專利名稱：內(nèi)皮因子抗體的制作方法
內(nèi)皮因子抗體交叉引用
本申請要求2009年9月30日提交的美國臨時申請?zhí)?1/247，290和2010年3月31日提交的美國非臨時申請?zhí)?2/751,907的權(quán)益，它們二者的公開內(nèi)容通過引用整體并入本文。
背景技術(shù)：
內(nèi)皮因子(除了別的以外，也稱作⑶105或edg-1)是在增殖中的血管內(nèi)皮細(xì)胞中高水平表達(dá)的I型同源二聚膜糖蛋白(Burrows等人，1995，Clin. Cancer Res.1:1623-1634)。因此，內(nèi)皮因子主要是進(jìn)行活躍的血管生成的內(nèi)皮細(xì)胞的增殖相關(guān)標(biāo)志物。但是，內(nèi)皮因子的有些表達(dá)是通過正常組織的血管內(nèi)皮(Burrows等人，同上；Wang等人，1993，Int. J. Cancer 54:363-370)。已知人內(nèi)皮因子會特異性地結(jié)合轉(zhuǎn)化生長因子-3(TGF-P)，并且內(nèi)皮因子的推論氨基酸序列與￠-聚糖(TGF-0受體的一種類型)具有強同源性。在基于抗體的減少腫瘤脈管系統(tǒng)的方法中，已經(jīng)靶向內(nèi)皮因子(EDG)，因為EDG是在內(nèi)皮和白血病細(xì)胞上的一種增殖相關(guān)的抗原。在腫瘤相關(guān)的血管內(nèi)皮中，它的表達(dá)被增量調(diào)節(jié)，且對血管生成而言是必需的。血管生成包括導(dǎo)致新生血管形成的新毛細(xì)血管形成，以及現(xiàn)有脈管系統(tǒng)的維持。它是一個復(fù)雜的過程，包括一系列連續(xù)步驟，所述步驟包括血管基膜和間質(zhì)基質(zhì)的內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的降解，內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，以及通過內(nèi)皮細(xì)胞形成毛細(xì)血管袢。已經(jīng)描述了幾種抗-內(nèi)皮因子抗體，尤其是抗-內(nèi)皮因子單克隆抗體(“mAb”XmAbSN6是用人白血病細(xì)胞的細(xì)胞膜的糖蛋白混合物免疫小鼠所生成的抗體(Haruta和Seon，1986，Proc. Natl. Acad. Sci. 83:7898_7902XSN6是一種識別人內(nèi)皮因子的鼠mAboinAb44G4是用人前-B白血病細(xì)胞的全細(xì)胞懸浮液免疫小鼠所生成的抗體(Gougos和Letarte，1988， J. Immunol. 141:1925-1933; 1990， J. Biol. Chem. 265:8361-8364)。 44G4 也是一種識別人內(nèi)皮因子的鼠mAb。mAb MJ7/18是用發(fā)炎的小鼠皮膚免疫大鼠所生成的抗體(Ge和Butcher, 1994，同上)。MJ7/18也是一種識別鼠內(nèi)皮因子的mAb。mAb Tec-Il是用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞免疫小鼠所生成的抗體(Burrows等人，1995，Clin. Cancer Res.1:1623-1634)。Tec-Il是一種具有限于人內(nèi)皮因子的反應(yīng)性的鼠mAb。針對內(nèi)皮因子的抗體代表用于治療多種疾病和病癥(它們涉及血管生成，受血管生成的影響)的療法的發(fā)展的一個重要領(lǐng)域。血管生成是從現(xiàn)有血管形成新血管的生理過程(Varner，等人，Cell Adh. Commun. 1995, 3:367-374; Blood,等人，Biochim. Biophys. Acta. 1990,1032:89-118; Weidner,等人，J. Natl. Cancer Inst. 1992，84:1875-1887)。已經(jīng)提出，血管生成在正常過程和病理過程中都起作用。例如，血管生成過程涉入動物器官和組織的血管系統(tǒng)的發(fā)育。這些過程也涉入血管生成的暫時相，例如，在月經(jīng)周期中，在妊娠中，和在傷口愈合中。另一方面，已知許多疾病與失調(diào)的血管生成有關(guān)。
在某些病理狀態(tài)下，血管生成受到刺激，作為為受累組織內(nèi)的細(xì)胞提供充足的血液和營養(yǎng)物供給的方式。許多這樣的病理狀態(tài)包括異常的細(xì)胞增殖和/或調(diào)節(jié)。因此，血管生成的抑制是治療特征在于新血管形成的疾病的潛在有用方案。例如，血管生成涉入的病理狀態(tài)包括不同形式的特征在于血管生成/新生血管形成的眼疾病和非眼疾病(例如，黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變)、糖尿病腎病、慢性炎性疾病(例如，IBD)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎和不同形式的癌癥、實體瘤和轉(zhuǎn)移灶等。

發(fā)明內(nèi)容
本文提供了一種結(jié)合內(nèi)皮因子的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段。這樣的抗體具有體外和體內(nèi)純化、檢測、診斷和 治療用途。本文也提供了這樣的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段其結(jié)合內(nèi)皮因子的一種或多種物質(zhì)或變體，并抑制血管生成。本文另外提供了用結(jié)合內(nèi)皮因子的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段治療血管生成相關(guān)疾病的方法。本文所述的結(jié)合內(nèi)皮因子的人源化抗體和抗原結(jié)合片段可以用于治療或預(yù)防黃斑變性、脈絡(luò)膜新血管生成(CNV)、糖尿病視網(wǎng)膜病變或增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變。本文描述了通過施用本文所述的抗體和抗原結(jié)合片段來治療或預(yù)防黃斑變性、CNV、糖尿病視網(wǎng)膜病變或增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變的方法。本文所述的結(jié)合內(nèi)皮因子的人源化抗體和抗原結(jié)合片段也可以收縮血管、抑制與眼病有關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、清除出血的征狀、治療視力模糊、提供視力損失的停滯和/或防止血管的滲漏。本文所述的人源化抗體和抗原結(jié)合片段也可以用于藥物中，所述藥物用于治療黃斑變性、CNV、糖尿病視網(wǎng)膜病變或增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變。本文所述的人源化抗體和抗原結(jié)合片段也可以用于治療癌癥用的藥物中。本文提供了一種抗體或其抗原結(jié)合片段，其具有具有如SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。本文提供了一種結(jié)合內(nèi)皮因子的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含具有如SEQ IDNO: 3所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和具有如SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，其中，所述重鏈可變區(qū)另外包含一個或多個選自下述的修飾用丙氨酸(A)置換在位置49處的甘氨酸(G);用絲氨酸(S)置換在位置76處的天冬酰胺(N);用精氨酸(R)置換在位置77處的蘇氨酸(T);用纈氨酸(V)置換在位置78處的亮氨酸(L);用異亮氨酸(I)置換在位置82a處的天冬酰胺(N);用異亮氨酸(I)或亮氨酸(L)置換在位置89處的纈氨酸(V);用精氨酸(R)或甘氨酸(G)置換在位置94處的蘇氨酸(T);用蘇氨酸(T)置換在位置108處的亮氨酸(L);用亮氨酸(L)置換在位置109處的纈氨酸(V);和用丙氨酸(A)置換在位置113處的絲氨酸(S)，其中使用Kabat編號系統(tǒng)；且所述輕鏈可變區(qū)另外包含一個或多個選自下述的修飾用谷氨酰胺(Q)置換在位置I處的天冬氨酸(D);用纈氨酸(V)置換在位置3處的谷氨酰胺(Q);用亮氨酸(L)置換在位置4處的甲硫氨酸(M);用絲氨酸(S)置換在位置5處的蘇氨酸(T);用苯丙氨酸(F)置換在位置36處的酪氨酸(Y);用脯氨酸(P)置換在位置46處的亮氨酸(L);用色氨酸(W)置換在位置47處的亮氨酸(L);用纈氨酸(V)或丙氨酸(A)置換在位置60處的絲氨酸(S);用絲氨酸(S)置換在位置70處的天冬氨酸(D);用酪氨酸(Y)置換在位置71處的苯丙氨酸(F);用丙氨酸(A)置換在位置100處的谷氨酰胺(G);和用亮氨酸(L)置換在位置106處的異亮氨酸(I),其中使用Kabat編號系統(tǒng)。本文提供了一種結(jié)合內(nèi)皮因子的抗體或其抗原結(jié)合片段，其具有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，
其中所述重鏈可變區(qū)包含
(i)SEQ ID NO: 66 的 CDRl、SEQ ID NO: 67 的 CDR2 和 SEQ ID NO: 68 的 CDR3 ；
(ii)重鏈FRl，其具有SEQID NO: 44的氨基酸序列或包含一個或多個保守置換的SEQID NO: 44的氨基酸序列；
(iii)重鏈FR2，其具有SEQID NO: 45的氨基酸序列或包含丙氨酸(A)對位置49處的甘氨酸(G)的置換的SEQ ID NO: 45的氨基酸序列，其中使用Kabat編號系統(tǒng)；和
(iv)重鏈FR3，其具有SEQID NO: 47的氨基酸序列或包含一個或多個選自下述的置換的SEQ ID NO: 47的氨基酸序列
Ca)用絲氨酸(S)置換在位置76處的天冬酰胺(N)；
(b)用精氨酸(R)置換在位置77處的蘇氨酸(T)；
(c)用纈氨酸(V)置換在位置78處的亮氨酸(L)；
Cd)用異亮氨酸(I)置換在位置82a處的天冬酰胺(N)；
Ce)用異亮氨酸(I)或亮氨酸(L)置換在位置89處的纈氨酸(V);和(f)用精氨酸(R)或甘氨酸(G)置換在位置94處的蘇氨酸(T)，其中使用Kabat編號系統(tǒng)；和
(V)重鏈FR4，其具有SEQ ID NO: 56的氨基酸序列或包含一個或多個選自下述的置換的SEQ ID NO: 56的氨基酸序列
Ca)用蘇氨酸(T)置換在位置108處的亮氨酸(L)；
(b)用亮氨酸(L)置換在位置109處的纈氨酸(V);和
(C)用丙氨酸(A)置換在位置113處的絲氨酸(S)，其中使用Kabat編號系
統(tǒng)；
且所述輕鏈可變區(qū)包含
(i)SEQ ID NO: 63 的 CDRl、SEQ ID NO: 64 的 CDR2 和 SEQ ID NO: 65 的 CDR3 ；
(ii)輕鏈FRl，其具有SEQID NO: 6的氨基酸序列或包含一個或多個選自下述的置換的SEQ ID NO: 6的氨基酸序列
Ca)用谷氨酰胺(Q)置換在位置I處的天冬氨酸(D)；
(b)用纈氨酸(V)置換在位置3處的谷氨酰胺(Q)；
(c)用亮氨酸(L)置換在位置4處的甲硫氨酸(M);和
(d)用絲氨酸(S)置換在位置5處的蘇氨酸(T);其中使用Kabat編號系統(tǒng)；
和
(iii)輕鏈FR2，其具有SEQID NO: 20的氨基酸序列或包含一個或多個選自下述的置換的SEQ ID NO: 20的氨基酸序列
Ca)用苯丙氨酸(F)置換在位置36處的酪氨酸(Y)；
(b)用脯氨酸(P)置換在位置46處的亮氨酸(L);和(C)用色氨酸(W)置換在位置47處的亮氨酸(L),其中使用Kabat編號系
統(tǒng)；和
(iv)輕鏈FR3，其具有SEQID NO: 28的氨基酸序列或包含一個或多個選自下述的置換的SEQ ID NO: 28的氨基酸序列(a)用纈氨酸(V)或丙氨酸(A)置換在位置60處的絲氨酸(S)；
(b)用絲氨酸(S)置換在位置70處的天冬氨酸(D);和
(b)用酪氨酸(Y)置換在位置71處的苯丙氨酸(F)，其中使用Kabat編號系
統(tǒng)；和
(V)輕鏈FR4，其具有SEQ ID NO: 35的氨基酸序列或包含一個或多個選自下述的置換的SEQ ID NO: 35的氨基酸序列
Ca)用丙氨酸(A)置換在位置100處的甘氨酸(G);和
(b)用亮氨酸(L)置換在位置106處的異亮氨酸(I)，其中使用Kabat編號系統(tǒng)。本文提供了一種抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含具有如SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。本文提供了一種結(jié)合內(nèi)皮因子的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含具有如SEQ IDNO: 4所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和具有如SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，其中，所述重鏈可變區(qū)另外包含一個或多個選自下述的修飾用丙氨酸(A)置換在位置49處的甘氨酸(G);用絲氨酸(S)置換在位置76處的天冬酰胺(N);用精氨酸(R)置換在位置77處的蘇氨酸(T);用纈氨酸(V)置換在位置78處的亮氨酸(L);用異亮氨酸(I)置換在位置82a處的天冬酰胺(N);用異亮氨酸(I)或亮氨酸(L)置換在位置89處的纈氨酸(V);用蘇氨酸(T)或甘氨酸(G)置換在位置94處的精氨酸(R);用蘇氨酸(T)置換在位置108處的亮氨酸(L);用亮氨酸(L)置換在位置109處的纈氨酸(V);和用丙氨酸(A)置換在 位置113處的絲氨酸(S)，其中使用Kabat編號系統(tǒng)；且所述輕鏈可變區(qū)另外包含一個或多個選自下述的修飾用谷氨酰胺(Q)置換在位置I處的天冬氨酸(D);用纈氨酸(V)置換在位置3處的谷氨酰胺(Q);用亮氨酸(L)置換在位置4處的甲硫氨酸(M);用絲氨酸(S)置換在位置5處的蘇氨酸(T);用苯丙氨酸(F)置換在位置36處的酪氨酸(Y);用亮氨酸(L)置換在位置46處的脯氨酸(P);用亮氨酸(L)置換在位置47處的色氨酸(W);用纈氨酸(V)或丙氨酸(A)置換在位置60處的絲氨酸(S);用絲氨酸(S)置換在位置70處的天冬氨酸(D);用苯丙氨酸(F)置換在位置71處的酪氨酸(Y);用丙氨酸(A)置換在位置100處的谷氨酰胺(G);和用亮氨酸(L)置換在位置106處的異亮氨酸(I),其中使用Kabat編號系統(tǒng)。本文提供了一種結(jié)合內(nèi)皮因子的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，
其中所述重鏈可變區(qū)包含
(i)SEQ ID NO: 66 的 CDRl、SEQ ID NO: 67 的 CDR2 和 SEQ ID NO: 68 的 CDR3 ；
(ii)重鏈FRl，其具有SEQID NO: 44的氨基酸序列或包含一個或多個保守置換的SEQID NO: 44的氨基酸序列；
(iii)重鏈FR2，其具有SEQID NO: 45的氨基酸序列或包含丙氨酸(A)對位置49處的甘氨酸(G)的置換的SEQ ID NO: 45的氨基酸序列，其中使用Kabat編號系統(tǒng)；和
(iv)重鏈FR3，其具有SEQID NO: 47的氨基酸序列或包含一個或多個選自下述的置換的SEQ ID NO: 47的氨基酸序列
Ca)用絲氨酸(S)置換在位置76處的天冬酰胺(N)；
(b)用精氨酸(R)置換在位置77處的蘇氨酸(T)；(C)用纈氨酸(V)置換在位置78處的亮氨酸(L)；
Cd)用異亮氨酸置換在位置82a處的天冬酰胺(N)；
Ce)用異亮氨酸(I)或亮氨酸(L)置換在位置89處的纈氨酸(V);和(f)用蘇氨酸(T)或甘氨酸(G)置換在位置94處的精氨酸(R)，其中使用Kabat編號系統(tǒng)；和
(V)重鏈FR4，其具有SEQ ID NO: 56的氨基酸序列或包含一個或多個選自下述的置換的SEQ ID NO: 56的氨基酸序列
Ca)用蘇氨酸(T)置換在位置108處的亮氨酸(L)；
(b)用亮氨酸(L)置換在位置109處的纈氨酸(V);和
(C)用丙氨酸(A)置換在位置113處的絲氨酸(S)，其中使用Kabat編號系
統(tǒng)；
且所述輕鏈可變區(qū)包含
(i)SEQ ID NO: 63 的 CDRl、SEQ ID NO: 64 的 CDR2 和 SEQ ID NO: 65 的 CDR3 ；
(ii)輕鏈FRl，其具有SEQID NO: 6的·氨基酸序列或包含一個或多個選自下述的置換的SEQ ID NO: 6的氨基酸序列
Ca)用谷氨酰胺(Q)置換在位置I處的天冬氨酸(D)；
(b)用纈氨酸(V)置換在位置3處的谷氨酰胺(Q)；
(c)用亮氨酸(L)置換在位置4處的甲硫氨酸(M);和
(d)用絲氨酸(S)置換在位置5處的蘇氨酸(T);其中使用Kabat編號系統(tǒng)；
和
(iii)輕鏈FR2，其具有SEQID NO: 21的氨基酸序列或包含一個或多個選自下述的置換的SEQ ID NO: 20的氨基酸序列
Ca)用苯丙氨酸(F)置換在位置36處的酪氨酸(Y)；
(b)用亮氨酸(L)置換在位置46處的脯氨酸(P);和(C)用亮氨酸(L)置換在位置47處的色氨酸(W),其中使用Kabat編號系
統(tǒng)；和
(iv)輕鏈FR3，其具有SEQID NO: 29的氨基酸序列或包含一個或多個選自下述的置換的SEQ ID NO: 28的氨基酸序列
Ca)用纈氨酸(V)或丙氨酸(A)置換在位置60處的絲氨酸(S)；
(b)用絲氨酸(S)置換在位置70處的天冬氨酸(D);和
(b)用苯丙氨酸(F)置換在位置71處的酪氨酸(Y)，其中使用Kabat編號系
統(tǒng)；和
(V)輕鏈FR4，其具有SEQ ID NO: 35的氨基酸序列或包含一個或多個選自下述的置換的SEQ ID NO: 35的氨基酸序列
Ca)用丙氨酸(A)置換在位置100處的甘氨酸(G);和
(b)用亮氨酸(L)置換在位置106處的異亮氨酸(I)，其中使用Kabat編號系統(tǒng)。本文提供了一種抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含具有如SEQ ID NO: 93所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(VKlAA)和具有如SEQ ID NO: 89所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(VH1A2)。本文提供了一種結(jié)合內(nèi)皮因子的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含具有如SEQ IDNO: 89所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有如SEQ ID NO: 93所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，其中
(i )所述重鏈可變區(qū)另外包含一個或多個選自下述的修飾用丙氨酸(A)或絲氨酸(S)置換在位置49處的甘氨酸(G);用異亮氨酸(I)置換在位置51處的丙氨酸(A);用精氨酸(R)或天冬酰胺(Q)置換在位置52b處的賴氨酸(K);用纈氨酸(V)置換在位置78處的亮氨酸(L),其中使用Kabat編號系統(tǒng)；和
(ii)所述輕鏈可變區(qū)另外包含一個或多個選自下述的修飾用亮氨酸(L)置換在位置 4處的甲硫氨酸(M);用纈氨酸(V)置換在位置19處的丙氨酸(A);用絲氨酸(S)置換在位置22處的蘇氨酸(T);用異亮氨酸(I)置換在位置48處的丙氨酸(A);和用絲氨酸(S)置換在位置51處的蘇氨酸(T)，其中使用Kabat編號系統(tǒng)。本文提供了根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含具有如SEQID NO: 88、89、90、91或92所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和具有如SEQ ID NO: 93、94、
95、96、97、100、102或103所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在一個方面，本文所述的抗體和抗原結(jié)合片段是人源化的，且可以是任意同種型。在本文中也包括AVIMER、雙體和重鏈二聚體(包括駱駝類和鯊魚重鏈構(gòu)建體)。術(shù)語“抗體的抗原結(jié)合部分”、“抗原結(jié)合片段”、“抗原-結(jié)合域”、“抗體片段”或“抗體的功能片段”在本文中互換地用于表示，抗體的保留特異性地結(jié)合抗原的能力的一個或多個片段。被包括在這樣的術(shù)語內(nèi)的抗體片段的非限制性實例包括、但不限于(i) Fab片段，即由\、VH、(^和Cm結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii)F(ab’)2片段，即含有通過在鉸鏈區(qū)處的二硫鍵相連的2個Fab片段的二價片段；(iii)由Vh和Chi結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)Fv片段,其含有抗體的單條臂的Vlj和Vh結(jié)構(gòu)域；(v)dAb片段(Ward等人，(1989) Nature341:544 546)，其含有Vh結(jié)構(gòu)域；和(vi)分離的⑶R。在該定義中另外包括“一半”抗體，其包括單個重鏈和單個輕鏈。在本文中也包括其它形式的單鏈抗體，諸如雙體?？乖Y(jié)合片段可以是本文所述的那些中的任一種，包括、但不限于，F(xiàn)ab片段、Fab’、F(ab’ )2片段、Fv片段(包括非共價地和共價地連接的Fv片段)、scFv片段、單鏈結(jié)合多肽、Fd片段、Fv片段或dAb片段。在一個非限制性實施方案中，所述抗原結(jié)合片段是scFv,其可以任選地進(jìn)一步與抗體的人Fe部分融合。在一個非限制性實施方案中，所述結(jié)合內(nèi)皮因子的抗體或其抗原結(jié)合片段包含具有如SEQ ID NO: 41、42或43所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有如SEQ ID NO: 3、4或5所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在另一個非限制性實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含具有如SEQ IDNO: 41所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在另一個非限制性實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含具有如SEQ IDNO: 41所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在另一個非限制性實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含具有如SEQ IDNO: 41所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有如SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在另一個非限制性實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含具有如SEQ IDNO: 42所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在另一個非限制性實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含具有如SEQ IDNO: 42所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在另一個非限制性實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含具有如SEQ IDNO: 42所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有如SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
在另一個非限制性實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含具有如SEQ IDNO: 43所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在另一個非限制性實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含具有如SEQ IDNO: 43所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在另一個非限制性實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含具有如SEQ IDNO: 43所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有如SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在另一個非限制性實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段的重鏈可變區(qū)另外包含一個或多個選自下述的修飾用絲氨酸(S)置換在位置76處的天冬酰胺(N);用精氨酸(R)置換在位置77處的蘇氨酸(T);用異亮氨酸(I)置換在位置82a處的天冬酰胺(N);用異亮氨酸(I)或亮氨酸(L)置換在位置89處的纈氨酸(V);用甘氨酸(G)置換在位置94處的蘇氨酸(T);用蘇氨酸(T)置換在位置108處的亮氨酸(L);用亮氨酸(L)置換在位置109處的纈氨酸(V);和用丙氨酸(A)置換在位置113處的絲氨酸(S);且所述輕鏈可變區(qū)另外包含一個或多個選自下述的修飾用谷氨酰胺(Q)置換在位置I處的天冬氨酸(D);用纈氨酸(V)置換在位置3處的谷氨酰胺(Q);用絲氨酸(S)置換在位置5處的蘇氨酸(T);用苯丙氨酸(F)置換在位置36處的酪氨酸(Y);用纈氨酸(V)或丙氨酸(A)置換在位置60處的絲氨酸(S);用絲氨酸(S)置換在位置70處的天冬氨酸(D);用丙氨酸(A)置換在位置100處的甘氨酸(G);和用亮氨酸(L)置換在位置106處的異亮氨酸(I)，其中使用Kabat編號系統(tǒng)。在一個方面，可以修飾本文所述的抗體和抗原結(jié)合片段。例如，在一個實施方案中，可以修飾所述化合物，以改變所述化合物的藥代動力學(xué)性質(zhì)，例如，體內(nèi)穩(wěn)定性、溶解度、生物利用度或半衰期。這樣的修飾包括、但不限于聚乙二醇化和/或糖基化。使用常規(guī)方法，可以配制本文所述的抗體和抗原結(jié)合片段，用于快速的或長期的遞送。在一個非限制性實施方案中，快速遞送是，例如，通過靜脈內(nèi)注射。在另一個非限制性實施方案中，長期遞送是，例如，通過皮下蓄積。在另一個非限制性實施方案中，通過施用氣霧劑來實現(xiàn)遞送。本文提供了本文所述的抗體和抗原結(jié)合片段和可接受的載體或賦形劑的組合物。
本文提供了多核苷酸(核酸)，其包含編碼本文所述的抗體或其抗原結(jié)合片段的核苷酸序列。本文所述的抗體和其抗原結(jié)合片段可以用于治療與血管生成有關(guān)的多種疾病和病癥，例如，不同形式的特征在于血管生成/新生血管形成的眼疾病(例如，黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變)、糖尿病腎病、慢性炎性疾病(例如，IBD)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎和不同形式的癌癥、實體瘤和轉(zhuǎn)移灶。另外，本文所述的這些抗體和其抗原結(jié)合片段可以用于藥物制劑中，所述藥物制劑用于預(yù)防、治療或診斷與血管生成有關(guān)的疾病和病癥，例如，不同形式的特征在于血管生成/新生血管形成的眼疾病和非眼疾病(例如，黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變)、糖尿病腎病、慢性炎性疾病(例如，IBD)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎和不同形式的癌癥、實體瘤和轉(zhuǎn)移灶。 本文提供了一種通過給患者施用組合物來在所述患者中誘導(dǎo)針對內(nèi)皮因子的宿主免疫應(yīng)答的方法，其中所述組合物包含人源化的抗-內(nèi)皮因子抗體或其抗原結(jié)合片段，其誘導(dǎo)針對所述抗體或其片段特異性地識別的表位的有效宿主免疫應(yīng)答。所述宿主免疫應(yīng)答可以是體液免疫應(yīng)答或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。如果所述免疫應(yīng)答是體液免疫應(yīng)答，它可以是抑制血管生成、血管生成依賴性的疾病或血管生成依賴性的障礙的保護(hù)性抗體應(yīng)答。免疫應(yīng)答也包括細(xì)胞信號傳遞途徑(例如Smad信號傳遞)的誘導(dǎo)或阻斷。所述血管生成依賴性的疾病或障礙可以是，例如，不同形式的特征在于血管生成/新生血管形成的眼疾病和非眼疾病(例如，黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變)、糖尿病腎病、慢性炎性疾病(例如，IBD)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、不同形式的癌癥(原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移灶)等。在一個實施方案中，所述保護(hù)性的抗體應(yīng)答會抑制血管生成。本文提供了一種影響與內(nèi)皮因子和血管生成有關(guān)的細(xì)胞信號傳遞途徑的方法?？梢允寡苌杉?xì)胞與足以改變細(xì)胞信號傳遞途徑的量的本文所述的抗體或其抗原結(jié)合片段接觸(體外、體內(nèi)或離體)。在一個非限制性實施例中，響應(yīng)于抗體結(jié)合，血管生成細(xì)胞中的Smad 1、5和/或8信號傳遞被抑制了約I. 5倍或更多。在另一個非限制性實施例中，Smad 3水平增加了約I. 5倍或更多，提示細(xì)胞正在恢復(fù)至靜止?fàn)顟B(tài)。本文提供了一種抑制受試者的血管生成或血管生成依賴性的疾病或障礙的方法，其中將本文提供的組合物施用給患者。所述血管生成依賴性的疾病或障礙可以是下述的任一種不同形式的特征在于血管生成/新生血管形成的眼疾病和非眼疾病(例如，黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變)、糖尿病腎病、慢性炎性疾病(例如，IBD)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎和不同形式的癌癥、實體瘤和轉(zhuǎn)移灶。在一個實施方案中，抑制血管生成或血管生成依賴性的疾病或障礙會減輕與所述疾病或障礙有關(guān)的征狀。在另一個實施方案中，抑制血管生成或血管生成依賴性的疾病或障礙會導(dǎo)致腫瘤大小的減小、腫瘤進(jìn)展的預(yù)防、細(xì)胞增殖的減少、細(xì)胞凋亡的增加或患者存活期的增加。抑制血管生成可以導(dǎo)致腫瘤大小的減小，或預(yù)防腫瘤進(jìn)展。所述方法可以另外包括外科手術(shù)切除癌癥和/或給遭受癌癥的患者施用一種或多種額外的抗癌劑或治療。本文提供了一種預(yù)防或治療受試者的癌癥或轉(zhuǎn)移的方法，其中施用本文提供的組合物。在一個實施方案中，所述藥物組合物的施用會延長被治療的受試者的壽命。要治療的癌癥/腫瘤包括實體瘤；腫瘤可以是原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移性腫瘤。示例性的實體瘤屬于選自下述的組織或器官皮膚、黑素瘤、肺、胰腺、乳房、卵巢、結(jié)腸、直腸、胃、甲狀腺、喉部、卵巢、前列腺、結(jié)腸直腸、頭部、頸部、眼、嘴、喉、食管、胸部、骨、睪丸、淋巴、骨髓、骨、肉瘤、腎、汗腺、肝、腎、腦(例如多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)和類似的組織。在一個非限制性實施例中，實體瘤是結(jié)腸腫瘤、乳腺腫瘤、腎腫瘤、肺腫瘤、前列腺癌、卵巢腫瘤或這些腫瘤中任一種的轉(zhuǎn)移灶。所述方法可以另外包括外科手術(shù)切除癌癥，和/或施用一種或多種抗癌劑?？梢栽谑┯盟鏊幬锝M合物之前、同時或之后，施用抗癌劑?？梢栽谒鏊幬锝M合物之前一周內(nèi)、在所述藥物組合物之后一周內(nèi)，施用抗癌劑，或者可以在所述藥物組合物同一天施用抗癌劑。如果在所述藥物組合物同一天施用抗癌劑，施用可以是并行的。本文提供了一種預(yù)防或治療癌癥或轉(zhuǎn)移的方法，其中外科手術(shù)切除癌癥/腫瘤，并將抗癌劑或治療和本文提供的組合物同時施用給受試者。
本文提供了一種抑制血管生成的方法，其中使細(xì)胞或組織接觸足以抑制血管生成的治療有效量的本文所述的抗體或其抗原結(jié)合片段。本文提供了一種抑制癌細(xì)胞生長的方法，其中接觸足以抑制癌細(xì)胞生長或造成癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的治療有效量的本文所述的抗體或其抗原結(jié)合片段。本文提供了一種方法，所述方法包括使組織接觸本文所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中接觸會抑制血管生成。所述組織可以是培養(yǎng)的組織活組織檢查樣品，或可以存在于受試者中。本文提供了一種預(yù)防或治療細(xì)胞增殖(例如，血管生成)障礙的方法，其中給具有細(xì)胞增殖障礙的受試者或處于該風(fēng)險中的受試者施用有效量的本文提供的組合物，以有效地治療細(xì)胞增殖障礙。所述細(xì)胞增殖障礙可以是，例如良性或惡性實體瘤或非實體瘤，所述腫瘤可以是轉(zhuǎn)移性的或非轉(zhuǎn)移性的。所述治療可以導(dǎo)致改善受試者的病癥，且可以通過確定是否已經(jīng)發(fā)生下述因素中的一個或多個來評估細(xì)胞增殖的減少、細(xì)胞數(shù)目的減少、細(xì)胞凋亡的增加或至少一部分構(gòu)成細(xì)胞增殖障礙的細(xì)胞的存活期減小。在某些情況下，這些事件中的一個或多個可能導(dǎo)致癌癥的部分或完全消除和患者存活期的延長。任選地，所述方法可以另外包括給所述受試者施用抗癌劑或治療。本文提供了一種治療患者的糖尿病視網(wǎng)膜病變、黃斑變性、脈絡(luò)膜新血管生成或新生血管性青光眼的方法，其中給患者施用治療有效量的本文提供的組合物。所述治療可以導(dǎo)致改善受試者的病癥，且可以通過確定是否已經(jīng)發(fā)生下述因素中的一個或多個來評估黃斑水腫的減少、CNV面積的減小或視敏度的增加。在本文提供的方法中，所述受試者可以是人或非人受試者。本文提供的組合物和抗癌劑或治療可以施用一次或多次，取決于患者的健康、疾病或病癥的進(jìn)展、和治療的效能。在治療過程中，可以調(diào)節(jié)療法和治療?？梢跃植康?locally)、區(qū)域性地(regionalIy)或全身地施用組合物,例如,通過皮下的、玻璃體內(nèi)的、真皮內(nèi)的、靜脈內(nèi)的、動脈內(nèi)的、腹膜內(nèi)的或肌肉內(nèi)的注射來施用。另外，本文所述的人源化抗體和抗原結(jié)合片段也可以與已知的用于治療黃斑變性、CNV、糖尿病視網(wǎng)膜病變或增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變的療法和/或化合物聯(lián)合使用。這樣的化合物的實例包括、但不限于貝伐單抗(阿伐他汀 )、ranibizumab (LUCENTIS )>aflibercept(VEGF-Trap)或Macugen。除了本文所述的施用模式以外,所述人源化的抗-內(nèi)皮因子抗體和抗原結(jié)合片段可以經(jīng)由玻璃體內(nèi)途徑來施用。玻璃體內(nèi)施用模式的非限制性實例包括玻璃體內(nèi)注射和使用玻璃體內(nèi)植入物。另一個方面是，通過施用本文所述的抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物來治療受試者的慢性炎性疾病。慢性炎性疾病的非限制性實例包括IBD、克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎。另一個方面是，通過施用本文所述的抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物來治療受試者的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。另一個方面是，通過施用本文所述的抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物來治療受試者的骨關(guān)節(jié)炎。通過不同的方法，可以評估具有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和/或骨關(guān)節(jié)炎的受試者的治療，所述方法包括根據(jù)公開的指南測量的ACR評分的適當(dāng)分類的改善。本文提供了一種監(jiān)測本文提供的方法中的任意一種或多種的效能的方法。增加的 可溶性內(nèi)皮因子的水平，已經(jīng)與癌癥患者的降低的存活期相關(guān)聯(lián)。因而，在一個方面，可以在治療之前和過程中，監(jiān)測可溶性內(nèi)皮因子的水平。因此，可溶性內(nèi)皮因子的水平的降低可以指示，治療方案有效地治療患者。本發(fā)明的一個實施方案預(yù)見到，本發(fā)明的任一種組合物用于配制藥物的用途，所述藥物用于本發(fā)明的障礙?？梢曰谛枰委煹幕颊?受試者的身體特征來配制藥物，且可以基于例如癌性組織的階段，配制成單個制劑或多個制劑。可以將本發(fā)明的藥物包裝在具有適當(dāng)標(biāo)簽的合適藥物包中以分配給醫(yī)院和診所，其中所述標(biāo)簽是用于指示治療受試者的本文所述的障礙。藥物可以包裝成單個或多個單元。在藥物包中可以包括關(guān)于本發(fā)明的組合物的劑量和施用的說明書。本文提供了一種診斷方法，其中提供來自待測患者的實體瘤的癌細(xì)胞或血漿樣品，檢測至少一種基因或基因廣物在樣品中的表達(dá)，所述基因或基因廣物選自其表達(dá)已經(jīng)與對血管生成抑制劑的敏感性或抗性相關(guān)聯(lián)的基因或基因產(chǎn)物集合，其中所述至少一種基因或基因產(chǎn)物選自下述的一種或多種基因或基因產(chǎn)物VEGF、VEGF受體、HIF-I a、胎盤生長因子受體和CD105，并對比在患者樣品中檢測到的至少一種基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)水平和已經(jīng)與對血管生成抑制劑的敏感性或抗性相關(guān)聯(lián)的至少一種基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)水平。在一個實施方案中，所述血管生成抑制劑選自=VEGF受體抑制劑、VEGF抑制劑和內(nèi)皮因子抑制劑。本文提供了一種試劑盒，其用于檢測已經(jīng)與對血管生成抑制劑的敏感性或抗性相關(guān)聯(lián)的基因在癌細(xì)胞或人血漿樣品中的表達(dá)水平。在一個實施方案中，一種或多種基因是選自VEGF、VEGF受體、HIF-I a、胎盤生長因子受體和內(nèi)皮因子。通過引用并入
在本說明書中提及的所有出版物和專利申請都通過引用并入本文中，其程度如同具體地且單個地指出每篇單獨的出版物或?qū)＠暾埻ㄟ^引用整體并入，除非另外特別指出。本申請含有對氨基酸序列的提及，所述氨基酸序列已經(jīng)作為序列表文本文件“35882-706-202-SeqList. txt”(文件大小 67，843 千字節(jié)(KB)，于 2010 年 3 月 30 日建立)與本文同時呈交。根據(jù)37C.F.R. § 1.52(e) (5)，前述序列表通過引用整體并入本文。


圖I提供了人源化的02-V 1-39可變(Vl)輕鏈，其具有嫁接在人序列02-V 1-39的框架區(qū)(FR) 1-3和來自人J 4序列的框架區(qū)4 (SEQ ID NO: 4)(都為粗體)之間的單克隆鼠嵌合的TRC105 Vl⑶R (帶有下劃線)。在所述序列(在SEQ ID NO: 86中公開的序列)的位置1、3、4、5、36、46、47、60、70、71、100和106處，指示可以對人FR做出的變化(在人源化序列下面以斜體顯示)，其中使用Kabat編號系統(tǒng)。圖2提供了人源化的VH3-15可變(Vh)重鏈，其具有嫁接在人序列VH3-15的框架區(qū)(FR) 1-3和人JH4序列的框架區(qū)4 (SEQ ID NO: 42)(都為粗體)之間的單克隆鼠單克隆鼠嵌合的TRC105 Vh⑶R (帶有下劃線)。在所述序列(在SEQ ID NO: 87中公開的序列)的位置49、76、77、78、82a、89、94、108、109和113處，指示可以對人FR做出的一個或多個變化(在人源化序列下面以斜體顯示)，其中使用Kabat編號系統(tǒng)。圖3提供了 TGF-P /ALK5信號傳遞途徑的簡圖。TGF-P /ALK5途徑(A)會導(dǎo)致細(xì)胞增殖和遷移的抑制。TGF-P/ALKl途徑(B)會誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，并需要⑶105 (內(nèi) 皮因子)進(jìn)行ALKl信號傳遞。虛線指示無活性的或阻斷的途徑。加粗的箭頭指示信號傳遞途徑的刺激。圖4提供了根據(jù)本文所述的發(fā)明生產(chǎn)的示例性的小鼠和人源化的VK鏈(按照出現(xiàn)次序，分別是SEQ ID NO 1-5)和Vh鏈(按照出現(xiàn)次序，分別是SEQ ID NO 39-43)的氨基酸序列比對。圖5提供了根據(jù)本文所述的發(fā)明生產(chǎn)的示例性的小鼠和超人源化的VK鏈(按照出現(xiàn)次序，分別是SEQ ID NO I和69-72)和Vh鏈(按照出現(xiàn)次序，分別是SEQ ID NO 39和73-75)的氨基酸序列比對。圖6提供了根據(jù)本文所述的發(fā)明生產(chǎn)的示例性的小鼠和人源化的和超人源化的VK鏈(按照出現(xiàn)次序，分別是SEQ ID NO I、3和70 )和Vh鏈(按照出現(xiàn)次序，分別是SEQ IDNO 39、41和74)的氨基酸序列比對和對比。圖I解釋了在競爭ELISA試驗中人源化的變體構(gòu)建體與內(nèi)皮因子的結(jié)合。圖8.使用人源化的和人源化的/去免疫化的抗體的抗-CD105競爭ELISA。將不同濃度的每種抗體與固定濃度的生物素化的參照抗-CD105抗體(6. 25 ng/ml)相混合，并與CD105 (100 ng/ml)結(jié)合，所述CD105捕獲在Nunc MaxiSorp平板上。通過抗生蛋白鏈菌素-HRP和TMB底物，檢測結(jié)合。在平板讀數(shù)器上測量在450nm的吸光度(OD)，并相對于實驗抗體濃度繪圖。圖9解釋了變體VK1AAVH1A +含有VK2的對照的結(jié)合試驗數(shù)據(jù)。圖10解釋了嵌合體相對于VK1AAVH1A2和VK2AAVH1A2的結(jié)合試驗數(shù)據(jù)。圖11解釋了嵌合體相對于VK2AAVH1Q的結(jié)合試驗數(shù)據(jù)。圖12解釋了嵌合體相對于VK2AAVH1R的結(jié)合試驗數(shù)據(jù)。圖13解釋了嵌合體相對于VK1AAVH1A2的結(jié)合試驗數(shù)據(jù)。圖14解釋了嵌合體相對于VK1AAVH1Q的結(jié)合試驗數(shù)據(jù)。圖15解釋了嵌合體相對于VK1AAVH1R的結(jié)合試驗數(shù)據(jù)。圖16解釋了嵌合體相對于VK2AAVH1A2的結(jié)合試驗數(shù)據(jù)。圖17解釋了先導(dǎo)人源化的去免疫化的重鏈可變區(qū)，其中CDR顯示為粗體并帶有下劃線(在SEQ ID NO: 89中公開的序列)。在所述序列(在SEQ ID NO: 116中公開的序列)的鑒定位置處，指出了可以做出的變異(在人源化序列下面以斜體顯示)，其中使用Kabat編號系統(tǒng)。變異可以作為單突變或作為超過一個突變而產(chǎn)生，且變異可以與突變?nèi)我饨M合地產(chǎn)生。圖18解釋了先導(dǎo)人源化的去免疫化的輕鏈可變區(qū)，其中CDR顯示為粗體并帶有下劃線(在SEQ ID NO: 93中公開的序列)。在所述序列(在SEQ ID NO: 117中公開的序列)的鑒定位置處，指出了可以做出的變異(在人源化序列下面以斜體顯示)，其中使用Kabat編號系統(tǒng)。變異可以作為單突變或作為超過一個突變而產(chǎn)生，且變異可以與突變?nèi)我饨M合地產(chǎn)生。圖19解釋了使用iTope 對重鏈(SEQ ID NO: 41)的區(qū)域的分析。以一個氨基酸增量，將跨整個序列的肽測試為9聚體肽。用“0”(如果結(jié)合評分是0.55-0. 6)和用“X”(如果結(jié)合評分>0. 6)指示預(yù)測的每個殘基(作為核心9聚體肽的pi錨)與MHC II類等位基因的結(jié)合。在“iTope”列中，指出了含有潛在免疫原性肽的區(qū)域，深灰色指示混雜的高親和力MHC II類結(jié)合肽，淺灰色指示混雜的中等親和力MHC II類結(jié)合肽。在“總”和“高親和力”列中，顯示了預(yù)測會結(jié)合的MHC II類等位基因的數(shù)目。在“序列”列的相反類型中，顯示了被鑒別為種系序列的潛在Pl錨殘基。
圖20解釋了使用iTope 對重鏈變體(SEQ ID NO: 118)的變體區(qū)域的分析。以一個氨基酸增量，將跨整個序列的肽測試為9聚體肽。用“0”(如果結(jié)合評分是0.55-0. 6)和用“X”(如果結(jié)合評分>0. 6)指示預(yù)測的每個殘基(作為核心9聚體肽的pi錨)與MHC II類等位基因的結(jié)合。在“iTope”列中，指出了含有潛在免疫原性肽的區(qū)域，深灰色指示混雜的高親和力MHC II類結(jié)合肽，淺灰色指示混雜的中等親和力MHC II類結(jié)合肽。在“總”和“高親和力”列中，顯示了預(yù)測會結(jié)合的MHC II類等位基因的數(shù)目，顯示了結(jié)合的差異。在“序列”列的相反類型中，顯示了被鑒別為種系序列的潛在Pl錨殘基，變體中的氨基酸差異帶有框。圖21解釋了使用iTope 對輕鏈(SEQ ID NO: 3)的區(qū)域的分析。以一個氨基酸增量，將跨整個序列的肽測試為9聚體肽。用“0”(如果結(jié)合評分是0.55-0. 6)和用“X”(如果結(jié)合評分>0. 6)指示預(yù)測的每個殘基(作為核心9聚體肽的pi錨)與MHC II類等位基因的結(jié)合。在“iTope”列中，指出了含有潛在免疫原性肽的區(qū)域，深灰色指示混雜的高親和力MHC II類結(jié)合肽，淺灰色指示混雜的中等親和力MHC II類結(jié)合肽。在“總”和“高親和力”列中，顯示了預(yù)測會結(jié)合的MHC II類等位基因的數(shù)目。在“序列”列的相反類型中，顯示了被鑒別為種系序列的潛在Pl錨殘基。圖22解釋了使用iTope 對輕鏈(SEQ ID NO: 101)的變體區(qū)域的分析。以一個氨基酸增量，將跨整個序列的肽測試為9聚體肽。用“0”(如果結(jié)合評分是0.55-0. 6)和用“X”(如果結(jié)合評分>0. 6)指示預(yù)測的每個殘基(作為核心9聚體肽的pi錨)與MHC II類等位基因的結(jié)合。在“iTope”列中，指出了含有潛在免疫原性肽的區(qū)域，深灰色指示混雜的高親和力MHC II類結(jié)合肽，淺灰色指示混雜的中等親和力MHC II類結(jié)合肽。在“總”和“高親和力”列中，顯示了預(yù)測會結(jié)合的MHC II類等位基因的數(shù)目，顯示了結(jié)合的差異。在“序列”列的相反類型中，顯示了被鑒別為種系序列的潛在Pl錨殘基，變體中的氨基酸差異帶有框。圖23解釋了 MHC II類同種異型在世界人群和研究人群中的頻率。圖24使用來自20個供體的PBMC，在EpiScreen 時程T細(xì)胞試驗中測試了嵌合的抗-內(nèi)皮因子抗體、人源化的抗-內(nèi)皮因子抗體VKlVHl和人源化的/去免疫化的抗-內(nèi)皮因子抗體VK1AAVH1A2。在第5、6、7和8天，對與實驗抗體一起溫育的PBMC主培養(yǎng)物(Bulkculture)取樣，并用3H-胸苷脈沖處理。收獲細(xì)胞，并通過閃爍計數(shù)，測量放射性的摻入。取每個一式三份樣品的結(jié)果的平均值，并通過轉(zhuǎn)化成刺激指數(shù)(SI)來標(biāo)準(zhǔn)化。對于嵌合抗體TRC105 (圖24A)、VK1VH1 (圖24B)和VK1AAVH1A2 (圖24C)，在上面顯示了每種供體的每個時間點的SI。用虛線突出了用于測定SI >2的陽性應(yīng)答的截止值，并指出(*)顯著的應(yīng)答(在 student 氏 t_ 檢驗中，p〈0. 05)。
具體實施例方式應(yīng)當(dāng)理解，本申請不限于特定制劑或工藝參數(shù)，因為這些當(dāng)然可以變化。還應(yīng)當(dāng)理解，在本文中使用的術(shù)語僅用于描述具體實施方案的目的，無意進(jìn)行限制。此外，應(yīng)當(dāng)理解，與本文所述的那些類似或等效的許多方法和材料可以用于實踐本發(fā)明。根據(jù)本申請，可以采用屬于本領(lǐng)域技能的常規(guī)分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。在本領(lǐng)域中充分解釋了這樣的技術(shù)。參見，例如，Sambrook等人，“MolecularCloning: A Laboratory Manual” (1989) ；uCurrent Protocols in Molecular Biology”第 I-III 卷[Ausubel, R. M.,編(1994)] ;“Cell Biology: A Laboratory Handbook，，第 I-III 卷[J. E. Celis,編(1994))] ；uCurrent Protocols in Immunology” 第I-III 卷[Coligan, J. E.,編(1994)] ,Oligonucleotide Synthesis”(M. J. Gait編 1984) ;“Nucleic Acid Hybridization，，[B. D. Hames 和 S. J. Higgins 編(1985)]；“Transcription And Translation，，[B. D. Hames 和 S. J. Higgins,編(1984)] ;“AnimalCell Culture” [R. I. Freshney,編(1986)] Immobilized Cells And Enzymes” [IRLPress, (1986)]; B. Perbal, “A Practical Guide To Molecular Cloning，，(1984),它們各自特別地通過弓I用整體并入本文。已經(jīng)針對內(nèi)皮因子產(chǎn)生了鼠單克隆抗體(mAb)，其調(diào)節(jié)內(nèi)皮因子活性，并從而抑制血管生成和/或抑制小血管的血管舒張。這些鼠抗體描述在美國專利5，928，641、6，200，566，6，190，660和7，097，836中，它們特此整體并入。另外，已經(jīng)證實了許多這樣的抗體的離體和體內(nèi)有效性；這些結(jié)合內(nèi)皮因子的單克隆抗體具有作為調(diào)節(jié)內(nèi)皮因子的化合物的利益。但是，這些鼠抗體的治療用途是不可行的，因為它們的施用具有許多限制，包括，例如，以人抗-小鼠抗體(HAMA)形式時的免疫原性。制備人源化抗體來解決這些反應(yīng)。本文描述了結(jié)合內(nèi)皮因子的人源化抗體,其表現(xiàn)出降低的免疫原性,并同時維持和/或提高它們的特異性。另外，為了解決與鼠抗體有關(guān)的問題，本文描述了結(jié)合內(nèi)皮因子并減少和/或抑制血管生成的人源化抗體，其表現(xiàn)出降低的免疫原性，并同時維持和/或提高它們的特異性。這些人源化的內(nèi)皮因子抗體可用于診斷和治療不同的病癥和疾病，以及 用于純化和檢測內(nèi)皮因子。I.抗-內(nèi)皮因子抗體
本文提供了結(jié)合內(nèi)皮因子的人源化抗體和其抗原結(jié)合片段。在包含和支持現(xiàn)有脈管系統(tǒng)的細(xì)胞以及促進(jìn)新脈管系統(tǒng)的生長并變成其一部分的細(xì)胞上，可以發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮因子。這些抗體和抗原結(jié)合片段可以結(jié)合內(nèi)皮因子，并從而抑制血管生成、抑制現(xiàn)有脈管系統(tǒng)或現(xiàn)有脈管系統(tǒng)的維持和/或抑制小血管膨脹。在下文中，提及的術(shù)語“抗體”應(yīng)當(dāng)視作包括本文所述的任一種抗原結(jié)合片段，且所述術(shù)語在適用之處是可互換的。除了它們用于純化內(nèi)皮因子的用途以外，這些抗體可用于純化、檢測和診斷目的以及治療目的。本文提供的抗體可以用于配制用于治療多種病癥和疾病的藥物制劑、治療所述病癥和疾病的方法和檢測方法或診斷方法。本文使用的血管生成包括新血管的生長和/或發(fā)育(也稱作新生血管形成)、小血管的膨脹、過度的或延長的血管生長和現(xiàn)有脈管系統(tǒng)的維持。血管生成病癥和疾病表示與血管生成有關(guān)、由血管生成造成或伴隨血管生成的那些疾病和病癥。這樣的疾病的非限制性實施例包括，例如，不同形式的特征在于血管生成/新生血管形成的眼疾病(例如，黃斑變性、CNV、糖尿病視網(wǎng)膜病變)、糖尿病腎病、慢性炎性疾病(例如，IBD)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎和不同形式的癌癥(原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移灶)。A.抗體術(shù)語
本文使用的術(shù)語“抗體”表示免疫球蛋白(Ig)，無論天然的還是部分地或完全地合成生產(chǎn)的。該術(shù)語也涵蓋具有結(jié)合域的任意多肽或蛋白，所述結(jié)合域是抗原結(jié)合域或與抗原結(jié) 合域同源。該術(shù)語另外包括“抗原結(jié)合片段”和諸如下述的類似結(jié)合片段的其它可互換的術(shù)語。該術(shù)語也包括互補性決定區(qū)(CDR)移植的抗體和其它人源化抗體(包括CDR修飾和框架區(qū)修飾)。天然抗體和天然免疫球蛋白通常是約150，000道爾頓的異源四聚體糖蛋白，其由2個相同的輕(L)鏈2個相同的重(L)鏈組成。每個輕鏈通常通過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而二硫鍵的數(shù)目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈之間存在差異。每個重鏈和輕鏈也具有規(guī)則分布的鏈內(nèi)二硫鍵。每個重鏈具有在一個末端處的可變結(jié)構(gòu)域(“VH”)，其后是許多恒定結(jié)構(gòu)域(“CH”)。每個輕鏈具有在一個末端處的可變結(jié)構(gòu)域(“'”)和在它的另一個末端處的恒定結(jié)構(gòu)域(“匕”)；輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域與重鏈的第一個恒定結(jié)構(gòu)域?qū)R，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域與重鏈的可變結(jié)構(gòu)域?qū)R。認(rèn)為特定氨基酸殘基會形成輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域之間的接口。本文使用的術(shù)語“合成的多核苷酸”、“合成的基因”或“合成的多肽”表示，對應(yīng)的多核苷酸序列或其一部分或氨基酸序列或其一部分源自已經(jīng)設(shè)計的序列，或從新合成，或與等效的天然存在的序列相比被修飾。通過本領(lǐng)域已知的方法，可以制備合成的多核苷酸(抗體或抗原結(jié)合片段)或合成的基因，所述方法包括但不限于核酸或氨基酸序列的化學(xué)合成。合成的基因通常在氨基酸或多核苷酸水平(或在兩個水平)不同于天然存在的基因，且通常位于合成的表達(dá)控制序列的背景內(nèi)。例如，合成的基因序列可以包括已經(jīng)改變的氨基酸或多核苷酸序列，例如，通過置換、刪除或添加一個或多個氨基酸或核苷酸，從而提供不同于源序列的抗體氨基酸序列或多核苷酸編碼序列。與天然的基因相比，合成的基因多核苷酸序列可能不一定編碼具有不同氨基酸的蛋白；例如，它們也可以包括合成的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列摻入不同的密碼子，但是它們編碼相同的氨基酸(即，核苷酸變化代表在氨基酸水平的沉默突變)。關(guān)于抗體，術(shù)語“可變結(jié)構(gòu)域”表示，在每個特定抗體與它的特定抗原的結(jié)合和特異性中使用的抗體可變結(jié)構(gòu)域。但是，變異性不均勻地分布在抗體的可變結(jié)構(gòu)域中。相反，它集中在3個稱作高變區(qū)(也稱作CDR)的區(qū)段中，所述區(qū)段在輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中。可變結(jié)構(gòu)域的更高度保守的部分被稱作“框架區(qū)”或“FR”。未修飾的重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域各自含有4個FR (FR1、FR2、FR3和FR4)，它們主要采取P -折疊構(gòu)型，其間散布著3個⑶R，所述⑶R形成環(huán)，并在某些情況下連接P -折疊結(jié)構(gòu)部分。每個鏈中的⑶R被FR保持緊密靠在一起，并與來自其它鏈的CDR —起，促進(jìn)抗體的抗原結(jié)合位點的形成(參見Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版.Public HealthService, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)，第 647-669 頁)。在本文中使用的術(shù)語“高變區(qū)”和“CDR”表示，抗體的負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。CDR包括來自3個序列區(qū)的氨基酸殘基，所述序列區(qū)以互補方式結(jié)合抗原，并被稱作CDRKCDR2 和 CDR3(對于每個 Vh 和 Vl 鏈)。根據(jù) Kabat 等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第 5 版.Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, Md. (1991))，在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中，CDR通常大致對應(yīng)著殘基24-34(CDRLl)、50-56 (CDRL2)和89-97 (CDRL3)，在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中，CDR通常大致對應(yīng)著殘 基殘基 31-35 (CDRHl )、50-65 (CDRH2)和 95-102 (CDRH3)。應(yīng)當(dāng)理解，不同抗體的 CDR 可以含有插入序列，因而氨基酸編號可能不同。Kabat編號系統(tǒng)用下述編號方案來補償這樣的插入序列所述方案利用與特定殘基相連的字母(例如，在輕鏈中，⑶RLl的27A、27B、27C、27D、27E和27F)來反映在不同抗體之間的編號的任何插入?；蛘?，根據(jù)Chothia和Lesk，J. Mol. Biol. , 196: 901-917 (1987))，在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中，CDR通常大致對應(yīng)著殘基26-32 (CDRLl)、50-52 (CDRL2)和91-96 (CDRL3)，在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中，CDR通常大致對應(yīng)著殘基 26-32 (CDRHl)、53-55 (CDRH2)和 96-101 (CDRH3)。本文使用的“框架區(qū)”或“FR”表示，形成抗原結(jié)合槽或溝的一部分的框架氨基酸殘基。在有些實施方案中，所述框架殘基形成環(huán)，所述環(huán)是抗原結(jié)合槽或溝的一部分，且在所述環(huán)中的氨基酸殘基可以接觸或不接觸抗原?？蚣軈^(qū)通常包括在CDR之間的區(qū)域。根據(jù) Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版.PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)),在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中，F(xiàn)R通常大致對應(yīng)著殘基0-23 (FRLl ),35-49 (FRL2)、57_88 (FRL3)和98-109，在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中，F(xiàn)R通常大致對應(yīng)著殘基0-30 (FRHl ),36-49 (FRH2)、66_94 (FRH3)和103-133。如上面關(guān)于輕鏈的Kabat編號所討論的，重鏈也以類似的方式補償插入(例如，在重鏈中，CDRHl 的 35A、35B)?；蛘撸鶕?jù) Chothia 和 Lesk, J. Mol. Biol. , 196: 901-917(1987))，在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中，F(xiàn)R通常大致對應(yīng)著殘基0-25 (FRLl),33-49 (FRL2) 53-90(FRL3)和97-109 (FRL4)，在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中，F(xiàn)R通常大致對應(yīng)著殘基0_25 (FRH1)、33-52 (FRH2)、56-95 (FRH3)和 102-113 (FRH4)。通過檢查抗體重鏈和/或抗體輕鏈的三維結(jié)構(gòu)，可以評估和測定FR的環(huán)氨基酸?？梢苑治鋈S結(jié)構(gòu)中的溶劑可接近的氨基酸位置，因為這樣的位置可能形成環(huán)和/或提供在抗體可變結(jié)構(gòu)域中的抗原接觸。一些溶劑可接近的位置可以耐受氨基酸序列變化，其它位置(例如，結(jié)構(gòu)位置)通常更少變化。從晶體結(jié)構(gòu)或蛋白建模，可以衍生出抗體可變結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)。抗體的恒定結(jié)構(gòu)域(Fe)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是相反地表現(xiàn)出不同的效應(yīng)子功能,諸如通過與例如Fe受體(FcR)的相互作用,抗體參與抗體依賴性的細(xì)胞毒性。Fe結(jié)構(gòu)域也可以增加抗體在施用給患者以后在循環(huán)中的生物利用度。根據(jù)它們的重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，可以將免疫球蛋白歸入不同的類另IJ。存在5個主要的免疫球蛋白類別1§么、1§0、1§￡、1§6和1§11，它們中的幾個可以進(jìn)一步分成子類(同種型)，例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。與不同類別的免疫球蛋白相對應(yīng)的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(Fe)分別被稱作a、S、e、Y和ii。不同類別的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是眾所周知的?；谒鼈兊暮愣ńY(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，可以將來自任意脊椎動物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”歸入2個明顯不同的類型(稱作kappa或(“ K ”或“K”)和lambda或(“入，，))之一。術(shù)語“抗體的抗原結(jié)合部分”、“抗原結(jié)合片段”、“抗原結(jié)合域”、“抗體片段”或“抗體的功能片段”在本文中互換地用于表示抗體的一個或多個片段，所述片段保留特異性地結(jié)合抗原的能力。在這樣的術(shù)語內(nèi)包括的抗體片段的非限制性實施例包括、但不限于(i)Fab片段，即由\、VH、Cl和Chi結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii) F(ab’ )2片段，即含有2個通過在鉸鏈區(qū)處的二硫鍵相連的Fab片段的二價片段；(iii)由Vh和Chi結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)含有抗體的單臂的Vl和Vh結(jié)構(gòu)域的Fv片段；(V) dAb片段(Ward等人，(1989) Nature 341:544 546)，其含有Vh結(jié)構(gòu)域；和(vi )分離的CDR。在該定義中另外包括含有單個重鏈和單個輕鏈的“一半”抗體。在本文中也包括其它形式的單鏈抗體，諸如雙特異抗體。通過用蛋白酶(諸如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶)處理Ig，可以生產(chǎn)“F(ab’)2”和“Fab’ ”部分，且包括通過在二硫鍵附近消化免疫球蛋白所產(chǎn)生的抗體片段，所述二硫鍵存在于2個重鏈中的每一個內(nèi)的鉸鏈區(qū)之間。例如，木瓜蛋白酶會在存在于2個重鏈中的每一個內(nèi)的鉸鏈區(qū)之間的二硫鍵的上游切割I(lǐng)gG，以產(chǎn)生2個同源的抗體片段，其中由\和Q組成的輕鏈(輕鏈恒定區(qū))和由Vh和Chy1 ( Y I)區(qū)組成的重鏈片段(在重鏈的恒定區(qū)中)在它們的C端區(qū)域通過二硫鍵相連。這2個同源的抗體片段中的每一個被稱作Fab’。胃蛋白酶也會在存在于2個重鏈中的每一個內(nèi)的鉸鏈區(qū)之間的二硫鍵的上游切割I(lǐng)gG，以產(chǎn)生這樣的抗體片段所述片段稍微大于2個上述的Fab’在其中在鉸鏈區(qū)處相連的片段。該抗體片段被稱作F(ab’)2。Fab片段也含有輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的第一個恒定結(jié)構(gòu)域(ChI)。Fab’片段與Fab片段的差別在于，在重鏈ChI結(jié)構(gòu)域的羧基端處添加了幾個殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。Fab’-SH在本文中表示這樣的Fab’ 其中恒定結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基攜帶游離的巰基。？(&13’)2抗體片段最初被生產(chǎn)為Fab’片段對，它們具有在它們之間的鉸鏈半胱氨酸。抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)也是已知的?！癋v”表示含有完整抗原識別和抗原結(jié)合位點的抗體片段。該區(qū)域由緊密地非共價或共價結(jié)合的一個重鏈和一個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的二聚體組成(本領(lǐng)域已經(jīng)描述了二硫鍵連接的 Fv,Reiter 等人(1996)Nature Biotechnology 14:1239-1245)。在該構(gòu)型中，每個可變結(jié)構(gòu)域的3個CDR相互作用，以限定在Vh-' 二聚體的表面上的抗原結(jié)合位點。來自每個Vh和\鏈的一個或多個CDR的組合一起賦予抗體抗原結(jié)合特異性。例如，應(yīng)當(dāng)理解，例如，當(dāng)轉(zhuǎn)移至受體抗體的Vh和\鏈或其抗原結(jié)合片段上時，CDRH3和CDRL3足以賦予抗體抗原結(jié)合特異性，且可以使用本文所述的任意技術(shù)測試該CDR組合的結(jié)合、親和力等。甚至單個可變結(jié)構(gòu)域(或僅包含對抗原特異性的3個CDR的Fv的一半)具有識別和結(jié)合抗原的能力，盡管親和力可能比與第二個可變結(jié)構(gòu)域相組合時更低。此外，盡管Fv片段的2個結(jié)構(gòu)域(\和Vh)由單獨的基因編碼，使用重組方法，通過合成的連接物可以連接它們，所述連接物使它們能夠制成單個蛋白鏈，其中\(zhòng)和Vh區(qū)配對形成單價分子(稱作單鏈Fv (scFv);Bird等人(1988)Science 242:423-426; Huston等人(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:5879-5883 ;和 Osbourn 等人(1998) Nat. Biotechnol. 16:778)。在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”內(nèi)，也意圖包括這樣的scFv?？梢詫⑻囟╯cFv的任意Vj^P Vlj序列連接到Fe區(qū)cDNA或基因組序列上，以便制備編碼完整Ig (例如，IgG)分子或其它同種型的表達(dá)載體。Vh和\也可以用于制備Fab、Fv或Ig的其它片段，其中使用蛋白化學(xué)或重組DNA技術(shù)?！皢捂淔v”或“sFv”抗體片段包含抗體的Vh和\結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單個多肽鏈中。在有些實施方案中，所述Fv多肽另外包含在Vh和'結(jié)構(gòu)域之間的多肽連接物，其使sFv能夠形成抗原結(jié)合所希望的結(jié)構(gòu)。關(guān)于sFv的綜述,參見,例如，Pluckthunin The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg和 Moore 編Springer-Verlag, New York,第 269-315 頁(1994)。術(shù)語“AVIMER ”表示一類人起源的治療蛋白，它們與抗體和抗體片段無關(guān)，由幾個模塊的且可重復(fù)使用的結(jié)合域組成，所述結(jié)合域稱作A-結(jié)構(gòu)域(也稱作A類模塊、補體型重復(fù)序列或LDL-受體類A結(jié)構(gòu)域)。它們通過體外外顯子改組和噬菌體展示從人胞外受體結(jié)構(gòu)域發(fā)展而成(Silverman 等人，2005，Nat. Biotechnol. 23:1493-1494;Silverman等人，2006，Nat. Biotechnol. 24:220)。得到的蛋白可以含有多個獨立結(jié)合域，它們與單表位結(jié)合蛋白相比，可以表現(xiàn)出提高的親和力(在某些情況下，低于納摩爾)和特異性。參見，例如，美國專利申請公開號2005/0221384、2005/0164301、2005/0053973和2005/0089932、2005/0048512和2004/0175756，它們各自特此通過引用整體并入本文。已知的217個人A-結(jié)構(gòu)域中的每一個包含約35個氨基酸(約4 kDa);這些結(jié)構(gòu)域被連接物隔開，所述連接物的長度是平均5個氨基酸。天然A-結(jié)構(gòu)域快速地且有效地折疊成均勻的、穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，這主要由鈣結(jié)合和二硫鍵形成來介導(dǎo)。該共有結(jié)構(gòu)需要僅12個 氨基酸的保守支架基序。最終結(jié)果是含有多個結(jié)構(gòu)域的單個蛋白鏈，每個結(jié)構(gòu)域代表單獨的功能。所述蛋白的每個結(jié)構(gòu)域獨立地結(jié)合，且每個結(jié)構(gòu)域的活力貢獻(xiàn)是累加的。這些蛋白被稱作來自親合力多聚體的“AVIMERs ”。術(shù)語“雙特異抗體”表示具有2個抗原結(jié)合位點的小抗體片段，所述片段包含在相同多肽鏈(VH-VL)中與輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)相連的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)。通過使用太短而不允許在相同鏈上的2個結(jié)構(gòu)域之間配對的連接物，迫使所述結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對，并建立2個抗原結(jié)合位點。雙特異抗體更完整地描述在，例如，EP 404, 097; WO93/11161 ;和 Hollinger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444 6448 (1993)?？乖Y(jié)合多肽也包括重鏈二聚體，例如，來自駱駝類(camelids)和鯊魚的抗體。駱駝類和鯊魚抗體包括V-樣和C-樣結(jié)構(gòu)域的2條鏈的同源二聚體對(都不具有輕鏈)。因為駱駝類的重鏈二聚體IgG的Vh區(qū)不一定與輕鏈產(chǎn)生疏水相互作用，在駱駝類中，通常接觸輕鏈的重鏈中的該區(qū)域變成親水氨基酸殘基。重鏈二聚體IgG的Vh結(jié)構(gòu)域稱作Vhh結(jié)構(gòu)域。鯊魚I g-NAR包括I個可變結(jié)構(gòu)域(稱作V-NAR結(jié)構(gòu)域)和5個C-樣恒定結(jié)構(gòu)域(C-NAR結(jié)構(gòu)域)的同源二聚體。在駱駝類中，抗體所有組成部分的多樣性由VH* Vhh區(qū)中的CDR 1、2和3決定。駱駝Vhh區(qū)中的CDR3的特征在于它的相對長的長度，平均16個氨基酸(Muyldermans 等人，1994，Protein Engineering 7 (9): 1129)。這不同于許多其它物種的抗體的CDR3區(qū)。例如，小鼠Vh的CDR3具有平均9個氨基酸。通過例如在美國專利申請系列號20050037421中公開的方法，可以制備駱駝類-衍生的抗體可變區(qū)(它們維持駱駝類可變區(qū)的體內(nèi)多樣性)的文庫?！叭嗽椿毙问降姆侨?例如，鼠)抗體包括含有源自非人Ig的最小序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體是這樣的人Ig (受體抗體)其中受體的一個或多個CDR被來自非人物種(諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物)抗體(供體抗體)的CDR替換，后者具有希望的特異性、親和力和結(jié)合功能。在某些情況下，人Ig的一個或多個FR氨基酸殘基被對應(yīng)的非人氨基酸殘基替換。此外，人源化抗體可以含有在受體抗體或供體抗體中不存在的殘基。如果需要的話，可以做出這些修飾，以優(yōu)化抗體性能。人源化抗體可以包含基本上所有的、或至少I個(且在有些情況下，2個)可變結(jié)構(gòu)域，其中所有或基本上所有的高變區(qū)對應(yīng)非人免疫球蛋白的高變區(qū)，所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR。所述人源化抗體還可以任選地包括免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)的至少一部分，通常人免疫球蛋白的至少一部分。關(guān)于細(xì)節(jié)，參見 Jones 等人，Nature 321: 522-525 (1986) ;Reichmann 等人，Nature 332: 323-329 (1988);和 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. , 2: 593-596(1992)。
人源化抗體也包括這樣的抗體，其中重鏈和輕鏈的部分或所有CDR源自非人單克隆抗體，可變區(qū)的基本上所有的剩余部分源自人可變區(qū)(重鏈和輕鏈二者)，且恒定區(qū)源自人恒定區(qū)。在一個實施方案中，重鏈和輕鏈的⑶R1、⑶R2和⑶R3區(qū)域源自非人抗體。在另一個實施方案中，所述重鏈和輕鏈的至少一個⑶R (例如，⑶R3)源自非人抗體。⑶R1、CDR2和CDR3的不同組合可以源自非人抗體，并在本文中預(yù)見到。在一個非限制性實施例中，重鏈和輕鏈各自的CDRl、CDR2和CDR3區(qū)域中的一個或多個源自鼠嵌合的單克隆抗體克隆 TRC105。本文使用的術(shù)語“單克隆抗體”表示從基本上同質(zhì)的抗體群體得到的抗體，即，除了可能以微量存在的可能天然存在的突變以外，構(gòu)成該群體的單個抗體是相同的。單克隆抗體是高度特異性的，針對單個抗原位點。此外，不同于常規(guī)的(多克隆的)抗體制品(它們可以包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體)，每個單克隆抗體針對抗原上的單個決定簇。修飾詞“單克隆”指示抗體的特征是從基本上同質(zhì)的抗體群體得到，不應(yīng)解釋為需要通過任何特定方法生產(chǎn)抗體。例如，單克隆抗體可以通過Kohler等人，Nature 256:495(1975)首先描述的雜交瘤方法來制備，或可以通過重組DNA方法(參見，例如，美國專利號4，816，567)來制備。在某些實施方案中，使用例如在Clackson等人，Nature 352:624-628(1991)和Marks等人，J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)中所述的技術(shù)，可以從噬菌體抗體文庫分離出單克隆抗體。通過飽和硫酸銨沉淀、優(yōu)球蛋白(euglobulin)沉淀法、己酸方法、辛酸方法、離子交換色譜法(DEAE或DE52)或使用抗-Ig柱或蛋白A、G或L柱的親和色譜法(諸如下面更詳細(xì)地描述的那些)，可以從上述的培養(yǎng)物上清液或腹水分離和純化抗體。用于本文所述的組合物和方法中的示例性抗體是完整的免疫球蛋白分子，例如，人源化抗體，或人源化Ig分子的含有抗原結(jié)合位點(即，互補位)或單個重鏈和單個輕鏈的那些部分，包括在本領(lǐng)域中稱作Fab、Fab’、F(ab) ’、F(ab') 2、Fd、scFv、可變重結(jié)構(gòu)域、可變輕結(jié)構(gòu)域、可變NAR結(jié)構(gòu)域、雙特異性的scFv、雙特異性的Fab2、三特異性的Fab3和單鏈結(jié)合多肽的那些部分，和也稱作抗原結(jié)合片段的其它片段。當(dāng)構(gòu)建免疫球蛋白分子或其片段時，可變區(qū)或其部分可以與一個或多個恒定區(qū)或其部分融合、連接或以其它方式相連，以生成本文所述的任意抗體其片段。這可以以本領(lǐng)域已知的多種方式來實現(xiàn)，包括但不限于分子克隆技術(shù)，或直接合成編碼所述分子的核酸。構(gòu)建這些分子的示例性的非限制性方法也可以參見本文所述的實施例。在一個示例性的實施方案中，本申請預(yù)見到結(jié)合內(nèi)皮因子的單鏈結(jié)合多肽，其具有重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)，并任選地具有免疫球蛋白Fe區(qū)。在一個示例性的實施方案中，本申請預(yù)見到具有重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)的單鏈結(jié)合多肽，其結(jié)合內(nèi)皮因子，并抑制血管生成，并任選地具有免疫球蛋白Fe區(qū)。這樣的分子是單鏈可變片段，其任選地通過免疫球蛋白Fe區(qū)的存在而具有效應(yīng)子功能或增加的半衰期。制備單鏈結(jié)合多肽的方法是本領(lǐng)域已知的(例如，美 國專利申請?zhí)?005/0238646 )。術(shù)語“種系基因區(qū)段”或“種系序列”表示來自所述種系的基因(單倍體配偶子和形成它們的那些二倍體細(xì)胞)。種系DNA含有多個編碼單個Ig重鏈或輕鏈的基因區(qū)段。這些基因區(qū)段被攜帶在生殖細(xì)胞中，但是在它們排列成功能基因之前，不能被轉(zhuǎn)錄和翻譯成重鏈和輕鏈。在骨髓中的B-細(xì)胞分化過程中，這些基因區(qū)段被能夠產(chǎn)生超過IO8種特異性的動態(tài)遺傳系統(tǒng)隨機地混亂化。種系數(shù)據(jù)庫公開和收集了這些基因區(qū)段中的大部分。本文使用的“免疫反應(yīng)性的”表示這樣的結(jié)合劑、抗體或其片段它們對氨基酸殘基的序列(“結(jié)合位點”或“表位”)是特異性的，且如果與其它肽/蛋白具有交叉反應(yīng)性，則在它們?yōu)榱耸┯糜谌擞猛径渲频乃绞菬o毒的。術(shù)語“結(jié)合”表示在生理條件下由于例如共價、靜電、疏水和離子和/或氫鍵相互作用而發(fā)生的2個分子之間的直接結(jié)合，包括相互作用諸如鹽橋和水橋和任意其它常規(guī)結(jié)合方式。術(shù)語“優(yōu)選地結(jié)合”是指，與它結(jié)合無關(guān)的氨基酸序列相比，結(jié)合劑以更大的親和力結(jié)合結(jié)合位點。優(yōu)選地，與結(jié)合劑對無關(guān)的氨基酸序列的親和力相比，這樣的親和力是至少I倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或至少1000倍。術(shù)語“免疫反應(yīng)性的”和“優(yōu)選地結(jié)合”在本文中可互換地使用。本文使用的術(shù)語“親和力”表示2種試劑的可逆結(jié)合的平衡常數(shù)，并表示為Kd。結(jié)合蛋白對配體的親和力(諸如抗體對表位的親和力)可以是,例如,約100納摩爾(nM)至約0. I nM、約100 nM至約I皮摩爾(pM)或約100 nM至約I飛摩爾(fM)。本文使用的術(shù)語“親合力”表示，2種或更多種試劑的復(fù)合物在稀釋以后對解離的抵抗力。通過諸如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的任意其它技術(shù)等方法，可以測定表觀親和力。通過諸如Scatchard分析或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的任意其它技術(shù)等方法,可以測定親合力。“表位”表示，抗原或其它大分子的能夠與抗體的可變區(qū)結(jié)合槽形成結(jié)合相互作用的部分。這樣的結(jié)合相互作用可以顯示為與一個或多個CDR的一個或多個氨基酸殘基的分子間接觸?？乖Y(jié)合可以涉及，例如，CDR3或CDR3對，或在某些情況下，Vh和\鏈的多達(dá)所有6個CDR的相互作用。表位可以是線性肽序列(即，“連續(xù)的”)，或可以由不連續(xù)的氨基酸序列(即，“構(gòu)象的”或“不連續(xù)的”)組成?？贵w可以識別一個或多個氨基酸序列；因此，表位可以限定超過一個獨特的氨基酸序列。通過肽作圖和本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的序列分析技術(shù)，可以測定由抗體識別的表位。結(jié)合相互作用顯示為與CDR的一個或多個氨基酸殘基的分子間接觸。TRC105是一種嵌合抗體，它是與在美國專利號5，928，641,6, 200, 566、6，190, 660和7，097, 836中描述為Y4-2F1或SN6j的鼠抗體相同的可變氨基酸序列。以前已經(jīng)鑒別出Y4-2F1和SN6j識別(因而TRC105也識別)的表位。術(shù)語“特異性的”表示這樣的情形其中抗體不再顯示出對除了含有抗體識別的表位的抗原以外的分子的任何顯著結(jié)合。該術(shù)語也適用于這樣的情形例如，抗原結(jié)合域?qū)υS多抗原攜帶的特定表位是特異性的，在該情況下，攜帶抗原結(jié)合域的抗體或其抗原結(jié)合片段能夠結(jié)合攜帶所述表位的不同抗原。術(shù)語“優(yōu)選地結(jié)合”或“特異性地結(jié)合”是指，與它結(jié)合無關(guān)的氨基酸序列相比，抗體或其片段以更大的親和力結(jié)合表位，且如果與其它含有所述表位的多肽具有交叉反應(yīng)性，則在它們?yōu)榱耸┯糜谌擞猛径渲频乃绞菬o毒的。在一個方面，與抗體或其片段對無關(guān)的氨基酸序列的親和力相比，這樣的親和力是至少I倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或至少1000倍。術(shù)語“免疫反應(yīng)性的”、“結(jié)合”、“優(yōu)選地結(jié)合”和“特異性地結(jié) 合”在本文中可互換地使用。術(shù)語“結(jié)合”表示在生理條件下由于例如共價、靜電、疏水和離子和/或氫鍵相互作用而發(fā)生的2個分子之間的直接結(jié)合，包括相互作用諸如鹽橋和水橋以及任意其它常規(guī)結(jié)合方式。短語“保守氨基酸置換”表示，在某些共同性質(zhì)基礎(chǔ)上的氨基酸分類。一種定義單個氨基酸之間的共同性質(zhì)的有效方法是，分析同源生物體的對應(yīng)蛋白之間的氨基酸變化的標(biāo)準(zhǔn)化頻率(Schulz, G. E.和 R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure,Springer-Verlag)。根據(jù)這樣的分析,可以確定氨基酸組,其中組內(nèi)氨基酸優(yōu)先彼此互換，并因此在對總蛋白結(jié)構(gòu)的影響方面彼此最相似(Schulz, G. E.和R. H. Schirmer,Principles of Protein Structure, Springer-Verlag)。以這種方式定義的氨基酸組的實例包括
(i)帶電荷組，由Glu和Asp、Lys>Arg和His組成，
(ii)帶正電荷組，由Lys、Arg和His組成，
(iii)帶負(fù)電荷組，由Glu和Asp組成，
(iv)芳族組，由Phe>Tyr和Trp組成，
(V)氮環(huán)組，由His和Trp組成，
(vi)大脂肪族非極性組，由Val、Leu和Ile組成，
(vii)弱極性組，由Met和Cys組成，
(viii)小殘基組，由Ser、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln 和 Pro 組成，
(ix)脂肪族組，由Val、Leu、lie、Met和Cys組成,和 (X)小輕基組，由Ser和Thr組成。除上述組以外，每個氨基酸殘基可形成它自己的組，并且由單個氨基酸形成的組可用單字母和/或三字母縮寫簡單地指代如上所述的本領(lǐng)域中常用的氨基酸。“保守殘基”是在相似蛋白范圍內(nèi)相對不變的氨基酸。通常保守殘基將只發(fā)生被相似氨基酸置換的變化，如以上關(guān)于“保守氨基酸置換”所述。在本文的氨基酸序列中使用的字母“ X ”或“ xaa”意圖表示，20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸中的任一種可以在該位置被替換，除非另外特別指出。為了肽擬似物設(shè)計的目的，在氨基酸序列中的“x”或“xaa”可以被在所述靶序列中的氨基酸的擬似物替換，或所述氨基酸可以被不會干擾肽擬似物活性的基本上任意形式的間隔物替換。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指兩個肽之間或兩個核酸分子之間的序列相似性。同源性和同一性中的每一個可以通過比較每個序列中的位置來確定，所述序列為了比較目的而進(jìn)行比對。當(dāng)所比較的序列中的等同位置被相同的堿基或氨基酸占據(jù)時，則所述分子在此位置是相同的；當(dāng)?shù)韧恢帽幌嗤蛳嗨瓢被釟埢?例如在空間和/或電子性質(zhì)方面相似的)占據(jù)時，則所述分子可稱作在此位置是同源的(相似的)。同源性/相似性或同一性的百分比表示是指，在所比較的序列共有的位置處的相同或相似的氨基酸的數(shù)目的函數(shù)。“無關(guān)的”或“非同源的”序列與本發(fā)明的序列具有小于40%同一性，盡管優(yōu)選小于25%同一性。在比較兩個序列中，殘基(氨基酸或核酸)的缺失或額外殘基的存在，也會降低同一性和同源性/相似性。術(shù)語“同源性”描述了基于數(shù)學(xué)的序列相似性比較，所述序列相似性用來鑒定具有相似功能或基序的基因或蛋白。本發(fā)明的核酸(核苷酸、寡核苷酸)和氨基酸(蛋白)序列可以用作“查詢序列”，對公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，以便例如鑒定其它家族成員、有關(guān)序列或同系物。這樣的搜索可以用 Altschul,等人(1990) J. Mol. Biol. 215:403-10 的 NBLAST 和XBLAST程序(2. 0版)來進(jìn)行。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST程序(分值=100，字長= 12)來進(jìn)行，以獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索可以用XBLAST程序(分值=50，字長=3)來進(jìn)行，以獲得與本發(fā)明的蛋白分子同源的氨基酸序列。為了獲得加入空位的比對用于比較目的，可以如在Altschul等人，(1997) Nucleic Acids Res.25(17) :3389-3402 中所述，利用 Gapped BLAST。當(dāng)用 BLAST 和 Gapped BLAST 程序時，可以使用各個程序(例如XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)(參見，www. ncbi. nlm. nih. gov)。本文所用的“同一性”是指，當(dāng)把兩個或兩個以上序列進(jìn)行比對以使序列匹配最大化時，即考慮空位和插入時，在所述序列的相應(yīng)位置上相同的核苷酸或氨基酸殘基的百分比。同一性可通過已知方法容易地計算，所述方法包括、但不限于以下文獻(xiàn)中描述的方法Computational Molecular Biology, Lesk, A. M.,編，Oxford University Press,New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. ff.,編，Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I,Griffin, A. M.,和Griffin, H. G.,編，Humana Press, New Jersey, 1994; SequenceAnalysis in Molecular Biology, von Heinje, G. , Academic Press, 1987 ;和SequenceAnalysis Primer, Gribskov, M. ^PDevereux, J.,編，M 儲液 ton Press, New York,1991 ;以及 Carillo, H.,和 Lipman, D. , SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)。設(shè)計測定同一性的方法，以給出所測序列之間的最大匹配。此外，測定同一性的方法已被編入公眾可得到的計算機程序中。測定兩個序列之間的同一性的計算機程序方法包括、但不限于GCG 程序包(Devereux, J.,等人，Nucleic Acids Research 12(1): 387(1984) )、BLASTP、BLASTN 和 FASTA (Altschul, S. F.等人，J. Molec. Biol. 215:403-410 (1990)和 Altschul 等人 Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997))。公眾可從NCBI 及其它來源得到BLAST X程序(BLAST Manual, Altschul, S.,等人，NCBI NLM NIHBethesda, Md. 20894; Altschul, S.,等人，J. Mol. Biol. 215: 403-410(1990)。眾所周知的Smith Waterman算法也可以用于測定同一丨丨生。當(dāng)應(yīng)用于多肽時，“分離的”(與“基本上純的”可互換地使用)是指多肽或其一部分，其因為它的來源或操作而(i)存在于宿主細(xì)胞中，作為表達(dá)載體的一部分的表達(dá)產(chǎn)物；或(ii)與它在自然界中相連的那些以外的蛋白或其它化學(xué)部分相連；或(iii)在自然界中不存在，例如，如下化學(xué)操作的蛋白向所述蛋白附加或添加至少一個疏水部分，使得所述蛋白處于在自然界中不存在的形式?！胺蛛x的”另外表示這樣的蛋白，其(i)是化學(xué)合成的；或(ii)在宿主細(xì)胞中表達(dá)，并從結(jié)合的蛋白和污染蛋白中純化出來。該術(shù)語通常是指這樣的多肽其已經(jīng)與它天然地伴隨的其它蛋白和核酸分離開。優(yōu)選地，所述多肽也與用于純化它的物質(zhì)分離，所述物質(zhì)例如抗體或凝膠基質(zhì)(聚丙烯酰胺)。本文使用的術(shù)語“血管生成抑制性的”、“抑制血管生成的”或“抗血管生成的”包括血管發(fā)生的抑制，且意在表示影響新生血管形成的范圍、量或速率的減小。實現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖或組織遷移的范圍、量或速率的減小，是抑制血管生成的具體實例。術(shù)語“血管生成抑制性的組合物”表示這樣的組合物其抑制血管生成介導(dǎo)的過程，諸如內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖、管形成，并隨后導(dǎo)致從現(xiàn)有血管產(chǎn)生新血管的抑制，并從而影響血管生成依賴性的病癥。 本文使用的術(shù)語“血管生成依賴性的病癥”意在表示這樣的病癥其中血管生成或血管發(fā)生的過程支持或增加病理狀態(tài)，或有利地影響正常的生理過程。因此，其中血管生成支持病理狀態(tài)的血管生成依賴性的病癥的治療可能導(dǎo)致疾病的遷移，而其中血管生成有利地影響正常的生理過程的血管生成依賴性的病癥的治療可能導(dǎo)致例如正常過程的增強。血管生成是從預(yù)先存在的毛細(xì)血管或毛細(xì)血管后微靜脈形成新血管。血管發(fā)生源自新血管的形成，所述新血管從成血管細(xì)胞(它們是內(nèi)皮細(xì)胞前體)產(chǎn)生。兩個過程導(dǎo)致新血管形成，并被包括在術(shù)語血管生成依賴性的病癥的含義中。本文使用的術(shù)語“血管生成”意圖包括，血管的重新形成，諸如從血管發(fā)生產(chǎn)生的血管以及從現(xiàn)有血管、毛細(xì)血管和微靜脈的分支和生長產(chǎn)生的血管。血管生成也可以包括，誘導(dǎo)ALKl信號傳遞和有關(guān)的Smad1/5/8磷酸化和/或信號傳遞。還已知⑶105涉入ALKl信號傳遞途徑，因而也被包括在血管生成的含義內(nèi)?！罢T導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答”是指，患者經(jīng)歷疾病的征象或征狀的減輕或減少，具體地包括但不限于生存期的延長。在根據(jù)本發(fā)明的方法的某些優(yōu)選的實施方案中，在施用了拮抗劑的患者中，活化生產(chǎn)⑶8+ IFN-Y的T細(xì)胞，以誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的T淋巴細(xì)胞(CTL)免疫應(yīng)答。在根據(jù)本發(fā)明的方法的某些實施方案中，在施用了所述組合物的患者中，活化生產(chǎn)CD4+IFN- Y的T細(xì)胞，以誘導(dǎo)輔助T細(xì)胞免疫應(yīng)答。這些活化的生產(chǎn)⑶4+ IFN- Y的T細(xì)胞(即，輔助T細(xì)胞)會提供必要的免疫學(xué)幫助(例如，通過細(xì)胞因子的釋放)，以不僅誘導(dǎo)和維持CTL，而且誘導(dǎo)和維持由B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答。因而，在根據(jù)本發(fā)明的方法的某些實施方案中，在施用了所述組合物的患者中，活化對抗原的體液應(yīng)答。在一個方面，可以將佐劑加入所述組合物中，以增加免疫應(yīng)答。佐劑是本領(lǐng)域眾所周知的。⑶8+和/或⑶4+ T細(xì)胞的活化是指，造成具有生產(chǎn)細(xì)胞因子(例如，IFN- y )的能力的T細(xì)胞實際上生產(chǎn)一種或多種細(xì)胞因子，或增加它們對一種或多種細(xì)胞因子的生產(chǎn)?！癈TL應(yīng)答的誘導(dǎo)”是指，造成潛在細(xì)胞毒性的T淋巴細(xì)胞表現(xiàn)出抗原特異性的細(xì)胞毒性。“抗原特異性的細(xì)胞毒性”是指，針對呈遞與癌癥相關(guān)抗原有關(guān)的抗原的細(xì)胞的細(xì)胞毒性大于癌癥不相關(guān)抗原?！凹?xì)胞毒性”表示細(xì)胞毒性的T淋巴細(xì)胞的殺死靶細(xì)胞的能力。這樣的抗原特異性的細(xì)胞毒性可以是對不呈遞癌癥不相關(guān)抗原的細(xì)胞的細(xì)胞毒性的至少約3倍、至少約10倍、至少約100倍或更高。抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)也包括天然殺傷細(xì)胞(“NK細(xì)胞”)的活化，所述天然殺傷細(xì)胞通過抗體結(jié)合來介導(dǎo)細(xì)胞殺死。本文所述的抗體和抗原結(jié)合片段可以通過NK細(xì)胞(通過內(nèi)皮因子的結(jié)合)來介導(dǎo)ADCC。本文使用的術(shù)語“增殖障礙”和“增殖病癥”是指，特征在于異常的或不希望的增殖的任何病理學(xué)的或非病理學(xué)的生理狀況。術(shù)語“細(xì)胞增殖障礙”和“細(xì)胞增殖病癥”是指，特征在于異常的或不希望的細(xì)胞增殖的任何病理學(xué)的或非病理學(xué)的生理狀況，以及包括特征在于不希望的或不需要的細(xì)胞增殖或細(xì)胞存活(例如，由于有缺陷的細(xì)胞凋亡)的病癥，特征在于有缺陷的或異常的或有缺陷的細(xì)胞凋亡的病癥，以及特征在于異常的或不希望的或不需要的細(xì)胞存活的病癥。術(shù)語“分化障礙”是指，特征在于異常的或有缺陷的分化的任何病理學(xué)的或非病理學(xué)的生理狀況。順從治療的增殖或分化障礙包括特征 在于異常的或不希望的細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞生長或細(xì)胞存活的良性的和腫瘤性的疾病和非病理性生理狀況。這樣的障礙或病癥因此可以構(gòu)成疾病狀態(tài)，且包括所有類型的癌性生長或致癌過程、轉(zhuǎn)移組織或惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或器官，或可以是非病理性的，即，偏離正常，但是通常與疾病無關(guān)。根據(jù)本發(fā)明可以治療的非病理狀況的一個具體實例是，來自創(chuàng)傷修復(fù)的組織再生，這會導(dǎo)致瘢痕形成。包含增殖或分化障礙的細(xì)胞可以聚集成細(xì)胞團(tuán)，或是分散的。術(shù)語“實體瘤”表示通常聚集在一起并形成塊的瘤形成或轉(zhuǎn)移灶。具體實例包括內(nèi)臟腫瘤，諸如胃癌或結(jié)腸癌、肝細(xì)胞瘤、腎癌、肺和腦腫瘤/癌癥?！胺菍嶓w瘤”表示造血系統(tǒng)的瘤形成，諸如淋巴瘤、骨髓瘤和白血病，或在性質(zhì)上是擴(kuò)散的瘤形成，因為它們通常不形成實體塊。白血病的具體實例包括例如，急性和慢性淋巴母細(xì)胞性白血病、成髓細(xì)胞白血病和多發(fā)性骨髓瘤。這樣的障礙包括腫瘤或癌癥，它們可以影響基本上任意細(xì)胞或組織類型，例如，癌、肉瘤、黑素瘤、轉(zhuǎn)移性障礙或造血腫瘤性障礙。轉(zhuǎn)移性腫瘤可以源自多種原發(fā)性腫瘤類型，包括但不限于乳房、肺、甲狀腺、頭頸部、腦、淋巴樣、胃腸道(嘴、食道、胃、小腸、結(jié)腸、直腸)、泌尿生殖道(子宮、卵巢、宮頸、膀胱、睪丸、陰莖、前列腺)、腎、胰腺、肝、骨、肌肉、皮膚
坐寸o癌表示上皮或內(nèi)分泌組織的惡性腫瘤，且包括呼吸系統(tǒng)癌、胃腸道系統(tǒng)癌、泌尿生殖系統(tǒng)癌、睪丸癌、乳癌、前列腺癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌和黑素瘤。示例性的癌包括從宮頸、肺、前列腺、乳房、頭頸部、結(jié)腸、肝和卵巢形成的那些。該術(shù)語也包括癌肉瘤，例如，它們包括由癌性和肉瘤性組織組成的惡性腫瘤。腺癌包括腺組織的癌，或其中腫瘤形成腺樣結(jié)構(gòu)。要治療的眼組織是，例如，具有糖尿病視網(wǎng)膜病變、黃斑變性或新生血管性青光眼的患者的視網(wǎng)膜組織，要抑制的血管生成是視網(wǎng)膜組織血管生成，其中存在視網(wǎng)膜組織的新生血管形成。要治療的癌性組織是，例如，表達(dá)異常水平的內(nèi)皮因子的內(nèi)皮組織。本文使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”是指，已經(jīng)自發(fā)地轉(zhuǎn)化成無限制生長狀態(tài)的細(xì)胞，即，它們已經(jīng)獲得通過在培養(yǎng)物中無限數(shù)目的分裂來生長的能力。在它們生長控制缺失方面，可以用諸如腫瘤性的、間變性的和/或增生性的等術(shù)語來表征轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“惡性哺乳動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化表型”和“轉(zhuǎn)化表型”意圖包括、但不限于，與哺乳動物細(xì)胞的細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān)的任何下述表型特性永生化、形態(tài)或生長轉(zhuǎn)化和致腫瘤性(通過在細(xì)胞培養(yǎng)物中的延長生長、在半固體培養(yǎng)基中的生長或在無免疫能力的或同源的動物中的致腫瘤生長來檢測)。術(shù)語“腫瘤細(xì)胞抗原”在本文中被定義為，與無關(guān)的腫瘤細(xì)胞、正常細(xì)胞或在正常體液中相比，抗原以更高的量存在于腫瘤細(xì)胞上或在體液中。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意數(shù)目的試驗，可以測試抗原存在，所述試驗包括但不限于使用抗體的陰性和/或陽性選擇，諸如ELISA試驗、放射免疫測定或通過蛋白印跡。術(shù)語“細(xì)胞凋亡”或“程序化細(xì)胞死亡”表示這樣的生理過程在發(fā)育和其它正常生物學(xué)過程中，通過該過程來消除不希望的或無用的細(xì)胞。細(xì)胞凋亡是在正常生理條件下發(fā)生的細(xì)胞死亡模式，細(xì)胞是它自身的死亡的主參加者(“細(xì)胞自殺”)。它最常見于下述過程中正常的細(xì)胞更新和組織體內(nèi)穩(wěn)態(tài)、胚胎發(fā)生、免疫耐受性的誘導(dǎo)和維持、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和內(nèi)分泌依賴性的組織萎縮。經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞表現(xiàn)出特有的形態(tài)學(xué)和生化特征。這些特征包括染色質(zhì)聚集、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)濃縮、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核分隔成膜結(jié)合的囊泡(凋亡小體，它們含有核糖體)、形態(tài)學(xué)上完整的線粒體和核質(zhì)。在體內(nèi)，這些凋亡小體快速地被巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞或鄰近的上皮細(xì)胞識別和吞噬。由于在體內(nèi)去除凋亡細(xì)胞的這種有效機制，不會引起炎癥應(yīng)答。在體外，凋亡小體以及剩余的細(xì)胞碎片最終膨脹，并最后裂解。該體外細(xì)胞死亡的末期已經(jīng)被稱作“次要壞死”。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，可以測量 細(xì)胞凋亡，所述方法如DNA片段化、膜聯(lián)蛋白V的暴露、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的活化、細(xì) 胞色素C的釋放等。已經(jīng)誘導(dǎo)死亡的細(xì)胞在本文中稱作“凋亡細(xì)胞”?！凹?xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑”在本文中定義為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡/程序化細(xì)胞死亡，且包括，例如，輻照、化療劑或受體連接劑，其中細(xì)胞(例如，腫瘤細(xì)胞)被誘導(dǎo)經(jīng)歷程序化細(xì)胞死亡。在下面更詳細(xì)地描述了示例性的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。使用標(biāo)準(zhǔn)的膜聯(lián)蛋白V細(xì)胞凋亡試驗，可以測試細(xì)胞凋亡在6-孔平板(NUNC)中培養(yǎng)NIH:0VCAR-3細(xì)胞，輻照，或用拮抗劑(或與另一種抗癌藥相組合)處理4-48小時，洗滌，并用膜聯(lián)蛋白V-FITC (BD-Pharmingen)染色I(xiàn)小時。通過流式細(xì)胞術(shù)(Becton-Dickinson, CellQuest)分析細(xì)胞,用碘化丙唳復(fù)染色,并在流式細(xì)胞計中再次分析。B.制備和表達(dá)人源化的抗-內(nèi)皮因子抗體的方法
已經(jīng)開發(fā)了結(jié)合內(nèi)皮因子的嵌合的單克隆抗體。該抗體被命名為TR105 (也稱作c-SN6j)。在一個方面，通過人源化嵌合的單克隆TRC105抗體的'和Vh序列(分別是SEQ IDNO. I和39)，制備了本文所述的抗體和其抗原結(jié)合片段。借助于基因工程，已經(jīng)構(gòu)建了人源化的免疫球蛋白，包括人源化的抗體。以前已經(jīng)描述的大多數(shù)人源化的免疫球蛋白已經(jīng)包含與特定人免疫球蛋白鏈(即，接收體或受體)的框架相同的框架和3個來自非人(S卩，供體)免疫球蛋白鏈的CDR。本文所述的人源化也可以包括這樣的標(biāo)準(zhǔn)通過所述標(biāo)準(zhǔn)，在人源化的免疫球蛋白鏈的框架中鑒別出有限數(shù)目的氨基酸，并選擇為與在供體(而不是接收體)中的那些位置處的氨基酸相同，以便增加或維持包含人源化的免疫球蛋白鏈的抗體的親和力。本發(fā)明部分地基于下述模型即在生產(chǎn)人源化抗體(例如，使用小鼠抗體作為CDR來源)的現(xiàn)有技術(shù)中造成親和力損失的2個促成原因是(I)當(dāng)小鼠CDR與人框架相化合時，框架中接近CDR的氨基酸變成人的，而不是小鼠的。無意受理論的約束，這些變化的氨基酸可能輕微的改變CDR (例如，它們可能產(chǎn)生不同于供體小鼠抗體的靜電力或疏水力，且改變的-CDR可能不會象在供體抗體中的CDR那樣與抗原發(fā)生有效接觸);(2)另外，靠近CDRJM不是所述CDR的一部分(即，仍然是框架的一部分)的初始小鼠抗體中的氨基酸可與抗原發(fā)生有助于親和力的接觸。當(dāng)抗體被人源化時，會喪失這些氨基酸，因為所有的框架氨基酸通常都是人的。為了避免這些問題，并且為了產(chǎn)生對期望的抗原具有非常強的親和力的人源化抗體，采用下列原則中的一條或多條，可以構(gòu)建人源化抗體和其抗原結(jié)合片段。一條非限制性原則是，例如，采用來自與要人源化的供體免疫球蛋白通常同源的特定人免疫球蛋白的框架作為受體，或者采用來自許多人抗體的共有框架作為受體。例如，數(shù)據(jù)庫(例如，全國生物醫(yī)學(xué)研究基金會蛋白鑒定資源(National Biomedical ResearchFoundation Protein Identification Resource)或國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information, NCBI)的蛋白序列數(shù)據(jù)庫)中的小鼠重鏈(或輕鏈)可變區(qū)與人重鏈(或輕鏈)可變區(qū)的序列比較表明，對于不同的人區(qū)域，同源性程度變化很大，例如約40%至約60%、約70%、約80%或更高。通過選擇與供體免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)最同源的人重鏈可變區(qū)之一作為受體免疫球蛋白，在從供體免疫球蛋白變成人源化免疫球蛋白中將會改變更少的氨基酸。通過選擇與供體免疫球蛋白的輕鏈可變區(qū)最同源的人輕鏈可變區(qū)之一作為受體免疫球蛋白，在從供體免疫球蛋白變成人源化免疫球蛋白中將會改 變更少的氨基酸。通常，使用這樣的技術(shù)，存在更小的機會來改變一個或多個CDR附近的氨基酸并從而改變它們的構(gòu)象。此外，包含人源化免疫球蛋白鏈的人源化抗體的精確總體形狀可能更接近類似于供體抗體的形狀，由此也減少了使⑶R變形的機會。也可以使用來自與受體序列相同的人抗體的輕鏈和重鏈，以提高人源化的輕鏈和重鏈彼此發(fā)生有利接觸的可能性?；蛘?，也可以使用來自與受體序列不同的人抗體種系序列的輕鏈和重鏈；當(dāng)使用這樣的組合時，使用常規(guī)試驗(例如，ELISA)，可以容易地確定'是否結(jié)合目標(biāo)表位。在一個實施例中，將會選擇這樣的人抗體，其中輕鏈和重鏈可變區(qū)序列(一并考慮)整體與供體輕鏈和重鏈可變區(qū)序列最同源。有時，將會更偏重于重鏈序列。不管怎樣選擇受體免疫球蛋白，在某些情況下，通過選擇人源化免疫球蛋白鏈框架中的少量氨基酸，使其與供體(而不是受體)中那些位置處的氨基酸相同，可以實現(xiàn)更高的親和力。親和力成熟方法是本領(lǐng)域已知的。就用于人治療而言，人源化抗體通常具有至少3個優(yōu)于小鼠或嵌合抗體的潛在優(yōu)點。因為抗體的效應(yīng)部分是人的，認(rèn)為它會與人免疫系統(tǒng)的其它部分更好地相互作用(例如，通過補體依賴性的細(xì)胞毒性(CDC)或抗體依賴性的細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)更有效地破壞靶細(xì)胞)。另外，人免疫系統(tǒng)不會將人源化抗體的框架或恒定區(qū)識別為外來物，因此針對這樣的注射的抗體的抗體應(yīng)答會小于針對完全外來的小鼠抗體或部分外來的嵌合抗體的抗體應(yīng)答。最后，已知小鼠抗體在人循環(huán)中的半衰期遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于人抗體的半衰期。據(jù)推測，人源化抗體可以具有與天然存在的人抗體更類似的半衰期，這允許施用更小的且更低頻率的劑量。通過本領(lǐng)域已知的和本文描述的多種方法，可以實現(xiàn)抗體和其抗原結(jié)合片段的人源化。類似地，通過本領(lǐng)域已知的和本文描述的方法，也可以實現(xiàn)人源化抗體的生產(chǎn)。修飾框架區(qū)的方法是本領(lǐng)域已知的，且在本文中預(yù)見到。用以變更的一個或多個有關(guān)框架氨基酸位置的選擇，取決于多種標(biāo)準(zhǔn)。選擇用以改變的有關(guān)框架氨基酸的一種標(biāo)準(zhǔn)可以是，在供體分子與受體分子之間在氨基酸框架殘基中的相對差異。使用該方案來選擇用以變更的有關(guān)框架位置，具有避免在殘基確定中的任何主觀偏差或在殘基對CDR結(jié)合親和力的貢獻(xiàn)中的任何偏差的優(yōu)勢。用于確定用以改變的有關(guān)氨基酸位置的另一個標(biāo)準(zhǔn)可以是，例如，選擇已知是重要的或有助于CDR構(gòu)象的框架殘基。例如，規(guī)范的框架殘基對于CDR構(gòu)象和/或結(jié)構(gòu)而言是重要的。規(guī)范框架殘基作為用以改變的有關(guān)位置的靶向，可以用于鑒別在其相關(guān)的供體CDR序列背景中更適合的氨基酸殘基。氨基酸殘基在特定框架位置處的頻率是另一個標(biāo)準(zhǔn)，其可用于選擇所要改變的有關(guān)框架氨基酸位置。例如，所選框架與其亞家族內(nèi)的其它框架序列的比較，可以揭示在一個或多個特定位置處以較小頻率出現(xiàn)的殘基。接納不太豐富的殘基的位置，可類似地適用于選擇作為在受體可變區(qū)框架中所要變更的位置。例如，基于與CDR的近似度，也可以選擇用以改變的有關(guān)氨基酸位置。在某些背景下，F(xiàn)R殘基可以參與CDR構(gòu)象和/或抗原結(jié)合。此外，該標(biāo)準(zhǔn)可類似地用于把通過本文所 述的其它標(biāo)準(zhǔn)選出的有關(guān)位置區(qū)分優(yōu)先次序。因此，區(qū)分在一個或多個CDR的近側(cè)和遠(yuǎn)側(cè)的殘基，代表減少所要改變的有關(guān)位置的數(shù)目的一種方法。用于選擇所要變更的有關(guān)氨基酸框架位置的其它標(biāo)準(zhǔn)包括，例如，已知或預(yù)測存在于抗原-CDR界面附近的三維空間中的殘基，或預(yù)測會調(diào)節(jié)CDR活性的殘基。類似地，可選擇已知或預(yù)測在重鏈可變區(qū)(Vh)和輕鏈可變區(qū)(')界面之間形成接觸的框架殘基。通過調(diào)節(jié)⑶R結(jié)合槽、抗原(表位)相互作用或V1^P '相互作用，這樣的框架位置可以影響⑶R的構(gòu)象和/或親和力。因此，選擇這些氨基酸位置來構(gòu)建用于篩選結(jié)合活性的不同群體，可以用于鑒別框架變化，所述框架變化替代對CDR構(gòu)象具有不利影響的殘基，或抵償對框架中別處存在的殘基的不利影響?？蛇x擇用于變更的其它框架殘基包括溶劑難以接近的氨基酸位置。這樣的殘基通常隱匿在可變區(qū)中，且因此能夠影響CDR的構(gòu)象或V1^P '相互作用。例如，從由多肽的氨基酸側(cè)鏈和/或由已知的三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)所創(chuàng)造的環(huán)境的相對疏水性，可以預(yù)測溶劑的可接近性。在于供體CDR中選擇有關(guān)氨基酸位置、以及在想要改變的框架區(qū)中選擇任意有關(guān)氨基酸位置之后，可以將在某些或全部所選位置處的氨基酸變化摻入受體可變區(qū)框架和供體⑶R的編碼核酸中?？梢詥蝹€地制備并測試變更的框架或⑶R序列，或者可以順序地或同時地化合并測試。在任意或全部變更位置的可變性范圍可以是從幾個至多個不同氨基酸殘基，包括所有二十種天然存在的氨基酸或其功能等價物和類似物。在某些情況下，也可以考慮非天然存在的氨基酸，且是本領(lǐng)域已知的。用以改變的氨基酸位置的數(shù)目及定位的選擇是靈活的，且可以取決于用來鑒別具有理想活性(例如相對于供體可變區(qū)而言基本相同的或更高的結(jié)合親和力)的變更可變區(qū)的預(yù)期用途和所想要的效率。在這方面，摻入經(jīng)變更的可變區(qū)群體中的變化的數(shù)目越大，則對展示出理想活性(例如，與供體基本相同的或高于供體的結(jié)合親和力)的至少一個物種的鑒別更有效?；蛘?，如果使用者具有關(guān)于某些氨基酸殘基或位置不均衡地有助于結(jié)合親和力的影響的經(jīng)驗或?qū)嶋H數(shù)據(jù)，那么可希望產(chǎn)生變更可變區(qū)的有限群體，其集中在那些經(jīng)鑒別的殘基或位置之內(nèi)或周圍的變化。例如，若需要⑶R移植的可變區(qū)，則經(jīng)變更的可變區(qū)的大的不同的群體可以包括在供體和受體框架與所有單一 CDR氨基酸位置變化之間的所有非相同框架區(qū)位置?；蛘撸虚g差異的群體可以包括子集，例如僅為要與所有單一 CDR氨基酸位置變化一起摻入(例如，為了增加人源化抗體或抗原結(jié)合片段的親和力)的近側(cè)非相同框架位置的子集的子集，。例如，通過另外包括所有成對的CDR氨基酸位置變化，可進(jìn)一步增加上述群體的差異。相比而言，可以類似地進(jìn)行構(gòu)建集中在預(yù)定殘基或位置(其在少至一個框架和/或一個⑶R氨基酸殘基位置處摻入變體殘基)上的群體，用于篩選和鑒別變更的抗體可變區(qū)。與上述群體一樣，通過另外擴(kuò)展所選擇用以改變的位置，以包括在框架和CDR區(qū)中的任一個或兩者中的其它有關(guān)位置，可以進(jìn)一步增加這樣的集中群體的差異。在可以另外采用的框架區(qū)和CDR中的任一個或兩者中，存在從很少變化到許多變化的范圍的許多其它組合，所有這些組合將產(chǎn)生經(jīng)變更的可變區(qū)群體，可以篩選該群體以鑒別具有所想要活性(例如，對內(nèi)皮因子的結(jié)合活性)的至少一個CDR移植的變更的可變區(qū)?；诒疚闹刑峁┑慕虒?dǎo)和引導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道或者可確定，在框架或供體CDR或其子集中哪個所選的殘基位置可進(jìn)行改變以產(chǎn)生用于篩選和鑒別本發(fā)明的變更的抗體的群體。編碼氨基酸的密碼子是本領(lǐng)域已知 的。另一種人源化抗體的方法包括稱作“超人源化(superhumanization)”的方法。超人源化包括下述步驟得到由非人成熟抗體基因編碼的主題可變區(qū)的肽序列，并鑒別在非人抗體可變區(qū)內(nèi)的至少2個⑶R的第一組規(guī)范⑶R結(jié)構(gòu)類型。規(guī)范⑶R結(jié)構(gòu)類型是通過Chothia (CITE)命名的結(jié)構(gòu)類型。Chothia及其同事發(fā)現(xiàn)，許多抗體的⑶R的關(guān)鍵部分采用幾乎相同的肽主鏈構(gòu)象，盡管在氨基酸序列水平的差異巨大。因此，Chothia為每條鏈中的每個CDR定義了一個或幾個“規(guī)范結(jié)構(gòu)”。每個規(guī)范結(jié)構(gòu)主要為形成環(huán)的氨基酸殘基的連續(xù)區(qū)段指定一組肽主鏈扭轉(zhuǎn)角。在鑒定規(guī)范CDR結(jié)構(gòu)類型以后，也得到人抗體的人抗體可變區(qū)的肽序列文庫。該文庫含有種系核酸區(qū)段編碼的人種系可變區(qū)序列，且可能包括成熟的人抗體序列。在任一種情況下，所述方法都包括，鑒別出在人可變區(qū)序列文庫內(nèi)的每個序列的至少兩個CDR的規(guī)范CDR結(jié)構(gòu)類型(即，第二組規(guī)范CDR結(jié)構(gòu)類型)。如下從該文庫中選擇出候選序列的子集通過比較第一組規(guī)范⑶R結(jié)構(gòu)類型與第二組規(guī)范⑶R結(jié)構(gòu)類型(即，比較在可變區(qū)內(nèi)的相應(yīng)位置處的小鼠規(guī)范CDR結(jié)構(gòu)類型與人規(guī)范CDR結(jié)構(gòu)類型)，并選擇這樣的人序列其中就分別在非人與人可變區(qū)內(nèi)的相應(yīng)位置處的⑶R序列而言，第二組規(guī)范⑶R結(jié)構(gòu)與第一組規(guī)范CDR結(jié)構(gòu)類型相同。本方法使用這些候選的人可變區(qū)序列作為構(gòu)建嵌合分子的基礎(chǔ)，所述嵌合分子包括與來自候選的人可變區(qū)序列的構(gòu)架區(qū)結(jié)合的來自非人可變區(qū)的至少兩個CDR序列(例如小鼠CDR)。該構(gòu)建的結(jié)果是，所述嵌合抗體含有在可變區(qū)的相應(yīng)位置處用于置換每個人CDR序列的每個非人CDR序列，使得嵌合抗體的框架序列不同于候選的人框架序列。在兩個水平上評價每個結(jié)構(gòu)域與候選的人抗體序列的主題CDR的相似性。首先，尋找三維構(gòu)象完全一樣的⑶R肽主鏈。試驗性確定主題⑶R的原子坐標(biāo)幾乎是不可能的，因此如下近似確定三維相似性確定主題⑶R的Chothia規(guī)范結(jié)構(gòu)類型，并從進(jìn)一步分析中排除具有不同規(guī)范結(jié)構(gòu)的候選序列。其次，分析主題CDR與剩余的人候選CDR之間的殘基對殘基的同源性，并選擇具有最高同源性的候選序列。選擇最高同源性是基于，用于評級具有與主題非人可變區(qū)相同的規(guī)范結(jié)構(gòu)的候選人可變區(qū)的各種標(biāo)準(zhǔn)。用于評級所選擇組的成員的標(biāo)準(zhǔn)，可以是氨基酸序列同一性或氨基酸同源性或兩者。氨基酸同一性是通過氨基酸殘基的位點對位點匹配得到的簡單評分。氨基酸同源性所確定的相似性是特征性的殘基結(jié)構(gòu)中的位點對位點的相似性。例如，根據(jù) Henikoff 和 Henikoff, (1992) Amino acid substitution matrices from proteinblocks, Proc. Natl. Acad. Sci 89: 10915-10919 所描述的表和規(guī)程,或通過 Henikoff和Henikoff，(1996)所描述的BLOSUM系列，可以對同源性評分。步驟如下
a)確定出主題抗體的重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的肽序列。可以用幾種方法中的任一種方法確定出這些序列，例如在傳統(tǒng)cDNA克隆后對各個基因進(jìn)行DNA測序；對已經(jīng)通過聚合酶鏈反應(yīng)從主題雜交瘤系的逆轉(zhuǎn)錄物或DNA擴(kuò)增得到的克隆產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序；或?qū)兓目贵w蛋白進(jìn)行肽測序。b)將Kabat編號系統(tǒng)(Kabat等，同上，1991)應(yīng)用于主題非人抗體的重鏈及輕鏈序列。確定出主題非人抗體的每一個CDR的規(guī)范結(jié)構(gòu)類型。如下完成此確定根據(jù)Chothia和 Lesk (1987)、Chothia 等人(1992)、Tomlinson 等人(1995)、Martin 和 Thornton (1996)和Al-Lazikani等人(1997)所討論的指南,檢查肽序列。 每一個⑶R規(guī)范結(jié)構(gòu)確定的顯著特點如下。對于重鏈⑶R1，目前已知有三種規(guī)范結(jié)構(gòu)類型。對新序列的指定是直截了當(dāng)?shù)?，因為每種規(guī)范結(jié)構(gòu)類型具有不同的殘基數(shù)目。如在Al-Lazikani等人(1997)中所描述的，當(dāng)將Kabat編號指定給序列時,對于各個規(guī)范結(jié)構(gòu)，殘基31-35的編號如下
規(guī)范結(jié)構(gòu)類型I: 31、32、33、34、35。規(guī)范結(jié)構(gòu)類型2: 31、32、33、34、35、35a。規(guī)范結(jié)構(gòu)類型3: 31、32、33、34、35、35a、35b。對于重鏈⑶R2，目前已知有四種規(guī)范結(jié)構(gòu)類型。一些結(jié)構(gòu)類型具有獨特的殘基數(shù)目，從它們的位點52-56的獨特的Kabat編號，可以將它們輕易地區(qū)別開，即
規(guī)范結(jié)構(gòu)類型I: 52、53、54、55、56。規(guī)范結(jié)構(gòu)類型4: 52、52a、52b、52c、53、54、55、56。重鏈⑶R2的規(guī)范結(jié)構(gòu)類型2與3具有相同的殘基數(shù)目，因此必須通過它們序列內(nèi)的線索進(jìn)行區(qū)別，如在Chothia等(1992 )中所討論的。含有這些線索的片段的Kabat編號為52、52a、53、54、55。規(guī)范類型2在52a位點為Pro或Ser，在55位點為GLy或Ser, M在其它位點沒有限制。規(guī)范類型3在54位點為Gly、Ser、Asn或Asp，而在其它位點沒有限制。在大多數(shù)情況下，這些標(biāo)準(zhǔn)足以進(jìn)行正確的指定。另外，對于規(guī)范類型2，構(gòu)架殘基71通常是Ala、Val、Leu、Ile或Thr,而對于規(guī)范類型3,通常是Arg。重鏈⑶R3是所有⑶R中變化最多的一種⑶R。它是通過淋巴細(xì)胞特有的遺傳學(xué)過程(一些具有隨機性質(zhì))所生成。因此，難以預(yù)測⑶R3的規(guī)范結(jié)構(gòu)。在任何情況下，人種系V基因片段都不編碼⑶R3的任何部分；因為V基因片段終止于Kabat位點94，而位點95至102編碼⑶R3。因為這些原因，選擇候選人序列時通常不考慮⑶R3的規(guī)范結(jié)構(gòu)。對于輕鏈⑶R1，在K鏈上目前已知有⑶Rl的六種規(guī)范類型結(jié)構(gòu)。每種規(guī)范類型結(jié)構(gòu)具有不同的殘基數(shù)目，因此，從殘基位點27-31的Kabat編號，顯而易見給新序列指定的規(guī)范類型結(jié)構(gòu)。規(guī)范結(jié)構(gòu)類型I: 27、29、30、31。
規(guī)范結(jié)構(gòu)類型2: 27、28、29、30、31。規(guī)范結(jié)構(gòu)類型3: 27、27a、27b、27c、27d、27e、27f、28、29、30、31。規(guī)范結(jié)構(gòu)類型4: 27、27a、27b、27c 、27d、27e、28、29、30、31。規(guī)范結(jié)構(gòu)類型5: 27、27a、27b、27c、27d、28、29、30、31。規(guī)范結(jié)構(gòu)類型6: 27、27a、28、29、30、31。對于輕鏈⑶R2，在K鏈上已知⑶R2只有一種規(guī)范結(jié)構(gòu)類型，因此，除了特殊的主題抗體序列外，指定是自動的。對于輕鏈CDR3，在K鏈上已經(jīng)描述了 CDR3的最多到6種規(guī)范結(jié)構(gòu)類型，但其中三種是罕見的。三種常見的規(guī)范結(jié)構(gòu)類型可以通過它們的長度來區(qū)別，反映為殘基位點91-97的Kabat編號
規(guī)范結(jié)構(gòu)類型I 91、92、93、94、95、96、97 (在位點95處必須是Pro，在位點90處必須是 Gin、Asn 或 His)。規(guī)范結(jié)構(gòu)類型3: 91、92、93、94、95、97.
規(guī)范結(jié)構(gòu)類型 5: 91、92、93、94、95、96、96a、97。在鑒別出主題非人抗體的規(guī)范⑶R結(jié)構(gòu)類型后，鑒別出具有與主題抗體同樣的規(guī)范結(jié)構(gòu)類型組合的相同鏈類型(重鏈或輕鏈)的人基因，以形成人序列的候選集合。這些基因片段的絕大多數(shù)已經(jīng)被闡明，并已經(jīng)被指定到一種規(guī)范結(jié)構(gòu)類型(Chothia等人，1992，Tomlinson 等人，1995)。對于重鏈，評價了⑶Rl和⑶R2與小鼠規(guī)范結(jié)構(gòu)類型的一致性，排除了不一致的基因。對于輕鏈，首先評價了每個人序列的CDRl和CDR2與主題抗體的規(guī)范結(jié)構(gòu)類型的一致性。如下評價候選的V K基因的殘基89-95形成與主題抗體一樣的規(guī)范結(jié)構(gòu)類型的CDR3的能力使所述基因與J區(qū)融合，并將CDR3的規(guī)范CDR結(jié)構(gòu)類型的確定標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用于所述融合的序列，并排除不符合的序列。或者，當(dāng)主題抗體的可變結(jié)構(gòu)域具有人基因組所沒有的規(guī)范結(jié)構(gòu)類型時，則考慮用于比較的是這樣的人種系V基因其具有三維上相似的、但不同的規(guī)范結(jié)構(gòu)類型。這樣的情況經(jīng)常出現(xiàn)在鼠抗體的K鏈⑶Rl上，包括下面描述的兩個實施例。在鼠抗體的這個⑶R處，已經(jīng)觀察到所有6種可能的規(guī)范結(jié)構(gòu)類型，而人基因組只編碼規(guī)范類型2、3、4和6。在這些情況下，可以選擇用于比較的是這樣的規(guī)范CDR結(jié)構(gòu)類型其具有在主題非人序列的氨基酸殘基長度的兩倍內(nèi)的氨基酸殘基長度。例如，如果在主題抗體中發(fā)現(xiàn)I型規(guī)范結(jié)構(gòu)，那么用于比較的是具有規(guī)范結(jié)構(gòu)類型2的人VK序列。如果在鼠抗體中發(fā)現(xiàn)的是5型規(guī)范結(jié)構(gòu)，那么用于比較的是具有規(guī)范結(jié)構(gòu)類型3或4的人Vk序列。成熟的、重排的人抗體序列可被考慮用于序列比較。在多種情況下，可以有這種考慮，所述情況包括但不限定于下述情況其中，成熟的人序列(I)與種系非常接近；(2)已知在人體內(nèi)沒有免疫原性；或(3)含有與主題抗體相同的的、但在人種系中沒有發(fā)現(xiàn)的規(guī)范結(jié)構(gòu)類型。對于每一個具有匹配的規(guī)范結(jié)構(gòu)類型的候選V基因，也評估與主題序列的殘基對殘基的序列同一性和/或同源性，以評級候選人序列。例如，評估的殘基如下=(I)Kappa()輕鏈 CDR 氨基酸殘基位置是 CDRl (26-32)、CDR2 (50-52)、CDR3 (91-96);和(2)重鏈⑶R氨基酸殘基位置是⑶Rl (31-35)和⑶R2 (50-60)。另外，也可以考慮重鏈⑶R3氨基酸殘基位置95至102。
首先，通過主題序列與候選人序列之間的相同氨基酸殘基的數(shù)目，將殘基對殘基的同源性評分。從最高評分前25%的候選序列中，選出用于隨后構(gòu)建轉(zhuǎn)化抗體的人序列。在適當(dāng)時，諸如當(dāng)一些候選序列具有相似的同一性評分時，還可以根據(jù)需要另外考慮非一致的氨基酸殘基之間的相似性。在評分中添加了主題殘基與目標(biāo)殘基之間的脂肪族與脂肪族、芳香族與芳香族或極性與極性的匹配。在另一個實施例中，使用氨基酸置換矩陣，例如Henikoff和Henikoff的BL0SUM62矩陣，可以進(jìn)行序列同源性的定量評估。從已知的人種系J片段組中，可以選出⑶R3序列的C末端構(gòu)架區(qū)的目標(biāo)序列。通過使用上面提及的特異地用于評估候選的V基因的評分標(biāo)準(zhǔn)評估每個J片段的殘基對殘基的同源性(就CDR3與J重疊的序列位點而言)，選出J肽序列。從最高評分的前25%候選序列中，選出用于隨后構(gòu)建轉(zhuǎn)化抗體的J基因片段肽序列。
作為一個實例，嵌合的可變鏈含有來自主題非人序列的至少兩個CDR以及來自候選人序列的框架序列。在另一個實施例中，嵌合的輕鏈含有來自主題非人序列的三個CDR以及來自候選人序列的框架序列。在其它實施例中，嵌合的重鏈含有含有來自主題重鏈的至少兩個CDR以及來自候選人重鏈的框架序列，或者，嵌合的重鏈含有來自主題重鏈的每一個CDR以及來自候選人重鏈的框架序列。在另一個實施例中，嵌合抗體重鏈含有來自主題非人序列的CDRl和2以及CDR3的殘基50-60以及來自候選人重鏈的CDR的殘基61-65，以及候選人序列的框架序列。在另一個實施例中，嵌合的重鏈序列含有來自主題非人序列的每一個CDR ;來自主題序列的框架序列27-30，以及來自候選序列的框架序列。然而，在所有情況下，嵌合抗體分子含有的框架序列與候選人可變結(jié)構(gòu)域的框架序列的差異不超過10個氨基酸殘基。當(dāng)希望增加的人源化抗體的親和力時，可以額外地用其它氨基酸置換轉(zhuǎn)化抗體的CDR內(nèi)的殘基。通常，改變CDR中的不超過4個氨基酸殘基，更通常地，改變CDR中的不超過2個殘基，但是重鏈CDR2除外，這時可以改變多達(dá)10個殘基。通過常規(guī)方法，例如本文所述的那些(例如，Biacore),可以測量親和力的變化。在美國專利號6，881，557 (它通過引用整體并入本文)中，更詳細(xì)地描述了超人源化抗體的方法。使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)，可以構(gòu)建和生產(chǎn)人源化抗體和抗原結(jié)合片段。另外，經(jīng)?？梢源罅可a(chǎn)重組制備的抗體，特別當(dāng)使用高水平表達(dá)載體時。使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)，可以對抗體測序。在一個方面，將一個或多個CDR的氨基酸序列插入合成序列(例如，人抗體(或其抗原結(jié)合片段)框架的合成序列)中，以產(chǎn)生這樣的人抗體其會限制用非人抗體治療人患者時的不利副反應(yīng)。也可以將一個或多個⑶R的氨基酸序列插入合成序列(例如，結(jié)合蛋白諸如AVIMER )中，以產(chǎn)生用于施用給人患者的構(gòu)建體。根據(jù)要治療的動物的物種，可以改進(jìn)這樣的技術(shù)。例如，就獸醫(yī)學(xué)應(yīng)用而言，可以合成抗體、抗原結(jié)合片段或結(jié)合蛋白，用于施用給非人動物(例如，靈長類動物、牛、馬
-Tf- ) o在另一個方面，使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)，諸如在本文中提供和并入的那些技術(shù)，可以將編碼一個或多個⑶R的氨基酸序列的核苷酸插入(例如，通過重組技術(shù))編碼抗體、抗原結(jié)合片段或結(jié)合蛋白的現(xiàn)有多核苷酸的限制性內(nèi)切核酸酶位點中。為了表達(dá)，表達(dá)系統(tǒng)是這樣的系統(tǒng)其利用GS系統(tǒng)(Lonza)，使用谷氨酰胺合成酶基因作為選擇標(biāo)記。簡而言之，使用GS系統(tǒng)(Lonza)，使用谷氨酰胺合成酶基因作為選擇標(biāo)記，通過電穿孔(250V)，在CHO細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在含有10%透析的胎牛血清(FCS，含有
2mM谷氨酰胺)的DMEM (Sigma)中，培養(yǎng)野生型CHO細(xì)胞。通過電穿孔，用300呢線性化的DNA，轉(zhuǎn)染6xl07 CHO細(xì)胞。在電穿孔以后，將細(xì)胞重新懸浮于含有谷氨酰胺的DMEM中，涂布在36x96-孔平板(50耵/孔)上，在5% CO2中在37 °C溫育。次日，加入150W/孔的選擇性培養(yǎng)基(沒有谷氨酰胺的DMEM)。在大約3周以后，使用無關(guān)的抗體作為陰性對照，通過ELISA (參見下面)篩選菌落。在24-孔平板中繁殖生產(chǎn)>20l^g/ml的所有菌落，然后在雙份T25燒瓶中繁殖。為了高水平生產(chǎn)，最廣泛使用的哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)是這樣的系統(tǒng)其利用由二氫葉酸還原酶缺陷型(“dhfr-”)中國倉鼠卵巢細(xì)胞提供的基因擴(kuò)增操作。所述系統(tǒng)是技術(shù)人員眾所周知的。所述系統(tǒng)是基于脫氫葉酸鹽還原酶“過/r”基因，該基因編碼DHFR酶，該酶催化脫氫葉酸鹽向四氫葉酸鹽的轉(zhuǎn)化。為了實現(xiàn)高產(chǎn)量，用含有功能性DHFR基因(以及編碼目標(biāo)蛋白的基因)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染dhfr- CHO細(xì)胞。在該情況下，目標(biāo)蛋白是重組抗體重鏈和/或輕鏈。
通過增加競爭性DHFR抑制劑甲氨蝶呤(MTX)的量，重組細(xì)胞會通過擴(kuò)增過/r基因來產(chǎn)生抗性。在標(biāo)準(zhǔn)情況下，采用的擴(kuò)增單元遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于過/r基因的大小，結(jié)果共擴(kuò)增抗體重鏈_。當(dāng)希望大規(guī)模生產(chǎn)蛋白(諸如抗體鏈)時，考慮采用的細(xì)胞的表達(dá)水平和穩(wěn)定性。在長期培養(yǎng)中，重組CHO細(xì)胞群體在擴(kuò)增過程中喪失在它們的特異性抗體生產(chǎn)力方面的同質(zhì)性，即使它們源自單個親代克隆。本申請?zhí)峁┝司幋a本文所述的抗體或抗原結(jié)合片段的分離的多核苷酸(核酸)、含有這種多核苷酸的載體以及用于將這種多核苷酸轉(zhuǎn)錄和翻譯成多肽的宿主細(xì)胞和表達(dá)系統(tǒng)。本申請也提供了質(zhì)粒、載體、轉(zhuǎn)錄或表達(dá)盒形式的構(gòu)建體，其包含至少一個上述的多核苷酸。本申請也提供了重組宿主細(xì)胞，其包含一個或多個上述的構(gòu)建體。編碼本文所述的任意抗體或其抗原結(jié)合片段的核酸按照提供的那樣自身形成本申請的一個方面，本文所述的抗體或其抗原結(jié)合片段的生產(chǎn)方法也形成本申請的一個方面，所述方法包括從來源的編碼核酸進(jìn)行表達(dá)。通過在適當(dāng)條件下培養(yǎng)含有所述核酸的重組宿主細(xì)胞，可以方便地進(jìn)行表達(dá)。在通過表達(dá)來生產(chǎn)以后，使用任意合適的技術(shù)，可以分離和/或純化抗體或抗原結(jié)合片段，然后適當(dāng)?shù)厥褂??？梢詮睦缢鼈兊奶烊画h(huán)境中，以基本上純的或同質(zhì)的形式提供、分離和/或純化本文所述的特定抗體、抗原結(jié)合片段和編碼核酸和載體。在核酸的情況下，除了編碼具有所需功能的多肽的序列以外，游離的或基本上游離的核酸或基因來源。核酸可以包括DNA或RNA，且可以是完全或部分合成的。純化方法是本領(lǐng)域眾所周知的。用于在多種不同的宿主細(xì)胞中克隆和表達(dá)多肽的系統(tǒng)是眾所周知的。合適的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、哺乳動物細(xì)胞、酵母和桿狀病毒系統(tǒng)。在本領(lǐng)域中可用于表達(dá)異源多肽的哺乳動物細(xì)胞系包括中國倉鼠卵巢細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼侖鼠腎細(xì)胞、NSO小鼠骨髓瘤細(xì)胞和許多其它細(xì)胞。常見的細(xì)菌宿主是大腸桿菌。
抗體和抗體片段在原核細(xì)胞(諸如大腸桿菌)中的表達(dá)在本領(lǐng)域中是非常確定的。關(guān)于綜述，參見例如 Pliickthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991)。在培養(yǎng)的真核細(xì)胞中的表達(dá)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的，作為生產(chǎn)本文所述的抗體和抗原結(jié)合片段的一個選擇，最新的綜述參見，例如Raff, M. E. (1993)Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576;Trill J. J.等人(1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560,它們中的每一篇通過引用整體并入本文。可以選擇或構(gòu)建合適的載體，其含有適當(dāng)調(diào)節(jié)的序列，包括啟動子序列、終止子序列、聚腺苷酸化序列、增強子序列、標(biāo)志物基因和適當(dāng)?shù)钠渌蛄?。載體可以是適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒、病毒載體，例如曬菌體或曬粒。關(guān)于其它細(xì)節(jié)，參見，例如，Molecular Cloning: aLaboratory Manual:第 2 版，Sambrook 等人，1989, Cold Spring Harbor LaboratoryPress。許多已知的核酸操作技術(shù)和方法，例如核酸構(gòu)建體的制備、誘變、測序、將DNA導(dǎo)入細(xì)胞中和基因表達(dá)以及蛋白的分析，詳細(xì)描述在Short Protocols in Molecular Biology,第 2版，Ausubel 等人編，John Wiley & Sons, IggZtjSambrook等人和Ausubel等人的方法和公開內(nèi)容通過引用整體并入本文，且是本領(lǐng)域眾所周知的。因而，另一個方面提供了一種宿主細(xì)胞，其含有本文公開的核酸。另一個方面提供了一種方法，所述方法包括將這樣的核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。所述導(dǎo)入可以采用任何可利用的技術(shù)。對于真核細(xì)胞，合適的技術(shù)可以包括，例如，磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE葡聚糖、電穿孔、月旨質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它病毒(例如，牛痘，或者對于昆蟲細(xì)胞，桿狀病毒)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。對于細(xì)菌細(xì)胞，合適的技術(shù)可以包括，例如，氯化鈣轉(zhuǎn)化、電穿孔和使用噬菌體的轉(zhuǎn)染。在導(dǎo)入之后，可以造成或允許核酸的表達(dá)，例如通過在基因表達(dá)條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。在一個實施方案中，將核酸整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組(例如染色體)中。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過包含促進(jìn)與基因組的重組的序列，可以促進(jìn)整合。根據(jù)需要，可以初始化Ig增強，以使表達(dá)最大化。本申請也提供了一種方法，所述方法包括在表達(dá)系統(tǒng)中使用上述的構(gòu)建體，以便表達(dá)上述的抗體或其抗原結(jié)合片段。本申請也涉及分離的核酸，諸如重組DNA分子或克隆的基因或其簡并變體、突變體、類似物或其片段，它們編碼本文所述的結(jié)合內(nèi)皮因子的抗體或抗原結(jié)合序列。在一個方面，本申請?zhí)峁┝艘环N核酸，其編碼本文所述的結(jié)合內(nèi)皮因子的抗體或其抗原結(jié)合片段。在另一個實施方案中，本文所述的抗體或抗原結(jié)合片段的重組DNA分子或克隆的基因的完整DNA序列可以可操作地連接到表達(dá)控制序列上，后者可以導(dǎo)入適當(dāng)宿主中。本申請因此延伸至單細(xì)胞宿主，所述宿主被抗體的克隆基因或包含編碼抗體的Vh和/或 '或其部分的DNA序列的重組DNA分子轉(zhuǎn)化。另一個特征是，本文公開的DNA序列的表達(dá)。如本領(lǐng)域眾所周知的，可以如下表達(dá)DNA序列將它們可操作地連接至適當(dāng)表達(dá)載體中的表達(dá)控制序列上，并采用該表達(dá)載體來轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)膯渭?xì)胞宿主。DNA序列與表達(dá)控制序列的這種可操作連接當(dāng)然地包括(如果不是DNA序列的一部分)在DNA序列上游的正確讀碼框中，提供起始密碼子ATG?？梢砸苑蛛x的和/或純化的形式(例如，編碼具有所需功能的多肽的多核苷酸以外的來源的游離的或基本上游離的多核苷酸)提供多核苷酸和載體。本文使用的“基本上純的”和“基本上游離的”表示，含有少于例如約20%或更少外來物、約10%或更少外來物、約5%或更少外來物、約4%或更少外來物、約3%或更少外來物、約2%或更少外來物或約1%或更少外來物 溶液或懸浮液。多種宿主/表達(dá)載體組合可以用于表達(dá)本發(fā)明的DNA序列。有用的表達(dá)載體，例如，可以由染色體的、非染色體的和合成的DNA序列的區(qū)段組成。合適的載體包括、但不限于SV40和已知的細(xì)菌質(zhì)粒的衍生物，例如，大腸桿菌質(zhì)粒col El、Pcrl、Pbr322、Pmb9和它們的衍生物，質(zhì)粒諸如RP4 ;噬菌體DNA，例如，噬菌體入的眾多衍生物，例如，NM989和其它噬菌體DNA，例如，M13和絲狀單鏈?zhǔn)删wDNA ;酵母質(zhì)粒諸如2u質(zhì)?；蚱溲苌铮豢捎糜谡婧思?xì)胞中的載體，諸如可用于昆蟲或哺乳動物細(xì)胞中的載體；源自質(zhì)粒和噬菌體DNA的組合的載體，諸如已經(jīng)被修飾成采用噬菌體DNA或其它表達(dá)控制序列的質(zhì)粒；等。本文也提供了一種重組宿主細(xì)胞，其包含一種或多種多核苷酸構(gòu)建體。編碼本文提供的抗體或抗原結(jié)合片段的多核苷酸形成本申請的一個方面，抗體或抗原結(jié)合片段的生產(chǎn)方法也形成本申請的一個方面，所述方法包括從多核苷酸進(jìn)行表達(dá)。例如，通過在適當(dāng)條件下培養(yǎng)含有所述多核苷酸的重組宿主細(xì)胞，可以實現(xiàn)表達(dá)。然后使用任意合適的技術(shù)，可以分離和/或純化抗體或抗原結(jié)合片段，并適當(dāng)?shù)厥褂?。多種表達(dá)控制序列(控制可操作地連接到它上的DNA序列的表達(dá)的序列)中的任一種可以用于這些載體中，以表達(dá)DNA序列。這樣的有用的表達(dá)控制序列包括，例如，SV40的早期或晚期啟動子、CMV、牛痘、多瘤或腺病毒、Iac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、TAC系統(tǒng)、TRC系統(tǒng)、LTR系統(tǒng)、噬菌體\的主要操縱基因和啟動子區(qū)、fd外殼蛋白的控制區(qū)、3-磷酸甘油酸酯激酶或其它糖酵解酶的啟動子、酸性磷酸酶的啟動子(例如，Pho5)、酵母交配因子的啟動子和已知控制原核或真核細(xì)胞的基因或它們的病毒和它們的不同組合的表達(dá)的其它序列。用于在多種不同的宿主細(xì)胞中克隆和表達(dá)多肽的系統(tǒng)是眾所周知的。合適的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、哺乳動物細(xì)胞、酵母和桿狀病毒系統(tǒng)。在本領(lǐng)域中可用于表達(dá)異源多肽的哺乳動物細(xì)胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼倉鼠腎細(xì)胞、NSO小鼠骨髓瘤細(xì)胞和許多其它細(xì)胞。一種常見的細(xì)菌宿主是，例如，大腸桿菌?？贵w或抗原結(jié)合片段在原核細(xì)胞(諸如大腸桿菌)中的表達(dá)在本領(lǐng)域中是非常確定的。關(guān)于綜述，參見例如 PlUckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991)。在培養(yǎng)的真核細(xì)胞中的表達(dá)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的(Raff, M. E. (1993) Curr. OpinionBiotech. 4: 573-576; Trill J. J.等人(1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560)。多種單細(xì)胞宿主細(xì)胞也可用于表達(dá)DNA序列。這些宿主包括眾所周知的真核和原核宿主，諸如在組織培養(yǎng)物中的大腸桿菌、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬、真菌(諸如酵母)和動物細(xì)胞(諸如CH0、YB/20、NS0、SP2/0、R1. 1、B_W和L-M細(xì)胞、非洲綠猴腎細(xì)胞(例如，COS I、COS 7、BSC1、BSC40和BMT10))、昆蟲細(xì)胞(例如，Sf9)和人細(xì)胞和植物細(xì)胞的菌株。應(yīng)當(dāng)理解，并非所有載體、表達(dá)控制序列和宿主同樣好地起表達(dá)DNA序列的功能。也并非所有宿主對相同的表達(dá)系統(tǒng)同樣好地起作用。但是，無需過多實驗，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇適當(dāng)?shù)妮d體、表達(dá)控制序列和宿主，以實現(xiàn)希望的表達(dá)，而不脫離本申請的范圍。例如，在選擇載體時，必須考慮宿主，因為所述載體必須在所述宿主中發(fā)揮功能。還會考慮載體的拷貝數(shù)、控制該拷貝數(shù)的能力以及由所述載體編碼的任意其它蛋白(諸如抗生素標(biāo)志物)的表達(dá)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以選擇適當(dāng)?shù)妮d體、表達(dá)控制序列和宿主，以實現(xiàn)希望的表達(dá)，而不脫離本申請的范圍。例如，例如，在選擇載體時，考慮宿主，因為所述載體必須在所述宿主中發(fā)揮功能。還可以考慮載體的拷貝數(shù)、控制該拷貝數(shù)的能力以及由所述載體編碼的任意其它蛋白(諸如抗生素標(biāo)志物)的表達(dá)。本申請也提供了在本文別處所述的質(zhì)粒、載體、轉(zhuǎn)錄或表達(dá)盒形式的構(gòu)建體，它們包括至少一個上述的多核苷酸?？梢赃x擇或構(gòu)建合適的載體，其含有適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列，包括啟動子序列、終止子序列、聚腺苷酸化序列、增強子序列、選擇標(biāo)記和適當(dāng)?shù)钠渌蛄?。載體可以是適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒、病毒載體，例如適當(dāng)?shù)氖删w、噬粒等。關(guān)于其它細(xì)節(jié)，參見，例如，Molecular Cloning: a Laboratory Manual:第 2 版，Sambrook 等人，1989，ColdSpring Harbor Laboratory Press。許多已知的核酸操作技術(shù)和方法，例如核酸構(gòu)建體的制備、誘變、測序、將DNA導(dǎo)入細(xì)胞中和基因表達(dá)以及蛋白的分析，詳細(xì)描述在=ShortProtocols in Molecular Biology,第 2 版，Ausubel 等人編，John Wiley & Sons, 1992。Sambrook等人和Ausubel等人的方法和公開內(nèi)容通過引用整體并入本文。在選擇表達(dá)控制序列時，通?？紤]多種因素。這些因素包括，例如，系統(tǒng)的相對強度、它的可控性和它與要表達(dá)的特定DNA序列或基因的相容性，特別是在潛在二級結(jié)構(gòu)方面。通過考慮例如它們與選擇的載體的相容性、它們的分泌特征、它們的正確折疊蛋白的能力、和它們的發(fā)酵需要以及由要表達(dá)的DNA序列編碼的產(chǎn)物對宿主的毒性和表達(dá)產(chǎn)物的純化容易性，選擇合適的單細(xì)胞宿主。另一個方面提供了一種宿主細(xì)胞，其含有一種或多種本文公開的多核苷酸。另一個方面提供了通過任意可利用的技術(shù)將這樣的一種或多種多核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的方法。對于真核細(xì)胞，合適的技術(shù)可以包括，例如，磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE葡聚糖、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它病毒(例如，牛痘，或者對于昆蟲細(xì)胞，桿狀病毒)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。對于細(xì)菌細(xì)胞，合適的技術(shù)可以包括，例如，氯化鈣轉(zhuǎn)化、電穿孔和使用噬菌體的轉(zhuǎn)染。在導(dǎo)入之后，可以造成或允許一個或多個多核苷酸的表達(dá)，例如通過在從一個或多個多核苷酸表達(dá)一種或多種多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞?？梢允褂每烧T導(dǎo)的系統(tǒng)，并通過加入活化劑來誘導(dǎo)表達(dá)。在一個實施方案中，可以將多核苷酸整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組(例如染色體)中。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過包含促進(jìn)與基因組的重組的序列，可以促進(jìn)整合。在另一個實施方案中，所述核酸維持在宿主細(xì)胞中的附加型載體上。本文提供了這樣的方法，所述方法包括在表達(dá)系統(tǒng)中使用上述的構(gòu)建體，以便表達(dá)特定多肽?？紤]到這些和其它因素，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠構(gòu)建多種載體/表達(dá)控制序列/宿主組合，它們在發(fā)酵或大規(guī)模動物培養(yǎng)中表達(dá)所述DNA序列。除了克隆以外，或作為克隆的替代，可以重組地/合成地制備編碼抗體、抗原結(jié)合片段或結(jié)合蛋白的多核苷酸?？梢詫⒍嗪塑账嵩O(shè)計成具有抗體、抗原結(jié)合片段或結(jié)合蛋白的適當(dāng)密碼子。一般而言，如果序列要用于表達(dá)，可以選擇對于目標(biāo)宿主而言優(yōu)選的密碼子?？梢詮耐ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)方法制備的重疊寡核苷酸裝配完整多核苷酸，并裝配成完整編碼序列。參見，例如，Edge, Nature, 292:756 (1981) ;Nambair等人，Science, 223:1299 (1984)；Jay 等人，J. Biol. Chem. , 259:6311 (1984)。將非天然氨基酸位點特異性地?fù)饺氲鞍字械囊话惴椒?，參見Christopher J.Noren, Spencer J. Anthony-Cahi11, Michael C. Griffith, Peter G. Schultz,Science, 244:182-188( 1989年4月)。該方法可以用于產(chǎn)生具有非天然氨基酸的類似物。如上所述，除了克隆以外，可以合成地制備編碼抗體或其抗原結(jié)合片段的DNA序列?？梢詫⑺鯠NA序列設(shè)計成具有抗體或抗原結(jié)合片段氨基酸序列的適當(dāng)密碼子。一般而言，如果序列要用于表達(dá)，可以選擇對于目標(biāo)宿主而言優(yōu)選的密碼子?？梢詮耐ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)方法制備的重疊寡核苷酸裝配完整序列，并裝配成完整編碼序列。參見，例如，Edge，Nature,292:756 (1981) ;Nambair等人，Science, 223:1299 (1984) Jay等人，J. Biol. Chem., 259:6311 (1984)，它們中的每一篇通過引用整體并入本文。C.免疫原性的計算機分析
如果需要的話，可以評估本文所述的抗體或其抗原結(jié)合片段的免疫原性，并根據(jù)需要，去免疫化(即通過改變一個或多個T細(xì)胞表位,使所述抗體具有更低的免疫反應(yīng)性)。通過使用軟件和專門的數(shù)據(jù)庫，可以分析在本文所述的人源化的抗-內(nèi)皮因子抗體和抗原結(jié)合片段中存在的免疫原性和T-細(xì)胞表位。示例性的軟件和數(shù)據(jù)庫包括由英格蘭的Antitopeof Cambridge開發(fā)的iTope 。iTope 是一種用于分析肽與人MHC II類等位基因的結(jié)合的計算機技術(shù)。所述iTope 軟件會預(yù)測肽與人MHC II類等位基因的結(jié)合，并從而提供這樣的“潛在T細(xì)胞表位”的位置的初步篩選。iTope "軟件會預(yù)測肽的氨基酸側(cè)鏈和34個人MHC II類等位基因的結(jié)合槽內(nèi)的特定結(jié)合槽之間的有利相互作用。通過計算機產(chǎn)生9聚體肽(它們重疊一個氨基酸，所述氨基酸跨實驗抗體可變區(qū)序列)，獲取關(guān)鍵結(jié)合殘基的位置。可以相對于34個MHC II類同種異型中的每一個，測試每個9聚體肽，并基于它們與MHC II類結(jié)合槽的潛在“擬合”和相互作用，進(jìn)行評分。相對于>50%的MHC II類等位基因產(chǎn)生高平均結(jié)合評分(在iTope 評分函數(shù)中，>0. 55)的肽，被視作潛在T細(xì)胞表位。在這樣的區(qū)域中，分析在MHC II類槽內(nèi)的肽結(jié)合所用的核心9氨基酸序列，以測定MHC II類槽殘基(P1、P4、P6、P7和P9 )和可能的T細(xì)胞受體(TCR)接觸殘基(P_1、P2、P3、P5、P8 )。在鑒別任何T-細(xì)胞表位以后，可以導(dǎo)入氨基酸殘基變化、置換、添加和/或刪除，以去除鑒別的T-細(xì)胞表位?？梢宰龀鲞@樣的變化，從而在仍然去除鑒別的表位的同時，保持抗體結(jié)構(gòu)和功能。示例性的變化可以包括、但不限于保守的氨基酸變化。利用重組MHC分子與合成肽的可溶性復(fù)合物的技術(shù)，已經(jīng)得到應(yīng)用。這些試劑和方法可以用于鑒定人或?qū)嶒瀯游锸茉囌叩耐庵苎獦又心芙Y(jié)合特定MHC-肽復(fù)合物的T細(xì)胞克隆的存在，但是這些試劑和方法不適于篩選各種MHC同種異型的多種潛在表位。T細(xì)胞活化的生物學(xué)測定，提供了一個解讀受試肽/蛋白序列引起免疫應(yīng)答的能力的實用選擇。該類方法的實例包括使用針對細(xì)菌蛋白葡萄球菌激酶的T細(xì)胞增殖測定，然后用合成肽刺激T細(xì)胞系的表位作圖。類似地，使用破傷風(fēng)毒素蛋白的合成肽進(jìn)行的T細(xì)胞增殖試驗，已經(jīng)導(dǎo)致該毒素的免疫顯性表位區(qū)域的確定。在一個實施方案中，可以如下確定受試蛋白的T-細(xì)胞表位利用分離的人免疫細(xì)胞子集，促進(jìn)它們的體外分化，并在合成的目標(biāo)肽存在下培養(yǎng)細(xì)胞，測量培養(yǎng)的T細(xì)胞中任何誘導(dǎo)的增殖。也可以使用其它技術(shù)。這樣的技術(shù)包括，小心地應(yīng)用細(xì)胞分離技術(shù)和使用多種細(xì)胞因子補充物的細(xì)胞培養(yǎng)，以得到所需的免疫細(xì)胞子集(樹突細(xì)胞、CD4+和/或CD8+T細(xì)胞)。在另一個實施方案中，可以如下確定T細(xì)胞表位在抗體中的存在將所述抗體加給分離的人免疫細(xì)胞子集，并評估它們的體外分化，測量培養(yǎng)的T細(xì)胞中任何誘導(dǎo)的增殖。也可以使用計算機技術(shù)來確定多種治療性蛋白的MHC II類配體。但是，由于諸如需要蛋白水解加工和其它生理步驟(所述步驟導(dǎo)致免疫原性肽體內(nèi)呈遞)等原因，通過基于計算機的方案可定義的整個肽庫的子集具有最終的生物學(xué)相關(guān)性。因而，離體人T-細(xì)胞活化試驗可以用于確定多肽的蛋白序列中能夠支持T細(xì)胞活化并因此與該蛋白的免疫原性在生物學(xué)上最相關(guān)的區(qū)域。本文使用的“T-細(xì)胞表位”表示這樣的氨基酸序列，其能夠結(jié)合MHC II類、能夠刺激T細(xì)胞和/或也在與MHC II類的復(fù)合物中結(jié)合(不必可測得地活化)T細(xì)胞。根據(jù)本文提供的方法，測試合成肽或整個抗體的引起體外培養(yǎng)的人T細(xì)胞產(chǎn)生增殖反應(yīng)的能力。所述T細(xì)胞存在于外周血單核細(xì)胞(PBMC)層內(nèi)，后者易于通過熟知的方法 從全血樣本獲得。此外，所述PBMC制備物含有生理比例的T細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞，并因此是在體外進(jìn)行替代免疫反應(yīng)的良好材料來源。在這樣的試驗的操作中，靠近2. 0或大于2. 0的刺激指數(shù)是誘導(dǎo)的增殖的一個有用的度量。但是，刺激指數(shù)可能隨抗體或其抗原結(jié)合片段而異，且可以參照每種抗體或其抗原結(jié)合片段和對應(yīng)的肽文庫的基線來建立。在這樣的測試的一個實施例中，可以常規(guī)地如下衍生出刺激指數(shù)(SI):將所測定的針對受試肽的增殖分值(例如，如果使用例如3H-胸苷摻入，每分鐘的放射性計數(shù))除以在未與受試肽接觸的細(xì)胞中測得的分值。不引起反應(yīng)的肽可能產(chǎn)生SI = 1.0，而在0.8-1. 2的范圍內(nèi)的SI值也可能是常見的。為了確保所記錄分值的可信性，可將許多技術(shù)方法結(jié)合入此類試驗的操作中。通常，所有的測定均至少一式三份地進(jìn)行，并計算平均分值。如果所計算的SI =>
2.0，則可對三份中的單個分值檢查偏離數(shù)據(jù)的證據(jù)。使受試肽以至少兩種不同的濃度與細(xì)胞接觸，并且所述濃度之間一般最少有兩倍濃度差異。這樣的濃度范圍會提供所述試驗的動力學(xué)范圍的偏置，并且在單個時間點(例如在第7天)測定時可能是有用的。在一些試驗中，可進(jìn)行多時程測定，也可以使用在最少兩種不同的濃度提供的肽免疫原進(jìn)行這些測定。同樣，在每個試驗板中可包括對照肽，其中所述對照肽預(yù)期對大多數(shù)PBMC供體樣本為反應(yīng)性的。流感血細(xì)胞凝集素肽307-319序列PKYVKQNTLKLA (SEQ ID NO: 104)和衣原體HSP60肽序列KVVDQIKKISKPVQH (SEQ ID NO: 105)是用于這樣的試驗中的對照肽的實例。替代地，或額外地，所述試驗也可以使用有效的完整蛋白抗原如來自Keyhole Limpet的血藍(lán)蛋白，預(yù)期所有的PBMC樣本對所述抗原會顯示明顯大于2. 0的SI。用于這樣的用途的其它對照抗原是本領(lǐng)域眾所周知的。本文公開的方法可以提供抗體或其抗原結(jié)合片段的表位圖譜，其中所述圖譜與可能的MHC同種異型的寬范圍相關(guān)。所述圖譜可以具有足夠的代表性，使得可以設(shè)計或選擇經(jīng)修飾的蛋白，對于可能施用所述蛋白的患者中的大多數(shù)而言，所述蛋白的引起T細(xì)胞驅(qū)動的免疫應(yīng)答的能力消失或至少改善。改善可以表示，與未修飾的蛋白相比，免疫應(yīng)答減少(即，減少的免疫原性)(例如減少了約I. 5倍、減少了約2倍、減少了約5倍、減少了約10倍、減少了約20倍、減少了約50倍、減少了約100倍、減少了約200倍、減少了約500倍或更多，或它們中的任意范圍)。或者，具有減少的免疫原性的抗體或其抗原結(jié)合片段可以表示，與未修飾的蛋白相比，它的引起免疫應(yīng)答的能力的減少百分比(例如減少了約1%、減少了約2%、減少了約3%、減少了約4%、減少了約5%、減少了約10%、減少了約20%、減少了約50%、減少了約100%和它們中的任意范圍)因此，在篩選方法的實踐中，從具有足夠免疫多樣性的供體庫中收集來自原初供體PBMC衍生的T細(xì)胞，以提供在人群中至少大于90%的MHC II類庫(HLA-DR)的樣本。如果欲對給定的合成肽(或抗體)檢測原初T細(xì)胞應(yīng)答，在實踐中使該肽(或抗體)與源自多個分別供體的PBMC制品接觸；對于實踐目的而言，供體的數(shù)量(或“供體庫”大小)不可能小于20個不相關(guān)個體，并且供體庫中的所有樣本根據(jù)它們的MHC II類單倍型進(jìn)行預(yù)選擇。本文使用的術(shù)語“原初供體”表示以前沒有暴露(無論是在環(huán)境中、通過疫苗接種，還是通過其它方式，例如，輸血)于本文所述的抗體或其抗原結(jié)合片段的受試者。
當(dāng)篩選T-細(xì)胞表位時，可以從外周血樣本獲得T細(xì)胞，所述外周血樣本來自沒有接受所述蛋白治療的多個不同健康供體。如果需要的話，使用常規(guī)試驗(諸如ELISA，其使用抗體來鑒別一種或多種多肽的存在與否)，可以測試患者血液樣品中特定多肽的存在。所述試驗使用體外培養(yǎng)的PBMC來進(jìn)行，其中使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法，并包括，使PBMC與目標(biāo)蛋白的代表性的合成肽物質(zhì)(即文庫)或整個蛋白(諸如抗體)接觸，在合適的溫育時間后，測量誘導(dǎo)的T細(xì)胞活化，諸如細(xì)胞增殖。測定可以通過任意合適的方法來進(jìn)行，并且可以例如使用H3-胸苷摻入來進(jìn)行，由此易于通過實驗室儀器測定H3在細(xì)胞物質(zhì)中的積累。與在未處理的PBMC樣本中看到的相應(yīng)值相比，可以檢查PBMC樣品和合成肽的每種組合或整個蛋白的細(xì)胞增殖程度。也可參照在用預(yù)期具有增殖作用的一種或多種肽或整個蛋白處理以后所看到的增殖反應(yīng)。關(guān)于此，有利地使用具有已知的寬MHC限制性的肽或整個蛋白，尤其是對DP或DQ同種型具有MHC限制的肽表位，盡管本發(fā)明不限于這樣的限制的肽或蛋白的應(yīng)用。在上面，例如關(guān)于流感血細(xì)胞凝集素和衣原體HSP60，已經(jīng)描述了這樣的肽。在一個非限制性實施例中，使用本文所述的方法，繪制T-細(xì)胞表位的圖譜，并隨后修改。為了促進(jìn)表位圖譜的組裝，生產(chǎn)了合成肽的文庫。每個肽的長度為15個氨基酸殘基，且每個與該系列中的下一個肽重疊12個氨基酸殘基，即在該系列中的每個連續(xù)肽漸增地添加另外3個氨基酸用于分析。以此方式，肽的任一特定相鄰對會反映連續(xù)序列的18個氨基酸。在下面的實施例I中例證了使用原初T細(xì)胞試驗確定T-細(xì)胞圖譜的一種方法。據(jù)提示，通過確定T-細(xì)胞圖譜的方法鑒別出的每種肽能夠結(jié)合MHC II類，并以足夠的親和力與至少一種同源TCR結(jié)合，從而引起在試驗系統(tǒng)中可檢測到的增殖爆發(fā)。在另一個非限制性實施例中，評估加工抗體以產(chǎn)生T-細(xì)胞表位的可能性，所述生T-細(xì)胞表位能夠結(jié)合MHC II類，并以足夠的親和力與至少一種同源TCR結(jié)合，從而引起在試驗系統(tǒng)中可檢測到的增殖爆發(fā)。以多種方法中的任一種，包括使用重組方法，可以制備本文所述的分子。本文提供的蛋白序列和信息可以用于推論編碼氨基酸序列的多核苷酸(DNA)。這可以例如使用計算機軟件工具(諸如DNAtar軟件套件[DNAtar Inc, Madison, Wis., USA]或類似的工具)來實現(xiàn)。在本文中預(yù)見到編碼多肽或重要的同系物、變體、截短、延長或它們的進(jìn)一步修飾的任意這樣的多核苷酸。本文提供了繪制T-細(xì)胞表位的圖譜(鑒別T-細(xì)胞表位)的方法，和修飾所述表位使得被修飾的序列減少(部分地或完全地)T-輔助應(yīng)答的誘導(dǎo)的方法。修飾包括，在編碼修飾的多肽的多核苷酸的密碼子中產(chǎn)生的氨基酸置換、刪除或插入，以影響類似的變化。編碼氨基酸殘基的密碼子是本領(lǐng)域眾所周知的?？赡苁褂弥亟MDNA方法來實現(xiàn)靶序列的定向誘變，許多這樣的技術(shù)是可得到的、描述在本文中和本領(lǐng)域已知的，諸如描述在上面。一般而言，定位誘變技術(shù)是眾所周知的。簡而言之，采用噬菌體載體，其產(chǎn)生用于寡核苷酸指導(dǎo)的PCR誘變的單鏈模板。噬菌體載體(例如M13)是可商業(yè)得到的，它們的應(yīng)用通常是本領(lǐng)域眾所周知的。類似地，雙鏈質(zhì)粒也常規(guī)地用于定位誘變中，這會消除將目標(biāo)多核苷酸從噬菌體轉(zhuǎn)移至質(zhì)粒的步驟?？梢允褂脭y帶希望的突變序列的合成寡核苷酸引物來指導(dǎo)從該模板體外合成修飾的(希望的突變體)DNA,并使用異源雙鏈體DNA來轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，用于生長選擇和所需克隆的鑒別。或者，可以在PCR反應(yīng)使一對引物與雙鏈載體的2條單獨的鏈對合，以同時合成具有希望的突變的兩條對應(yīng)互補鏈。在一個實施方案中，可以采用Quick Change定位誘變方法,該方法使用質(zhì)粒DNA模板。使用含有希望的突變的2種合成寡核苷酸引物，可以實現(xiàn)含有插入片段的插入靶基因的質(zhì)粒模板的PCR擴(kuò)增。通過誘變級PfuTurbo DNA聚合酶，在溫度循環(huán)中延長寡核苷酸引物，每種引物與載體的相反鏈互補。寡核苷酸引物摻入以后，制備含有交錯切口的突變質(zhì)粒。用Dpn I處理擴(kuò)增的未甲基化的產(chǎn)物，以消化甲基化的親代DNA模板，并選擇用于含有突變的新合成的DNA。由于從大多數(shù)大腸桿菌菌株分離出的DNA被dam甲基化，它對Dpn I消化是敏感的，所述Dpn I對甲基化的和半甲基化的DNA是特異性的。將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌的高效率菌株中，以得到含有希望的修飾的質(zhì)粒。用于將氨基酸修飾導(dǎo)入多肽中的其它方法是本領(lǐng)域眾所周知的，且也可以用于本文中。對所述蛋白的合適修飾可包括，特定殘基或殘基組合的氨基酸置換。為了消除T-細(xì)胞表位，在所預(yù)測的氨基酸序列內(nèi)的合適位點或氨基酸殘基處進(jìn)行氨基酸置換，以實現(xiàn)T-細(xì)胞表位活性的減小或消除。在實踐中，合適的位點或氨基酸殘基優(yōu)選地等同于在MHC II類結(jié)合槽內(nèi)所提供的口袋之一內(nèi)結(jié)合的氨基酸殘基。這樣的修飾可能改變在所述肽的所謂的“P1”或“P1錨”位置處在裂縫的第一口袋內(nèi)的結(jié)合。肽的Pl錨殘基和MHC II類結(jié)合槽的第一口袋之間的結(jié)合相互作用的質(zhì)量，被公認(rèn)為整個肽的總結(jié)合親和力的主要 決定因素。在氨基酸序列的該位置的適當(dāng)置換，通常會摻入不易容納到所述口袋中的氨基酸殘基(例如，置換為更親水的殘基)。所述肽中處于如下位置的氨基酸殘基也被考慮到并落入本發(fā)明的范圍內(nèi)所述位置為與在MHC結(jié)合裂縫內(nèi)的其它口袋區(qū)域結(jié)合的位置。應(yīng)當(dāng)理解，在給定的潛在T-細(xì)胞表位內(nèi)的單個氨基酸修飾代表可以用于消除一個或多個T-細(xì)胞表位的途徑?？梢灶A(yù)見到在單個表位內(nèi)的修飾組合，且在單獨定義的表位彼此重疊的情況下，可能是適當(dāng)?shù)?。此外，氨基酸修?在給定的表位內(nèi)單獨地，或在單個表位內(nèi)組合地)可以發(fā)生在非對應(yīng)于MHC II類結(jié)合槽的“口袋殘基”的位置，而是在所述氨基酸序列內(nèi)的任意位點處。基于所述多肽的已知結(jié)構(gòu)特征，參照使用本領(lǐng)域已知且在本文中描述的計算機技術(shù)產(chǎn)生的同源結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)方法，可以做出修飾。可以考慮恢復(fù)變體分子的結(jié)構(gòu)或生物活性的改變(修飾)。此類補償性改變還可以包括對多肽中的特定氨基酸殘基的刪除或添加(插入)。另外，可以做出這樣的修飾，所述修飾改變分子的結(jié)構(gòu)和/或降低分子的生物活性，并也消除T-細(xì)胞表位，從而減少分子的免疫原性。在本文中預(yù)見到所有類型的修飾。
從蛋白分子中去除表位的另一種方法是，協(xié)同使用本文描繪的原初T細(xì)胞活化試驗方案以及根據(jù)在WO 02/069232 (它也通過引用全部并入本文中)中描述的方案開發(fā)出的計算機工具。該軟件在多肽-MHC II類結(jié)合相互作用水平上模擬抗原呈遞過程，以提供對任一特定多肽序列的結(jié)合分值。對在人群中存在的許多主要MHC II類同種異型，測定這樣的分值。由于該方案能夠測試任意多肽序列，可以在多肽與MHC II類結(jié)合槽相互作用的能力方面預(yù)測氨基酸置換、添加或刪除的后果。由此，可以設(shè)計這樣的新序列組合物，其含有減少數(shù)目的能夠與MHC II類相互作用并從而作為免疫原性的T-細(xì)胞表位發(fā)揮作用的氨基酸。在使用任一種給定供體樣本的生物試驗可以評估與最多4種DR同種異型的結(jié)合的情況下，計算機方法可同時使用超過40種同種異型測試相同的多肽序列。在實踐中，該方案能夠指導(dǎo)新序列變體的設(shè)計，所述新序列變體在與多種MHC同種異型相互作用的能力方面有所改變。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚置換的多種備選集合可達(dá)到去除不需要的表位的目的。但是，認(rèn)為所得到的序列與本文公開的具體組合物密切同源，并因此落入本申請的范圍。關(guān)于表位作圖和使用基于生物學(xué)的T細(xì)胞活化試驗任選地重新測試，使用用于鑒 別MHC II類配體的計算機工具和缺乏MHC II類配體的序列類似物的設(shè)計的組合方案，是本申請的另一種方法和實施方案。根據(jù)該實施方案的一般方法包括以下步驟
i)使用原初T細(xì)胞活化試驗和合成肽(它們合起來包括目標(biāo)蛋白序列)，鑒別能夠活化T細(xì)胞的表位區(qū)域；
ii)使用模擬肽配體與一種或多種MHC同種異型結(jié)合的計算方案，分析在步驟(i)中鑒別出的表位區(qū)域，并從而鑒別在表位區(qū)域內(nèi)的MHC II類配體；
iii)使用模擬肽配體與一種或多種MHC同種異型結(jié)合的計算方案，鑒別在表位區(qū)中所包含的MHC配體的序列類似物，所述序列類似物不再結(jié)合MHC II類或以降低的親和力結(jié)合更少數(shù)目的MHC同種異型；和任選地，
iv)使用原初T細(xì)胞活化試驗和合成肽(它們?nèi)炕蚝掀饋戆谀繕?biāo)蛋白中鑒別的表位區(qū))，并在原初T細(xì)胞活化試驗中與野生型(親本)序列平行地測試所述序列類似物。在一個實施方案中，制備修飾的抗體或其抗原結(jié)合片段(與未修飾的抗體或其抗原結(jié)合片段相比，其表現(xiàn)出降低的免疫原性)的方法包括在抗體或其抗原結(jié)合片段的氨基酸序列內(nèi)，鑒別出至少一個T-細(xì)胞表位，并修飾在至少一個鑒別出的T-細(xì)胞表位內(nèi)的至少一個氨基酸殘基。在另一個實施方案中，通過下述方法，生產(chǎn)修飾的抗體或其抗原結(jié)合片段(與未修飾的抗體或其抗原結(jié)合片段相比，其表現(xiàn)出降低的免疫原性)，所述方法包括在抗體或其抗原結(jié)合片段的氨基酸序列內(nèi)，鑒別出至少一個T-細(xì)胞表位，并修飾在至少一個鑒別出的T-細(xì)胞表位內(nèi)的至少一個氨基酸殘基。在另一個實施方案中，選擇修飾的抗體或其抗原結(jié)合片段(與未修飾的抗體或其抗原結(jié)合片段相比，其表現(xiàn)出降低的免疫原性)的方法包括在抗體或其抗原結(jié)合片段的氨基酸序列內(nèi)，鑒別出至少一個T-細(xì)胞表位，修飾在至少一個鑒別出的T-細(xì)胞表位內(nèi)的至少一個氨基酸殘基，并選擇修飾的抗體或其抗原結(jié)合片段，其與未修飾的抗體或其抗原結(jié)合片段相比表現(xiàn)出降低的免疫原性。通過表位區(qū)域，可以進(jìn)一步表征本文所述的T-細(xì)胞表位。這樣的區(qū)域包括表位核心、N-端和C-端。本文使用的“表位核心”表示，T-細(xì)胞表位的核心9-聚體氨基酸序列。所述表位核心可以另外包括在N-端和/或C-端上鄰近所述核心9-聚體氨基酸序列的O、1、2或3個氨基酸殘基。因而，在某些實施方案中，所述表位核心的長度范圍可以是約9個氨基酸至約15個氨基酸。本文使用的“N-端”表示，鄰近表位核心的N-端的氨基酸，且包括鄰近表位核心的N-端并在其上游的至少1、2、3、4、5、6、7、8或9個氨基酸。本文使用的“C-端”表示鄰近表位核心的C-端的氨基酸，且包括鄰近表位核心的C-端并在其下游的至少1、2、3、4、5、6、7、8或9個氨基酸。在一個實施方案中，修飾的抗體或其抗原結(jié)合片段含有I個或多個修飾。
在一個實施方案中，修飾的抗體或其抗原結(jié)合片段含有2個修飾。在一個實施方案中，修飾的抗體或其抗原結(jié)合片段含有3個修飾。在一個實施方案中，修飾的抗體或其抗原結(jié)合片段含有4個修飾。在一個實施方案中，修飾的抗體或其抗原結(jié)合片段含有5個修飾。在一個實施方案中，修飾的抗體或其抗原結(jié)合片段含有6個修飾。在一個實施方案中，修飾的抗體或其抗原結(jié)合片段含有7個修飾。在一個實施方案中，修飾的抗體或其抗原結(jié)合片段含有8個修飾。在一個實施方案中，修飾的抗體或其抗原結(jié)合片段含有9個修飾。在一個實施方案中，修飾的抗體或其抗原結(jié)合片段含有10個修飾。在一個實施方案中，修飾的抗體或其抗原結(jié)合片段含有最多20個修飾。本文提供了一種抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含具有如SEQ ID NO: 93所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(VKlAA)和具有如SEQ ID NO: 89所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(VH1A2)。本文提供了一種抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含具有如SEQ ID NO: 88、89、90、91和92中的任一個所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。本文提供了一種抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含具有如SEQ ID NO: 93、94、95、
96、97、100、102和103中的任一個所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。本文提供了一種結(jié)合內(nèi)皮因子的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含具有如SEQ IDNO: 89所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有如SEQ ID NO: 93所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，其中
(i )所述重鏈可變區(qū)另外包含一個或多個選自下述的修飾用丙氨酸(A)或絲氨酸(S)置換在位置49處的甘氨酸(G);用異亮氨酸(I)置換在位置51處的丙氨酸(A);用精氨酸(R)或天冬酰胺(Q)置換在位置52b處的賴氨酸(K);用纈氨酸(V)置換在位置78處的亮氨酸(L),其中使用Kabat編號系統(tǒng)；和
(ii)所述輕鏈可變區(qū)另外包含一個或多個選自下述的修飾用亮氨酸(L)置換在位置4處的甲硫氨酸(M);用纈氨酸(V)置換在位置19處的丙氨酸(A);用絲氨酸(S)置換在位置22處的蘇氨酸(T);用異亮氨酸(I)置換在位置48處的丙氨酸(A);和用絲氨酸(S)置換在位置51處的蘇氨酸(T)，其中使用Kabat編號系統(tǒng)。本文提供了一種抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含具有如SEQ ID NO: 88、89、90、91和92所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和具有如SEQ ID NO: 93、95、96、97、100、102或103所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
除了前述的實施例和實施方案以外，在本文中預(yù)見到修飾的抗體或其抗原結(jié)合片段，其具有在ー個或多個T-細(xì)胞表位中的一個或多個氨基酸修飾。在一個非限制性實施例中，本文提供了抗體或其抗原結(jié)合片段，其具有在至少ー個T-細(xì)胞表位中的至少ー個修飾。在另ー個非限制性實施例中，本文提供了抗體或其抗原結(jié)合片段，其具有在1、2、3、4、5、6或7個本文所述的T-細(xì)胞表位的中的至少ー個氨基酸修飾。其它非限制性實施例這樣的抗體或其抗原結(jié)合片段，其具有在超過ー個T-細(xì)胞表位中的超過ー個氨基酸修飾。在本文中預(yù)見到在任意數(shù)目的上述抗體或其抗原結(jié)合片段、T-細(xì)胞表位中的氨基酸修飾的任意組合。
T-細(xì)朐表位和同種異型頻率
在抗原內(nèi)發(fā)現(xiàn)的單個表位可以優(yōu)選地由特定MHC II類同種異型來呈現(xiàn)，類似地，在相同抗原內(nèi)的其它特定表位根本不可能呈現(xiàn)在MHC II類分子上。已經(jīng)證實，特定表位與特定MCH II類分子的這種關(guān)聯(lián)依賴于個體的MHC II類同種異型。當(dāng)修飾抗體或其抗原結(jié)合片段(為了去除T-細(xì)胞表位)時，也可以考慮特定表位與特定同種異型的關(guān)聯(lián)。對于特定同種異型(例如，對于具有某些MHC II類同種異型的特定受試者群體)，這樣的考慮可以實現(xiàn)抗體或其抗原結(jié)合片段的高度特異性的修飾。通過本領(lǐng)域已知的基因分型方法，可以容易地確定一位或多位受試者的MHC II類同種異型，從而容易地鑒別T-細(xì)胞表位與給定同種異型的關(guān)聯(lián)，用于在抗體或其抗原結(jié)合片段的修飾中進(jìn)行考慮，定制為該同種異型。在下面的實施例中，更詳細(xì)地描述了 T-細(xì)胞表位和MHC II類同種異型之間的關(guān)聯(lián)的鑒別。在本文中預(yù)見到修飾的抗體或其抗原結(jié)合片段，其具有T-細(xì)胞表位修飾，所述修飾定制為關(guān)于特定表位所鑒別出的MHC II類關(guān)聯(lián)。D.杭-內(nèi)皮因子抗體
通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法，包括、例如，重組和化學(xué)合成，可以實現(xiàn)編碼FR和/或CDR的所有核酸和所有選擇的氨基酸位置變化的同時摻入。例如，同時摻入可以如下實現(xiàn)例如，化學(xué)地合成受體可變區(qū)的核苷酸序列，與編碼供體CDR的核酸融合到一起，并將許多對應(yīng)的氨基酸密碼子摻入在選擇出的用于攜帶可變氨基酸殘基的位置處。本文提供了結(jié)合內(nèi)皮因子的抗體和其抗原結(jié)合片段。也提供了這樣的抗體和其抗原結(jié)合片段，它們結(jié)合內(nèi)皮因子，并抑制(部分地或完全地)或控制/治療(部分地或完全地)血管生成/新生血管形成、小血管膨脹和/或與過度血管生成有關(guān)的疾病。類似地，在抑制或結(jié)合內(nèi)皮因子的含義內(nèi)，也包括抑制內(nèi)皮因子功能(例如，信號傳遞、結(jié)合、活化等)。在另一個實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段通過結(jié)合內(nèi)皮因子來抑制血管生成。本申請也提供了可以用于生產(chǎn)抗體的細(xì)胞系、用于生產(chǎn)所述細(xì)胞系的方法、用于表達(dá)抗體或其抗原結(jié)合片段和純化它們的方法?？梢哉J(rèn)識到，使用常規(guī)方法(包括，但不限于ELISA)，使用本文提供的或本領(lǐng)域已知的試驗，可以測試使用本文所述方法制備的特異性地結(jié)合內(nèi)皮因子的抗體和其抗原結(jié)合片段的結(jié)合內(nèi)皮因子的能力。使用常規(guī)方法，包括但不限于Biacore或表面等離子體共振，也可以測定本文所述抗體的親和カ。通過人源化TRC105抗體的Vh和ん序列，構(gòu)建出本文所述的抗體及其抗原結(jié)合片段。為了實現(xiàn)該人源化，建立并分析了 TRC105的Vh和ん鏈的三維模型。然后將Vh和^序列單個地與人種系序列數(shù)據(jù)庫相對比，基于它們與TRC105的Vh和ん序列的同源性，從所述數(shù)據(jù)庫中選出人Vh和^序列。為人源化選出的人^序列是02/012 (VK1-39) (SEQ IDNO. 2)。02/012與TRC105具有65%的序列同一性，所述基因在人種系所有組成部分中高度表達(dá)。為人源化選出的人Vh序列是VH3-15(SEQ ID NO. 40)。VH3-15與TRC105具有70%的序列同一性，并以合理的頻率在人種系所有組成部分中表達(dá)。在TRC105的三維模型中，檢查在TRC105和人序列之間不同的氨基酸位置，以確定考慮將哪個置換用于修飾?；谌S模型分析的氨基酸選擇標(biāo)準(zhǔn)包括、但不限于，例如，與氨基酸有關(guān)的空間效應(yīng)、氨基酸的相關(guān)電荷和氨基酸在可變重鏈和/或輕鏈內(nèi)的位置。將為人框架區(qū)鑒別和提議的置換摻入02和VH3-15人框架區(qū)中，并將TRC105的CDR移植進(jìn)對應(yīng)的02和VH3-15人框架區(qū)中，得到許多人源化抗體或其抗原結(jié)合片段。另外，輕鏈的FR-4源自人J種系序列Jk4。類似地，重鏈的FR-4源自人J種系序列JH4。本文描述了結(jié)合內(nèi)皮因子的人源化抗體和抗原結(jié)合片段。也本文描述了結(jié)合內(nèi)皮因子并抑制血管生成的人源化抗體和抗原結(jié)合片段。如上所述制備本文所述的抗體和抗原結(jié)合片段?？贵w和其抗原結(jié)合片段可以具有可變重(Vh)鏈、可變輕(\)鏈、二者或其結(jié)合部 列或其結(jié)合部分。這樣的Vh鏈可以具有如SEQ ID NO: 44-62中的任一個所示的框架區(qū)序列。在另ー個實施方案中，所述ん鏈具有如SEQ ID NO: 3-5中的任一個所示的氨基酸序列或其結(jié)合部分。這樣的ん鏈可以具有如SEQ ID NO: 6-38中的任一個所示的框架區(qū)序列。本文提供了ー種抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和具有如SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。本文提供了ー種抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和具有如SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)另外包含ー個或多個選自下述的修飾用丙氨酸(A)置換在位置49處的甘氨酸(G);用絲氨酸(S)置換在位置76處的天冬酰胺(N);用精氨酸(R)置換在位置77處的蘇氨酸(T);用纈氨酸(V)置換在位置78處的亮氨酸(L);用異亮氨酸(I)置換在位置82a處的天冬酰胺(N);用異亮氨酸(I)或亮氨酸(L)置換在位置89處的纈氨酸(V);用精氨酸(R)或甘氨酸(G)置換在位置94處的蘇氨酸(T);用蘇氨酸(T)置換在位置108處的亮氨酸(U;用亮氨酸(L)置換在位置109處的纈氨酸(V);和用丙氨酸(A)置換在位置113處的絲氨酸(S)，其中使用Kabat編號系統(tǒng)；且所述輕鏈可變區(qū)另外包含一個或多個選自下述的修飾用谷氨酰胺(Q)置換在位置I處的天冬氨酸(D);用纈氨酸(V)置換在位置3處的谷氨酰胺(Q);用亮氨酸(L)置換在位置4處的甲硫氨酸(M);用絲氨酸(S)置換在位置5處的蘇氨酸(T);用苯丙氨酸(F)置換在位置36處的酪氨酸(Y);用脯氨酸(P)置換在位置46處的亮氨酸(L);用色氨酸(W)置換在位置47處的亮氨酸(L);用纈氨酸(V)或丙氨酸(A)置換在位置60處的絲氨酸(S);用絲氨酸(S)置換在位置70處的天冬氨酸(D);用酪氨酸(Y)置換在位置71處的苯丙氨酸(F);用丙氨酸(A)置換在位置100處的谷氨酰胺(G);和用亮氨酸(L)置換在位置106處的異亮氨酸(I)，其中使用Kabat編號系統(tǒng)。本文提供了一種結(jié)合內(nèi)皮因子的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含具有如SEQ IDNO: 41、42或43所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和具有如SEQ ID NO: 3、4或5所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。ー種抗體或其抗原結(jié)合片段可以包含具有如SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。ー種抗體或其抗原結(jié)合片段可以包含具有如SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。ー種抗體或其抗原結(jié)合片段可以包含具有如SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。ー種抗體或其抗原結(jié)合片段可以包含具有如SEQ IDNO: 42所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。ー種抗體或其抗原結(jié)合片段可以包含具有如SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。ー種抗體或其抗原結(jié)合片段可以包含具有如SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有如SEQID NO: 5所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。ー種抗體或其抗原結(jié)合片段可以包含具有如SEQ ID NO: 43所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。ー種抗體或其抗原結(jié)合片段可以包含具有如SEQ ID NO: 43所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。ー種抗體或其抗原結(jié)合片段可以包含具有如SEQ ID NO: 43所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有如SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。這樣的抗體可以結(jié)合內(nèi)皮因子和抑 制血管生成。在任一個這樣的實施方案中，所述重鏈可變區(qū)可以另外包含ー個或多個選自下述的修飾用絲氨酸(S)置換在位置76處的天冬酰胺(N);用精氨酸(R)置換在位置77處的蘇氨酸(T);用異亮氨酸(I)置換在位置82a處的天冬酰胺(N);用異亮氨酸(I)或亮氨酸(L)置換在位置89處的纈氨酸(V);用甘氨酸(G)置換在位置94處的蘇氨酸(T);用蘇氨酸(T)置換在位置108處的亮氨酸(L);用亮氨酸(L)置換在位置109處的纈氨酸(V);和用丙氨酸(A)置換在位置113處的絲氨酸(S);且所述輕鏈可變區(qū)可以另外包含ー個或多個選自下述的修飾用谷氨酰胺(Q)置換在位置I處的天冬氨酸(D);用纈氨酸(V)置換在位置3處的谷氨酰胺(Q);用絲氨酸(S)置換在位置5處的蘇氨酸(T);用苯丙氨酸(F)置換在位置36處的酪氨酸(Y);用纈氨酸(V)或丙氨酸(A)置換在位置60處的絲氨酸(S);用絲氨酸(S)置換在位置70處的天冬氨酸(D);用丙氨酸(A)置換在位置100處的甘氨酸(G);和用亮氨酸(L)置換在位置106處的異亮氨酸(I)，其中使用Kabat編號系統(tǒng)。本文提供了一種結(jié)合內(nèi)皮因子的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包含
(i)SEQ ID NO: 66 的 CDRl、SEQ ID NO: 67 的 CDR2 和 SEQ ID NO: 68 的 CDR3 ；
(ii)重鏈FRl，其具有SEQID NO: 44的氨基酸序列或包含ー個或多個保守置換的SEQID NO: 44的氨基酸序列；
(iii)重鏈FR2，其具有SEQID NO: 45的氨基酸序列或包含丙氨酸(A)對位置49處的甘氨酸(G)的置換的SEQ ID NO: 45的氨基酸序列，其中使用Kabat編號系統(tǒng)；和
(iv)重鏈FR3，其具有SEQID NO: 47的氨基酸序列或包含一個或多個選自下述的置換的SEQ ID NO: 47的氨基酸序列
Ca)用絲氨酸(S)置換在位置76處的天冬酰胺(N)；
(b)用精氨酸(R)置換在位置77處的蘇氨酸(T)；
(c)用纈氨酸(V)置換在位置78處的亮氨酸(L)；(d)用異亮氨酸(I)置換在位置82a處的天冬酰胺(N)；
Ce)用異亮氨酸(I)或亮氨酸(L)置換在位置89處的纈氨酸(V);和(f)用精氨酸(R)或甘氨酸(G)置換在位置94處的蘇氨酸(T)，其中使用Kabat編號系統(tǒng)；和
(V)重鏈FR4，其具有SEQ ID NO: 56 的氨基酸序列或包含ー個或多個選自下述的置換的SEQ ID NO: 56的氨基酸序列
Ca)用蘇氨酸(T)置換在位置108處的亮氨酸(L)；
(b)用亮氨酸(L)置換在位置109處的纈氨酸(V);和
(C)用丙氨酸(A)置換在位置113處的絲氨酸(S)，其中使用Kabat編號系
統(tǒng)；
且所述輕鏈可變區(qū)包含
(i)SEQ ID NO: 63 的 CDRl、SEQ ID NO: 64 的 CDR2 和 SEQ ID NO: 65 的 CDR3 ；
(ii)輕鏈FRl，其具有SEQID NO: 6的氨基酸序列或包含ー個或多個選自下述的置換的SEQ ID NO: 6的氨基酸序列
Ca)用谷氨酰胺(Q)置換在位置I處的天冬氨酸(D)；
(b)用纈氨酸(V)置換在位置3處的谷氨酰胺(Q)；
(c)用亮氨酸(L)置換在位置4處的甲硫氨酸(M);和
(d)用絲氨酸(S)置換在位置5處的蘇氨酸(T);其中使用Kabat編號系統(tǒng)；
和
(iii)輕鏈FR2，其具有SEQID NO: 20的氨基酸序列或包含一個或多個選自下述的置換的SEQ ID NO: 20的氨基酸序列
Ca)用苯丙氨酸(F)置換在位置36處的酪氨酸(Y)；
(b)用脯氨酸(P)置換在位置46處的亮氨酸(L);和(C)用色氨酸(W)置換在位置47處的亮氨酸(L),其中使用Kabat編號系
統(tǒng)；和
(iv)輕鏈FR3，其具有SEQID NO: 28的氨基酸序列或包含一個或多個選自下述的置換的SEQ ID NO: 28的氨基酸序列
Ca)用纈氨酸(V)或丙氨酸(A)置換在位置60處的絲氨酸(S)；
(b)用絲氨酸(S)置換在位置70處的天冬氨酸(D);和
(b)用酪氨酸(Y)置換在位置71處的苯丙氨酸(F)，其中使用Kabat編號系
統(tǒng)；和
(V)輕鏈FR4，其具有SEQ ID NO: 35的氨基酸序列或包含ー個或多個選自下述的置換的SEQ ID NO: 35的氨基酸序列
Ca)用丙氨酸(A)置換在位置100處的甘氨酸(G);和
(b)用亮氨酸(L)置換在位置106處的異亮氨酸(I)，其中使用Kabat編號系統(tǒng)。本文提供的抗體或其抗原結(jié)合片段可以包含具有在SEQ ID NO: 66中所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)⑶R1、具有在SEQ ID NO: 67中所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)⑶R2、具有在SEQ ID NO: 68中所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)⑶R3、具有在SEQ ID NO:63中所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR1、具有在SEQ ID NO: 64中所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)⑶R2和具有在SEQ ID NO: 65中所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)⑶R3。在一個實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合內(nèi)皮因子，并包含具有在SEQ ID NO: 44中所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)FR1、具有在SEQ ID NO: 45中所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)FR2、具有在SEQ ID NO: 47中所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)FR3、具有在SEQ ID NO: 56中所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)FR4。在另ー個實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合內(nèi)皮因子，并包含具有在SEQ ID NO: 44中所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)FR1、具有在SEQ ID NO: 46中所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)FR2、具有在SEQ ID NO: 48中所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)FR3、具有在SEQ ID NO: 56中所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)FR4。
·
在另ー個實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含具有在SEQ ID NO: 6中所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)FR1、具有在SEQ ID NO: 20中所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)FR2、具有在SEQ ID NO: 28中所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)FR3和具有在SEQ IDNO: 35中所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)FR4。在另ー個實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合內(nèi)皮因子，并包含具有在SEQ ID NO: 6中所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)FR1、具有在SEQ ID NO: 21中所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)FR2、具有在SEQ ID NO: 29中所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)FR3和具有在SEQ ID NO: 35中所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)FR4。在另ー個實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合內(nèi)皮因子，并包含具有在SEQ ID NO: 7中所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)FR1、具有在SEQ ID NO: 21中所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)FR2、具有在SEQ ID NO: 29中所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)FR3和具有在SEQ ID NO: 35中所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)FR4。本文提供了ー種抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含具有如SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。本文提供了一種結(jié)合內(nèi)皮因子的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含具有如SEQ IDNO: 4所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和具有如SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，其中，所述重鏈可變區(qū)另外包含ー個或多個選自下述的修飾用丙氨酸(A)置換在位置49處的甘氨酸(G);用絲氨酸(S)置換在位置76處的天冬酰胺(N);用精氨酸(R)置換在位置77處的蘇氨酸(T);用纈氨酸(V)置換在位置78處的亮氨酸(L);用異亮氨酸(I)置換在位置82a處的天冬酰胺(N);用異亮氨酸(I)或亮氨酸(L)置換在位置89處的纈氨酸(V);用蘇氨酸(T)或甘氨酸(G)置換在位置94處的精氨酸(R);用蘇氨酸(T)置換在位置108處的亮氨酸(L);用亮氨酸(L)置換在位置109處的纈氨酸(V);和用丙氨酸(A)置換在位置113處的絲氨酸(S)，其中使用Kabat編號系統(tǒng)；且所述輕鏈可變區(qū)另外包含一個或多個選自下述的修飾用谷氨酰胺(Q)置換在位置I處的天冬氨酸(D);用纈氨酸(V)置換在位置3處的谷氨酰胺(Q);用亮氨酸(L)置換在位置4處的甲硫氨酸(M);用絲氨酸(S)置換在位置5處的蘇氨酸(T);用苯丙氨酸(F)置換在位置36處的酪氨酸(Y);用亮氨酸(L)置換在位置46處的脯氨酸(P);用亮氨酸(L)置換在位置47處的色氨酸(W);用纈氨酸(V)或丙氨酸(A)置換在位置60處的絲氨酸(S);用絲氨酸(S)置換在位置70處的天冬氨酸(D);用苯丙氨酸(F)置換在位置71處的酪氨酸(Y);用丙氨酸(A)置換在位置100處的谷氨酰胺(G);和用亮氨酸(L)置換在位置106處的異亮氨酸(I),其中使用Kabat編號系統(tǒng)。本文提供了一種結(jié)合內(nèi)皮因子的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，
其中所述重鏈可變區(qū)包含
(i)SEQ ID NO: 66 的 CDRl、SEQ ID NO: 67 的 CDR2 和 SEQ ID NO: 68 的 CDR3 ；
(ii)重鏈FRl，其具有SEQID NO: 44的氨基酸序列或包含一個或多個保守置換的SEQID NO: 44的氨基酸序列；
(iii)重鏈FR2，其具有SEQID NO: 45的氨基酸序列或包含丙氨酸(A)對位置49處的甘氨酸(G)的置換的SEQ ID NO: 45的氨基酸序列，其中使用Kabat編號系統(tǒng)；和
(iv)重鏈FR3，其具有SEQID NO: 47的氨基酸序列或包含一個或多個選自下述的置 換的SEQ ID NO: 47的氨基酸序列
Ca)用絲氨酸(S)置換在位置76處的天冬酰胺(N)；
(b)用精氨酸(R)置換在位置77處的蘇氨酸(T)；
(c)用纈氨酸(V)置換在位置78處的亮氨酸(L)；
Cd)用異亮氨酸(I)置換在位置82a處的天冬酰胺(N)；
Ce)用異亮氨酸(I)或亮氨酸(L)置換在位置89處的纈氨酸(V);和(f)用蘇氨酸(T)或甘氨酸(G)置換在位置94處的精氨酸(R)，其中使用Kabat編號系統(tǒng)；和
(V)重鏈FR4，其具有SEQ ID NO: 56的氨基酸序列或包含一個或多個選自下述的置換的SEQ ID NO: 56的氨基酸序列
Ca)用蘇氨酸(T)置換在位置108處的亮氨酸(L)；
(b)用亮氨酸(L)置換在位置109處的纈氨酸(V);和
(C)用丙氨酸(A)置換在位置113處的絲氨酸(S)，其中使用Kabat編號系
統(tǒng)；
且所述輕鏈可變區(qū)包含
(i)SEQ ID NO: 63 的 CDRl、SEQ ID NO: 64 的 CDR2 和 SEQ ID NO: 65 的 CDR3 ；
(ii)輕鏈FRl，其具有SEQID NO: 6的氨基酸序列或包含一個或多個選自下述的置換的SEQ ID NO: 6的氨基酸序列
Ca)用谷氨酰胺(Q)置換在位置I處的天冬氨酸(D)；
(b)用纈氨酸(V)置換在位置3處的谷氨酰胺(Q)；
(c)用亮氨酸(L)置換在位置4處的甲硫氨酸(M);和
(d)用絲氨酸(S)置換在位置5處的蘇氨酸(T);其中使用Kabat編號系統(tǒng)；
和
(iii)輕鏈FR2，其具有SEQID NO: 21的氨基酸序列或包含一個或多個選自下述的置換的SEQ ID NO: 20的氨基酸序列
Ca)用苯丙氨酸(F)置換在位置36處的酪氨酸(Y)；
(b)用亮氨酸(L)置換在位置46處的脯氨酸(P);和(C)用亮氨酸(L)置換在位置47處的色氨酸(W),其中使用Kabat編號系
統(tǒng)；和(iv)輕鏈FR3，其具有SEQ ID NO: 29的氨基酸序列或包含一個或多個選自下述的置換的SEQ ID NO: 28的氨基酸序列
Ca)用纈氨酸(V)或丙氨酸(A)置換在位置60處的絲氨酸(S)；
(b)用絲氨酸(S)置換在位置70處的天冬氨酸(D);和
(b)用苯丙氨酸(F)置換在位置71處的酪氨酸(Y),其中使用Kabat編號系
統(tǒng)；和
(V)輕鏈FR4，其具有SEQ ID NO: 35的氨基酸序列或包含一個或多個選自下述的置換的SEQ ID NO: 35的氨基酸序列
Ca)用丙氨酸(A)置換在位置100處的甘氨酸(G);和
(b)用亮氨酸(L)置換在位置106處的異亮氨酸(I)，其中使用Kabat編號系統(tǒng)?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的主要部分包括3個⑶R區(qū)域以及它們的插入框架區(qū)。所述部分也可以包括第一和第四框架區(qū)中的任一個或二者的至少約50%，所述50%是第一框架區(qū)的C-端50%和第四框架區(qū)的N-端50%。在可變結(jié)構(gòu)域的主要部分的N-端或C-端末端處的其它殘基可以是，通常與天然存在的可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域無關(guān)的那些殘基。例如，通過重組DNA技術(shù)構(gòu)建本文所述的人源化的內(nèi)皮因子抗體和抗原結(jié)合片段，可以導(dǎo)入由導(dǎo)入的連接物編碼的N-或C-端殘基，以促進(jìn)克隆或其它操作步驟。其它操作步驟包括，導(dǎo)入連接物來使可變結(jié)構(gòu)域與其它蛋白序列相連，所述其它蛋白序列包括免疫球蛋白重鏈、其它可變結(jié)構(gòu)域(例如在雙體的生產(chǎn)中)或在下面更詳細(xì)地討論的蛋白標(biāo)記。人源化的內(nèi)皮因子CDR3區(qū)域(其具有基本上如本文所述抗體的CDR3區(qū)域所示的氨基酸序列)將被負(fù)載在允許所述CDR3區(qū)域與內(nèi)皮因子結(jié)合的結(jié)構(gòu)中。用于負(fù)載CDR3的結(jié)構(gòu)可以是抗體重鏈或輕鏈序列或其主要部分，其中所述⑶R3區(qū)域位于這樣的位置所述位置與由重排的免疫球蛋白基因編碼的天然存在的V1^P'抗體可變結(jié)構(gòu)域的CDR3區(qū)域相對應(yīng)。在一個非限制性實施例中，本文提供了抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含可變重鏈和/或可變輕鏈，所述可變重鏈的⑶R3具有如SEQ ID NO: 68所示的氨基酸序列，所述可變輕鏈的⑶R3具有如SEQ ID NO: 65所示的氨基酸序列。在一個實施方案中，所述可變重鏈具有如SEQ ID NO: 40所示的氨基酸序列，但是⑶R3被置換為如SEQ ID NO: 68所示的CDR3氨基序列。在另一個實施方案中，所述可變輕鏈具有如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序 列，但是⑶R3被置換為如SEQ ID NO: 65所示的⑶R3氨基酸序列。另外，這樣的含有⑶R3的可變區(qū)/鏈可以包含例如如上所述的一個或多個FR氨基酸序列(或這樣的含有一個或多個額外修飾的FR)，其中所述抗體或抗原結(jié)合片段在每個VH和VL區(qū)域中具有3個CDR和4個FR，具有對內(nèi)皮因子的特異性結(jié)合活性，且能夠抑制血管生成。另外，也可以置換在這些可變區(qū)內(nèi)的不同的抗體J區(qū)段，用于實現(xiàn)可變區(qū)鏈內(nèi)的其它變化。在一個方面，通過進(jìn)一步替代FR4序列，也可以制備本文所述的可變重鏈和輕鏈。在一個實施方案中，所述重鏈FR4序列可以置換下述之一
SEQIDN0:IKabat-編號|l03|l04|l05|l06|l07|l08|l09|ll0|lll|ll2|ll3
76萊自 JHl、JH4 或 JH5 的 FRM4ff~G~Q~G~T~L~~T~ VS S
77系自 JH2 的 FRM4ff~G~R~G~T~L~~Τ~VS S
78I來白 JH3 的 FRM4|ff |& |q |g |t |m |v |t |v |s |s
權(quán)利要求
1.一種抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含具有如SEQ ID NO: 89所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有如SEQ ID NO: 93所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
2.一種結(jié)合內(nèi)皮因子的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含具有如SEQ ID NO: 89所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有如SEQ ID NO: 93所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，其中 所述重鏈可變區(qū)另外包含一個或多個選自下述的修飾用丙氨酸(A)或絲氨酸(S)置換在位置49處的甘氨酸(G);用異亮氨酸(I)置換在位置51處的丙氨酸(A);用精氨酸(R)或天冬酰胺(Q)置換在位置52b處的賴氨酸(K);用纈氨酸(V)置換在位置78處的亮氨酸(L),其中使用Kabat編號系統(tǒng)；和 所述輕鏈可變區(qū)另外包含一個或多個選自下述的修飾用亮氨酸(L)置換在位置4處的甲硫氨酸(M);用纈氨酸(V)置換在位置19處的丙氨酸(A);用絲氨酸(S)置換在位置22處的蘇氨酸(T);用異亮氨酸(I)置換在位置48處的丙氨酸(A);和用絲氨酸(S)置換在位置51處的蘇氨酸(T)，其中使用Kabat編號系統(tǒng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含具有如SEQID NO: 88、89、90、91或92所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和具有如SEQ ID NO: 93、94、95、96、97、100、102或103所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗原結(jié)合片段，其中所述抗原結(jié)合片段是Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、scFv片段、單鏈結(jié)合多肽、Fd片段、可變重鏈、可變輕鏈或dAb片段。
5.一種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗體或抗原結(jié)合片段和可接受的載體或賦形劑。
6.一種核酸，其包含編碼根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗體或抗原結(jié)合片段的核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其被治療標(biāo)記、診斷標(biāo)記或二者進(jìn)一步標(biāo)記。
8.一種治療受試者的血管生成有關(guān)疾病的方法，所述方法包括施用根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段被治療標(biāo)記、可檢測標(biāo)記或二者標(biāo)記。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述血管生成有關(guān)疾病是特征在于血管生成/新生血管形成的眼病、糖尿病腎病、IBD、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、癌癥或轉(zhuǎn)移。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述眼病是黃斑變性。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述眼病是糖尿病視網(wǎng)膜病變。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述癌癥是實體瘤。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述癌癥是基于上皮的腫瘤。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述癌癥選自肺癌、婦科惡性腫瘤、黑素瘤、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、腎癌、頭部癌癥、胰腺癌、肝癌(肝細(xì)胞癌)、子宮癌、頸部癌癥、腎癌(腎細(xì)胞癌)、肉瘤、骨髓瘤和淋巴瘤。
16.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，所述方法另外包括施用一種或多種血管生成抑制劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述血管生成抑制劑是化學(xué)療法、VEGF受體抑制劑、VEGF抑制劑或其組合。
18.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法,其中以約0.Ol mg/kg、約0.05 mg/kg、約0.1 mg/kg、約 0. 5 mg/kg、約 I mg/kg、約 5 mg/kg、約 10 mg/kg、約 20 mg/kg、約 30 mg/kg、約 40 mg/kg、約50 mg/kg、約60 mg/kg、約70 mg/kg、約80 mg/kg、約90 mg/kg、約100 mg/kg、約125mg/kg、約150 mg/kg、約175 mg/kg或約200 mg/kg的量,施用抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物。
19.一種診斷方法，其包括 a)提供來自待測患者的實體瘤的癌細(xì)胞或血漿樣品； b)檢測至少一種基因或基因廣物在樣品中的表達(dá)，所述基因或基因廣物選自其表達(dá)已經(jīng)與對血管生成抑制劑的敏感性或抗性相關(guān)聯(lián)的基因或基因產(chǎn)物集合，其中所述至少一種基因或基因產(chǎn)物選自下述的一種或多種基因或基因產(chǎn)物VEGF、VEGF受體、HIF-I a、胎盤生長因子受體和⑶105 ;和 c)對比在患者樣品中檢測到的至少一種基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)水平和已經(jīng)與對血管生成抑制劑的敏感性或抗性相關(guān)聯(lián)的至少一種基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)水平。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述血管生成抑制劑選自VEGF受體抑制劑、VEGF抑制劑和內(nèi)皮因子抑制劑。
21.—種試劑盒，其包含用于檢測已經(jīng)與對血管生成抑制劑的敏感性或抗性相關(guān)聯(lián)的一個或多個基因在癌細(xì)胞或人血漿樣品中的表達(dá)水平的試劑，所述基因選自VEGF、VEGF受體、HIF-I a、胎盤生長因子受體和內(nèi)皮因子。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，其中所述試劑盒含有抗體或其抗原結(jié)合片段。
全文摘要
本申請涉及人源化的和人源化的/去免疫化的抗-內(nèi)皮因子抗體和其抗原結(jié)合片段的組合物。一個方面涉及抗體，所述抗體具有在可變重鏈、可變輕鏈或二者的至少一個框架區(qū)的至少一個氨基酸殘基中的一個或多個修飾。另一個方面涉及抗體，所述抗體結(jié)合內(nèi)皮因子，并抑制血管生成。另一個方面涉及人源化抗體的去免疫化以降低免疫原性。另一個方面涉及人源化的和人源化的/去免疫化的結(jié)合內(nèi)皮因子的抗體用于檢測、診斷或治療與內(nèi)皮因子、血管生成或其組合有關(guān)的疾病或病癥的用途。
文檔編號A61K39/395GK102762227SQ201080054202
公開日2012年10月31日 申請日期2010年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月30日
發(fā)明者C.托伊爾, M.瓦斯克斯 申請人:特雷康制藥公司