且可以(但是不需要)具有希望的功能。
在另ー個實施方案中，猴腺病毒載體可以包含對特定類型的真核細(xì)胞沒有選擇性的嵌合病毒外殼蛋白。該嵌合外殼蛋白與野生型外殼蛋白不 同在于將非天然氨基酸序列插入或替換內(nèi)部外殼蛋白序列，或非天然氨基酸序列連接至外殼蛋白的N或C末端。例如，包含約5個至約9個賴氨酸殘基(優(yōu)選地7個賴氨酸殘基)的配體可以通過非功能性間隔序列與腺病毒纖維蛋白的C-末端連接。在該實施方案中，嵌合病毒外殼蛋白高效地與范圍較野生型病毒外殼蛋白更廣的真核細(xì)胞結(jié)合，如美國專利6，465，253和國際專利申請公開WO97/20051中所描述?？梢栽跊]有遺傳操作的情況下調(diào)節(jié)猴腺病毒載體識別潛在宿主細(xì)胞的能力，SP，通過使用雙特異性分子。例如，將腺病毒與下述雙特異性分子復(fù)合使得猴腺病毒載體靶向特定細(xì)胞類型成為可能，其中所述雙特異性分子包含五鄰體基底結(jié)合結(jié)構(gòu)域和選擇性結(jié)合特定細(xì)胞表面結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)域。同樣地，可以通過非遺傳手段將抗原與腺病毒顆粒的表面綴合?？梢詫⒎翘烊话被嵝蛄信c腺病毒外殼蛋白中任一者綴合以形成嵌合腺病毒外殼蛋白。因此，例如，非天然氨基酸序列可以與纖維蛋白、五鄰體基底蛋白、六鄰體蛋白、蛋白IX、VI或IIIa等綴合、插入其中或與之連接。使用此類蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域熟知的(見，例如，美國專利 5，543，328 ；5, 559,099 ;5，712，136 ;5，731，190 ;5，756，086 ；5，770，442 ;5，846，782 ;5，962，311 ;5，965，541 ;5，846，782 ;6，057，155 ;6，127，525 ；6，153，435 ;6，329，190 ;6，455，314 ;6，465，253 ;6，576，456 ;6，649，407 ;6，740，525 和6，951，755 和國際專利申請公開 WO 96/07734、WO 96/26281、WO 97/20051、WO 98/07877、WO 98/07865,WO 98/40509,WO 98/54346,WO 00/15823,WO 01/58940 和 TO 01/92549)。嵌合腺病毒外殼蛋白可以使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。優(yōu)選地，編碼嵌合腺病毒外殼蛋白的核酸序列位于腺病毒基因組內(nèi)部并且與調(diào)節(jié)外殼蛋白在野生型腺病毒中表達(dá)的啟動子可操作地連接。備選地，編碼嵌合腺病毒外殼蛋白的核酸序列位于腺病毒基因組內(nèi)部并且是表達(dá)盒的一部分，所述表達(dá)盒包含為高效表達(dá)嵌合外殼蛋白所需要的遺傳元件。嵌合腺病毒外殼蛋白的外殼蛋白部分可以是附加有非天然氨基酸序列的全長腺病毒外殼蛋白，或它可以被截短的，例如，在內(nèi)部截短或在C末端和/或N末端處截短。無論怎樣修飾(包括存在非天然氨基酸)，嵌合外殼蛋白優(yōu)選地能夠并入腺病毒衣殼中。在非天然氨基酸序列與纖維蛋白連接的情況下，優(yōu)選地，它不擾亂病毒蛋白質(zhì)或纖維單體之間的相互作用。因此，非天然氨基酸序列優(yōu)選地本身不是寡聚化結(jié)構(gòu)域，因為此類結(jié)構(gòu)域可以不利地與腺病毒纖維的三聚化結(jié)構(gòu)域相互作用。優(yōu)選地，將非天然氨基酸序列以這樣的方式添加至病毒粒子蛋白并且并入，從而容易地暴露于基底、細(xì)胞表面受體或免疫細(xì)胞(例如，在腺病毒蛋白的N-末端或C-末端、與面朝基底的殘基連接、位于在肽間隔序列上等)以最大限度地暴露非天然氨基酸序列。理想地，將非天然氨基酸序列在纖維蛋白的C-末端并入腺病毒纖維蛋白中(并且經(jīng)間隔序列連接)或并入纖維的暴露環(huán)(例如，HI環(huán))中以產(chǎn)生嵌合外殼蛋白。在非天然氨基酸序列與五鄰體基底連接或替換其一部分的情況下，優(yōu)選地，它位于高變區(qū)內(nèi)部以確保它接觸基底、細(xì)胞表面受體或免疫細(xì)胞。在非天然氨基酸序列與六鄰體連接的情況下，優(yōu)選地，它位于高變區(qū)內(nèi)部(Crawford-Miksza等，J.Virol, 70 (3) : 1836-44 (1996))。在非天然氨基酸與pIX連接或替換pIX的一部分的情況下，優(yōu)選地，它位于PlX的C-末端內(nèi)部。使用間隔序列使非天然氨基酸序列延伸離開腺病毒顆粒的表面可能是有利的，因為非天然氨基酸序列可以更多地可用于結(jié)合至受體，并且可以減少非天然氨基酸序列和腺病毒纖維單體之間的空間相互作用。在其他實施方案(例如促進(jìn)在在特定工程化細(xì)胞類型內(nèi)純化或増殖)中，非天然氨基酸(例如，配體)可以結(jié)合除細(xì)胞表面蛋白之外的化合物。因此，所述配體可以結(jié)合血液源和/或淋巴液源蛋白質(zhì)(例如，白蛋白)、合成肽序列如聚氨基酸(例如，聚賴氨酸、聚組氨酸等)、人工肽序列(例如，F(xiàn)LAG)和RGD肽片段(Pasqualini等，J. Cell. Biol.，130:1189(1995))。配體甚至可以結(jié)合非肽基底如塑料(例如，Adey 等，Gene, 156:27 (1995))、生物素(Saggio 等，Biochem. J.，293:613 (1993))、DNA 序列(Cheng 等，Gene,171:1 (1996),和 Krook 等，Biochem. Biophys.，Res.Commun.，204:849(1994))、鏈霉親和素(Geibel 等,Biochemistry, 34:15430(1995) 和 Katz, Biochemistry, 34:15421(1995))> 硝基鏈霉親和素(Baiass 等,Anal.Biochem.，243:264(1996))、肝素(Wickham等，Nature Biotechnol, 14:1570-73(1996))和其他基底。腺病毒外殼蛋白與細(xì)胞表面受體天然結(jié)合的破壞也可以使它更不能夠與先天或獲得性宿主免疫系統(tǒng)相互作用。腺病毒載體施用誘導(dǎo)炎癥并且激活先天和獲得性免疫機(jī)制。腺病毒載體激活抗原特異性(例如，T-細(xì)胞依賴性)免疫應(yīng)答，其限制初次施用該載體后轉(zhuǎn)基因表達(dá)的持續(xù)時間。此外，暴露于腺病毒載體刺激由B細(xì)胞產(chǎn)生中和抗體，這可以阻止由腺病毒載體隨后給藥引起的基因表達(dá)(Wilson和Kay，Nat.Med.，3(9) :887-889(1995))。實際上，反復(fù)施用載體的有效性可能極大地受宿主免疫力限制。除刺激體液免疫之外，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能負(fù)責(zé)從身體清除病毒。病毒的快速清除歸功于先天免疫機(jī)制(見，例如，Worgali等，Human Gene Therapy, 8:37-44 (1997)),并且可能牽涉肝臟內(nèi)部存在的枯否氏細(xì)胞。因此，通過去除腺病毒纖維蛋白和五鄰體基底蛋白的天然結(jié)合，削弱免疫系統(tǒng)對腺病毒載體的識別，從而増加宿主的載體耐受性。用于規(guī)避針對腺病毒的先存宿主免疫力的方法包括修飾腺病毒外殼蛋白，從而它顯示出減弱的宿主免疫系統(tǒng)識別作用。修飾的外殼蛋白優(yōu)選地是五鄰體、纖維或六鄰體蛋白。最優(yōu)選地，修飾的外殼蛋白是六鄰體蛋白。外殼蛋白可以用任何合適的方式修飾，但是優(yōu)選地通過在外殼蛋白中產(chǎn)生多祥性來修飾。優(yōu)選地，此類外殼蛋白變體不被先存的宿主腺病毒特異性中和抗體識別?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何合適方法，包括例如定向進(jìn)化(即，多核苷酸改組)和易錯 PGR(見，例如，Cadwell，PCR meth Appl, 2:28-33 (1991)，Leung等,Technique, 1:11-15 (1989)和 Pritehard 等,J. TheoreticalBiol, 234:497-509 (2005))產(chǎn)生多祥性。免疫規(guī)避也包括聚こニ醇化等。也可以通過以下方式修飾腺病毒外殼蛋白以規(guī)避先存的宿主免疫力缺失外殼蛋白的某個區(qū)域并且將其替換為來自另ー種腺病毒血清型，尤其在人類中免疫原性較低的血清型的外殼蛋白的相應(yīng)區(qū)域。就這一點而言，可以將纖維蛋白、五鄰體基底蛋白和/或六鄰體蛋白內(nèi)部的氨基酸序列移去并且替換為來自不同腺病毒血清型的相應(yīng)序列。因此,例如，當(dāng)修飾纖維蛋白以規(guī)避先存的宿主免疫カ時，可以將來自猴腺病毒纖維蛋白的結(jié)節(jié)區(qū)域的氨基酸殘基缺失并且替換為來自不同血清型(如本文所述的那些血清型)的猴腺病毒中的相應(yīng)氨基酸殘基。同樣地，當(dāng)修飾五鄰體基底蛋白以規(guī)避先存的宿主免疫カ時，可以將猴腺病毒五鄰體基底蛋白的高變區(qū)內(nèi)的氨基酸殘基缺失并且替換為來自不同血清型(如本文所述的那些血清型)的猴腺病毒中的相應(yīng)氨基酸殘基。優(yōu)選地，將猴腺病毒載體的六鄰體蛋白以這種方式修飾以規(guī)避先存的宿主免疫力。就這一點而言，將六鄰體蛋白的環(huán)中存在的一個或多個高變區(qū)內(nèi)的氨基酸殘基移去并且替換為來自不同血清型的相應(yīng)氨基酸殘基?？梢詮牧忬w蛋白中移去整個環(huán)區(qū)域并且將其替換為另ー種猴腺病毒血清型的相應(yīng)環(huán)區(qū)域。備選地，可以從猴腺病毒載體六鄰體蛋白中移去環(huán)區(qū)域的部分并且將其替換為另ー種猴腺病毒血清型(猴或人)的六鄰體環(huán)的相應(yīng)部分?？梢詫⒑锵俨《据d體的ー個或多個六鄰體或其部分移去并且替換為來自任何其他腺病毒血清型(猴或人)(如本文所描述的那些血清型)的六鄰體環(huán)中的相應(yīng)序列。修飾六鄰體蛋白的方法在例如Rux等，J.Virol, 77:9553-9566(2003)和美國專利6，127，525中公開。也可以將六鄰體蛋白的高變區(qū)替換為隨機(jī)肽序列或源自致病性病原體(例如，HIV)的肽序列。對腺病毒外殼蛋白的修飾在例如美國專利5，543，328 ；5, 559,099 ;5，712，136 ；·5，731，190 ;5，756，086 ;5，770，442 ;5，846，782 ;5，871，727 ;5，885，808 ;5，922，315 ；5，962，311 ;5，965，541 ;6，057，155 ;6，127，525 ;6，153，435 ;6，329，190 ;6，455，314 ；6，465，253 ;6，576，456 ;6，649，407 ;6，740，525 和 6，951，755 ;以及國際專利申請 WO96/07734、TO 96/26281、WO 97/20051、TO 98/07865、TO 98/07877、WO 98/40509、WO98/54346、WO 00/15823、WO 01/58940 和 WO 01/92549 中描述。猴腺病毒也可以用來將遺傳物質(zhì)遞送至細(xì)胞。遺傳物質(zhì)通常是DNA。插入猴病毒基因組中的任何DNA在本文中稱作異源核酸序列或“hDNA”。存在所述hDNA可以具有的本領(lǐng)域已知的眾多功能。hDNA可以具有調(diào)節(jié)特性。ー些更常見的元件調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，如啟動子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、剪接元件、基質(zhì)結(jié)合調(diào)節(jié)元件、轉(zhuǎn)錄絕緣子和聚腺苷酸化序列，不一而足。如果RNA從所述hDNA產(chǎn)生，它可能具有功能。一些功能在本質(zhì)上是調(diào)節(jié)性的，如siRNA、shRNAJi RNA、反義RNA、VA RNA所顯示。所述RNA也可以編碼多肽如蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)可以是天然的或以本領(lǐng)域已知的任何方式修飾。存在本領(lǐng)域已知的許多方式來調(diào)節(jié)RNA水平、翻譯和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。存在調(diào)節(jié)性RNA和多肽可以具有的眾多功能。異源核酸序列優(yōu)選地編碼病原體的抗原。病原體可以是病毒，如呼吸道合胞病毒(RSV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、ロ蹄疫病毒(FMDV)、單純皰疹病毒(HSV)、丙型肝炎病毒(HCV)、埃博拉病毒或馬爾堡病毒。病原體也可以是寄生蟲，例如，造成瘧疾的瘧原蟲屬(Plasmodium)寄生蟲(例如，惡性痕原蟲(Plasmodium falciparum))。備選地，該異源核酸序列可以編碼例如無調(diào)同源物蛋白(例如，HATH I或MATHl)、TNF-a或色素上皮衍生因子(PEDF)。本發(fā)明的腺病毒載體可以有復(fù)制能力。例如，腺病毒載體可以在腺病毒基因組中具有不抑制宿主細(xì)胞中病毒復(fù)制的突變(例如，缺失、插入或置換)。然而，優(yōu)選地，腺病毒載體是復(fù)制缺陷型的。所謂“復(fù)制缺陷型”意指腺病毒載體包含有缺少至少ー個復(fù)制必需基因功能(即，以致于該腺病毒載體在常見宿主細(xì)胞中不復(fù)制，尤其在人患者內(nèi)可能在本發(fā)明方法過程中被腺病毒載體感染的那些宿主細(xì)胞)的腺病毒基因組。如本文所用，基因、基因功能或者基因或基因組區(qū)域的缺乏定義為病毒基因組的大量遺傳物質(zhì)缺失以致于損害或消除核酸序列完全或部分缺失的基因的功能。盡管優(yōu)選遺傳物質(zhì)的缺失，但通過添加或置換使遺傳物質(zhì)突變也適用于破壞基因功能。復(fù)制必需基因功能是復(fù)制(例如，増殖)所需要的那些基因功能并且由例如腺病毒早期區(qū)(例如，E1、E2和E4區(qū))、晩期區(qū)(例如，L1-L5區(qū))、參與病毒包裝的基因(例如，IVa2基因)和病毒相關(guān)RNA (例如，VA-RNAl和/或VA-RNA-2)編碼。更優(yōu)選地，復(fù)制缺陷型腺病毒載體包含在ー個或多個腺病毒基因組區(qū)域的至少ー項復(fù)制必需基因功能方面有缺陷的腺病毒基因組。優(yōu)選地，腺病毒載體在病毒復(fù)制所需要的腺病毒基因組ElA區(qū)、ElB區(qū)或E4區(qū)的至少ー項基因功能方面有缺陷(稱作El-缺陷或E4-缺陷型腺病毒載體)。除El區(qū)中的缺陷之外，該重組腺病毒還可以在主要晚期啟動子(MLP)中具有突變，如國際專利申請WO 00/00628 中所討論。在一些實施方案中，腺病毒載體在El區(qū)的至少ー項復(fù)制必需基因功能(期望的是全部復(fù)制必需基因功能)方面和非必需E3區(qū)的至少ー項基因功能方面有缺陷(例如，E3區(qū)的Xba I缺失)(稱作El/E3缺陷型腺病毒載體)。相對于El區(qū)，腺病毒載體可以在全部或部分的ElA區(qū)和全部或部分的ElB區(qū)內(nèi)有缺陷。為了說明但是不限于這個實施方案，血清型35腺病毒載體可以包含核苷酸570位至3484的El缺失。當(dāng)腺病毒載體在腺病毒基因組的僅ー個區(qū)域內(nèi)至少ー項復(fù)制必需基因功能方面有缺陷時(例如，El-缺陷型或E1/E3-缺陷型腺病毒載體)，該腺病毒載體稱作是“單ー復(fù)制缺陷型的”。本發(fā)明的猴腺病毒載體可以是“多重復(fù)制缺陷型的”，這意指該腺病毒載體在兩個或更多個腺病毒基因組區(qū)域的每個區(qū)域內(nèi)一項或多項復(fù)制必需基因功能方面有缺陷。例如，前述的El-缺陷或E1/E3-缺陷型腺病毒載體可以在E4區(qū)的至少ー項復(fù)制必需基因功能方面進(jìn)ー步有缺陷(稱作E1/E4-缺陷型或E1/E3/E4-缺陷型腺病毒載體)和/或在E2區(qū)的至少ー項復(fù)制必需基因功能方面進(jìn)ー步有缺陷(稱作E1/E2-缺陷型或E1/E2 E3-缺陷型腺病毒載體)，優(yōu)選地在E2A區(qū)的至少ー項復(fù)制必需基因功能方面進(jìn)ー步有缺陷(稱作E1/E2A-缺陷型或E1/E2A/E3-缺陷型腺病毒載體)。通過移除腺病毒基因組的全部或部分，例如El、E3和E4區(qū)，所得到的腺病毒載體能夠接受外源核酸序列的插入，而同時保留被包裝入腺病毒衣殼的能力。所述核酸序列可以位于腺病毒基因組的El區(qū)、E3區(qū)或E4區(qū)內(nèi)。實際上，可以將核酸序列插入腺病毒基因組中的任何位置，只要該位置不阻止該核酸序列的表達(dá)或干擾腺病毒載體的包裝。腺病毒載體還可以包含多個(即，兩個或更多個)編碼相同抗原的核酸序列。或者，腺病毒載體可以包含多個編碼兩種或更多種不同抗原的核酸序列。根據(jù)執(zhí)業(yè)醫(yī)師期望的表達(dá)譜，每個核酸序列可以與相同啟動子或與不同啟動子可操作地連接，并且可以插入腺病毒基因組的相同區(qū)域(例如，E4區(qū))內(nèi)或腺病毒基因組的不同區(qū)域內(nèi)。當(dāng)具有多重復(fù)制缺陷型時，尤其在El和E4區(qū)的復(fù)制必需基因功能方面，猴腺病毒載體優(yōu)選地包含間隔序列以在互補(bǔ)性細(xì)胞系中提供病毒生長，類似于由單一復(fù)制缺陷型腺病毒載體、尤其El-缺陷型腺病毒載體所實現(xiàn)的那種情況。所述間隔序列可以含有期望長度的任何核苷酸序列或多個序列，如長度為至少約15個堿基對(例如，在約15個堿基對和約12，000個堿基對之間)、優(yōu)選地約100個堿基對至約10，000個堿基對、更優(yōu)選地約500個堿基對至約8，OOO個堿基對、甚至更優(yōu)選地約1，500個堿基對至約6，000個堿基對并且最優(yōu)選地約2，000至約3，000個堿基對的序列。間隔元件序列可以是編碼性或非編碼性的并且相對于腺病毒基因組是天然或非天然的，但是不恢復(fù)缺陷區(qū)域的復(fù)制必需功能。間隔元件優(yōu)選地位于腺病毒基因組的E4區(qū)內(nèi)。美國專利5，851，806中描述了間隔區(qū)在腺病毒載體中的用途。已經(jīng)觀察到至少E4-缺陷型腺病毒載體在體內(nèi)以高水平表達(dá)有限的時間量轉(zhuǎn)基因并且觀察到轉(zhuǎn)基因在至少E4-缺陷型腺病毒載體中表達(dá)的持續(xù)性可以借助尤其是反式作用因子(如HSV ICP0,Ad pTP、CMV-IE2、CMV-IE86、HIV tat、HTLV-tax、HBV_X、MV R印78、來自U205骨肉瘤細(xì)胞系中如HSV ICPO那樣發(fā)揮作用的細(xì)胞因子或PC12細(xì)胞中由神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)的細(xì)胞因子)的作用進(jìn)行調(diào)節(jié)，如在例如美國專利6，225，113、美國專利申請公開2002/0031823A1和國際專利申請WO 00/34496中所描述。鑒于上文，多重缺陷型腺病毒載體(例如，至少E4-缺陷型腺病毒載體)或第二表達(dá)載體期望地包含編碼反式作用因子的核酸序列，所述反式作用因子調(diào)節(jié)核酸序列表達(dá)的持續(xù)性。當(dāng)產(chǎn)生免疫耐受時，抗原性DNA的持續(xù)表達(dá)可能是期望的。猴腺病毒載體可以在僅腺病毒基因組的早期區(qū)域、僅腺病毒基因組的晚期區(qū)域以及腺病毒基因組的早期和晩期區(qū)域的復(fù)制必需基因功能方面有缺陷。猴腺病毒載體也可以被移除基本上整個腺病毒基因組，在這種情況下，優(yōu)選留下至少病毒末端反向重復(fù)序列(ITR)和一個或多個啟動子或病毒ITR和包裝信號保持完整(即，腺病毒復(fù)制子)。在一個實施方案中，本發(fā)明的猴腺病毒載體可以包含缺少編碼腺病毒蛋白的天然核酸序列的腺病毒基因組?？梢员Ａ魹閺?fù)制腺病毒基因組和將其包裝入腺病毒衣殼蛋白中所需要的腺病毒基因組元件。缺少腺病毒蛋白編碼序列的最小腺病毒載體稱作“輔助依賴性”腺病毒載體，并且經(jīng)常需要輔助腺病毒的互補(bǔ)作用以高效増殖。在美國專利5，837，511 ；5，851，806 ;5，994，106 ;6，127，175 和 6，482，616 ;美國專利申請公開 2001/0043922A1、2002/0004040AU2002/0031831A1 和 2002/0110545A1 以及國際專利申請 WO 94/28352、 WO 95/02697、WO 95/16772、WO 95/34671、WO 96/22378、WO 97/12986、WO 97/21826 和 WO03/022311中公開了合適的復(fù)制缺陷型腺病毒載體，包括多重復(fù)制缺陷型腺病毒載體。如果腺病毒載體不是復(fù)制缺陷型的，則理想地操作腺病毒載體以使該載體的復(fù)制限于靶組織內(nèi)。例如，所述腺病毒載體可以是條件復(fù)制型腺病毒載體，所述載體經(jīng)工程化以在執(zhí)業(yè)醫(yī)師所預(yù)定的條件下復(fù)制。例如，復(fù)制必需基因功能，例如，由腺病毒早期區(qū)域編碼的基因功能，可以與誘導(dǎo)型、阻遏型或組織特異性轉(zhuǎn)錄控制序列(例如啟動子)可操作地連接。在該實施方案中，復(fù)制需要存在或不存在與轉(zhuǎn)錄控制序列相互作用的特定因子。在自身免疫病治療中，可能有利的是控制腺病毒載體在例如淋巴結(jié)中復(fù)制以獲得連續(xù)的抗原產(chǎn)生并且控制免疫細(xì)胞產(chǎn)生。條件復(fù)制型腺病毒載體進(jìn)一歩在美國專利5，998，205中描述。在猴腺病毒中添加大量hDNA可能是有利的。例如，如果需要大的調(diào)節(jié)序列，需要多重轉(zhuǎn)錄單位或轉(zhuǎn)錄物龐大，則這種情況可以出現(xiàn)。由于腺病毒的包裝尺寸上限是大約105%野生型基因組，具有較大基因組的病毒難以產(chǎn)生并且經(jīng)常是不穩(wěn)定的。為克服這種包裝和穩(wěn)定性限制，可以使病毒DNA序列缺失以容納龐大量的hDNA。存在至少3個可以從病毒中移除并且仍能夠產(chǎn)生感染病毒顆粒的病毒區(qū)域(即，EU E3和E4區(qū))。這些病毒區(qū)域中每個區(qū)域由至少ー個啟動子和多腺苷酸化信號組成，所述區(qū)域編碼多種轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)?？梢允惯@些區(qū)域的全部或部分從病毒基因組缺失。本領(lǐng)域已知，已經(jīng)將hDNA插入或用來替換這些區(qū)域的每ー個。這些區(qū)域可以逐一或組合地進(jìn)行修飾以產(chǎn)生El、E3和E4修飾的病毒。這進(jìn)ー步擴(kuò)展所述猴病毒的靈活性并因此擴(kuò)展其用途。從該病毒移去El、E3和E4區(qū)對于猴腺病毒的用途具有額外益處。這些區(qū)域已知編碼可以直接改變宿主細(xì)胞或刺激額外的病毒蛋白表達(dá)的多種調(diào)節(jié)蛋白。尤其已知El和E4區(qū)編碼致癌基因。在許多應(yīng)用中，優(yōu)選病毒的基因不表達(dá)。更少病毒基因表達(dá)的益處中的ー些是來自所添加hDNA的改進(jìn)的活性，如基因表達(dá)，規(guī)避在該病毒施用至動物時的免疫監(jiān)視，和増加可以施用的病毒劑量。增加劑量和改進(jìn)hDNA基因調(diào)節(jié)的能力擴(kuò)展了猴病毒的應(yīng)用并且因此擴(kuò)展其用途。因此，缺失病毒DNA將同時擴(kuò)展病毒可以容納的hDNA的量和從病毒移除有害序列，從而擴(kuò)展病毒的用途。本文所述的技術(shù)支持缺失型猴腺病毒的構(gòu)建。如上文所述，腺病毒El區(qū)編碼調(diào)節(jié)蛋白。在El功能不存在的情況下，腺病毒是復(fù)制缺陷型的(本文中也稱作“復(fù)制缺陷型的”)。以下實施例說明，用人腺病毒El和E40RF6實現(xiàn)了 El缺失型猴腺病毒的復(fù)制缺陷性的完全互補(bǔ)作用(見實施例3)。因此，對于猴腺病毒在猴細(xì)胞上生長必需的這些區(qū)域?qū)θ?細(xì)胞系-人腺病毒系統(tǒng)中的生長是非必需的(實施例3)。由E3區(qū)編碼的蛋白質(zhì)對病毒生長是非必要的。本領(lǐng)域已知，甚至在帶有El缺和或E4缺失的病毒中容易產(chǎn)生帶有E3缺失的腺病毒。令人驚訝的是，在多種已知的E4蛋白中，一種負(fù)責(zé)擴(kuò)展猴腺病毒宿主范圍至人細(xì)胞的蛋白質(zhì)(0RF6)也能夠?qū)4缺失型腺病毒生長起到補(bǔ)足作用。已經(jīng)顯示，來自相同C組血清型的El和E4表達(dá)均支持帶有El-、E3-、E4-缺失的非種類C腺病毒生長(Tatsis等，Gene Ther.，13(5):421-9 (2006))。源自猴腺病毒的腺病毒載體用于以下的應(yīng)用(I)用于傳染病適應(yīng)癥的疫苗載體，(2)用于抗癌應(yīng)用的疫苗載體，(3)轉(zhuǎn)移編碼治療性蛋白的轉(zhuǎn)基因用于急性和慢性疾病介入治療。猴腺病毒載體可以用于誘導(dǎo)哺乳動物中的免疫應(yīng)答(接種)。在這個方面，人腺病毒載體的廣泛用途至少部分地因載體的免疫原性而受阻。大部分的美國人群已經(jīng)暴露于野生型人腺病毒并且發(fā)展針對基于人腺病毒的基因轉(zhuǎn)移載體的先存免疫力。因此，人腺病毒載體因先存的宿主免疫應(yīng)答而失活，從而降低該載體的效力。身體內(nèi)對腺病毒載的中和和/或清除使得使用這些載體作為DNA疫苗復(fù)雜化。DNA疫苗利用基因轉(zhuǎn)移載體來遞送編碼抗原的DNA至宿主細(xì)胞。通過在體內(nèi)產(chǎn)生抗原性蛋白質(zhì)，將免疫系統(tǒng)的體液介導(dǎo)免疫和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫激活，從而與其中將外源蛋白注入體內(nèi)的傳統(tǒng)疫苗相比，產(chǎn)生針對該抗原的更完整免疫應(yīng)答。盡管人腺病毒載體作為基因遞送載體存在有利特征，然而該載體的免疫原性阻止了高效的反復(fù)給藥，這可以有利干“增強(qiáng)”免疫系統(tǒng)對抗病原體，并且導(dǎo)致僅ー小部分劑量的腺病毒載體遞送其有效載荷至宿主細(xì)胞。猴腺病毒載體將不經(jīng)歷由針對人腺病毒的先存免疫カ介導(dǎo)的中和和/或清除。另夕卜，兩種或更多種猴腺病毒載體的組合將避免隨著反復(fù)施用人腺病毒載體時所觀察到的抑制；因此將可能增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對抗病原體。因此，猴腺病毒載體提供了人腺病毒載體的相同優(yōu)點，而沒有其缺點。本發(fā)明腺病毒的一個實施方案包括編碼抗原的核酸序列，其中所述抗原在哺乳動物中表達(dá)以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答?！翱乖笔窃诓溉閯游镏杏|發(fā)免疫應(yīng)答的分子?！懊庖邞?yīng)答”可以引起例如抗體生產(chǎn)和/或免疫效應(yīng)細(xì)胞的活化。在本發(fā)明的語境下的抗原可以包括任何蛋白質(zhì)分子的任何亞單位，所述蛋白質(zhì)分子包括病毒、細(xì)菌、寄生蟲、真菌、原蟲、朊蛋白、細(xì)胞或胞外來源的蛋白質(zhì)或肽，它們理想地在哺乳動物中誘發(fā)免疫應(yīng)答，優(yōu)選地導(dǎo)致保護(hù)性免疫?？乖部梢允亲陨砜乖?，即，身體已經(jīng)將其錯誤地視為外來入侵者的自體蛋白。在一個實施方案中，抗原是病毒抗原。病毒抗原可以從任何病毒分離，所述病毒包括，但不限于來自以下任何病毒科的病毒沙粒病毒科(Arenaviridae)、動脈炎病毒屬(Arterivirus)、星狀病韋科(Astroviridae)、桿狀病韋科(Baculoviridae)、桿狀DNA病韋屬(Badnavirus)、桿狀RNA病韋科(Barnaviridae)、雙RNA病韋科(Birnaviridae)、雀麥花葉病韋科(Bromoviridae)、布尼亞病韋科(Bunyaviridae)、杯狀病韋科(Caliciviridae)、毛狀病毒組(Capillovirus)、香石竹潛隱病毒屬(Carlavirus)、花椰菜花葉病毒組(Caulimovirus)、圓環(huán)病毒科(Circoviridae)、線形病毒組(Closterovirus)、紅豆花葉病韋科(Comoviridae)、冠狀病韋科(Coronaviridae)(例如，冠狀病韋屬(Coronavirus)JPI嚴(yán)重急性呼吸窘迫綜合征(SARS)病毒)、覆蓋噬菌體科(Corticoviridae)、囊狀噬菌體科(Cystoviridae)、6病毒屬(Deltavirus)、香石竹病毒組(Dianthovirus)、耳突花葉病毒屬(Enamovirus)、絲狀病毒科(Filoviridae)(例如，馬爾堡病毒和埃博拉病毒(例如， Zaire株、Reston株、象牙海岸株或蘇丹株)、黃病毒科(Flaviviridae)(例如,丙型肝炎病毒、登革病毒I、登革病毒2、登革病毒3和登革病毒4)、嗜肝DNA病毒科Ofepadnaviridae)(例如，こ型肝炎病毒)、皰疹病毒科(Herpesviridae)(例如，人皰疹病毒1、2、3、4、5及6和細(xì)胞巨化病毒)、減毒病毒科(Hypoviridae)、虹彩病毒科(Iridoviridae)、光滑病毒科(Leviviridae)、脂毛卩遼菌體科(Lipothrixviridae)、微小卩遼菌體科(Microviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，甲型和こ型流感病毒)、乳多空病毒科(Papovaviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)(例如，麻疫病毒、腿腺炎病毒和人呼吸道合胞體病毒)、細(xì)小病毒科(Parvoviridae)、微RNA病韋科(Picornaviridae)(例如，脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒、嗜肝病毒和ロ蹄疫病毒)、痘病毒科(Poxviridae)(例如，痘苗病毒)、呼腸孤病毒科(Reoviridae)(例如，輪狀病毒(rotavirus)、逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)(例如，慢病毒屬(Intivirus)，如人免疫缺陷病毒(HIV) I和HIV2)、彈狀病毒科(Rhahdoviridae)和整體病毒科(Totiviridae)。在一個實施方案中，本發(fā)明方法的抗原是呼吸道合胞體病毒(RSV)抗原。該抗原可以是例如RSV A株或B株抗原，如F、G、M、M1、M2、SH或NSl或NS2蛋白的全部或部分，或不止ー種這些蛋白質(zhì)的全部或部分的融合物。由腺病毒載體編碼的抗原也可以是逆轉(zhuǎn)錄病毒抗原。逆轉(zhuǎn)錄病毒抗原可以是例如，HIV抗原，如gag、env或pol蛋白的全部或部分。HIV的任何進(jìn)化支適用于抗原選擇,包括進(jìn)化支A、B、C、MN等。在一些實施方案中，由腺病毒載體編碼的至少ー種抗原是單純皰疹病毒2 (HV-2)抗原。本發(fā)明方法的合適SARS病毒抗原包括例如UL19、UL47或gD蛋白的全部或部分。本文中具體提到的抗原性肽僅是示例性的，因為可以在本發(fā)明的語境中使用任何病毒蛋白。抗原也可以是寄生蟲抗原,例如,但不限于孢子蟲(Sporozoan)抗原。例如，核酸序列可以編碼瘧原蟲(Plasmodium)抗原，如環(huán)子孢子蛋白、子孢子表面蛋白、肝期抗原、頂端膜相關(guān)蛋白質(zhì)或裂殖子表面蛋白的全部或部分。備選或另外，由腺病毒載體編碼的至少ー種抗原是細(xì)菌抗原?？乖梢栽醋匀魏渭?xì)菌，包括但不限于放線菌屬(Actinomyces)、魚腥藻屬(Anabaena)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、擬桿菌屬(Bacteroides)、輕弧菌屬(Bdeilovihrio)、柄桿菌屬(Caulobacter)、衣原體屬(Chlamydia)、綠菌屬(Chlorobium)、染綠菌屬(Chromatium)、梭菌屬(Clostridium)、卩遼纖維菌屬(Cytophaga)、異常球菌屬(Deinococcus)、埃西氏菌屬(Escherichia)、鹽桿菌屬(Halobacterium)、螺旋桿菌屬(Heliobacter)、生絲微菌屬(Hyphomicrobium)、甲燒桿菌屬(Methanobacterium)、微球菌屬(Micrococcus)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、支原體屬(Mycoplasma)、粘球菌屬(Myxococcus)、奈瑟菌屬(Neisseria)、硝化桿菌屬(Nitrobacter)、顫藍(lán)細(xì)菌屬(Oscillatoria)、原綠菌屬(Prochloron)、變形菌屬(Proteus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、紅螺菌屬(Rhodospirillum)、立克次氏體屬(Rickettsia)、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬(Shigella)、螺菌屬(Spirillum)、螺旋體屬(Spirochaeta)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、硫化葉菌屬(Sulfolobus)、熱原體屬(Thermoplasma)、硫桿菌屬(Thiobacillus)和密螺旋體屬(Treponema)。在一個實施方案中，由核酸序列編碼的至少ー種抗原是假單胞菌(Pseudomonas)抗原或螺旋桿菌(Heliobacter)抗原。
可以理解不需要整個、完好的病毒蛋白或細(xì)菌蛋白以產(chǎn)生免疫應(yīng)答。實際上，大部分抗原表位的尺寸相對小，因此蛋白質(zhì)片段對暴露于哺乳動物免疫系統(tǒng)而言可能是足夠的。此外，可以在ー種或多種抗原的兩個或更多個抗原表位之間產(chǎn)生融合蛋白。例如，HIVgpl20或gpl60的全部或部分可以與HIV pol蛋白的全部或部分融合以與由單ー表位所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答相比，產(chǎn)生針對HIV病原體的更完整的免疫應(yīng)答。融合蛋白由腺病毒載體遞送至哺乳動物允許免疫系統(tǒng)暴露于多種抗原，并且因此使單一疫苗組合物針對多種病原體提供免疫カ成為可能。核酸序列(包括編碼抗原的核酸序列)不限于一個類型的核酸序列或任何特定起源。該核酸序列可以是重組DNA，可以是基因組DNA，可以從潛在抗原表位的DNA文庫獲得，或可以通過合成的方式產(chǎn)生。該核酸序列可以作為表達(dá)盒的部分存在，所述表達(dá)盒另外包含為高效表達(dá)核酸序列和產(chǎn)生編碼的抗原所需要的遺傳元件。理想的是，編碼抗原的核酸序列與如本文所述的啟動子和聚腺苷酸化序列可操作地連接?？梢酝ㄟ^匹配啟動子的活性的特定模式與期望的抗原表達(dá)模式和水平，選擇用于本發(fā)明方法中的啟動子。例如，腺病毒載體可以包含編碼不同抗原并且與顯示出不同表達(dá)譜的不同啟動子可操作地連接的兩個或更多個核酸序列。例如，選擇第一啟動子以介導(dǎo)抗原產(chǎn)生的初始峰，從而引發(fā)免疫系統(tǒng)對抗編碼的抗原。選擇第二啟動子以驅(qū)動相同或不同抗原的產(chǎn)生，從而在第一啟動子的表達(dá)峰值稍后幾日出現(xiàn)表達(dá)峰，因此“增強(qiáng)”免疫系統(tǒng)對抗該抗原。備選地，可以構(gòu)建雜合啟動子，其組合了多個啟動子的期望方面。例如，本發(fā)明方法的許多實施方案中特別優(yōu)選將CMV啟動子活性最初突增和RSV啟動子維持高水平活性組合在一起的CMV-RSV雜合啟動子。在抗原可能對真核細(xì)胞有毒的情況下，可能有利的是，修飾啟動子以降低用來増殖腺病毒載體的互補(bǔ)性細(xì)胞系中的活性。以下實施例進(jìn)ー步說明本發(fā)明，但是當(dāng)然不得以任何方式解釋為限制本發(fā)明的范圍。實施例I
該實施例說明，猴腺病毒蝕斑的形成在表達(dá)人腺病毒組分El和E40RF6的人細(xì)胞系上十分聞效。猴腺病毒在人細(xì)胞上復(fù)制受限，并且人腺病毒因子克服這種限制。如本文所表明的，本發(fā)明具有兩個意料之外的結(jié)果猴腺病毒在人細(xì)胞上的生長比在含有完整E4區(qū)的那些人細(xì)胞上的生長改進(jìn)，并且與建議用于猴腺病毒生長的天然宿主細(xì)胞系相比，猴腺病毒在人細(xì)胞上的増殖有優(yōu)勢。用兩種方法學(xué)定義生長。使用蝕斑形成來測定在很低的感染復(fù)數(shù)(MOI)條件下的生長，并且需要多于ー個感染性循環(huán)以產(chǎn)生正結(jié)果，即，細(xì)胞單層中的蝕斑。因此，蝕斑形成真實地表明病毒的連續(xù)生長單個感染性病毒顆粒感染單個細(xì)胞，病毒生命周期的徹底完成出現(xiàn)，隨后病毒子代感染鄰近細(xì)胞等。第二種方法評估單輪病毒復(fù)制產(chǎn)生的感染性病毒子代的數(shù)目。該方法基于基本上所有單層中細(xì)胞的同步感染，稱作單次裂解生長評估。在全部E4因子中，本文表明0RF6足以在人細(xì)胞上增殖猴腺病毒。出乎意料的是，人細(xì)胞系在支持猴腺病毒形成蝕斑(一種測量病毒生長的標(biāo)準(zhǔn)方法)的能力方面優(yōu)于猴 細(xì)胞系。從恒河猴和綠長尾猴分離的兩種猴腺病毒SV-Il和SV-38在293-0RF6、BSC-I、LLC-MK2 (MK2) ,Vero和CV-I細(xì)胞上形成蝕斑。除293-0RF6細(xì)胞系之外的其他細(xì)胞系均源自猴。BSC-I和MK-2是由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)推薦的增殖該病毒的細(xì)胞系。使用兩種病毒的連續(xù)稀釋物來感染每個細(xì)胞系，所述細(xì)胞系在60mm培養(yǎng)皿中達(dá)到80%匯合度。感染條件是500 ill病毒I小吋，每隔15分鐘振搖。隨后移去病毒并且用EMEM+2%FBS和0. 9%瓊脂糖覆蓋細(xì)胞。14日后，對蝕斑進(jìn)行計數(shù)。293-0RF6細(xì)胞產(chǎn)生最高的蝕斑形成效率，十倍優(yōu)于所測試的任何其他細(xì)胞系(表I)。先前曾報道，在含有來自人腺病毒2的完整E4區(qū)的人細(xì)胞上形成蝕斑的猴病毒具有與CV-I細(xì)胞相比低40倍的蝕斑形成效率。采用本發(fā)明時，在生長方面存在明顯的400倍改善，如通過蝕斑形成活性所度量。如本文所表明的，本發(fā)明具有兩個意料之外的結(jié)果猴腺病毒在人細(xì)胞上的生長比在含有完整E4區(qū)的那些人細(xì)胞上的生長改進(jìn)，并且與推薦用于猴腺病毒生長的天然宿主細(xì)胞系相比，猴腺病毒在人細(xì)胞上的增殖有優(yōu)勢。表I
細(xì)胞系I病毒I滴度(PFU*/mL)
~BS-C-Il_ SV-Ill_ 1.67x10s
CV-I SV-11-11SV-Il2.89X107
LLC-M !<2 SV-M-IlSV-Il2.54xl0
VeroSV-Il1.94x10°
293-ORF6] SV-IlJ 6.36^ ICrr"
BSC-II SV-38] 1.27x10,
CV-ISV-384.09x1 Ob
LLC-MK2SV-38LOxJOr
VeroSV-386.66x1 Ob
293-ORF6] SV-38J 2.26x10°*蝕斑形成單位實施例2
該實施例顯示在具有人腺病毒種類C因子的人細(xì)胞系代上產(chǎn)生高滴度的猴腺病毒子代。進(jìn)行單次裂解生長實驗以確定人腺病毒El和E4 0rf6的組合是否足以克服對人細(xì)胞中猴腺病毒復(fù)制的限制性阻斷。將不表達(dá)Ad5因子(A549)、Ad5E40RF6 (A549+Ad5E40RF6)、Ad5El (293)或 Ad5El 和 E40RF6 (293-0RF6)的人細(xì)胞以每孔
I.5X IO6個細(xì)胞以三個重復(fù)接種于6孔平板中。源自非洲綠猴的容許猴腺病毒復(fù)制的BSC-I細(xì)胞以每孔IX IO5個細(xì)胞接種。使全部細(xì)胞在 具有10%FCS的DMEM中維持并且在37°C，5%C02下生長。次日，使細(xì)胞用CsCl2梯度純化的猴腺病毒原液，以每孔300iU中3個(圖2A)或I個(圖2B)集落形成単位(FFU)/細(xì)胞的MOI感染2小吋，隨后抽吸并且用3ml 具有 5%FCS 和 100 u M ZnCl2 的 DMEM 覆蓋以允許在 A549+Ad5E40RF6 和 293-0RF6 細(xì)胞中誘導(dǎo)E40RF6表達(dá)。隨后孵育細(xì)胞并且在感染后72小時收獲。通過由交替暴露于由干冰和37°C水浴組成的3次凍融循環(huán)，使病毒顆粒從細(xì)胞釋放。用Vaccine, 25:2074-2084(2007)中描述的FFU測定法，評估病毒-細(xì)胞裂解物中子代病毒粒子的數(shù)目。與A549和表達(dá)Ad5E40RF6的A549細(xì)胞相比(圖2A)，用猴腺病毒在人細(xì)胞系上產(chǎn)生感染性子代在采用293-0RF6細(xì)胞時最高。類似地，以MOT為I在293-0RF6細(xì)胞上產(chǎn)生病毒子代至少與在猴細(xì)胞系BSC-I上一樣高效(圖2B)。在一些情況下，與BSC-I細(xì)胞相比，從293-0RF6細(xì)胞產(chǎn)生10至1，000倍更多的病毒子代。相反，猴腺病毒在293細(xì)胞上復(fù)制比在BSC-I細(xì)胞上復(fù)制的效率低。因此，El和E40RF6的存在克服了人細(xì)胞中的宿主復(fù)制阻斷。這用SV-I得到進(jìn)ー步證實，當(dāng)在293-0RF6細(xì)胞上生長時，所述SV-I在純化后產(chǎn)生90，090個顆粒/細(xì)胞。最后，感染性子代在293-0RF6細(xì)胞上的產(chǎn)生比在BSC-I細(xì)胞上的產(chǎn)生高多達(dá)1，000倍，從而表明猴腺病毒在表達(dá)El和E40RF6的人細(xì)胞上的生長顯著地大于建議用于猴腺病毒生長的天然宿主細(xì)胞系上的生長。總之，猴腺病毒的蝕斑形成效率分析和單次裂解生長分析表明，猴腺病毒可以在293-0RF6細(xì)胞中高效復(fù)制，并且人腺病毒組分(Ad5El和E40RF6)的組合表達(dá)克服了人復(fù)制阻斷。另外，用8種猴腺病毒(相當(dāng)大的該組代表)證明了這一點。實施例3該實施例顯示在具有人腺病毒組分的人細(xì)胞系上構(gòu)建和增殖帶有El缺失的猴腺病毒載體。已將來自3個不同物種(綠長尾猴、食蟹猴和恒河猴)的7種不同猴腺病毒的El區(qū)替換為表達(dá)盒。本文所用的猴腺病毒是來自ATCC的SV-I、SV-7、SV-II、SV-16、SV-18、SV-38和SV-39。為有助于左ITR至Ela啟動子的克隆，測定pIX啟動子區(qū)和緊鄰野生型病毒右ITR的序列。設(shè)計El缺失以使Ela啟動子和El蛋白失活，但是保留pIX病毒啟動子、病毒包裝信號和復(fù)制起點。這些序列的同一性通過它們與已知腺病毒基因組的同源性確定，并且可以使用可公開獲得的軟件(例如在伯克利果蠅基因組計劃、國家中心生物技術(shù)信息和蛋白質(zhì)分析專家系統(tǒng)處找得到的軟件)鑒定。通常，El缺失始于Ela啟動子TATA框的5'的50堿基對(bp)內(nèi)并且終于pIX啟動子的5'的50至300bp。這些僅是其中可以產(chǎn)生缺失的實例，因為可以根據(jù)病毒載體的用途改變?nèi)笔?。例如，對于源自SV-38的載體，El缺失保留Ela啟動子的大部分，表明為了構(gòu)建體腺病毒載體，不需要完全移除Ela啟動子。雖然存在構(gòu)建此類病毒的多種方式，但是它基本上包括兩個步驟。在細(xì)菌中產(chǎn)生期望的病毒載體基因組，隨后將所述基因組轉(zhuǎn)染入293-0RF6細(xì)胞以產(chǎn)生病毒顆粒。圖3中概括出在細(xì)菌中產(chǎn)生病毒載體基因組的一般方法或該方法的較小變形。使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建穿梭質(zhì)粒，其包含病毒ITR(點畫框)、包裝信號(W)、替換El區(qū)的表達(dá)盒和pIX序列，此后是病毒右ITR。這個實施例中的表達(dá)盒由CMV啟動子(箭頭)、開放閱讀框(orf)和SV40多腺苷酸化信號(SV)組成。表達(dá)盒的方向和組成是說明性的并且不意在限定。該質(zhì)粒優(yōu)選地含有低拷貝數(shù)細(xì)菌復(fù)制起點如P15，不過也可以使用其他復(fù)制起點。納入提供對抗生素的耐藥性(如卡那霉素耐藥性(Kan r))的基因例如可用于選擇攜帯該質(zhì)粒的細(xì)菌。為構(gòu)建腺病毒載體基因組，通過同源重組將病毒基因組從PlX至右ITR的剰余部分克隆至穿梭質(zhì)粒中。為實現(xiàn)這種克隆，將重組感受態(tài)細(xì)菌如BJ5183用約50ng以核酸內(nèi)切酶在pIX和右ITR之間限制性消化的穿梭質(zhì)粒和IOOng純化的病毒基因組同時轉(zhuǎn)化。優(yōu)選在穿梭質(zhì)粒和用于重組的病毒基因組(X)的每個pIX和右ITR之間具有至少50bp的同源性。存在本領(lǐng)域已知的眾多方法來鑒定具有克隆的腺病毒載體基因組的細(xì)菌，包括限制性消化法、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和DNA測序。病毒六鄰體基因的測序例如可以用來進(jìn)ー步證實腺病毒的身份。使用與以下六鄰體序列的同源性來進(jìn)ー步證實腺病毒及其衍生物的身份SV-I (SEQ ID NO:22) ；SV-7(SEQ ID NO: 23) ；SV-11(SEQ ID NO :24) ； SV-16(SEQ ID NO :25) ；SV-18(SEQ ID NO :26) ； SV-38(SEQ ID NO :27) ； SV-39(SEQID N0:28)。一旦已經(jīng)鑒定到病毒載體基因組，則使用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化從其中擴(kuò)增和純化該質(zhì)粒的Re,細(xì)菌菌株，如DH10B。其次，如下實施第二步驟，從基因組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化(拯救)出感染性病毒。用限制性酶消化基因組質(zhì)粒以從質(zhì)粒骨架釋放兩個ITR，由苯酚氯仿異戊醇提取和こ醇沉淀法純化，并且重懸于IOmM Tris,lmM EDTA(pH 8.0)中。隨后采用Polyfect試劑(Qiagen)，以51^消化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293-01^6細(xì)胞系，約1.5\106個細(xì)胞/60111111平板。轉(zhuǎn)染后5日，收獲細(xì)胞，經(jīng)歷3次凍融循環(huán)，并且使細(xì)胞裂解物在新鮮的細(xì)胞上傳代。使細(xì)胞-病毒裂解物以這種方式以3至5日間隔連續(xù)傳代直至觀察到充分的細(xì)胞病變效應(yīng)(c.p. e)。如在'jail J G %, Rescue and production of vaccine and therapeutic adenovirusvectors expressing inhibitory transgenes. Mol Biotechnol. 35(3) :263-73(2007), PubMed PMID: 37652790中所描述的，從感染的細(xì)胞產(chǎn)生純化的腺病毒原液。簡而言之，收集感染的細(xì)胞并且棄去培養(yǎng)基。將細(xì)胞在25mM Tris (pH 7. 5)、75mM NaCl、5mM MgCl2的緩沖液中通過3次凍融循環(huán)裂解并且用Benzonase㊣以100單位/mL在室溫下處理過夜。進(jìn)行氯化銫等密度梯度離心并且如 Mittereder, N.等，Evaluation of the concentration andbioactivity of adenovirus vectors for gene therapy. J. Virol. 70:7498-7509(1996)中所描述的，通過在260nm處的吸光度確定總粒子單位滴度。如在Gall J G等Rescueand production oi vaccine and therapeutic adenovirus vectors expressinginhibitory transgenes. Mol Biotechnol.35 (3):263-73(2007), PubMed PMID:37652790 ；和 Lemiale F 等,Novel adenovirus vaccine vectors based on the enteric-tropicserotype 41. Vaccine 25(11):2074-84 (2007)，2006 年 11 月 28 電子出版 PubMedPMID: 17250935, PubMed Central PMCID:PMC2584667 中所描述的，在用 Ad2六鄰體抗體的熒光聚焦單位(FFU)測定法中確定活性粒子滴度。病毒制備物具有高品質(zhì)，總顆粒與感染性顆粒平均比是49+/-23 (n=6)，并且產(chǎn)率高，純化后每個細(xì)胞多達(dá)37，000個顆粒。通過部分DNA測序和診斷性PCR證實每種病毒的身份。通過蛋白質(zhì)印跡分析證實表達(dá)盒的功能性。以下顯示了用來產(chǎn)生本文所述的和圖3中的拯救穿梭質(zhì)粒的病毒序列的身份。全部序列以標(biāo)準(zhǔn)病毒基因組從左至右的方向給出。在標(biāo)準(zhǔn)病毒基因組中，El區(qū)位于病毒基因組的左側(cè)。包含左側(cè)ITR、包裝信號但是缺少完整Ela啟動子的序列稱作“左側(cè)序列”。pIX區(qū)中用于同源重組的序列稱作“PlX區(qū)序列”。由用于同源重組的右ITR的部分組成的序列稱作“右側(cè)序列”。全部序列以標(biāo)準(zhǔn)的5'至3'方向給出。SV-I :左側(cè)序列(SEQ ID NO: I) ;pIX區(qū)序列(SEQ ID NO: 2);右側(cè)序列(SEQ IDNO:3)。SV-7:左側(cè)序列(SEQ ID NO:4) ;pIX區(qū)序列(SEQ ID NO:5);右側(cè)序列(SEQ IDNO:6)。SV-Il :左側(cè)序列(SEQ ID N0:7) ;pIX 區(qū)序列(SEQ ID NO: 8);右側(cè)序列(SEQID NO:9)。 SV-16 :左側(cè)序列(SEQ ID NO: 10) ;pIX區(qū)序列(SEQ ID NO: 11);右側(cè)序列(SEQID NO:12)。SV-18 :左側(cè)序列(SEQ ID NO: 13) ;pIX區(qū)序列(SEQ ID NO: 14);右側(cè)序列(SEQID NO:15)。SV-38:左側(cè)序列(SEQ ID NO: 16) ;pIX區(qū)序列(SEQ ID NO: 17);右側(cè)序列(SEQID NO:18)。SV-39:左側(cè)序列(SEQ ID NO: 19) ;pIX區(qū)序列(SEQ ID NO:20);右側(cè)序列(SEQID N0:21)。實施例4該實施例顯示缺失El區(qū)序列的猴腺病毒是復(fù)制缺陷型的。將El-缺失如實施例3中所描述的那樣工程化至猴腺病毒SAV7、SAVll和SAV16中。設(shè)計El-缺失以移去ElA的啟動子、全部ElA編碼區(qū)、ElB啟動子、E1B21K蛋白質(zhì)同源物編碼區(qū)、ElB 55K同源物編碼區(qū)5'末端的大部分。另外，將如在實施例3和Gall J G等Rescue and production oi vaccine and therapeutic adenovirus vectors expressinginhibitory transgenes. Mol Biotechnol. 35(3):263-73(2007)，PubMed PMID:17652790中所描述的沒有所編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達(dá)盒插入El缺失的位置內(nèi)。為確定這些序列的移除是否改變病毒的復(fù)制，用所述病毒感染猴細(xì)胞并且測量感染性病毒子代。使用兩個猴源細(xì)胞系，并且它們被供應(yīng)商(ATCC)推薦用于增殖猴腺病毒。LC-MK2細(xì)胞系是來自恒河猴(Macaca mu I lata)的腎細(xì)胞系，并且BSC-1細(xì)胞系是來自非洲綠猴(Cercopithectisaethiops)的腎細(xì)胞系。用每種El缺失型和野生型腺病毒的100個顆粒/細(xì)胞感染以6孔平板每孔3X IO5個細(xì)胞接種的所述細(xì)胞系的貼壁培養(yǎng)物。感染后72和96小時(hpi)，收集細(xì)胞和培養(yǎng)基并且進(jìn)行3次凍融循環(huán)(在干冰上冷凍約10分鐘，在37°C水浴中融化約10分鐘)以裂解細(xì)胞。在如在Gall J G等，Rescue and production ofvaccine ana tnerapeutic adenovirus vectors expressing inhibitory transgenes.Mol Biotechnol. 35(3) :263-73 (2007) ,PubMed PMID: 37652790.;和 Lemiale F 等，Noveladenovirus vaccine vectors based on the enteric-tropic serotype 41.Vaccine25(11):2074-84(2007), 2006 年 11 月 28 電子出版 PubMed PMID:17250935，PubMedCentral PMCID:PMC2584667中所描述的熒光聚焦單位(FFU)測定法中測定細(xì)胞裂解物的感染性病毒。在產(chǎn)生自用野生型病毒感染的細(xì)胞的裂解物中存在高滴度的病毒子代(表2);因此該細(xì)胞培養(yǎng)物是可容許猴腺病毒的。重要的是，采用25，32525，875FFU/mL(每個顯微鏡視野最少5個轉(zhuǎn)化灶，每個細(xì)胞培養(yǎng)物孔1013個視野，并且裂解物未稀釋)的測定定量限，沒有在來自用El缺失型猴腺病毒感染的細(xì)胞的裂解物中檢測到子代病毒粒子。比較用每種血清型的野生型病毒所實現(xiàn)的最大滴度與所述定量限，顯示了 SAV7的復(fù)制減少至少19，348倍；SAV11的復(fù)制減少至少10，266倍；并且SAV16的復(fù)制減少至少5，133倍。此外，進(jìn)ー步降低分析限至檢測限5FFU/mL時，沒有在用來自無效病毒感染中的裂解物所感染的孔內(nèi)觀察到轉(zhuǎn)化灶。比較以每種血清型的野生型病毒所實現(xiàn)的最大滴度與所述檢測限，確立了 SAV7、SAVll和SAV16的復(fù)制分別減少9. 8X IO7倍、5. 2X IO7倍和2. 6X IO7倍。因此，具有El缺失的猴腺病毒是復(fù)制缺陷型的。表2 :病毒子代的產(chǎn)生(FFU/mL).
權(quán)利要求
1.一種增殖猴腺病毒的方法，所述方法包括使細(xì)胞與所述猴腺病毒接觸，其中所述細(xì)胞表達(dá)由人腺病毒ElA區(qū)和ElB區(qū)中一者或兩者編碼的基因產(chǎn)物和由基本上由人腺病毒E40RF6組成的E4區(qū)的部分編碼的基因產(chǎn)物，由此所述猴腺病毒在所述細(xì)胞中增殖。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述人腺病毒是種類C人腺病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述E4區(qū)的部分是E40RF6o
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述細(xì)胞是HEK-293細(xì)胞或PerC.6細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述猴腺病毒是復(fù)制缺陷型的。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述猴腺病毒需要所述腺病毒基因組的ElA區(qū)、ElB區(qū)和E4區(qū)中一者或多者的互補(bǔ)作用以用于增殖。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述猴腺病毒包含在所述腺病毒基因組的El區(qū)內(nèi)的缺陷和E4區(qū)的至少一部分內(nèi)的缺陷。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述猴腺病毒還包含在所述腺病毒基因組的E3區(qū)內(nèi)的缺陷。
10.一種增殖猴腺病毒的方法，所述方法包括使細(xì)胞與所述猴腺病毒接觸，其中所述猴腺病毒包含編碼人腺病毒的一種或多種基因產(chǎn)物的核酸序列，其中所述一種或多種基因產(chǎn)物包括由負(fù)責(zé)減輕或克服人細(xì)胞中宿主復(fù)制阻斷的E4區(qū)的一部分編碼的基因產(chǎn)物，所述部分基本上由E40RF6組成，并且由此所述猴腺病毒在所述細(xì)胞中增殖。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述猴腺病毒包含編碼種類C人腺病毒基因產(chǎn)物的核酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述一種或多種基因產(chǎn)物包括由人腺病毒的ElA區(qū)和ElB區(qū)中一者或兩者編碼的基因產(chǎn)物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述E4區(qū)的部分是E40RF6。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述細(xì)胞是HEK-293細(xì)胞或PerC.6細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求10-15中任一項所述的方法，其中所述猴腺病毒是復(fù)制缺陷型的。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述猴腺病毒需要所述腺病毒基因組的ElA區(qū)、ElB區(qū)和E4區(qū)中一者或多者的互補(bǔ)作用以用于增殖。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述猴腺病毒包含在所述腺病毒基因組的El區(qū)內(nèi)的缺陷和E4區(qū)的至少一部分內(nèi)的缺陷。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述猴腺病毒還包含在所述腺病毒基因組的E3區(qū)內(nèi)的缺陷。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于在包括人細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞中增殖猴腺病毒的方法，所述細(xì)胞包含從人腺病毒分離的一種或多種基因產(chǎn)物。另外，提供了用于增殖的方法，其中所述猴腺病毒包含編碼人腺病毒基因產(chǎn)物的核酸序列。本發(fā)明還提供了通過此類增殖方法獲得的猴腺病毒，包括復(fù)制缺陷型猴腺病毒。
文檔編號A61K35/76GK102770146SQ201080061001
公開日2012年11月7日 申請日期2010年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月9日
發(fā)明者克里斯多夫·卡爾, 詹森·加爾, 道格拉斯·布拉夫, 鄧肯·麥克維伊 申請人:金維克有限公司