專利名稱：用于處理組織的方法
用于處理組織的方法按照35U.S.C. § 119，本申請(qǐng)要求2009年8月18日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?61/234，681的優(yōu)先權(quán)。人類組織和動(dòng)物組織可用于產(chǎn)生多種用于患者應(yīng)用的組織產(chǎn)品。通常處理組織以去除某些細(xì)胞成分和/或非細(xì)胞成分和/或以破壞組織中存在的病原體。此外，在處理或儲(chǔ)存期間，可能冷凍和融化組織。發(fā)明概述根據(jù)某些實(shí)施方案，提供了一種用于將組織樣品去細(xì)胞化的方法，包括提供在液體中的包含哺乳動(dòng)物軟組織的組織樣品；和向液體施加至少200MPa的壓力，持續(xù)足以破壞軟組織中基本上所有天然組織細(xì)胞的時(shí)間，其中破壞基本上所有細(xì)胞包括破裂細(xì)胞的細(xì)胞膜，從而在鹽水溶液中洗滌組織樣品允許去除至少95%的天然組織細(xì)胞。根據(jù)某些實(shí)施方案，提供了一種用于融化組織樣品的方法，該方法包括提供在液體中的至少部分地冷凍的包含哺乳動(dòng)物組織的組織樣品；和向液體施加足以融化冷凍的組織樣品的壓力。根據(jù)某些實(shí)施方案，提供了一種用于將組織樣品去細(xì)胞化的方法，該方法包括提供在含液體的容器中的包含哺乳動(dòng)物組織的組織樣品；和向液體施加壓力，持續(xù)足以破壞軟組織中基本上所有細(xì)胞的時(shí)間，其中破壞基本上所有細(xì)胞包括破裂細(xì)胞的細(xì)胞膜，從而在鹽水溶液中洗滌組織樣品允許去除至少95%的天然組織細(xì)胞，且其中壓力以使得組織樣品的溫度不超過(guò)30°C的速率施加。根據(jù)某些實(shí)施方案，提供了一種用于減少組織樣品中的生物負(fù)荷(bioburden)的方法，該方法包括提供在含液體的容器中的包含哺乳動(dòng)物軟組織的組織樣品；和向液體施加壓力，持續(xù)足以導(dǎo)致軟組織中的細(xì)菌濃度至少減少5個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)(51og reduction)的時(shí)間，其中在施加壓力期間，組織樣品的溫度不超過(guò)30。C。


圖1是水的相圖。圖2A是如實(shí)驗(yàn)1所述的豬全皮樣品的生物負(fù)荷測(cè)試結(jié)果數(shù)據(jù)。圖2B是如實(shí)驗(yàn)1所述的豬真皮的生物負(fù)荷測(cè)試結(jié)果數(shù)據(jù)。圖3是如實(shí)驗(yàn)2所述的豬真皮的生物負(fù)荷測(cè)試結(jié)果數(shù)據(jù)。圖4是實(shí)驗(yàn)1和實(shí)驗(yàn)2的樣品的溫度相對(duì)壓力的分布曲線。某些示例實(shí)施方案的描述現(xiàn)在將詳細(xì)地參考根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的某些示例實(shí)施方案，其某些實(shí)例闡述在附圖中。盡可能地，在整個(gè)附圖中將使用相同的參考編號(hào)來(lái)指示相同或相似的部分。在本申請(qǐng)中，除非另外具體指明，否則單數(shù)形式的使用包括復(fù)數(shù)形式。在本申請(qǐng)中，除非另外指明，否則“或”的使用表示“和/或”。而且，術(shù)語(yǔ)“包括(including)，，、以及其他形式諸如“包括(includes)”和“包括(included) ”的使用不是限制性的。本文描述的任何范圍將理解為包括端點(diǎn)和端點(diǎn)之間的所有數(shù)值。
本文所用的“高靜壓(high hydrostatic pressure) ”理解為是指向液體中包含的物體施加的壓力，該液體被加壓以對(duì)該物體施加力。在某些實(shí)施方案中，高靜壓可包括向液體施加的大于200MPa的壓力。本文所用的“生物負(fù)荷”是指組織樣品中微生物的數(shù)量，所述微生物包括但不限于，細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲(chóng)、衣原體、立克次氏體、支原體和原生動(dòng)物。本文所用的“組織產(chǎn)品，，或“組織衍生產(chǎn)品，，是指從已被以任何方式(例如但不限于，通過(guò)從組織去除細(xì)胞，從組織去除某些化學(xué)物，或?qū)⒔M織滅菌)改變的組織產(chǎn)生的任何產(chǎn)品。本文所用的“組織樣品”包括完整、未處理的組織和已被處理以產(chǎn)生“組織產(chǎn)品”或 “組織衍生產(chǎn)品”的組織二者。本文所用的節(jié)標(biāo)題僅是為了結(jié)構(gòu)上的目的，且不應(yīng)解釋為限制所描述的主題。本申請(qǐng)中引用的所有文件或文件的部分，包括但不限于專利、專利申請(qǐng)、文章、書籍和論文，為了任何目的特此專門地通過(guò)引用全文并入。多種人類組織和動(dòng)物組織可用來(lái)產(chǎn)生用于治療患者的產(chǎn)品。例如，已經(jīng)產(chǎn)生了用于再生、修復(fù)、強(qiáng)化、增強(qiáng)和/或治療已由于多種疾病和/或結(jié)構(gòu)損傷(如，來(lái)自外傷、手術(shù)、 萎縮和/或長(zhǎng)期磨損和退化)而損傷或喪失的人類組織的多種組織產(chǎn)品。此類產(chǎn)品可包括，例如，可單獨(dú)使用或聯(lián)合其他材料和/或化學(xué)物使用的組織基質(zhì)(tissue matrices)和 /或組織衍生蛋白或含蛋白材料(如，葡萄糖胺聚糖)。在某些實(shí)施方案中，可將這些產(chǎn)品完全或部分地去細(xì)胞以產(chǎn)生將用于患者的組織基質(zhì)或細(xì)胞外組織材料。例如，可將多種組織，諸如皮膚、腸、骨、軟骨、神經(jīng)組織(如，神經(jīng)纖維或硬腦膜)、腱、韌帶、或其他組織完全或部分地去細(xì)胞以產(chǎn)生可用于患者的組織產(chǎn)品。 在一些情形中，可使用這些去細(xì)胞的產(chǎn)品而不添加外源的細(xì)胞材料(如，干細(xì)胞)。在某些情形中，可將這些去細(xì)胞的產(chǎn)品植入來(lái)自自體來(lái)源或其他來(lái)源的細(xì)胞以促進(jìn)治療。因?yàn)榻M織產(chǎn)品通常被植入到患者身體上或身體內(nèi)，在某些實(shí)施方案中，期望將這些材料滅菌，或至少將產(chǎn)品中可能存在的細(xì)菌或其他病原體的量減少到對(duì)于所選應(yīng)用可接受的水平。在某些實(shí)施方案中，多種組織、組織衍生產(chǎn)品和其他可植入醫(yī)療裝置通常利用諸如輻照(如，Y輻照、電子束輻照或X射線輻照)、化學(xué)物處理或加熱的過(guò)程來(lái)滅菌。為了在多種醫(yī)學(xué)應(yīng)用或手術(shù)應(yīng)用中使用，組織或組織產(chǎn)品應(yīng)具有取決于預(yù)期用途的期望生物特性。例如，用于組織再生的組織產(chǎn)品通常應(yīng)能夠支持或誘導(dǎo)細(xì)胞向內(nèi)生長(zhǎng)和 /或再生。然而，某些組織處理技術(shù)可損傷一些組織和/或去除對(duì)于某些生物功能期望的組織部分。例如，在某些實(shí)施方案中，組織去細(xì)胞化過(guò)程可包括使用多種酶、去垢劑和/或化學(xué)物，這可能損傷或去除對(duì)于某些組織的再生或生長(zhǎng)期望的多種細(xì)胞信號(hào)分子或細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。此外，在某些實(shí)施方案中，滅菌技術(shù)諸如Y輻照，可通過(guò)導(dǎo)致組織產(chǎn)品的損壞 (breakdown)和/或化學(xué)改變而改變這種產(chǎn)品。本公開(kāi)內(nèi)容提供處理組織樣品的方法，所述組織樣品保持利用這種方法產(chǎn)生的組織產(chǎn)品的某些期望生物特性。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括用于將組織樣品去細(xì)胞化的方法。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括用于融化組織樣品的方法。在一些實(shí)施方案中， 所述方法包括用于減少組織樣品的生物負(fù)荷的方法。在一些實(shí)施方案中，用于處理組織樣品的方法可包括向組織施加高靜壓。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)將組織樣品放置在液體中或提供在液體中的組織，可向組織樣品施加高靜壓。在某些實(shí)施方案中，可向液體施加壓力，從而控制施加于組織樣品的壓力。在各種實(shí)施方案中，可控制施加于組織樣品的壓力、施加壓力的時(shí)間、和/或壓力增加和/或減少的速率，以將組織樣品去細(xì)胞化，減少組織樣品中的生物負(fù)荷，和/或融化組織樣品。在各種實(shí)施方案中，施加于組織樣品的壓力可基于多種因素選擇。在一些實(shí)施方案中，壓力基于待處理的組織樣品類型來(lái)選擇。在一些實(shí)施方案中，選擇壓力以允許將組織樣品去細(xì)胞化，同時(shí)保持組織樣品的某些期望生物特性。在一些實(shí)施方案中，選擇壓力以允許組織融化而不升高組織樣品溫度到高于選定溫度和/或允許在選定時(shí)間內(nèi)融化。在各種實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容的方法可用來(lái)處理多種不同組織樣品類型。示例的哺乳動(dòng)物組織樣品包括但不限于，骨、皮膚、腸、膀胱、腱、韌帶、肌肉、筋膜、神經(jīng)組織、肝、 心、肺、腎、軟骨和/或其他哺乳動(dòng)物組織。在某些實(shí)施方案中，組織樣品可包括哺乳動(dòng)物軟組織樣品。例如，在某些實(shí)施方案中，組織樣品可包括哺乳動(dòng)物真皮。在某些實(shí)施方案中，真皮可以是與周圍的表皮和/或其他組織諸如皮下脂肪分離的。在某些實(shí)施方案中，組織樣品可包括小腸粘膜下層。在某些實(shí)施方案中，組織樣品可包括人類來(lái)源或非人類來(lái)源。示例的適當(dāng)非人類組織來(lái)源包括但不限于，豬、綿羊、山羊、兔、猴、和/或其他非人類哺乳動(dòng)物。根據(jù)某些實(shí)施方案，多種類型的高靜壓施加系統(tǒng)可用來(lái)處理組織樣品。在某些實(shí)施方案中，高靜壓施加系統(tǒng)包括鋼或其他硬質(zhì)材料制成的剛性器皿或容器。在某些實(shí)施方案中，將待處理的組織樣品放置在帶有流體(如，水)的器皿中。在某些實(shí)施方案中，可將組織樣品包裝在同樣含流體的柔性容器中，并可將該柔性包裝物(flexible package)放置在含流體的器皿中。在某些實(shí)施方案中，在用組織樣品和流體向器皿上樣之后，向器皿中的流體施加壓力。在某些實(shí)施方案中，可以多種方式施加壓力。例如，在某些實(shí)施方案中，可利用氣動(dòng)活塞壓縮器皿中的流體來(lái)施加壓力，或泵可迫使另外的流體進(jìn)入器皿直到器皿中的壓力達(dá)到期望水平。在某些實(shí)施方案中，將組織樣品包裝在含有液體的柔性容器中，并向容器施加壓力。在一些實(shí)施方案中，將組織樣品放置在含有液體的剛性加壓容器中，并向該剛性容器中的液體施加壓力。在一些實(shí)施方案中，將組織樣品包裝在含有液體的柔性容器中，并將該柔性容器放置在含有液體的剛性加壓容器中，并向該剛性容器中的液體施加壓力。在各種實(shí)施方案中，可通過(guò)利用例如活塞壓縮流體，或通過(guò)向具有固定容積的容器泵入添加的流體而對(duì)流體施加壓力。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)將組織樣品包裝在柔性容器中時(shí)，通常密封柔性容器從而僅柔性容器內(nèi)的流體接觸組織樣品。多種液體可用來(lái)在施加高靜壓期間接觸液體。例如，可使用多種含水溶液。在某些實(shí)施方案中，液體可包括鹽的水溶液。在某些實(shí)施方案中，液體可包括鹽水溶液，諸如磷酸鹽緩沖鹽水。在一些實(shí)施方案中，可處理組織樣品以破壞組織樣品的一些或基本上所有的天然組織細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，確定已完成的天然組織細(xì)胞的破壞可通過(guò)以下進(jìn)行用不明顯損傷細(xì)胞的液體(如，PBS)洗滌已被高靜壓處理的組織樣品，并分析樣品以確定(如果有的話)多少天然組織細(xì)胞保留。例如，在一些實(shí)施方案中，在高靜壓處理以破壞細(xì)胞后，用鹽水溶液簡(jiǎn)單洗滌可去除細(xì)胞殘余物，并可評(píng)價(jià)洗滌過(guò)的樣品以確定是否已經(jīng)去除了細(xì)胞，從而指示細(xì)胞的破壞。用于評(píng)價(jià)樣品以確定細(xì)胞是否已被破壞和去除的某些適當(dāng)方法是公知的，且包括例如但不限于，對(duì)冷凍或固定的組織細(xì)胞的光學(xué)顯微術(shù)。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞或細(xì)胞殘余物的存在可利用指示DNA存在的試劑來(lái)評(píng)價(jià)，例如，可使用 PICOGREEN DNA定量試劑盒。本文所用的破壞基本上所有的細(xì)胞理解為是指，已被高靜壓處理和在鹽水溶液中洗滌的組織樣品的天然組織細(xì)胞的至少95%至100%，包括端點(diǎn)和這些端點(diǎn)之間的所有百分比，當(dāng)利用常規(guī)組織學(xué)(如，光學(xué)顯微術(shù))評(píng)價(jià)時(shí)不存在。在一些實(shí)施方案中，可用高靜壓處理組織樣品以去除組織樣品中的一些或基本上所有細(xì)胞，并可進(jìn)一步用其他處理方法處理組織樣品以去除剩余的細(xì)胞。例如，如上所述， 在各種實(shí)施方案中，多種酶、去垢劑和/或其他化學(xué)物用來(lái)從組織去除細(xì)胞，但這種處理可能改變組織的細(xì)胞外基質(zhì)。因此，為了減少用酶、去垢劑和/或其他化學(xué)物進(jìn)行的處理的量，可首先用高靜壓處理來(lái)處理組織樣品，從而去除一些或基本上所有的細(xì)胞，且可進(jìn)一步用至少一種另外的去細(xì)胞化過(guò)程處理組織樣品以去除另外的細(xì)胞，如果組織樣品中存在任何另外的細(xì)胞的話。用于進(jìn)行去細(xì)胞化的適當(dāng)?shù)脑噭┖头椒òǖ幌抻?，例如，Livesey 等的美國(guó)專利號(hào)5，336，616中所述的那些。在一些實(shí)施方案中，可處理組織樣品以產(chǎn)生無(wú)細(xì)胞組織基質(zhì)。在一些實(shí)施方案中， 無(wú)細(xì)胞組織基質(zhì)可包括細(xì)胞外基質(zhì)。例如，在各種實(shí)施方案中，組織基質(zhì)可包括衍生自多種不同哺乳動(dòng)物軟組織的膠原基質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，組織基質(zhì)可包括一種或多種另外的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和/或分子，包括但不限于，多種GAG、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)分子、或?qū)崿F(xiàn)多種生物功能諸如細(xì)胞結(jié)合、粘附、生長(zhǎng)、分化和/或重構(gòu)所需的其他化學(xué)物。在一些實(shí)施方案中，用于將組織樣品去細(xì)胞化的方法包括提供在液體中的包含哺乳動(dòng)物軟組織的組織樣品，并向液體施加壓力，持續(xù)足以破壞軟組織中基本上所有天然組織細(xì)胞的時(shí)間。在一些實(shí)施方案中，以破壞軟組織中基本上所有天然組織細(xì)胞的最小壓力施加壓力。在各種實(shí)施方案中，壓力是至少200MPa、至少300MPa、至少400MPa或至少 500MPa。在各種實(shí)施方案中，壓力是300MPa至500MPa。在各種實(shí)施方案中，施加壓力持續(xù)足以破壞軟組織中基本上所有天然組織細(xì)胞的時(shí)間。在各種實(shí)施方案中，施加壓力持續(xù)至少30分鐘到至少60分鐘。在某些實(shí)施方案中，向液體施加的壓力是至少400MPa，持續(xù)至少 10分鐘。在某些實(shí)施方案中，向液體施加的壓力是至少400MPa，持續(xù)至少30分鐘。在某些實(shí)施方案中，向液體施加的壓力是至少500MPa，持續(xù)至少30分鐘。在各種實(shí)施方案中，進(jìn)行去細(xì)胞化的方法而不導(dǎo)致組織樣品的過(guò)度加熱，如下所述。在各種實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容的方法允許向組織樣品施加高靜壓而不導(dǎo)致組織樣品的明顯加熱。在各種實(shí)施方案中，某些組織樣品的加熱可能損傷多種組織細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，從而削弱組織樣品當(dāng)用于組織修復(fù)、更換或再生時(shí)的期望生物功能。因此，本文的某些實(shí)施方案可允許組織去細(xì)胞化、組織融化、和/或減少組織的生物負(fù)荷，而不加熱組織樣品到可能損傷組織細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的溫度或持續(xù)時(shí)間。在某些實(shí)施方案中，以使得組織樣品不達(dá)到大于30°C的溫度的速率和最大壓力施加高靜壓。在某些實(shí)施方案中，溫度不超過(guò) 25 °C。在某些實(shí)施方案中，在靜壓器皿中施加壓力導(dǎo)致器皿內(nèi)材料(即，液體)的絕熱壓縮，這導(dǎo)致被壓縮材料的溫度提高。然而，某些加壓器皿允許經(jīng)由器皿壁的一些熱傳遞，因此這種系統(tǒng)不是真正絕熱的。因此，在各種實(shí)施方案中，壓力增加的量與壓縮(即，壓力增力口)的速率和向器皿壁傳遞熱或從器皿壁傳遞熱有關(guān)。此外，在各種實(shí)施方案中，器皿內(nèi)水的相變也可影響器皿內(nèi)的溫度。因此，在一些實(shí)施方案中，被高靜壓處理的樣品的溫度可通過(guò)控制在處理器皿中的壓力增加的速率來(lái)控制。在某些實(shí)施方案中，可在施加高靜壓之前和/或過(guò)程中冷卻組織樣品、加壓器皿中容納的液體、和/或加壓設(shè)備。在一些實(shí)施方案中，可將冰放入加壓器皿中容納的液體， 和/或可冷卻加壓器皿的壁。在各種實(shí)施方案中，為了阻止組織損傷、損壞、和/或微生物生長(zhǎng)，通常期望在處理、運(yùn)輸和/或儲(chǔ)存期間冷凍組織樣品。在各種實(shí)施方案中，在隨后的處理或使用期間融化組織樣品。但在某些情形中，通過(guò)加熱來(lái)融化組織樣品可損傷組織細(xì)胞外基質(zhì)成分和/或促進(jìn)微生物生長(zhǎng)。而且，在某些實(shí)施方案中，在相對(duì)冷的條件下(如，在冷藏下或剛好高于樣品中水的凝固點(diǎn))融化組織樣品可以是耗時(shí)的，尤其對(duì)于較大的組織樣品。在某些實(shí)施方案中，用于融化組織樣品的方法包括提供在液體中的至少部分地冷凍的包含哺乳動(dòng)物組織的組織樣品，和向液體施加足以融化冷凍的組織樣品的壓力。在一些實(shí)施方案中，融化發(fā)生在有限時(shí)間內(nèi)和/或伴隨組織樣品溫度僅有限的升高。圖1提供水的固相和液相的相圖。如所示的，多種冰相的融點(diǎn)在較高壓力下降低。 因此，在某些實(shí)施方案中，向含有冰的樣品施加高靜壓可導(dǎo)致固態(tài)水向液體轉(zhuǎn)變而不明顯加熱組織樣品。在各種實(shí)施方案中，組織樣品可包含部分或完全地為固態(tài)(即，冰)的水。在各種實(shí)施方案中，融化組織樣品包括導(dǎo)致樣品中一部分或基本上所有固態(tài)水轉(zhuǎn)變?yōu)橐后w。在一些實(shí)施方案中，融化冷凍的組織樣品包括導(dǎo)致組織樣品中大于50%的固態(tài)水經(jīng)歷相轉(zhuǎn)變成為液態(tài)。在一些實(shí)施方案中，融化冷凍的組織包括導(dǎo)致組織樣品中基本上所有的固態(tài)水經(jīng)歷相轉(zhuǎn)變成為液態(tài)。在各種實(shí)施方案中，樣品中50%至100%的冰經(jīng)歷相轉(zhuǎn)變成為液態(tài)。在各種實(shí)施方案中，施加高靜壓處理之前和之后樣品中固態(tài)冰的量可以許多方式確定。例如，在各種實(shí)施方案中，對(duì)于小樣品可利用差示掃描量熱法(DSC)確定樣品中冰的存在。在各種實(shí)施方案中，對(duì)于較大樣品，可通過(guò)將樣品放置在已知溫度的絕熱液體中并向系統(tǒng)供應(yīng)熱來(lái)鑒定冰。在某些實(shí)施方案中，可在絕熱系統(tǒng)中壓縮(加壓)樣品，并且可在壓縮期間測(cè)量樣品溫度或樣品周圍的流體介質(zhì)的溫度。預(yù)期不含冰的樣品在絕熱系統(tǒng)中以相對(duì)于加壓速率的恒定速率提高其溫度。在某些實(shí)施方案中，對(duì)于含有冰的樣品，樣品溫度將在接近冰的融點(diǎn)的溫度達(dá)到平穩(wěn)(plateau)。在一些實(shí)施方案中，如果測(cè)量樣品周圍流體的溫度，含有冰的樣品的流體溫度將比不含冰的樣品更緩慢地提高。樣品溫度的平穩(wěn)和/或溫度升高速率的降低將取決于存在的冰的量。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)歷高靜壓處理的組織樣品的溫度被維持低于上限。在一些實(shí)施方案中，上限是基于樣品的開(kāi)始溫度。例如，在一些實(shí)施方案中，進(jìn)行組織融化而不使組織樣品的溫度提高多于10°C。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)行融化而不提高溫度到高于30°C。 在一些實(shí)施方案中，進(jìn)行融化而不提高溫度到高于25°C。在某些實(shí)施方案中，進(jìn)行融化而不提高組織樣品的溫度到高于約25°C至30°C。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)行融化而不提高溫度到高于上限，并在某一時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。例如，在一些實(shí)施方案中，融化發(fā)生在30分鐘內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，融化發(fā)生在60分鐘內(nèi)。 在各種實(shí)施方案中，融化發(fā)生在約30分鐘內(nèi)至約60分鐘內(nèi)。在各種實(shí)施方案中，進(jìn)行高靜壓處理以獲得樣品的生物負(fù)荷減少某一水平。例如，在各種實(shí)施方案中，高靜壓可以足以導(dǎo)致樣品的細(xì)菌負(fù)荷至少減少5個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)、減少6個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)、減少7個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)或減少8個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的壓力和時(shí)間施加。在一些實(shí)施方案中，高靜壓可以足以減少生物負(fù)荷到特定水平的壓力和時(shí)間施加。在各種實(shí)施方案中，組織樣品的生物負(fù)荷可通過(guò)如下測(cè)量從組織樣品提取微生物，并培養(yǎng)或定量特定類型的生物體。用于從樣品提取微生物的適當(dāng)方法包括用無(wú)菌液體洗滌樣品，并培養(yǎng)用來(lái)洗滌樣品的液體的部分或全部以定量樣品中任何特定的一種或多種微生物的量。在多種實(shí)施方案中，洗滌流體可基于待定量的微生物類型和/或?yàn)榱朔乐箤?duì)組織的損傷來(lái)選擇。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)行生物負(fù)荷減少而不提高溫度到高于30°C。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)行生物負(fù)荷減少而不提高溫度到高于25°C。在某些實(shí)施方案中，進(jìn)行生物負(fù)荷減少而不提高組織樣品的溫度到高于約25°C至30°C。在一些實(shí)施方案中，滅菌過(guò)程可在向組織樣品施加高靜壓之前或之后進(jìn)行。例如， 在一些實(shí)施方案中，施加高靜壓將至少部分地減少組織樣品的生物負(fù)荷，并且可進(jìn)行組織滅菌過(guò)程以進(jìn)一步減少樣品中的生物負(fù)荷。在一些實(shí)施方案中，滅菌過(guò)程可以是正好在包裝組織樣品之前或之后進(jìn)行的最后滅菌過(guò)程。本文所用的“滅菌過(guò)程”可包括減少樣品中的生物負(fù)荷的任何過(guò)程，但不需要使得樣品完全無(wú)菌。某些示例的過(guò)程包括但不限于，Y輻照過(guò)程、電子束輻照過(guò)程、超臨界二氧化碳滅菌過(guò)程和過(guò)乙酸處理過(guò)程。在各種實(shí)施方案中，這種過(guò)程可能損傷一些組織成分，且因此為了產(chǎn)生具有期望生物特性的組織，可能期望限制滅菌過(guò)程的時(shí)間或強(qiáng)度(如，輻射劑量或 PH)。在某些實(shí)施方案中，向樣品施加高靜壓以部分地減少生物負(fù)荷可因此減少用來(lái)實(shí)現(xiàn)期望的無(wú)菌性水平的隨后滅菌過(guò)程的劑量。適當(dāng)?shù)臏缇^(guò)程包括但不限于，例如，Sim等的美國(guó)專利公布號(hào)2006/0073592A1 ；Kemp的美國(guó)專利號(hào)5，460, 962 ；Cook等的美國(guó)專利公布號(hào) 2008/0171092A1中描述的那些。實(shí)施例1 組織生物負(fù)荷的減少使用豬皮。組織以帶有完整毛發(fā)的全皮提供，或以與表皮和皮下脂肪層分離的真皮層提供。真皮層通過(guò)如下分離從真皮切下皮下脂肪和薄層(l-2mm)的真皮下部，并從真皮切下薄層(0.25-lmm)的表皮和真皮上部。在分離真皮之前機(jī)械去除毛發(fā)。將兩種樣品類型預(yù)先冷凍，且為了增加分離的真皮組織中的生物負(fù)荷水平，將所有組織在冷藏條件下融化后一起(全皮和分離的真皮)儲(chǔ)存數(shù)天。利用DENI Magic Vac食品包裝設(shè)備(food saver device)單獨(dú)包裝每一片。將每一片密封在三個(gè)真空密封小袋中以防止豬組織暴露于加壓器皿。以密封小袋中帶有最少量的流體來(lái)密封樣品，從而使包裝物緊密地貼合樣品。ElmHurst Research，Inc (Albany，附)制造的13升加壓系統(tǒng)用于實(shí)驗(yàn)。該系統(tǒng)具有固定容積，并通過(guò)向器皿中泵入流體來(lái)施加壓力。利用熱電偶來(lái)測(cè)量溫度，該熱電偶從器皿的蓋伸入加壓腔中，以測(cè)量總流體壓力(bulk fluid pressure) 0首先測(cè)試全皮和分離的真皮二者的小片(運(yùn)行1和運(yùn)行幻，然后將大的未除毛的片暴露于相同條件(運(yùn)行3和運(yùn)行4)。表1概述了這些條件。壓力器皿不具有溫度控制系統(tǒng)，所以最大溫度主要依賴于開(kāi)始溫度和最大壓力。壓力增加的速率是以350PSI/秒的單速。在運(yùn)行1和運(yùn)行2后，通過(guò)肉眼和觸摸來(lái)檢查暴露于高靜壓的小組織片的明顯降解跡象。沒(méi)有觀察到明顯的降解跡象，所以在運(yùn)行3和運(yùn)行4中處理大組織片。
權(quán)利要求
1.一種用于將組織樣品去細(xì)胞化的方法，所述方法包括 提供在液體中的包含哺乳動(dòng)物組織的組織樣品；和向所述液體施加至少200MPa的壓力，持續(xù)足以破壞軟組織中基本上所有天然組織細(xì)胞的時(shí)間，其中破壞基本上所有細(xì)胞包括破裂所述細(xì)胞的細(xì)胞膜，從而在鹽水溶液中洗滌所述組織樣品允許去除至少95%的所述天然組織細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中向所述液體施加的壓力是至少約500MPa。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中向所述液體施加的壓力是至少300MPa，持續(xù)至少30 分鐘。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中向所述液體施加的壓力是至少400MPa，持續(xù)至少10 分鐘。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中向所述液體施加的壓力是至少400MPa，持續(xù)至少30 分鐘。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述液體包括鹽的水溶液。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述液體包括磷酸鹽緩沖鹽水。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括對(duì)所述組織進(jìn)行滅菌過(guò)程。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述滅菌過(guò)程包括γ輻照過(guò)程。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述滅菌過(guò)程包括電子束輻照過(guò)程。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述滅菌過(guò)程包括超臨界二氧化碳滅菌過(guò)程。
12.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述滅菌過(guò)程包括過(guò)乙酸處理過(guò)程。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物組織包括軟組織。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物組織包括皮膚。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物軟組織包括豬真皮。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，所述方法還包括在施加所述壓力之前從皮膚去除表皮層。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物組織包括腱或韌帶中的至少一種。
18.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物組織包括小腸粘膜下層。
19.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括洗滌所述哺乳動(dòng)物軟組織以去除被破壞的細(xì)胞；和對(duì)所述組織樣品進(jìn)行至少一種另外的去細(xì)胞化過(guò)程。
20.一種用于融化組織樣品的方法，所述方法包括提供在液體中的至少部分地冷凍的包含哺乳動(dòng)物組織的組織樣品；和向所述液體施加足以融化所述冷凍的組織樣品的壓力。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中融化所述冷凍的組織包括導(dǎo)致所述組織樣品中大于50%的固態(tài)水經(jīng)歷相轉(zhuǎn)變成為液態(tài)。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，其中融化所述冷凍的組織包括導(dǎo)致所述組織樣品中基本上所有的固態(tài)水經(jīng)歷相轉(zhuǎn)變成為液態(tài)。
23.如權(quán)利要求20所述的方法，其中進(jìn)行融化所述組織而不使所述組織樣品的溫度提高多于10°C。
24.如權(quán)利要求20所述的方法，其中進(jìn)行融化所述組織而不提高所述組織樣品的溫度到大于30°C。
25.如權(quán)利要求21所述的方法，其中進(jìn)行融化所述組織而不使所述組織樣品的溫度提高多于10°C。
26.如權(quán)利要求21所述的方法，其中進(jìn)行融化所述組織而不提高所述組織樣品的溫度到大于30°C。
27.如權(quán)利要求22所述的方法，其中進(jìn)行融化所述組織而不使所述組織樣品的溫度提高多于10°C。
28.如權(quán)利要求22所述的方法，其中進(jìn)行融化所述組織而不提高所述組織樣品的溫度到大于30°C。
29.如權(quán)利要求23- 任一項(xiàng)所述的方法，其中融化所述組織在少于30分鐘中進(jìn)行。
30.如權(quán)利要求23- 任一項(xiàng)所述的方法，其中融化所述組織在少于60分鐘中進(jìn)行。
31.如權(quán)利要求20所述的方法，其中向所述液體施加的壓力是至少500MPa。
32.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述液體包括鹽的水溶液。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述液體包括磷酸鹽緩沖鹽水。
34.如權(quán)利要求20所述的方法，所述方法還包括對(duì)所述組織進(jìn)行滅菌過(guò)程。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述滅菌過(guò)程包括、輻照過(guò)程。
36.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述滅菌過(guò)程包括電子束輻照過(guò)程。
37.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述滅菌過(guò)程包括超臨界二氧化碳滅菌過(guò)程。
38.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述滅菌過(guò)程包括過(guò)乙酸處理過(guò)程。
39.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述組織樣品包括軟組織。
40.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述軟組織包括真皮。
41.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述軟組織包括豬真皮。
42.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物組織包括腱或韌帶中的至少一種。
43.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物組織包括小腸粘膜下層。
44.一種用于將組織樣品去細(xì)胞化的方法，所述方法包括提供在含液體的容器中的包含哺乳動(dòng)物組織的組織樣品；和向所述液體施加壓力，持續(xù)足以破壞軟組織中基本上所有細(xì)胞的時(shí)間，其中破壞基本上所有細(xì)胞包括破裂所述細(xì)胞的細(xì)胞膜，從而在鹽水溶液中洗滌所述組織樣品允許去除至少95 %的天然組織細(xì)胞，且其中所述壓力以使得所述組織樣品的溫度不超過(guò)30°C的速率施加。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中向所述液體施加的壓力是至少500MPa。
46.如權(quán)利要求44所述的方法，其中向所述液體施加的壓力是至少300MPa，持續(xù)至少 30分鐘。
47.如權(quán)利要求44所述的方法，其中向所述液體施加的壓力是至少400MPa，持續(xù)至少 10分鐘。
48.如權(quán)利要求44所述的方法，其中向所述液體施加的壓力是至少400MPa，持續(xù)至少 40分鐘。
49.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述液體包括鹽的水溶液。
50.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述液體包括磷酸鹽緩沖鹽水。
51.如權(quán)利要求44所述的方法，所述方法還包括對(duì)所述組織進(jìn)行滅菌過(guò)程。
52.如權(quán)利要求51所述的方法，其中所述滅菌過(guò)程包括、輻照過(guò)程。
53.如權(quán)利要求51所述的方法，其中所述滅菌過(guò)程包括電子束輻照過(guò)程。
54.如權(quán)利要求51所述的方法，其中所述滅菌過(guò)程包括超臨界二氧化碳滅菌過(guò)程。
55.如權(quán)利要求51所述的方法，其中所述滅菌過(guò)程包括過(guò)乙酸處理過(guò)程。
56.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物組織包括皮膚。
57.如權(quán)利要求56所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物組織包括豬真皮。
58.如權(quán)利要求57所述的方法，所述方法還包括在施加所述壓力之前從皮膚去除表皮層。
59.一種用于減少組織樣品中的生物負(fù)荷的方法，所述方法包括 提供在含液體的容器中的包含哺乳動(dòng)物軟組織的組織樣品；和向所述液體施加壓力，持續(xù)足以導(dǎo)致所述軟組織中的細(xì)菌濃度至少減少5個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的時(shí)間，其中在施加所述壓力期間，所述組織樣品的溫度不超過(guò)30°C。
60.如權(quán)利要求59所述的方法，其中向所述液體施加的壓力是至少500MPa。
61.如權(quán)利要求59所述的方法，其中向所述液體施加的壓力是至少300MPa，持續(xù)至少 30分鐘。
62.如權(quán)利要求59所述的方法，其中向所述液體施加的壓力是至少400MPa，持續(xù)至少 10分鐘。
63.如權(quán)利要求59所述的方法，其中向所述液體施加的壓力是至少400MPa，持續(xù)至少 40分鐘。
64.如權(quán)利要求59所述的方法，其中所述液體包括鹽的水溶液。
65.如權(quán)利要求64所述的方法，其中所述液體包括磷酸鹽緩沖鹽水。
66.如權(quán)利要求59所述的方法，所述方法還包括對(duì)所述組織進(jìn)行至少一種另外的滅菌過(guò)程。
67.如權(quán)利要求66所述的方法，其中所述滅菌過(guò)程包括γ輻照過(guò)程。
68.如權(quán)利要求66所述的方法，其中所述滅菌過(guò)程包括電子束輻照過(guò)程。
69.如權(quán)利要求66所述的方法，其中所述滅菌過(guò)程包括超臨界二氧化碳滅菌過(guò)程。
70.如權(quán)利要求66所述的方法，其中所述滅菌過(guò)程包括過(guò)乙酸處理過(guò)程。
71.如權(quán)利要求59所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物軟組織包括皮膚。
72.如權(quán)利要求71所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物軟組織包括豬真皮。
73.如權(quán)利要求71所述的方法，所述方法還包括在施加所述壓力之前從皮膚去除表皮層。
74.如權(quán)利要求59所述的方法，其中所述組織樣品的溫度不超過(guò)25V。
75.如權(quán)利要求59所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物軟組織是真皮。
76.如權(quán)利要求75所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物軟組織是無(wú)細(xì)胞真皮。
77.如權(quán)利要求59所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物軟組織是無(wú)細(xì)胞的。
78.一種用于減少組織樣品中的生物負(fù)荷的方法，所述方法包括 提供在含液體的容器中的包含哺乳動(dòng)物軟組織的組織樣品；和向所述液體施加至少200MPa的壓力，其中在施加所述壓力期間，所述組織樣品的溫度不超過(guò)30°C。
79.如權(quán)利要求78所述的方法，其中向所述液體施加的壓力是至少500MPa。
80.如權(quán)利要求78所述的方法，其中向所述液體施加的壓力是至少300MPa，持續(xù)至少 30分鐘。
81.如權(quán)利要求78所述的方法，其中向所述液體施加的壓力是至少400MPa，持續(xù)至少 10分鐘。
82.如權(quán)利要求78所述的方法，其中向所述液體施加的壓力是至少400MPa，持續(xù)至少 40分鐘。
83.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述液體包括鹽的水溶液。
84.如權(quán)利要求83所述的方法，其中所述液體包括磷酸鹽緩沖鹽水。
85.如權(quán)利要求78所述的方法，所述方法還包括對(duì)所述組織進(jìn)行至少一種另外的滅菌過(guò)程。
86.如權(quán)利要求85所述的方法，其中所述滅菌過(guò)程包括γ輻照過(guò)程。
87.如權(quán)利要求85所述的方法，其中所述滅菌過(guò)程包括電子束輻照過(guò)程。
88.如權(quán)利要求85所述的方法，其中所述滅菌過(guò)程包括超臨界二氧化碳滅菌過(guò)程。
89.如權(quán)利要求85所述的方法，其中所述滅菌過(guò)程包括過(guò)乙酸處理過(guò)程。
90.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物軟組織包括皮膚。
91.如權(quán)利要求90所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物軟組織包括豬真皮。
92.如權(quán)利要求90所述的方法，所述方法還包括在施加所述壓力之前從皮膚去除表皮層。
93.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述組織樣品的溫度不超過(guò)25V。
94.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物軟組織是真皮。
95.如權(quán)利要求94所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物軟組織是無(wú)細(xì)胞真皮。
96.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物軟組織是無(wú)細(xì)胞的。
97.如權(quán)利要求78所述的方法，其中向所述液體施加壓力，持續(xù)足以導(dǎo)致所述哺乳動(dòng)物軟組織中的細(xì)菌濃度至少減少5個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的時(shí)間。
98.一種組織產(chǎn)品，所述組織產(chǎn)品是利用權(quán)利要求1-97任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的。
全文摘要
提供了用于處理組織的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括通過(guò)向組織樣品施加高靜壓而將組織樣品去細(xì)胞化的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括通過(guò)向組織樣品施加高靜壓而融化組織樣品和/或減少樣品中的生物負(fù)荷的方法。
文檔編號(hào)A61K35/12GK102470149SQ201080034252
公開(kāi)日2012年5月23日 申請(qǐng)日期2010年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月18日
發(fā)明者本杰明·奇巴羅 申請(qǐng)人:生命細(xì)胞公司