包含益生菌的成年胃腸不耐患者專用營養(yǎng)制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及成人營養(yǎng)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及預(yù)期用于胃腸道功能受損的成人的營養(yǎng)組合物。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及包含益生微生物的對胃腸道功能受損的成人施用的營養(yǎng)組合物。益生微生物可以是非復(fù)制型，例如生物活性的熱處理的益生微生物。
【專利說明】包含益生菌的成年胃腸不耐患者專用營養(yǎng)制劑
[0001] 本發(fā)明涉及成人營養(yǎng)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及預(yù)期用于胃腸道功能受損的成 人的營養(yǎng)組合物。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及包含益生微生物的對胃腸道功能受損的成人 施用的營養(yǎng)組合物。益生微生物可以是非復(fù)制型，例如生物活性的熱處理益生微生物。
[0002] 成人具有基于例如其年齡、性別或體力活動水平的具體營養(yǎng)需要。平衡的飲食通 ?？梢詽M足那些需要，并向身體提供所有所需營養(yǎng)物。
[0003] 但是，一些成人患有胃腸（GI)道功能受損。因此，并非總是想要或能夠向身體供 給足量營養(yǎng)物。
[0004] 這類成人通?；加欣缡秤档汀Ⅲw積不耐、便秘或腹瀉，其或者不允許足夠的食 物攝取，或者不允許從所攝入的食物正確吸收所需營養(yǎng)物。
[0005] 已針對這類情況開發(fā)了專用營養(yǎng)組合物，使得甚至在不利情況下也仍然可以滿足 這類患者的特殊需要。
[0006] 通常，在食物攝取不足的情況下，處理食物組合物中的常量營養(yǎng)物，以使它們更易 于吸收。
[0007] 然而，還希望支持腸道功能，使得消化系統(tǒng)更有效地工作。
[0008] 胃腸道功能受損引起的營養(yǎng)不良通常弱化免疫系統(tǒng)。
[0009] 還希望組合物具有抗炎作用。
[0010] 因此，希望以在疾病或從疾病恢復(fù)的情況下降低炎癥程度的天然組合物和/或以 允許腸道更好地起作用的手段，不僅向患者提供營養(yǎng)支持，而且提供免疫系統(tǒng)支持。
[0011] 因此，本領(lǐng)域中存在對營養(yǎng)組合物的需要，該營養(yǎng)組合物允許根據(jù)成年患者的具 體需要向他們提供專用營養(yǎng)，同時(shí)減少炎癥、強(qiáng)化免疫系統(tǒng)和/或改善消化。優(yōu)選通過使用 天然成分來達(dá)到此目的，該天然成分可以在無副作用的情況下安全施用，且易于用工業(yè)處 理摻入營養(yǎng)補(bǔ)充物中。
[0012] 本發(fā)明人已滿足了此需要。因此，本發(fā)明的目的是改進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)的狀態(tài)和提供滿 足上述需要的對成人施用的營養(yǎng)組合物。
[0013] 令本發(fā)明人驚奇地，他們可以通過獨(dú)立權(quán)利要求的主題來達(dá)到此目的。從屬權(quán)利 要求進(jìn)一步發(fā)展了本發(fā)明的想法。
[0014] 因此，本發(fā)明人提出提供包含益生菌的對患有胃腸道功能受損的成人施用的具體 的口服營養(yǎng)組合物。
[0015] 為了本發(fā)明的目的，將成人理解為至少18歲的人類。
[0016] 發(fā)現(xiàn)益生菌能夠在液體營養(yǎng)組合物的構(gòu)架中提供它們的健康益處。
[0017] 對具體患者施用的液體營養(yǎng)組合物通常具有超過包含益生菌的酸奶飲料的保質(zhì) 期的保質(zhì)期，由于可以在延長的保質(zhì)期內(nèi)確保益生菌的存活力的不確定性，目前未在這類 營養(yǎng)組合物中加入益生菌。
[0018] 本發(fā)明人現(xiàn)在能夠顯示，甚至非復(fù)制型益生菌也可以提供益生菌的健康益處，且 甚至可以具有改善的益處。
[0019] 因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是對成人施用的組合物，該組合物提供對患者的完 全營養(yǎng)，且包含益生微生物。
[0020] 成人可以患有例如胃腸道功能受損。
[0021] 如果患者從此組合物獲得所有所需營養(yǎng)物而無需其他食物來源，則該組合物提供 完全營養(yǎng)。
[0022] 本發(fā)明的組合物可以作為通過管飼口服施用的營養(yǎng)組合物或作為通過管飼腸內(nèi) 施用的營養(yǎng)組合物提供。
[0023] 本發(fā)明的營養(yǎng)組合物向胃腸道損傷患者提供中度高熱量、非常高蛋白質(zhì)、100%酶 水解乳清的全元素醫(yī)學(xué)食物。
[0024] 設(shè)計(jì)此組合物來滿足患者的需要，該患者可以經(jīng)歷氧化應(yīng)激、炎癥和/或進(jìn)食不 耐。
[0025] 存在于組合物中的肽可以完全或部分基于乳清，以便于胃排空。作為完全基于乳 清的蛋白質(zhì)源，可以使用酶水解的乳清蛋白。
[0026] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是組合物，該組合物具有0. 9-1. 4kcal/ml的范圍內(nèi)的熱 量密度（caloric density)、380-400m0sm/kg水的范圍內(nèi)的重量摩爾滲透壓濃度，且包含占 組合物卡路里（calories)的約23-27%的蛋白質(zhì)源、占組合物卡路里的約34-38%的糖類 源和占組合物卡路里的約37-41 %的脂質(zhì)源。
[0027] 非常高的蛋白質(zhì)含量支持身體在應(yīng)激期間的需要。
[0028] 因此，組合物可以具有70 : 1至80 : 1的范圍內(nèi)的NPC : N比率。通過計(jì)算每 天提供的氮的克數(shù)（lg N = 6. 25g蛋白質(zhì)），并用總的非蛋白質(zhì)千卡數(shù)（kcalories)除以氮 的克數(shù)來計(jì)算非蛋白質(zhì)千卡與氮之比率（NPC : N)。
[0029] 通常，將NPC : N比率在80 : 1的范圍內(nèi)的營養(yǎng)補(bǔ)充物用于最嚴(yán)重應(yīng)激的患者， NPC : N比率在100 : 1的范圍內(nèi)的營養(yǎng)補(bǔ)充物用于嚴(yán)重應(yīng)激的患者，而NPC : N比率在 150 : 1的范圍內(nèi)的營養(yǎng)補(bǔ)充物用于未應(yīng)激的患者。
[0030] 本發(fā)明的組合物可以包含具有1. 5 : 1至2 : 1的范圍內(nèi)的n6 : n3脂肪酸比率， 和/或55 : 45至45 : 55的范圍內(nèi)的MCT : LCT比率的脂質(zhì)源。
[0031] 大量的n-3脂肪酸有助于調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。平衡肽譜和MCT油促進(jìn)吸收和GI耐受。 選擇高M(jìn)CT : LCT比率來降低脂肪吸收障礙的可能性。
[0032] 本發(fā)明的組合物可以包含纖維來幫助促進(jìn)健康的腸道微生物區(qū)系?？梢允褂猛愣?纖維、寡聚果糖、菊粉及其組合。纖維可以以5-6g/L的量存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用寡 聚果糖和菊粉的組合。
[0033] 通常，本發(fā)明的組合物包含約79-83%自由水。自由水是滿足最低流體需要必不可 少的。通常，胃腸道功能受損的患者飲水不足。
[0034] 本發(fā)明的組合物可以用于腫瘤患者、IBD(炎性腸病）、短腸綜合征、敗血癥、危重 癥、胃腸道損傷、胃腸道瘺、感染、惡心、嘔吐、手術(shù)前和手術(shù)后病癥、壓力性潰瘍、傷口處理、 靜脈淤滯性潰瘍、呼吸機(jī)依賴性、燒傷、重癥監(jiān)護(hù)條件、局限性腸炎、腹瀉、脂肪吸收障礙、谷 蛋白不耐、代謝亢進(jìn)、消化和吸收受損、乳糖不耐、腸道功能受限、代謝應(yīng)激狀態(tài)、呼吸性疾 病、過渡進(jìn)食（TPN后）、早期手術(shù)后進(jìn)食、腸切除、胰腺炎或其組合的營養(yǎng)管理。
[0035] 組合物可以包含部分或僅包含非復(fù)制型益生微生物。
[0036] 發(fā)明人驚奇地看到，例如就免疫強(qiáng)化作用而言和/或就抗炎作用而言，非復(fù)制型 益生微生物可以甚至比復(fù)制型益生微生物更有效。
[0037] 這是令人驚奇的，因?yàn)橥ǔ⒁嫔x為"在以足夠的量施用時(shí)賦予宿主健 康益處的活微生物"（FA0/WH0指南）。絕大多數(shù)公開的文獻(xiàn)涉及活益生菌。此外，幾項(xiàng) 研究調(diào)查通過非復(fù)制型細(xì)菌傳遞的健康益處，它們中的大多數(shù)顯示，例如通過熱處理失活 益生菌導(dǎo)致它們聲稱的健康益處的喪失（Rachmilewitz，D.等，2004, Gastroenterology 126 :520-528 ;Castagliuolo 等，2005, FEMS Immunol. Med. Microbiol. 43 :197-204 ;Gill， H. S.和 K. J. Rutherfurd，2001，Br. J. Nutr. 86 :285-289 ;Kaila，M.等，1995, Arch. Dis. Child 72:51-53.)。一些研究顯示，滅活益生菌可以保留一些健康作用（Rachmilewitz， D.等，2004, Gastroenterology 126 :520-528 ;Gill，H.S.和 K.J.Rutherfurd，2001， Br. J. Nutr. 86 :285-289)，但顯然，到目前為止，本領(lǐng)域中認(rèn)為活益生菌更有效。
[0038] 本發(fā)明的組合物可以以任意有效量，例如以對應(yīng)于約106至1012cfu/g干重的量包 含益生微生物。
[0039] 益生微生物可以是非復(fù)制型益生微生物。
[0040] "非復(fù)制型"益生微生物包含經(jīng)熱處理的益生菌。這包含失活、死亡、不能生活和/ 或作為諸如DNA、代謝物、胞質(zhì)化合物和/或細(xì)胞壁物質(zhì)的片段存在的微生物。
[0041] "非復(fù)制型"意指通過經(jīng)典平板接種法不能檢測到活細(xì)胞和/或菌落形成單位。 這類經(jīng)典平板接種法總結(jié)在微生物學(xué)書籍James Monroe Jay, Martin J.Loessner，David A. Golden. 2005. Modern food microbiology.第 7 版，Springer Science, New York, N.Y.790p中。通常，活細(xì)胞的缺乏可以顯示如下：用不同濃度的細(xì)菌制劑（"非復(fù)制型"樣 品）接種并在適當(dāng)條件下孵育（有氧和/或缺氧環(huán)境下至少24小時(shí)）后瓊脂平板上無可 見菌落或液體生長培養(yǎng)基中無增加的濁度。
[0042] 為了本發(fā)明的目的，將益生菌定義為"對宿主的健康或康樂具有有益作用的微生 物細(xì)胞制劑或微生物細(xì)胞的成分"。（Salminen S，Ouwehand A.Benno Y.等"Probiotics: how should they be defined"Trends Food Sci.Technol. 1999:10107-10)。
[0043] 使用非復(fù)制型益生微生物的可能性提供了幾個(gè)優(yōu)勢。在嚴(yán)重?zé)o免疫應(yīng)答的患者 中，由于發(fā)生菌血癥的潛在風(fēng)險(xiǎn)，可以將活益生菌的使用限制在例外病例中?？梢詿o任何問 題地使用非復(fù)制型益生菌。
[0044] 此外，非復(fù)制型益生微生物的提供允許熱重構(gòu)，同時(shí)保持健康益處。
[0045] 本發(fā)明的組合物以足以至少部分產(chǎn)生健康益處的量包含益生微生物和/或非復(fù) 制型益生微生物。將足以達(dá)到此目的的量定義為"治療有效劑量"。對此目的有效的量將取 決于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多因素，如患者的體重和一般健康狀態(tài)，且取決于食物基質(zhì) 的作用。
[0046] 在預(yù)防性應(yīng)用中，以足以至少部分降低發(fā)生障礙的風(fēng)險(xiǎn)的量對易感該障礙或處于 該障礙的風(fēng)險(xiǎn)的消費(fèi)者施用本發(fā)明的組合物。將這種量定義為"預(yù)防有效劑量"。同樣，精 確的量取決于許多因素，如患者的健康狀態(tài)和體重，且取決于食物基質(zhì)的作用。
[0047] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)治療有效劑量和/或預(yù)防有效劑量。
[0048] 一般而言，本發(fā)明的組合物以治療有效劑量和/或以預(yù)防有效劑量包含益生微生 物和/或非復(fù)制型益生微生物。
[0049] 通常，治療有效劑量和/或預(yù)防有效劑量在每個(gè)日劑量約0, 005mg-1000mg益生微 生物和/或非復(fù)制型益生微生物的范圍內(nèi)。
[0050] 就數(shù)值量而言，"短時(shí)間高溫"處理的非復(fù)制型微生物可以以對應(yīng)于104至10 12等 同cfu/g干組合物的量存在于組合物中。顯然，非復(fù)制型微生物不形成菌落，因此，此術(shù)語 應(yīng)理解為從1〇 4至l〇12cfu/g復(fù)制型細(xì)菌獲得的非復(fù)制型微生物的量。這包含失活、不能存 活或死亡或作為諸如DNA或細(xì)胞壁或胞質(zhì)化合物的片段存在的微生物。換言之，按照該量 的微生物的菌落形成能力（cfu)來表示組合物所包含的微生物的量，就如同所有微生物都 是活的一樣，而不考慮它們實(shí)際上是否是非復(fù)制型，如失活或死亡、片段化或任意或所有這 些狀態(tài)的混合。
[0051] 優(yōu)選地，非復(fù)制型微生物以等同于104至109cfu/g干組合物的量、甚至更優(yōu)選以等 同于10 5至109cfu/g干組合物的量存在。
[0052] 可以通過本領(lǐng)域已知的任意方法使益生菌成為非復(fù)制型。
[0053] 使益生菌株成為非復(fù)制型的目前可獲得的技術(shù)通常是熱處理、Y -照射、紫外光或 使用化學(xué)試劑（福爾馬林、多聚甲醛）。
[0054] 可以優(yōu)選使用在食品工業(yè)中的工業(yè)環(huán)境下相對易于應(yīng)用的技術(shù)來使益生菌成為 非復(fù)制型。
[0055] 目前市場上的大多數(shù)包含益生菌的產(chǎn)品是在其產(chǎn)生過程中經(jīng)熱處理的產(chǎn)品。因此 便于能夠與所產(chǎn)生的產(chǎn)品一起或至少以相似的方式熱處理益生菌，同時(shí)益生菌保持或改善 了它們的有益特性或甚至獲得新的對消費(fèi)者有益的特性。
[0056] 但是，通過熱處理失活益生微生物在文獻(xiàn)中一般與益生活性的至少部分喪失相 關(guān)。
[0057] 本發(fā)明人現(xiàn)已驚奇地發(fā)現(xiàn)，例如通過熱處理使益生微生物成為非復(fù)制型未導(dǎo)致益 生健康益處的喪失，相反，可以增強(qiáng)現(xiàn)有健康益處和甚至產(chǎn)生新的健康益處。
[0058] 因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是組合物，其中通過熱處理使非復(fù)制型益生微生物 成為非復(fù)制型。
[0059] 這種熱處理可以在至少71. 5°C下進(jìn)行至少1秒。
[0060] 可以使用長期熱處理或短期熱處理。
[0061] 在目前的工業(yè)規(guī)模中，通常優(yōu)選短期熱處理，如UHT樣熱處理。這類熱處理減少了 細(xì)菌接種量，并減少了處理時(shí)間，從而減少了營養(yǎng)物的破壞。
[0062] 發(fā)明人首次表明，無論它們的起始特性如何，在高溫下短時(shí)間熱處理的益生微生 物都顯示抗炎免疫特性。具體而言，通過此熱處理，產(chǎn)生了新的抗炎特性，或增強(qiáng)了現(xiàn)有抗 炎特性。
[0063] 因此，即使活對應(yīng)物不是抗炎菌株，現(xiàn)在也可能通過使用對應(yīng)于典型的可在工業(yè) 上應(yīng)用的熱處理的具體熱處理參數(shù)來產(chǎn)生具有抗炎免疫特性的非復(fù)制型益生微生物。
[0064] 因此，例如，熱處理可以是在約71. 5_150°C下高溫處理約1-120秒。高溫處理可以 是高溫/短時(shí)間（HTST)處理或超高溫（UHT)處理。
[0065] 可以在約71. 5-150°C下對益生微生物進(jìn)行約1-120秒的短期高溫處理。
[0066] 更優(yōu)選可以在約90-140°C，例如90-120°C下對微生物進(jìn)行約1-30秒的短期高溫 處理。
[0067] 此高溫處理使微生物成為至少部分非復(fù)制型。
[0068] 高溫處理可以在正常大氣壓下進(jìn)行，但也可以在高壓下進(jìn)行。典型的壓力范圍為 1至50bar，優(yōu)選1至lObar，甚至更優(yōu)選2至5bar。顯然，應(yīng)用熱時(shí)，優(yōu)選在液體或固體的 介質(zhì)中熱處理益生菌。因此，所應(yīng)用的理想壓力將取決于其中提供了微生物的組合物的性 質(zhì)，且取決于所用溫度。
[0069] 高溫處理可以在約71. 5-150°C、優(yōu)選約90-120°C、甚至更優(yōu)選約120-140°C的溫 度范圍內(nèi)進(jìn)行。
[0070] 高溫處理可以短期進(jìn)行約1-120秒、優(yōu)選約1-30秒、甚至更優(yōu)選約5-15秒。
[0071] 此給定的時(shí)間范圍指益生微生物經(jīng)受給定的溫度的時(shí)間。注意，取決于其中提供 了微生物的組合物的性質(zhì)和量及取決于所使用的加熱器的結(jié)構(gòu)，熱應(yīng)用的時(shí)間可以不同。
[0072] 通常，但是，通過高溫短時(shí)間（HTST)處理、巴氏瞬間滅菌法或超高溫（UHT)處理來 處理本發(fā)明的組合物和/或微生物。
[0073] UHT處理是涉及通過在超過135°C (275 °F )(殺死牛奶中的細(xì)菌孢子所需的溫度） 的溫度下短時(shí)間（約1-10秒）加熱組合物來對它進(jìn)行至少部分滅菌的超高溫處理或超熱 處理（都縮寫為UHT)。例如，用超過135°C的溫度以此方式處理牛奶允許細(xì)菌接種量在使 得能夠進(jìn)行連續(xù)流操作的必要保持時(shí)間（至2-5秒）內(nèi)減少。
[0074] 存在兩種主要的UHT系統(tǒng)類型：直接系統(tǒng)和間接系統(tǒng)。在直接系統(tǒng)中，通過蒸汽注 射或蒸汽注入來處理產(chǎn)品，而在間接系統(tǒng)中，用板式換熱器、管式換熱器或刮面式換熱器熱 處理產(chǎn)品。可以在產(chǎn)物制備方法的任意一個(gè)或多個(gè)步驟應(yīng)用UHT系統(tǒng)的組合。
[0075] HTST處理定義如下（高溫/短時(shí)間）：設(shè)計(jì)來達(dá)到牛奶中存活微生物數(shù)目的5 個(gè)對數(shù)降低，殺死99, 9999%的巴斯德消毒法。認(rèn)為這足以破壞幾乎所有酵母、霉菌和 常見的腐敗細(xì)菌，以及確保充分破壞常見的致病耐熱生物。在HTST法中，將牛奶加熱至 71. 7? (161 T ) 15-20 秒。
[0076] 巴氏瞬間滅菌法是易腐飲料，如果汁和蔬菜汁、啤酒及乳制品的熱巴斯德消毒法。 它在灌裝入容器中之前進(jìn)行，以殺死腐敗微生物、使產(chǎn)品更安全和延長它們的保質(zhì)期。液體 在受控連續(xù)流中移動，同時(shí)經(jīng)受71. 5°C (160 °F )至74°C (165 °F )的溫度約15至30秒。
[0077] 為了本發(fā)明的目的，術(shù)語"短時(shí)間高溫處理"將包括例如高溫短時(shí)間（HTST)處理、 UHT處理和巴氏瞬間滅菌法。
[0078] 由于這種熱處理提供具有改善的抗炎特性的非復(fù)制型益生菌，本發(fā)明的組合物可 以用于預(yù)防或治療炎性障礙。
[0079] 不具體限制可以通過本發(fā)明的組合物治療或預(yù)防的炎性障礙。例如，它們可以選 自急性炎癥，如敗血癥；燒傷；和慢性炎癥，如炎性腸病，例如局限性腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、 隱窩炎；壞死性小腸結(jié)腸炎；皮膚炎癥，如UV或化學(xué)藥品誘導(dǎo)的皮膚炎癥、濕疹、反應(yīng)性皮 膚；腸易激綜合癥；眼睛炎癥；變態(tài)反應(yīng)、哮喘；及其組合。
[0080] 如果用長期熱處理來使益生微生物成為非復(fù)制型，則這種熱處理可以在約 70-150°C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行約3分鐘至2小時(shí)，優(yōu)選在80-140°C的范圍內(nèi)進(jìn)行5分鐘至40 分鐘。
[0081] 雖然現(xiàn)有技術(shù)一般教導(dǎo)，就發(fā)揮它們的益生特性而言，通過長期熱處理使之成為 非復(fù)制型的細(xì)菌通常不如活細(xì)胞有效，但本發(fā)明人能夠表明，與它們的活對應(yīng)物相比，熱處 理的益生菌在刺激免疫系統(tǒng)中更優(yōu)。
[0082] 本發(fā)明還涉及包含益生微生物的組合物，通過在至少約70°C下熱處理至少約3分 鐘來使該益生微生物成為非復(fù)制型。
[0083] 通過體外免疫特性分析（immunoprofi 1 ing)確認(rèn)了非復(fù)制型益生菌的免疫 強(qiáng)化作用。所使用的體外模型使用來自人外周血單核細(xì)胞（PBMC)的細(xì)胞因子譜分 析（profiling)，且作為用于測試免疫調(diào)節(jié)化合物的標(biāo)準(zhǔn)模型在本領(lǐng)域被廣為接受 (Schultz 等，2003， Journal of Dairy Research 70,165-173 ;Taylor 等，2006， Clinical and Experimental Allergy,36,1227-1235 ；Kekkonen 等，2008, World Journal of Gastroenterology,14,1192-1203))〇
[0084] 幾個(gè)作者/研究小組已用體外PBMC測定來例如根據(jù)益生菌的免疫特性，即它們的 抗炎或促炎特征來分類它們（Kekkonen 等，2008，World Journal of Gastroenterology， 14,1192-1203)。例如，已顯示此測定允許預(yù)測益生候選者在腸結(jié)腸炎的小鼠模型中的抗 炎作用（Foligne，B.等，2007，World J. Gastroenterol. 13:236-243)。此外，此測定常用 作臨床試驗(yàn)中的讀出，并顯示導(dǎo)致與臨床結(jié)果相關(guān)的結(jié)果（Schultz等，2003, Journal of Dairy Research 70,165-173 ;Taylor等，2006,Clinical and Experimental Allergy,36, 1227-1235)。
[0085] 變應(yīng)性疾病在過去幾十年中已穩(wěn)步增加，且目前WHO將它們視為流行病。一般而 言，認(rèn)為變態(tài)反應(yīng)由免疫系統(tǒng)的Thl和Th2應(yīng)答之間的不平衡引起，該不平衡導(dǎo)致趨向于 產(chǎn)生Th2介質(zhì)（mdiator)的強(qiáng)趨勢。因此，可以通過恢復(fù)免疫系統(tǒng)的Thl和Th2雙臂間的 恰當(dāng)平衡來緩解、下調(diào)或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)。這意味著必需降低Th2應(yīng)答，或至少瞬時(shí)增強(qiáng)Thl 應(yīng)答。后者可以是通常伴隨例如更高水平的IFNY、TNF-α和IL-12的免疫強(qiáng)化應(yīng)答的特 征。(Kekkonen 等，2008，World Journal of Gastroenterology，14,1192-1203 ;Viljanen M.等，2005, Allergy, 60,494-500)。
[0086] 因此，本發(fā)明的組合物允許治療或預(yù)防與免疫防御損傷相關(guān)的障礙。
[0087] 因此，不具體限制可以通過本發(fā)明的組合物治療或預(yù)防的與免疫防御損傷相關(guān)的 障礙。
[0088] 例如，它們可以選自感染，尤其是細(xì)菌、病毒、真菌和/或寄生蟲感染；吞噬細(xì)胞缺 乏；低至嚴(yán)重的免疫抑制水平，如由應(yīng)激或免疫抑制藥物、化學(xué)療法或放射治療誘導(dǎo)的那 些；較低免疫活性的免疫系統(tǒng)的天然狀態(tài)，如新生兒的那些；變態(tài)反應(yīng)；及其組合。
[0089] 本發(fā)明中所述的組合物還允許增強(qiáng)患者對疫苗，尤其是對口服疫苗的應(yīng)答。
[0090] 任意量的非復(fù)制型微生物都將是有效的。但是，一般優(yōu)選至少90%、優(yōu)選至少 95%、更優(yōu)選至少98%、最優(yōu)選至少99%、理想地至少99. 9%、最理想地所有的益生菌是非 復(fù)制型。
[0091] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所有微生物都是非復(fù)制型。
[0092] 因此，在本發(fā)明的組合物中，至少90 %、優(yōu)選至少95 %、更優(yōu)選至少98 %、最優(yōu)選 至少99%、理想地至少99. 9%、最理想地所有的益生菌可以是非復(fù)制型。
[0093] 為了本發(fā)明的目的，可以使用所有益生微生物。
[0094] 例如，益生微生物可以選自雙歧桿菌（bifidobacteria)、乳桿菌（lactobaci 11 i)、 丙酸桿菌（propionibacteria)或其組合，例如長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum)、乳 雙歧桿菌（Bifidobacterium lactis)、動物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis)、短雙 歧桿菌（Bifidobacterium breve)、嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacterium infantis)、青春雙 歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis)、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus)、 干釀乳桿菌（Lactobacillus casei)、類干釀乳桿菌（Lactobacillus paracasei)、唾液 乳桿菌（Lactobacillus salivarius)、路氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri)、鼠李糖 乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus)、約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii)、植物乳 桿菌（Lactobacillus plantarum)、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum)、乳乳球菌 (Lactococcus lactis)、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus)、乳乳球菌、二乙醜乳 乳球菌（Lactococcus diacetylactis)、乳脂乳球菌（Lactococcus cremoris)、保加利亞乳 桿菌（Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus)、德氏乳桿 菌（Lactobacillus delbrueckii)、大腸桿菌（Escherichia coli)和 / 或其混合物。
[0095] 本發(fā)明的組合物可以例如包含選自長雙歧桿菌NCC 3001、長雙歧桿菌NCC 2705、 短雙歧桿菌NCC 2950、乳雙歧桿菌NCC 2818、約氏乳桿菌Lai、類干酪乳桿菌NCC 2461、 鼠李糖乳桿菌NCC 4007、路氏乳桿菌DSM17983、路氏乳桿菌ATCC55730、嗜熱鏈球菌NCC 2019、嗜熱鏈球菌NCC 2059、干酪乳桿菌NCC 4006、嗜酸乳桿菌NCC 3009、干酪乳桿菌 ACA-DC 6002(NCC 1825)、尼氏大腸桿菌（Escherichia coli Nissle)、保加利亞乳桿菌NCC 15、乳乳球菌NCC 2287或其組合的益生微生物。
[0096] 所有這些菌株或是在布達(dá)佩斯條約（Budapest treaty)下保藏和/或是可商購獲 得的。
[0097] 已在布達(dá)佩斯條約下保藏的菌株如下：
[0098] 長雙歧桿菌 NCC 3001 :ATCC BAA-999
[0099] 長雙歧桿菌 NCC 2705 :CNCM 1-2618
[0100] 短雙歧桿菌 NCC 2950 :CNCM 1-3865
[0101] 乳雙歧桿菌 NCC 2818 :CNCM 1-3446
[0102] 類干酪乳桿菌 NCC 2461 :CNCM 1-2116
[0103] 鼠李糖乳桿菌 NCC 4007 :CGMCC 1· 3724
[0104] 嗜熱鏈球菌 NCC 2019 :CNCM 1-1422
[0105] 嗜熱鏈球菌 NCC 2059 :CNCM 1-4153
[0106] 乳乳球菌 NCC 2287 :CNCM 1-4154
[0107] 干酪乳桿菌 NCC 4006 :CNCM 1-1518
[0108] 干酪乳桿菌 NCC 1825 :ACA-DC 6002
[0109] 嗜酸乳桿菌 NCC 3009 :ATCC 700396
[0110] 保加利亞乳桿菌 NCC 15 :CNCM 1-1198
[0111] 約氏乳桿菌 Lai :CNCM 1-1225
[0112] 路氏乳桿菌 DSM17983 :DSM17983
[0113] 路氏乳桿菌 ATCC55730 :ATCC55730
[0114] 尼氏大腸桿菌1917 :DSM 6601
[0115] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，它們可以自由地組合本文中所述的本發(fā)明的所有特征， 而不偏離所公開的發(fā)明的范圍。
[0116] 本發(fā)明的其他優(yōu)勢和特征從以下實(shí)施例和附圖顯而易見。
[0117] 圖1A和B顯示用"短時(shí)間高溫"處理的益生菌的抗炎免疫特性的增強(qiáng)。
[0118] 圖2顯示變?yōu)榭寡仔偷姆强寡滓嫔?，即?短時(shí)間高溫"處理后顯示顯著的體 外抗炎免疫特性的非抗炎益生菌株。
[0119] 圖3A和B顯示用于市售產(chǎn)品中的益生菌株，其在用"短時(shí)間高溫"處理后顯示增 強(qiáng)的或新的體外抗炎免疫特性。
[0120] 圖4A和B顯示乳制品起子菌株（即Lcl起子菌株），其在高溫下熱處理時(shí)顯示增 強(qiáng)的或新的體外抗炎免疫特性。
[0121] 圖5顯示非抗炎益生菌株，其在用HTST處理處理后顯示體外抗炎免疫特性。
[0122] 圖6 :以它們的活體形式和熱處理（140°C，15秒）形式用益生菌株和乳制品起子 菌株產(chǎn)生的PBMC數(shù)據(jù)（IL-12p40、IFN-γ、TNF-α、IL-10)上的主成分分析。每個(gè)點(diǎn)代表 通過其NCC編號或名稱來辨別的一個(gè)活的或熱處理的菌株。
[0123] 圖7顯示活的和熱處理（85°C、20分鐘）的菌株的IL-12p40/IL-10比率?？傮w上， 與本發(fā)明的"短時(shí)間高溫"處理相反，在85°C下熱處理20分鐘導(dǎo)致IL-12p40/IL-10比率的 增加（圖1、2、3、4和5)。
[0124] 圖8顯示來自用熱處理的細(xì)菌刺激的人PBMC的體外細(xì)胞因子分泌的增強(qiáng)。
[0125] 圖9顯示在用鹽水攻擊的0VA致敏小鼠（陰性對照）、用0VA攻擊的0VA致敏小鼠 (陽性對照）及用0VA攻擊并用熱處理的或活的短雙歧桿菌NCC2950處理的0VA致敏小鼠 中觀察到的腹瀉強(qiáng)度的百分比。結(jié)果顯示為腹瀉強(qiáng)度的百分比（從4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)計(jì)算的平 均值土SEM)，100%的腹瀉強(qiáng)度對應(yīng)于陽性對照（用變應(yīng)原致敏和攻擊）組中發(fā)生的癥狀。
[0126] 實(shí)施例1 :
[0127] 方法學(xué)
[0128] 細(xì)菌制劑
[0129] 一般認(rèn)為通過活益生菌對宿主免疫系統(tǒng)傳遞的健康益處是菌株特異性的。已顯示 在體外誘導(dǎo)高水平IL-10和/或誘導(dǎo)低水平促炎細(xì)胞因子（PBMC測定）的益生菌是有效的 體內(nèi)抗炎菌株（Folign6，B.等，2007, World J. Gastroenterol. 13:236-243)。
[0130] 用幾種益生菌株來研究熱處理的益生菌的抗炎特性。這些菌株是長雙歧桿菌NCC 3001、長雙歧桿菌NCC 2705、短雙歧桿菌NCC 2950、乳雙歧桿菌NCC 2818、類干酪乳桿菌 NCC 2461、鼠李糖乳桿菌NCC 4007、干酪乳桿菌NCC 4006、嗜酸乳桿菌NCC 3009、干酪乳桿 菌ACA-DC 6002(NCC 1825)和尼氏大腸桿菌。還測試了包括商業(yè)上用來產(chǎn)生Nestl6Lcl發(fā) 酵產(chǎn)物的一些菌株的幾個(gè)起子培養(yǎng)物菌株：嗜熱鏈球菌NCC 2019、嗜熱鏈球菌NCC 2059、 保加利亞乳桿菌NCC 15和乳乳球菌NCC 2287。
[0131] 在針對各菌株優(yōu)化的條件下在5-15L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞?？梢允褂盟?典型的細(xì)菌生長培養(yǎng)基。這類培養(yǎng)基為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。調(diào)節(jié)pH至5.5時(shí)，連續(xù)加入 30%堿溶液（NaOH或Ca(0H) 2)。適當(dāng)時(shí)，通過用C02處理頂空來維持無氧條件。在標(biāo)準(zhǔn)有 氧條件下培養(yǎng)大腸桿菌。
[0132] 通過離心（5,000Xg、4°C )收集細(xì)菌細(xì)胞，并以適當(dāng)?shù)捏w積重懸在磷酸緩沖鹽溶 液（PBS)中，以達(dá)到約109-101(lCfu/ml的終濃度。用15%的甘油將部分制劑冷凍在-80°C。 通過以下來熱處理另一部分細(xì)胞：
[0133] -超高溫：140°C，15秒；通過直接的蒸汽注射；
[0134] -高溫短時(shí)間（HTST) :74°C、90°C和120°C，15秒，通過直接的蒸汽注射；
[0135] -水浴中長時(shí)間低溫（85°C，20分鐘）
[0136] 熱處理后，使樣品在_80°C下保持冷凍直至使用。
[0137] 細(xì)菌制劑的體外免疫特性分析
[0138] 評估了活的和熱處理的細(xì)菌制劑的免疫特性（即從體外人血細(xì)胞誘導(dǎo)特異性細(xì) 胞因子分泌的能力）。從血液濾器分離了人外周血單核細(xì)胞（PBMC)。通過細(xì)胞密度梯度分 開后，收集單核細(xì)胞，并用Hank's平衡鹽溶液洗滌兩次。然后將細(xì)胞重懸在補(bǔ)充了 10%胎 牛血清（Bioconcept，巴黎，法國）、1% L-谷氨酰胺（Sigma)、1 %青霉素/鏈霉素（Sigma) 和 0· 1%慶大霉素（Sigma)的 Iscove，s Modified Dulbecco，s Medium(IMDM，Sigma)中。 用活細(xì)菌和熱處理細(xì)菌（等于7 X 106cfu/孔）在48孔板中孵育PBMC (7 X 106細(xì)胞/孔）36 小時(shí)。在來自劃分為兩個(gè)分開的實(shí)驗(yàn)的8個(gè)個(gè)體供體的PBMC上測試了活的和熱處理的細(xì) 菌的作用。孵育36小時(shí)后，將培養(yǎng)板凍存在-20°C，直至細(xì)胞因子測量。平行（即在同一實(shí) 驗(yàn)中在同一批次的PBMC上）進(jìn)行活細(xì)菌和它們的熱處理對應(yīng)物的細(xì)胞因子譜分析。
[0139] 按照廠家的說明，通過 ELISA (R&D DuoSet Human IL-10、BD OptEIA Human IL12p40、BD OptEIA Human TNF a、BD OptEIA HumanIFN-γ )測定孵育 36 小時(shí)后的 細(xì)胞培養(yǎng)物上清中的細(xì)胞因子（IFN-γ、IL-12p40、TNF-α和IL-10)水平。IFN-γ、 IL-12p40和TNF-α是促炎細(xì)胞因子，而IL-10是有效的抗炎介質(zhì)。結(jié)果表示為4個(gè)個(gè)體 供體的平均值（pg/ml) 土SEM，且代表各用4個(gè)供體進(jìn)行的兩個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)。針對各菌株 計(jì)算了 IL-12p40/IL-10比率作為體內(nèi)抗炎作用的預(yù)測值（Folign6, B.等，2007, World J.Gastroenterol. 13 :236-243)〇
[0140] 將通過ELISA(見上文）測定的各菌株的數(shù)值型細(xì)胞因子值（pg/ml)轉(zhuǎn)入 BioNumerics ν5· 10 軟件（Applied Maths，Sint-Martens-Latem，比利時(shí)）。對此數(shù)據(jù)集進(jìn) 行了主成分分析（PCA，定尺度技術(shù)（dimensioning technique))。此分析中包括減去性狀 的平均值和除以性狀的方差。
[0141] 結(jié)果
[0142] 通過超高溫（UHT)/高溫短時(shí)間（HTST)樣處理產(chǎn)生的抗炎特性
[0143] 對所研究的益生菌株進(jìn)行了一系列熱處理（超高溫（UHT)、高溫短時(shí)間（HTST)和 85°C 20分鐘），并在體外將它們的免疫特性與活細(xì)胞的免疫特性相比較。在用人PBMC孵育 時(shí)，活微生物（益生菌和/或乳制品起子培養(yǎng)物）誘導(dǎo)了不同水平的細(xì)胞因子產(chǎn)生（圖1、 2、3、4和5)。這些微生物的熱處理以溫度依賴方式改變了由PBMC產(chǎn)生的細(xì)胞因子的水平。 "短時(shí)間高溫"處理（120°C或140°C，15秒）產(chǎn)生了具有抗炎免疫特性的非復(fù)制型細(xì)菌（圖 1、2、3和4)。事實(shí)上，UHT樣處理的菌株（140°C，15秒）誘導(dǎo)較少的促炎細(xì)胞因子（TNF-α、 IFN- γ、IL-12p40)，同時(shí)保持或誘導(dǎo)其他IL-10產(chǎn)生（與活對應(yīng)物相比）。與活細(xì)胞相比， 對于任意UHT樣處理的菌株，產(chǎn)生的IL-12p40/IL-10比率更低（圖1、2、3和4)。此觀測結(jié) 果對通過HTST樣處理的處理細(xì)菌，即經(jīng)受120°C 15秒（圖1、2、3和4)或74°C和90°C 15 秒（圖5)的細(xì)菌也正確。熱處理（UHT樣或HTST樣處理）對益生菌株（圖1、2、3和5)和 乳制品起子培養(yǎng)物（圖4)的體外免疫特性具有相似的作用。用活的和熱處理（140°C，15 秒）的益生菌株和乳制品起子菌株產(chǎn)生的PBMC數(shù)據(jù)上的主成分分析揭示，活菌株全沿X軸 散布，說明菌株顯示非常不同的體外免疫特性，從促炎細(xì)胞因子的低誘導(dǎo)者（左側(cè)）至高誘 導(dǎo)者（右側(cè)）。熱處理的菌株聚集在圖的左側(cè)，顯示熱處理的菌株較少地誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因 子（圖6)。相反，在85°C下熱處理20分鐘的細(xì)菌比活細(xì)胞誘導(dǎo)更多的促炎細(xì)胞因子和更 少的IL-10,導(dǎo)致更高的IL-12p40/IL-10比率（圖7)。
[0144] 通過UHT樣和HTST樣處理增強(qiáng)或產(chǎn)生了抗炎特性
[0145] 無論它們各自的起始免疫特性（活細(xì)胞）如何，UHT和HTST處理的菌株都顯 示抗炎特性。顯示了已知在體內(nèi)為抗炎型且顯示體外抗炎特性的益生菌株（長雙歧桿 菌NCC 3001、長雙歧桿菌NCC 2705、短雙歧桿菌NCC 2950、乳雙歧桿菌NCC 2818)在"短 時(shí)間高溫"處理后顯示增強(qiáng)的體外抗炎特性。如圖1中所示，UHT樣處理的雙歧桿菌屬 (Bifidobacterium)菌株的IL-12p40/IL-10比率低于來自活對應(yīng)物的那些，從而顯示UHT 樣處理的樣品的改善的抗炎特性。更令人驚奇地，還針對非抗炎型活菌株確認(rèn)了通過UHT 樣和HTST樣處理產(chǎn)生抗炎特性。活的鼠李糖乳桿菌NCC4007和類干酪乳桿菌NCC 2461都 在體外顯示高的IL-12p40/IL-10比率（圖2和5)。顯示了這兩種活菌株對小鼠中TNBS誘導(dǎo) 的結(jié)腸炎無保護(hù)作用。鼠李糖乳桿菌NCC 4007和類干酪乳桿菌NCC 2461誘導(dǎo)的IL-12p40/ IL-10比率在"短時(shí)間高溫"處理（UHT或HTST)后顯著降低，達(dá)到與用雙歧桿菌屬菌株獲 得的那些一樣低的水平。這些低IL-12p40/IL-10比率由低水平的IL-12p40產(chǎn)生與無變化 (鼠李糖乳桿菌NCC 4007)或顯著誘導(dǎo)（類干酪乳桿菌NCC 2461)的IL-10分泌的組合引 起（圖2)。
[0146] 因此：
[0147] -可以通過UHT樣和HTST樣熱處理來增強(qiáng)活微生物的抗炎特性（例如長雙歧桿菌 NCC 2705、長雙歧桿菌NCC 3001、短雙歧桿菌NCC 2950、乳雙歧桿菌NCC 2818);
[0148] -可以通過UHT樣和HTST樣熱處理來從非抗炎型活微生物（例如鼠李糖乳桿菌 NCC 4007、類干酪乳桿菌NCC 2461、乳制品起子嗜熱鏈球菌NCC 2019)產(chǎn)生抗炎特性；
[0149] -還針對包括益生大腸桿菌菌株的分離自市售產(chǎn)品的菌株（圖3A和B)顯示了抗 炎特性。
[0150] 對于所有測試的益生菌和乳制品起子，例如乳桿菌、雙歧桿菌和鏈球菌，UHT/HTST 樣處理的影響相似。
[0151] 將UHT/HTST樣處理應(yīng)用于顯示不同的體外免疫特性的幾種乳桿菌、雙歧桿菌和 鏈球菌。所有菌株在UHT/HTST樣處理后都比它們的活對應(yīng)物誘導(dǎo)更少的促炎細(xì)胞因子（圖 1、2、3、4、5和6)，表明UHT/HTST樣處理對產(chǎn)生的非復(fù)制型細(xì)菌的免疫特性的作用可以泛化 至所有益生菌，尤其是乳桿菌、雙歧桿菌和特定大腸桿菌菌株，及所有乳制品起子培養(yǎng)物， 尤其是鏈球菌、乳球菌和乳桿菌。
[0152] 實(shí)施例2:
[0153] 方法學(xué)
[0154] 細(xì)菌制劑
[0155] 用5個(gè)益生菌株來研究非復(fù)制型益生菌的免疫強(qiáng)化特性：3種雙歧桿菌（長雙歧 桿菌NCC3001、乳雙歧桿菌NCC2818、短雙歧桿菌NCC2950)和2種乳桿菌（類干酪乳桿菌 NCC2461、鼠李糖乳桿菌NCC4007)。
[0156] 在37°C的分批發(fā)酵中在MRS上培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞16-18小時(shí)，無 pH控制。離心 (5, 000Xg，4°C )沉淀細(xì)菌細(xì)胞，并重懸在磷酸緩沖鹽溶液中，然后稀釋在鹽水中，以達(dá)到 約lOElOcfu/ml的終濃度。在水浴中85°C熱處理長雙歧桿菌NCC3001、乳雙歧桿菌NCC2818、 類干酪乳桿菌NCC2461、鼠李糖乳桿菌NCC4007 20分鐘。在水浴中90°C熱處理短雙歧桿菌 NCC295030分鐘。分裝熱處理的細(xì)菌懸液，并凍存在-80°C，直至使用。將活細(xì)菌在PBS-15% 甘油中保存在_80°C，直至使用。
[0157] 細(xì)菌制劑的體外免疫特性分析
[0158] 評估了活的和熱處理的細(xì)菌制劑的免疫特性（即從體外人血細(xì)胞誘導(dǎo)特異性細(xì) 胞因子的分泌的能力）。從血液濾器分離了人外周血單核細(xì)胞（PBMC)。通過細(xì)胞密度梯度 分開后，收集單核細(xì)胞，并用Hank's平衡鹽溶液洗滌兩次。然后將細(xì)胞重懸在補(bǔ)充了 10% 胎牛血清（Bioconcept，巴黎，法國）、1% L-谷氨酰胺（Sigma)、1%青霉素/鏈霉素（Sigma) 和 0· 1%慶大霉素（Sigma)的 Iscove，s Modified Dulbecco，s Medium(IMDM，Sigma)中。 然后用活的和熱處理的細(xì)菌（等于7X 106cfu/孔）在48孔板中孵育PBMC(7X 106細(xì)胞/ 孔）36小時(shí)。在來自劃分為兩個(gè)分開的實(shí)驗(yàn)的8個(gè)個(gè)體供體的PBMC上測試了活的和熱處 理的細(xì)菌的作用。孵育36小時(shí)后，將培養(yǎng)板凍存在-20°C，直至細(xì)胞因子測量。平行（即在 同一實(shí)驗(yàn)中在同一批次的PBMC上）進(jìn)行活細(xì)菌和它們的熱處理對應(yīng)物的細(xì)胞因子譜分析。
[0159] 按照廠家的說明，通過 ELISA (R&D DuoSet Human IL-10、BDOptEIA Human IL12p40、BD OptEIA Human TNF、BD OptEIA HumanIFN-γ)測定孵育 36 小時(shí)后的細(xì)胞培 養(yǎng)物上清中的細(xì)胞因子（IFN-γ、IL-12p40、TNF-a和IL-10)水平。IFN-γ、IL-12p40和 TNF-a是促炎細(xì)胞因子，而IL-10是有效的抗炎介質(zhì)。結(jié)果表示為4個(gè)個(gè)體供體的平均值 (pg/ml) 土SEM，且代表各用4個(gè)供體進(jìn)行的兩個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)。
[0160] 活的和熱處理的短雙歧桿菌NCC2950在預(yù)防變應(yīng)性腹瀉中的體內(nèi)作用
[0161] 用變應(yīng)性腹瀉的小鼠模型來測試短雙歧桿菌NCC2950的Thl促進(jìn)作用（Brandt E.B等JCI 2003;112(11) :1666-1667)。致敏（按14天的間隔2次腹膜內(nèi)注射卵清蛋白 (0VA)和硫酸鋁鉀；第0天和第14天）后，用0VA經(jīng)口攻擊雄性Balb/c小鼠 6次（第27、 29、32、34、36、39天），導(dǎo)致短暫的臨床癥狀（腹瀉）和免疫參數(shù)（總IgE、0VA特異性IgE、 小鼠肥大細(xì)胞蛋白酶1 (即MMCP-1)的血漿濃度）的變化。OVA致敏前4天（第-3、-2、-1、 0天及第11、12、13和14天）和攻擊期期間（第23至39天），通過管飼法施用活的或90°C 下熱處理30分鐘的短雙歧桿菌NCC2950。使用了約109菌落形成單位（cfu)或等同cfu/ 小鼠的日細(xì)菌劑量。
[0162] 結(jié)果
[0163] 熱處理后"促炎"細(xì)胞因子的分泌的誘導(dǎo)
[0164] 在體外評估了熱處理的細(xì)菌菌株刺激人外周血單核細(xì)胞（PBMC)分泌細(xì)胞因子的 能力。將通過熱處理的細(xì)菌刺激PBMC后基于四種細(xì)胞因子的免疫特性與在同一體外測定 中通過活細(xì)菌細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫特性相比較。
[0165] 平板接種熱處理的制劑，并針對任意活菌計(jì)數(shù)的缺乏評估。熱處理的細(xì)菌制劑未 在平板接種后產(chǎn)生菌落。
[0166] 在用人PBMC孵育時(shí)，活益生菌誘導(dǎo)了不同且依賴于菌株的細(xì)胞因子產(chǎn)生水平（圖 8)。與它們的活對應(yīng)物相比，熱處理益生菌改變了由PBMC產(chǎn)生的細(xì)胞因子的水平。熱處理 的細(xì)菌比它們的活對應(yīng)物誘導(dǎo)更多的促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IFN-Y、IL-12p40)。相反，與 活細(xì)胞相比，熱處理的細(xì)菌誘導(dǎo)相似量或更低量的IL-10 (圖8)。這些數(shù)據(jù)顯示，熱處理的 細(xì)菌比它們的活對應(yīng)物更能夠刺激免疫系統(tǒng)，因此更能夠強(qiáng)化變?nèi)醯拿庖叻烙?。換言之，體 外數(shù)據(jù)表明熱處理后的細(xì)菌菌株的增強(qiáng)的免疫強(qiáng)化作用。
[0167] 為了說明熱處理的短雙歧桿菌NCC2950(與活細(xì)胞相比）對免疫系統(tǒng)的增強(qiáng)的作 用，在變應(yīng)性腹瀉的動物模型中測試了活的和熱處理的短雙歧桿菌NCC2950(菌株A)二者。
[0168] 與陽性對照組相比，用熱處理的短雙歧桿菌NCC2950處理后腹瀉強(qiáng)度顯著且一致 地減少（41. 1% ±4. 8)，而用活的短雙歧桿菌NCC2950處理后腹瀉強(qiáng)度僅降低20±28. 3%。 這些結(jié)果表明，與它的活對應(yīng)物相比，熱處理的短雙歧桿菌NCC2950顯示增強(qiáng)的對變應(yīng)性 腹瀉的保護(hù)作用（圖9)。
[0169] 因此，顯示了益生菌增強(qiáng)免疫防御的能力在熱處理后得到改善。
[0170] 實(shí)施例3:
[0171] 可以制備以下制劑：
[0172]
【權(quán)利要求】
1. 對患有胃腸道功能受損的成人施用的組合物，其向患者提供完全營養(yǎng)，且包含益生 微生物。
2. 權(quán)利要求1的組合物，其具有0. 9-1. 4kcal/ml的范圍內(nèi)的熱量密度、380-400m0sm/ kg水的范圍內(nèi)的重量摩爾滲透壓濃度，且包含占組合物卡路里的約23-27%的蛋白質(zhì)源、 占組合物卡路里的約34-38 %的糖類源和占組合物卡路里的約37-41 %的脂質(zhì)源，且具有 70 : 1至80 : 1的范圍內(nèi)的NPC : N比率。
3. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其包含n6 : n3脂肪酸比率在1.5 : 1至2 : 1 的范圍內(nèi)和/或MCT : LCT比率在55 : 45至45 : 55的范圍內(nèi)的脂質(zhì)源。
4. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其包含約79-83%自由水。
5. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中所述益生微生物包含非復(fù)制型益生微生物。
6. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其以對應(yīng)于約106至1012cfu的量包含益生微生 物。
7. 權(quán)利要求5-6中任一項(xiàng)的組合物，其中通過熱處理，優(yōu)選通過在至少71. 5°C下高溫 處理至少1秒來使所述非復(fù)制型益生微生物成為非復(fù)制型。
8. 權(quán)利要求7的組合物，其中所述熱處理是在約71. 5-150°C下高溫處理約1-120秒， 且優(yōu)選是高溫/短時(shí)間（HTST)處理或超高溫（UHT)處理。
9. 權(quán)利要求8的組合物，其用于預(yù)防或治療炎性障礙。
10. 權(quán)利要求7的組合物，其中所述熱處理在約70-150°C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行約3分鐘 至2小時(shí)，優(yōu)選在80-140°C的范圍內(nèi)進(jìn)行5分鐘至40分鐘。
11. 權(quán)利要求10的組合物，其用于預(yù)防或治療與免疫防御損傷相關(guān)的障礙。
12. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中所述益生菌的至少90%、優(yōu)選至少95%、更 優(yōu)選至少98%、最優(yōu)選至少99%、理想地至少99. 9%、最理想地全部是非復(fù)制型。
13. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中所述益生微生物選自雙歧桿菌、乳桿菌、丙 酸桿菌或其組合，例如長雙歧桿菌、乳雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿 菌、青春雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、類干酪乳桿菌、唾液乳桿菌、路氏乳桿菌、鼠李 糖乳桿菌、約氏乳桿菌、植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、乳乳球菌、嗜熱鏈球菌、乳乳球菌、二乙酰 乳乳球菌、乳脂乳球菌、保加利亞乳桿菌、瑞士乳桿菌、德氏乳桿菌、大腸桿菌和/或其組 合。
14. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中所述益生微生物選自長雙歧桿菌NCC 3001、長雙歧桿菌NCC 2705、短雙歧桿菌NCC 2950、乳雙歧桿菌NCC 2818、約氏乳桿菌 Lai、類干酪乳桿菌NCC 2461、鼠李糖乳桿菌NCC 4007、路氏乳桿菌DSM17983、路氏乳桿 菌八了0：55730、嗜熱鏈球菌％0 2019、嗜熱鏈球菌％0 2059、干酪乳桿菌％0 4006、嗜酸乳 桿菌NCC 3009、干酪乳桿菌ACA-DC 6002(NCC 1825)、尼氏大腸桿菌、保加利亞乳桿菌NCC 15、乳乳球菌NCC 2287或其組合。
15. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其每個(gè)日劑量包含約0, 005mg-1000mg非復(fù)制型 微生物。
【文檔編號】A61K35/74GK104220082SQ201080031174
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2010年5月11日 優(yōu)先權(quán)日:2009年5月11日
【發(fā)明者】A·梅賽尼爾, S·努特恩, G·普里烏特 申請人:雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司