專利名稱：基于外泌體的癌癥治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過使用源于例如B-細胞或樹突狀細胞的外泌體(exosomes)，在對象中喚起免疫調(diào)節(jié)性應(yīng)答的方法和手段。利用本發(fā)明的方法，能夠基于使用外泌體治療患者的癌癥。更具體來說，本發(fā)明涉及利用外泌體引發(fā)針對展示在患者癌細胞上的抗原的免疫應(yīng)答的方法。本發(fā)明還涉及使用源于例如B-細胞的外泌體來抑制免疫應(yīng)答，這在任何組織移植期間的療法中可能是需要的。
背景技術(shù)：
癌癥每年侵襲數(shù)以百萬的人。盡管在最近幾十年中癌癥治療已取得相當(dāng)大的進展，但仍然極為需要更好的療法。在本技術(shù)領(lǐng)域中有許多已證實或建議用于癌癥治療的化學(xué)和生物藥劑，其中包括人類來源的外泌體。外泌體是能夠攜帶抗原以及共同刺激分子的納米尺寸的囊泡。樹突狀細胞 (DC)是屬于哺乳動物免疫系統(tǒng)的抗原加工和抗原呈遞細胞。在被抗原激活的狀態(tài)下，它們與B細胞和T細胞相互作用以觸發(fā)它們的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。在最近十年中，已在動物模型和臨床試驗中試驗了將樹突狀細胞(DC)來源的外泌體用于惡性疾病治療。DC來源的外泌體能夠在體外和體內(nèi)刺激T細胞活化，并在小鼠中根除腫瘤(Amigorena S，使用樹突狀細胞來源的外泌體的抗腫瘤免疫療法(Anti-tumour immunotherapy using dendritic-cell-derived exosomes), Res Immunol 1998,149 (7-8) :661-662 ；Zitvogel L 等，使用新型無細胞疫苗——樹突狀細胞來源的外泌體根除已長成的鼠腫瘤(Eradication of established murine tumors using a novel cell—free vaccine :dendritic cell-derived exosomes)，Nat Med 1998,4(5) :594-600)。不同細胞類型產(chǎn)生的外泌體具有反映其細胞來源的表型(Johansson S M等，體外產(chǎn)生的人類單核細胞來源的樹突狀細胞的不同類型釋放具有不同表型的外泌體(Different types of in vitro generated human monocyte-derived dendritic cells release exosomes with distinct phenotypes), Immunology 2008，123 :491-499 ；Segura等，成熟樹突狀細胞分泌的外泌體具有誘導(dǎo)抗原特異性效應(yīng)細胞免疫應(yīng)答的強大能力(Mature dendritic cells secrete exosomes with strong ability to induce antigen-specific effector immune responses), Blood Cells Mol Dis 2005，35:89_93)。目前的信條認為樹突狀細胞來源的外泌體優(yōu)于B細胞來源的外泌體，因為相應(yīng)的細胞、即樹突狀細胞與B細胞相比更有效刺激幼稚T細胞。然而， 還從未探查過在這樣的背景下的B細胞外泌體。已經(jīng)提出了 B細胞在產(chǎn)生完整T細胞應(yīng)答中的作用(Ron Y和Sprent J，T細胞體內(nèi)引發(fā)B細胞在向淋巴結(jié)中的T細胞呈遞抗原中的主要作用(T cell priming in vivo a major role for B cells in presenting antigen to T cells in lymph nodes), J Immunol 1987,138(9) :2848-2856) 0后來，Ding等顯示將抗原靶向B細胞能夠增強特異性T細胞應(yīng)答并打破免疫耐受(Ding C等，將抗原靶向B細胞增強抗原特異性T-細胞應(yīng)答并打破對腫瘤相關(guān)抗原MUCl的免疫耐受(Targeting of antigens to B cellsaugments antigen-specific T-cell responses and breaks immune tolerance to tumor-associated antigen MUC 1)，Blood 2008,112(7) :2817-2825) 此外，新的數(shù)據(jù)顯示，B細胞在獲得長期T細胞免疫力中特別重要(Whitmire J K等，產(chǎn)生⑶4+記憶T細胞 W1S B MM (Requirement of B Cells for Generating CD4+T Cell Memory), J Immunol 2009,182(4) :1868-1876)。外泌體能夠攜帶B細胞表位；B細胞應(yīng)答為T細胞增殖所需 (Quazi KR等，載有抗原的外泌體單獨通過B-細胞依賴性機制誘導(dǎo)Thl型記憶(Antigen loaded exosomes alone induce Thl type memory through a B—cell dependent mechanism), Blood 2009,113 :2673-2683) 關(guān)于外泌體是否能夠通過其自身刺激T細胞 (Admyre C等，通過ELISP0T檢測到外泌體對外周人類T細胞的直接刺激(Direct exosome stimulation of peripheral human T cells detected by ELISPOT), Eur J Immunol 2006,36 :1772-1781)還是需要其他細胞作為中介(Vincentlchneider H等，帶有HLA-DRl 分子的外泌體需要樹突狀細胞來有效刺激特異性T細胞(Exosomes bearing HLA-DRl molecules need dendritic cells to efficiently stimulate specific T cells), Int Immunol 2002，14 :713-722)還有爭論，并且抗原特異性可能影響外泌體與T細胞之間的直接相互作用。不同來源的外泌體靶向人類血液中的特定細胞群體(Johansson S M等，
在Johansson S M的〈〈夕卜泌體-免疫調(diào)節(jié)中的納米囊泡》(Exosomes—nano—vesicles in
immune regulation), 2008 年博士學(xué)位論文，Karolinska Instituted Stockholm, ISBN 978-91-7409-058-1.中)。補體成分(3d/Epstein-Barr病毒)受體2 (CD21 ；也稱為CR2)是B細胞表面上參與其活化和成熟的受體。Epstein-Barr病毒(EBV)是人類親淋巴細胞皰疹病毒。EBV能夠?qū)⒊跫塀細胞永生化成能夠在體外生長的類淋巴母細胞。EBV糖蛋白gp350與CD21結(jié)合對于病毒附著于 B細胞來說是關(guān)鍵的(Young K A等，2型補體受體(CR2/CD21)與Epstein-Barr病毒糖蛋 S gp 350 白勺才目白勺^石出(Molecular basis of the interaction between complement receptor type 2(CR2/CD21)and Epstein-Barr virus glycoprotein gp 350)，J Virol 2008,82:11217-11227)。已報道來自EBV轉(zhuǎn)化的B細胞的外泌體攜帶EBV 編碼的具有T-細胞抑制活性的潛伏膜蛋白1 (LMPl) (Keryer-Bibens C等，由EBV感染的鼻咽癌細胞所釋放的外泌體運送病毒潛伏膜蛋白1和免疫調(diào)節(jié)蛋白半乳凝集素9(EXOSOmeS released by EBV-infected nasopharyngeal carcinoma cells convey the viral latent membrane protein 1 and the immunomodulatory protein galectin 9)，BMC Cancer 2006,6 :283)。發(fā)明概述本發(fā)明的發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)，EBV轉(zhuǎn)化的B-細胞分泌在gp350蛋白介導(dǎo)下與天然 B-細胞的CD21受體特異性結(jié)合的外泌體。具體來說，帶有EBV的B-細胞在其裂解期中產(chǎn)生與天然B-細胞結(jié)合的外泌體。另一方面，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，來自人類樹突狀細胞或乳汁的外泌體靶向單核細胞。因此，與較早所報道的相反，本發(fā)明的外泌體可以特異性靶向天然 B-細胞或單核細胞，因此不靶向T-細胞。因此，通過按照本發(fā)明的方法生產(chǎn)外泌體，所述外泌體包含能夠與例如天然B-細胞的CD21受體特異性結(jié)合的蛋白，并且通過進一步將一種或多種抗原摻入本發(fā)明的外泌體，在將所述外泌體與用作抗原呈遞細胞(APC)的天然B-細胞接觸后，特異性免疫應(yīng)答可能引起T-細胞的進一步募集。簡而言之，本發(fā)明的外泌體可以被看作包含與天然B-細胞受體連接的錨(以蛋白質(zhì)形式)和被轉(zhuǎn)移到天然B-細胞的抗原。發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供通過利用外泌體激活患者的免疫系統(tǒng)，治療患者癌癥的方法。更具體來說，本發(fā)明的目的是靶向腫瘤抗原以向B細胞提供刺激信號。本發(fā)明的另一個重要目的是以足以治療患者癌癥的量提供呈遞腫瘤抗原的外泌體。因此，本發(fā)明特別涉及源于例如B-細胞的外泌體，其中所述外泌體攜帶能夠與例如B-細胞受體結(jié)合的蛋白，并且其中所述外泌體還攜帶一種或多種任何類型的抗原。本發(fā)明還涉及通過源于其他B細胞、樹突狀細胞、單核細胞或巨噬細胞的外泌體靶向B細胞的方法，其中所述外泌體攜帶在與靶B-細胞結(jié)合后能夠引發(fā)免疫應(yīng)答的抗原性物質(zhì)(antigenic property)。本發(fā)明還涉及將外泌體用于治療起源于免疫調(diào)節(jié)或腫瘤形成的疾病例如癌癥，并且還可用于感染、過敏、自體免疫疾病的情形中以及還用于例如移植期間的療法中，其中本發(fā)明的外泌體可以被工程化改造以引發(fā)針對一種或多種抗原例如腫瘤抗原的免疫應(yīng)答，或者，本發(fā)明的外泌體可以被工程化改造以在例如移植的情況下需要時抑制免疫應(yīng)答，以避免被移植組織受到對象免疫系統(tǒng)的排斥。本發(fā)明還涉及被設(shè)計用于靶向天然B-細胞的外泌體的生產(chǎn)方法。從下面本發(fā)明的概述、其由許多附圖所圖示的詳細描述以及隨附的權(quán)利要求書， 本發(fā)明的其他目的將變得明顯。發(fā)明描述靶向B-細胞的外泌體的生產(chǎn)方法本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)靶向B-細胞的特異性免疫調(diào)節(jié)性外泌體的方法，所述方法包含下列步驟⑴用適合的手段例如用EB病毒感染B-細胞，將所述B-細胞轉(zhuǎn)化至潛伏期，從而表達能夠與天然B-細胞結(jié)合的一個或多個部分，(ii)培養(yǎng)(i)中的轉(zhuǎn)化的B-細胞，(iii)收獲從(ii)中轉(zhuǎn)化的B-細胞釋放的外泌體，其中所述外泌體包含能夠與天然B-細胞結(jié)合的一個或多個部分，并且其中所述外泌體直接和/或間接地荷載一種或多種抗原和/或免疫抑制因子。正如上面指出的，可以通過將(ii)中轉(zhuǎn)化的B-細胞與例如一種或多種抗原共同培養(yǎng)，使外泌體荷載一種或多種抗原(間接荷載)。另一方面，該方法還允許對外泌體進行直接荷載，即在(iii)中收獲外泌體后，將收集到的外泌體與例如一種或多種抗原相接觸。 直接荷載通常使用蛋白質(zhì)片段、例如肽或肽片段來進行，例如包含8至12個氨基酸殘基或 15至M個氨基酸殘基的肽片段。或者，省略在(II)中的間接荷載則必需在步驟(IV)中進行荷載。直接荷載包含將EBTB外泌體或DC外泌體與任何抗原(一種或多種彼此獨立的任何類型的抗原)，在促進一種或多種抗原被外泌體攝取的條件下進行接觸。這可以是例如在包含PH改變的條件下。這可以通過將外泌體懸浮在4°C下pH為至少pH5、優(yōu)選為約pH 5. 2 的適合介質(zhì)中來實現(xiàn)。加入肽片段，然后加入緩沖液例如TRIS緩沖液以將pH升高至約pH 7.0，從而將肽片段摻入外泌體。還存在不需改變pH進行直接荷載的技術(shù)。然而，還設(shè)想了可以利用使用直接和間接荷載技術(shù)二者的多重荷載方法。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，間接荷載特別有效。所述一種或多種抗原可以是內(nèi)源/自體的(來自于對象自身)或外源/異體的 (來自于另一個對象)，或者在多種抗原被整合到外泌體中/上的情況下，抗原可以是同源自體/異體抗原的任何混合物。優(yōu)選抗原是自體的。此外，所述一種或多種抗原可以具有任何來源，例如病毒或細菌，或可以是腫瘤抗原，并且此外可以是免疫刺激性或免疫抑制性的，或其組合。還設(shè)想了本發(fā)明的方法允許摻入一種或多種不同抗原，使得外泌體可以包含例如免疫抑制性抗原和針對巨細胞病毒(CMV)的抗原。因此，本發(fā)明的外泌體可以包含一種或多種任何類型或來源的抗原，例如2種以上不同抗原、例如3種以上不同抗原、例如4種以上不同抗原、例如5種以上不同抗原、例如6種以上不同抗原，并因此可以是一種或多種免疫刺激性抗原與一種或多種免疫抑制因子的組合。此外，還考慮到了本發(fā)明的外泌體可以被工程化改造以包含靶向B-細胞的任何抗原(例如病毒)，以用作疫苗(例如病毒疫苗)。還考慮到了本發(fā)明的外泌體可用于自體免疫疾病、過敏癥的情形中，或用于治療已經(jīng)歷任何種類的移植并可能具有發(fā)生免疫應(yīng)答從而排斥被移植組織的風(fēng)險的對象的情形中。這個方面可以通過在外泌體中摻入免疫抑制因子來實現(xiàn)。正如上面指出的，可以通過直接和/或間接荷載，使分泌的外泌體荷載一種或多種抗原或一種或多種免疫抑制因子或其任何組合。然而，抗原性部分可以化學(xué)連接到B-細胞。B-細胞結(jié)合蛋白或配體的化學(xué)連接可以通過將蛋白或配體與接頭例如BS3 (雙-(磺酰琥珀酰亞胺基)-辛二酸酯)、DSS ( 二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)、DSG ( 二琥珀酰亞胺基戊二酸酯)等進行反應(yīng)來實現(xiàn)。由于接頭是雙官能的、即具有兩個連接點，因此隨后將與接頭偶聯(lián)的蛋白或配體進一步反應(yīng)，以將接頭與外泌體偶聯(lián)，從而使蛋白或配體通過接頭分子與外泌體偶聯(lián)。在需要免疫抑制的情況下，可以將免疫抑制因子例如LMP-I、CTLA-4、PDl或其任何混合物摻入到外泌體中。然而，應(yīng)該清楚地理解，本發(fā)明可以使用任何能夠起到免疫抑制因子作用的因子。在本發(fā)明的其他方面下提到和討論的細節(jié)和詳情，在經(jīng)必要修改后適用于這一方面。B-細胞可以通過例如Epstein-Barr病毒(EBV)轉(zhuǎn)化，從而表達gp350蛋白。然而，轉(zhuǎn)化也可以通過本技術(shù)領(lǐng)域中公知的其他技術(shù)來進行，以使轉(zhuǎn)化的B-細胞表達能夠與天然B-細胞受體結(jié)合的任何蛋白。這樣的受體可以是例如⑶19、⑶21、⑶20、⑶23、 CD79、BAFF-R、TACI, BCMA, IFN-R0與這樣的B-細胞受體結(jié)合的適合的配體可以是例如 BAFF, APRIL、gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t))、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN- α，但根據(jù)本發(fā)明，能夠與B-細胞受體結(jié)合的任何配體都可以使用。因此，可以由此對B-細胞分泌的外泌體進行工程化改造，以表達與轉(zhuǎn)化的B-細胞所表達的相同的能夠結(jié)合天然B-細胞的部分。本發(fā)明的發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，用EBV感染的B-細胞表達gp350。轉(zhuǎn)化的B-細胞的培養(yǎng)條件可以按照本技術(shù)領(lǐng)域中公知的用于擴增細胞的程序。例如，可以將B細胞培養(yǎng)在適合的培養(yǎng)基例如MEM、DMEM或完全RPMI 1640培養(yǎng)基 (Invitrogen,Carlsbad,CA)中。培養(yǎng)基可以增補有10%過外泌體貧化的胎牛血清、100IU/ mL青鏈霉素、2mM L-谷氨酰胺、50μΜ β -巰基乙醇和25 μ g慶大霉素或其任何組合。如果使用其他細胞類型(B-細胞之外)例如MDDC或BMDC進行培養(yǎng)，除了上面陳述的培養(yǎng)基之外可以添加生長因子，例如可以使用GM-CSF和IL-4。培養(yǎng)通常在37°C下、在具有5% CO2 的加濕培養(yǎng)箱中溫育5天來進行，但是也可以在無CO2條件下和較短時間段例如約2天、例如約3天、例如約4天期間進行。為了培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的B細胞以收獲用于外泌體制備的上清液，可以將細胞溫育例如約 48小時、例如約72小時、例如約96小時。對于MDDC或BMDC培養(yǎng)來說，將溫育進行例如6 天以獲得未成熟DC，然后繼續(xù)進行另外48小時以收獲用于外泌體制備的上清液。為了將抗原荷載在BMDC上，在第6天將細胞用抗原脈沖/暴露于抗原過夜，然后清洗并在37°C下、在具有5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中溫育48小時。應(yīng)該理解，上面所述的是指導(dǎo)性說明，因此在本技術(shù)領(lǐng)域已知的用于培養(yǎng)細胞的方法中可能不同。具體實例是，例如可以將EBV轉(zhuǎn)化的B-細胞系在由RPMI-1640 (Gibco ；Invitrogen Corp, Paisley，英國)增補25yg/mL慶大霉素(Gibco)、10%熱失活胎牛血清(Hyclone， Logan, Utah)、2mmol/L L_g谷氨酰胺、lOOIU/mL青霉素(Gibco)、100 μ g/mL鏈霉素(Gibco) 和50μπιΟ1/1 β-巰基乙醇(KEB0-lab，Spanga，瑞典)構(gòu)成的完全培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。已將培養(yǎng)基進行外泌體貧化。細胞可以在含有6% CO2的37°C加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對于MDDC培養(yǎng)來說，按照制造商的說明書在Ficoll Paque (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala，瑞典)上進行離心，分離外周血單核細胞(PBMC)。然后可以將細胞在磷酸鹽緩沖鹽水(PBQ中洗滌，重懸浮在含有PBS、0-5%牛血清白蛋白(BSA)和2mM乙二胺四乙酸(EDTA)的細胞分揀緩沖液中，并用抗CD14磁珠(Miltenyi Biotech,Bergisch Gladbach，德國)標(biāo)記，以便使用自動化基質(zhì)輔助細胞分揀(AutoMACS ；Miltenyi Biotech) 對單核細胞進行陽性選擇。⑶14+純度在82至99%之間(中位數(shù)為94% ；η = 29)。在培養(yǎng)瓶(Costar，Cambridge, UK)中，在完全培養(yǎng)基中以虹105個細胞/ml的濃度建立單核細胞培養(yǎng)，所述完全培養(yǎng)基含RPMI 1640 (HyClone, Logan, UT)和10%過外泌體貧化的胎牛血清(FCS ；HyClone) ,2mm L-谷氨酰胺(Gibco，Paisley，UK)、100IU/ml 青霉素(Gibco)禾口 100 μ g/ml 鏈霉素(Gibco)、25 μ g/ml 慶大霉素(Gibco)和 50 μ m 2_β -巰基乙醇(Sigma Chemical Company, St Louis,M0)禾口800U/ml 重組人(rh) IL-4 (BioSource International, Camarillo, CA)以及 550U/ml rhGM-CSF (BioSource hternational)，在第 3 天時重新補給。在第6天，將細胞重新接種在含有增補劑的新鮮培養(yǎng)基中，并針對兩種條件將細胞密度調(diào)整至相同值。在培養(yǎng)的第6天通過臺盼藍拒染法確定細胞活性。在第8天收集培養(yǎng)上清液，在室溫下以3000g離心20分鐘，并儲存在_80°C。在第8天收獲細胞并通過流式細胞術(shù)分析表型。對于BMDC培養(yǎng)來說在10ng/mL白介素-4(IL_4 ；Invitrogen)和10%粒細胞巨噬細胞集落刺激因子調(diào)制過的培養(yǎng)基存在下，將骨髓細胞培養(yǎng)在完全RPMI 1640培養(yǎng)基中(Invitrogen, Carlsbad, CA ； 10%外泌體貧化的胎牛血清，ImM丙酮酸鈉，100IU/mL青鏈霉素，200mM L-谷氨酰胺，50 μ M β -巰基乙醇)(Ag8653/X63克隆)。在第6天，用新鮮培養(yǎng)基替換50%的培養(yǎng)上清液，并在48小時后收獲上清液。細胞可以培養(yǎng)至少2天的時間，例如至少3天、例如至少4天、例如至少5天、例如至少6天、例如至少7天、例如至少2周、例如至少3周、例如至少1個月、例如至少2個月、 例如至少3個月、例如至少4個月、例如至少5個月、例如至少6個月。本發(fā)明的方法能夠獲得較高外泌體收率，這進而允許進行有效治療。特別是在EBV 轉(zhuǎn)化的B-細胞中觀察到了高收率。細胞培養(yǎng)上清液可以例如每2天、例如每3天、例如每 4天、例如每5天、例如每6天、例如每7天進行收獲，并可以在例如至少1個月、例如至少2 個月、例如至少3個月、例如至少4個月、例如至少5個月、例如至少6個月期間以任何所述時間間隔中進行收獲。在EBTB細胞的例如約48小時培養(yǎng)期間，使用本發(fā)明方法獲得的外泌體收率可以是例如至少約0. 2 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞，例如至少約0. 3 μ g外泌體/ 一百萬個 EBTB細胞、例如至少約0. 4 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞、例如至少約0. 5 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞、例如至少約0. 6 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞、例如至少約0. 7 μ g 外泌體/ 一百萬個EBTB細胞、例如至少約0. 8 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞、例如至少約 0. 9 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞、例如至少約1. 0 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞、例如至少約1. 5 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞、例如至少約2. 0 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB 細胞、例如至少約2. 5 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞、例如至少約3. 0 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞、例如至少約5. 0 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞或例如至少約10. 0 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過用EBV轉(zhuǎn)化B-細胞，觀察到了更高的外泌體收率，當(dāng)例如使用樹突狀細胞并在相同時間段中培養(yǎng)時，其通常在0. 1 μ g外泌體/ 一百萬個細胞的范圍內(nèi)。應(yīng)該清楚地理解，適合的抗原根據(jù)外泌體所打算的目的或用途來選擇；S卩如果外泌體打算用于治療例如癌癥的情形，可以將一種或多種癌抗原與外泌體合并。如果外泌體所打算的目的是用于治療例如過敏癥的情形，可以將一種或多種免疫抑制因子與外泌體合并以抑制所述過敏反應(yīng)。這經(jīng)必要修改后適用于例如移植的概念。還應(yīng)該清楚地理解，也設(shè)想了根據(jù)所打算的目的或需要，可以將一種或多種抗原與例如一種或多種其他抗原或一種或多種免疫抑制因子組合。在本發(fā)明的其他方面下提到和討論的細節(jié)和詳情，在經(jīng)必要修改后適用于這一方面。外泌體的收獲可以通過例如超速離心或差速離心或其任何組合、然后收集沉淀的外泌體來進行?？梢詫⒊恋淼耐饷隗w用適合的介質(zhì)例如PBS進一步清洗，并隨后任選重懸浮在適合的介質(zhì)中，然后可以重復(fù)外泌體的離心、沉淀和用例如PBS清洗的整個循環(huán)，直到達到可接受的外泌體純度。應(yīng)該清楚地理解，本發(fā)明經(jīng)必要修改后可以適用于其他細胞類型，例如樹突狀細胞或濾泡樹突狀細胞(FDC)。在本發(fā)明的其他方面下提到和討論的細節(jié)和詳情，在經(jīng)必要修改后適用于這一方面。
治療方法本發(fā)明還涉及外泌體在疾病治療中的應(yīng)用，其中外泌體靶向天然B-細胞，所述方法包含(i)從對象獲取生物樣品，例如血樣(ii)從(i)中的所述樣品收集B-細胞(iii)通過適合的手段例如病毒轉(zhuǎn)化在(ii)中收集的B-細胞，從而使所述B-細胞表達能夠與天然B-細胞受體結(jié)合的蛋白或配體。(iv)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的B-細胞。(ν)收集從(iv)中轉(zhuǎn)化的B-細胞分泌的外泌體(vi)將(ν)中的外泌體轉(zhuǎn)移回到對象中，并且其中所述外泌體直接和/或間接荷載一種或多種抗原和/或免疫抑制因子。為了收集待轉(zhuǎn)化的B-細胞而從對象收集的樣品，可以是例如血樣例如外周血，或者可以是骨髓樣品或從對象的淋巴系統(tǒng)抽取的樣品，或其任何組合或混合物。正如上面指出的，可以通過將(iv)中轉(zhuǎn)化的B-細胞與例如一種或多種抗原共培養(yǎng)，使外泌體荷載一種或多種抗原(間接荷載)。另一方面，方法還允許直接荷載外泌體， 即在(ν)中收獲外泌體后，在轉(zhuǎn)移回到患者中之前使收集的外泌體經(jīng)受例如一種或多種抗原。直接荷載通常使用蛋白質(zhì)片段例如肽或肽片段來進行，例如包含8至12個氨基酸殘基或15至M個氨基酸殘基的肽片段?；蛘撸÷栽?ii)中的間接荷載則必需在步驟(iv) 中進行荷載。直接荷載包含將EBTB外泌體或DC外泌體與任何抗原(一種或多種彼此獨立的任何類型的抗原)，在促進一種或多種抗原被外泌體攝取的條件下進行接觸。這可以在例如包含PH改變的條件下。這可以通過將外泌體懸浮在4°C下pH為至少pH 5、優(yōu)選為約 PH 5. 2的適合介質(zhì)中來實現(xiàn)。加入肽片段，然后加入緩沖液例如TRIS緩沖液以將pH升高至約PH 7.0，從而將肽片段摻入外泌體。還存在不需改變pH進行直接荷載的技術(shù)。然而， 還設(shè)想了可以利用使用直接和間接荷載技術(shù)二者的多重荷載方法。所述一種或多種抗原可以是內(nèi)源/自體的(來自于對象自身)或外源/異體的 (來自于另一個對象)，或者在多種抗原被整合到外泌體中/上的情況下，所述抗原可以是自體/異體抗原的任何混合物。優(yōu)選抗原是自體的。此外，所述一種或多種抗原可以具有任何來源，例如病毒或細菌，或可以是腫瘤抗原，并且還可以是免疫刺激性或免疫抑制性的， 或其組合。還設(shè)想了本發(fā)明的方法允許摻入一種或多種不同抗原，使得外泌體可以包含例如免疫抑制性抗原和針對巨細胞病毒(CMV)的抗原。因此，本發(fā)明的外泌體可以包含一種或多種任何類型或來源的抗原，例如2種以上不同抗原、例如3種以上不同抗原、例如4種以上不同抗原、例如5種以上不同抗原、例如6種以上不同抗原，并因此可以是一種或多種免疫刺激性抗原與一種或多種免疫抑制因子的組合。此外，還考慮到了本發(fā)明的外泌體可以被工程化改造以包含靶向B-細胞的任何抗原(例如病毒)，以用作疫苗(例如病毒疫苗)。還考慮到了本發(fā)明的外泌體可用于自體免疫疾病、過敏癥的情形中，或用于治療已經(jīng)歷任何種類的移植并可能具有發(fā)生免疫應(yīng)答從而排斥被移植組織的風(fēng)險的對象的情形中。這個方面可以通過在外泌體中摻入免疫抑制因子來實現(xiàn)。
正如上面指出的，可以通過直接和/或間接荷載，使分泌的外泌體荷載一種或多種抗原或一種或多種免疫抑制因子或其任何組合。然而，抗原性部分可以化學(xué)連接到B-細胞。B-細胞結(jié)合蛋白或配體的化學(xué)連接可以通過將所述蛋白或配體與接頭例如 BS3 (雙-(磺酰琥珀酰亞胺基)-辛二酸酯)、DSS ( 二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)、DSG ( 二琥珀酰亞胺基戊二酸酯)等進行反應(yīng)來實現(xiàn)。由于接頭是雙官能的、即具有兩個連接點，因此隨后將與接頭偶聯(lián)的蛋白或配體進一步反應(yīng)，以將接頭與外泌體偶聯(lián)，從而使蛋白或配體通過接頭分子與外泌體偶聯(lián)。在需要免疫抑制的情況下，可以將免疫抑制因子例如LMP-I、CTLA-4、PDl或其任何混合物摻入到外泌體中。然而，應(yīng)該清楚地理解，本發(fā)明可以使用任何能夠起到免疫抑制因子作用的因子。在本發(fā)明的其他方面下提到和討論的細節(jié)和詳情，在經(jīng)必要修改后適用于這一方面。B-細胞可以通過例如Epstein-Barr病毒(EBV)轉(zhuǎn)化，從而表達gp350蛋白。然而，所述轉(zhuǎn)化也可以通過本技術(shù)領(lǐng)域中公知的其他技術(shù)來進行，以使轉(zhuǎn)化的B-細胞表達能夠與天然B-細胞受體結(jié)合的任何蛋白。這樣的受體可以是例如⑶19、⑶21、⑶20、⑶ 23、OT79、BAFF-R、TACI、BCMA、IFN-R。與這樣的B-細胞受體結(jié)合的適合的配體可以是例如 BAFF, APRIL、gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t))、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN- α，但根據(jù)本發(fā)明，能夠與B-細胞受體結(jié)合的任何配體都可以使用。因此，可以由此對B-細胞分泌的外泌體進行工程化改造，以表達與轉(zhuǎn)化的B-細胞所表達的相同的能夠結(jié)合天然B-細胞的部分。本發(fā)明的發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，用EBV感染的B-細胞表達gp350。轉(zhuǎn)化的B-細胞的培養(yǎng)條件可以按照本技術(shù)領(lǐng)域中公知的用于擴增細胞的程序。 細胞可以培養(yǎng)例如至少2天的時間，例如至少3天、例如至少4天、例如至少5天、例如至少 6天、例如至少7天、例如至少2周、例如至少3周、例如至少1個月、例如至少2個月、例如至少3個月、例如至少4個月、例如至少5個月、例如至少6個月。本發(fā)明的方法能夠獲得較高的外泌體收率，其進而允許進行有效治療。特別是在 EBV轉(zhuǎn)化的B-細胞中觀察到了高收率。細胞培養(yǎng)上清液可以例如每2天、例如每3天、例如每4天、例如每5天、例如每6天、例如每7天進行收獲，并可以在例如至少1個月、例如至少2個月、例如至少3個月、例如至少4個月、例如至少5個月、例如至少6個月期間以任何所述時間間隔進行收獲。在例如EBTB細胞的48小時培養(yǎng)期間，使用本發(fā)明方法獲得的外泌體收率可以是例如至少約0. 2 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞，例如至少約0. 3 μ g外泌體/ 一百萬個 EBTB細胞、例如至少約0. 4 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞、例如至少約0. 5 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞、例如至少約0. 6 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞、例如至少約0. 7 μ g 外泌體/ 一百萬個EBTB細胞、例如至少約0. 8 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞、例如至少約 0. 9 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞、例如至少約1. 0 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞、例如至少約1. 5 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞、例如至少約2. 0 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB 細胞、例如至少約2. 5 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞、例如至少約3. 0 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞、例如至少約5. 0 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞或例如至少約10. 0 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過用EBV轉(zhuǎn)化B-細胞，觀察到了更高的外泌體收率，當(dāng)例如使用樹突狀細胞并在相同時間段中培養(yǎng)時，其通常在0. 1 μ g外泌體/ 一百萬個細胞的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的其他方面下提到和討論的細節(jié)和詳情，在經(jīng)必要修改后適用于這一方面。外泌體的收獲可以通過例如超速離心或差速離心或其任何組合、然后收集沉淀的外泌體來進行?？梢詫⒊恋淼耐饷隗w用適合的介質(zhì)例如PBS進一步清洗，并隨后任選重懸浮在適合的介質(zhì)中，然后可以重復(fù)外泌體的離心、沉淀和用例如PBS清洗的整個循環(huán)，直到達到可接受的外泌體純度。應(yīng)該清楚地理解，本發(fā)明的所有方面經(jīng)必要修改后可以適用于其他細胞類型，例如樹突狀細胞或濾泡樹突狀細胞(FDC)。應(yīng)該清楚地理解，適合的抗原根據(jù)外泌體所打算的目的或用途來選擇；S卩如果外泌體打算用于治療例如癌癥的情形，可以將一種或多種癌抗原與外泌體合并。如果外泌體所打算的目的是治療例如過敏癥的情形，可以將一種或多種免疫抑制因子與外泌體合并以抑制所述過敏反應(yīng)。這經(jīng)必要修改后適用于例如移植的概念。還應(yīng)該清楚地理解，也設(shè)想了根據(jù)所打算的目的或需要，可以將一種或多種抗原與例如一種或多種其他抗原或一種或多種免疫抑制因子合并。在本發(fā)明的其他方面下提到和討論的細節(jié)和詳情，在經(jīng)必要修改后適用于這一方面。外泌體的給藥方式可以采取本技術(shù)領(lǐng)域中已知的各種形式，例如腸胃外給藥，因此可以是靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、骨內(nèi)、鞘內(nèi)、皮內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥。在對象中引起有效免疫應(yīng)答所需的外泌體的足夠劑量，可以是例如至少0. Img/ kg，例如至少0. 2mg/kg、例如至少0. 3mg/kg、例如至少0. 4mg/kg、例如至少0. 5mg/kg、例如至少0. 75mg/kg、例如至少0. 9mg/kg、例如至少1. Omg/kg、例如至少3. Omg/kg、例如至少 5. Omg/kg、例如至少 7. Omg/kg、例如至少 10. Omg/kg、例如至少 15. Omg/kg。外泌體可以在約1小時、例如約2小時、例如4小時、例如6小時的時間段內(nèi)作為例如靜脈輸注液給藥。或者，外泌體也可以在約20秒、例如約30秒、例如約40秒、例如約 1分鐘的時間跨度內(nèi)作為注射液給藥。本發(fā)明的治療方法可以是將外泌體作為單劑或多劑給藥。取決于疾病的嚴重性， 治療方法可以執(zhí)行一次或重復(fù)執(zhí)行。此外，可以在疾病復(fù)發(fā)后重復(fù)所述治療。所述治療方法打算用于癌癥、過敏癥、自體免疫疾病和移植療法期間。應(yīng)該清楚地理解，治療方案可以聯(lián)合或補充其他治療，例如在癌癥的情形中可以將化療與本發(fā)明的治療組合，或者例如抗組胺藥可以在過敏癥治療中與本發(fā)明的方法組合，或例如抗生素可以在治療感染等中與本發(fā)明的方法組合，等。在本發(fā)明的其他方面下提到和討論的細節(jié)和詳情，在經(jīng)必要修改后適用于這一方面。藥物組合物外泌體可以配制成適用于例如向?qū)ο竽c胃外給藥例如靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、皮內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥的藥物組合物。當(dāng)外泌體腸胃外給藥時，它們可以配制在等滲介質(zhì)、即與血液具有相同滲漲度的介質(zhì)中，并且還可以包含一種或多種防止外泌體聚集的物質(zhì)。可以使用鹽水溶液，例如生理鹽水(NS)，其是約0. 91% w/v的NaCl、約300m0sm/L的溶液。然而，可以使用其他鹽水溶液，例如半生理鹽水(0.45% NaCl)，經(jīng)常與“D5”(5%葡萄糖)一起，含有77mEq/L的Na 和Cl以及50g/L葡萄糖。四分之一生理鹽水(0. 22%妝(1)，其具有3911￡9/1的妝和(1，并且出于滲透性原因總是含有5%右旋糖。也可以使用高滲鹽水，例如通過中心靜脈導(dǎo)管施用的濃度高于2%的NaCl。它通常有兩種強度可用3% NaCl，具有 513mEq/L 的 Na 和 Cl。5 % NaCl，具有 856mEq/L 的 Na 和 Cl。溶液還可以增補有葡萄糖(右旋糖)，例如0. 18%鹽水中4%右旋糖(葡萄糖)。其他添加劑可以是例如最高3%的人血清白蛋白，例如最高2%的人血清白蛋白或最高的人血清白蛋白。對于靜脈內(nèi)給藥來說，待給藥的組合物中外泌體的濃度一般在至少約0. Iyg外泌體/ml介質(zhì)的范圍內(nèi)，例如至少約0. 2 μ g外泌體/ml介質(zhì)、例如至少約0. 3 μ g外泌體/ ml介質(zhì)、例如至少約0. 4 μ g外泌體/ml介質(zhì)、例如至少約0. 5 μ g外泌體/ml介質(zhì)、例如至少約0. 6 μ g外泌體/ml介質(zhì)、例如至少約0. 7 μ g外泌體/ml介質(zhì)、例如至少約0. 8 μ g外泌體/ml介質(zhì)、例如至少約0. 9 μ g外泌體/ml介質(zhì)、例如至少約1. 0 μ g外泌體/ml介質(zhì)、例如至少約1. 5 μ g外泌體/ml介質(zhì)、例如至少約2. 0 μ g外泌體/ml介質(zhì)、例如至少約2. 5 μ g 外泌體/ml介質(zhì)、例如至少約3. 0 μ g外泌體/ml介質(zhì)、例如至少約5. 0 μ g外泌體/ml介質(zhì)或例如至少約10. 0 μ g外泌體/ml介質(zhì)或例如至少15. 0 μ g外泌體/ml介質(zhì)或例如至少 20. Oyg外泌體/ml介質(zhì)。在本發(fā)明的其他方面下提到和討論的細節(jié)和詳情，在經(jīng)必要修改后適用于這一方面。外泌體本發(fā)明還涉及外泌體，優(yōu)選為源自B-細胞或源自樹突狀細胞、濾泡樹突狀細胞等的外泌體。本發(fā)明的外泌體包含能夠與天然B-細胞的受體結(jié)合的至少一種部分或因子或蛋白質(zhì)或肽片段。受體可以是但不限于例如⑶19、⑶21、⑶20、⑶23、⑶79、BAFF-R，TACI、 BCMA、IFN-R0此外，能夠與天然B-細胞的受體結(jié)合的所述一種部分或因子或蛋白質(zhì)或肽片段可以是但不限于例如 BAFF、APRIL、gp350, EBV gp350/220 (gp350 (470t)), CD23、C3b、 iC3b、C3d、IFN-a。然而，根據(jù)本發(fā)明，能夠與B_細胞受體結(jié)合的任何配體都可以使用。此外，本發(fā)明的外泌體還可以包含一種或多種抗原。所述一種或多種抗原可以是內(nèi)源/自體的(來自于對象自身)或外源/異體的(來自于另一個對象)，或者在多種抗原被整合到外泌體中/上的情況下，抗原可以是自體/異體抗原的任何混合物。優(yōu)選抗原是自體的。此外，所述一種或多種抗原可以具有任何來源，例如病毒或細菌，或可以是腫瘤抗原，并且還可以是免疫刺激性或免疫抑制性的，或其組合。在本發(fā)明的其他方面下提到和討論的細節(jié)和詳情，在經(jīng)必要修改后適用于這一方面。還設(shè)想了本發(fā)明的方法允許摻入一種或多種不同抗原，使得外泌體可以包含例如免疫抑制性抗原和針對巨細胞病毒(CMV)的抗原。因此，本發(fā)明的外泌體可以包含一種或多種任何類型或來源的抗原，例如2種以上不同抗原、例如3種以上不同抗原、例如4種以上不同抗原、例如5種以上不同抗原、例如6種以上不同抗原，并因此可以是一種或多種免疫刺激性抗原與一種或多種免疫抑制因子的組合。此外，還考慮到了本發(fā)明的外泌體可以被工程化改造以包含靶向B-細胞的任何抗原(例如病毒)，以用作疫苗(例如病毒疫苗)。還考慮到了本發(fā)明的外泌體可用于自體免疫疾病、過敏癥的情形中，或用于治療已經(jīng)歷了任何種類的移植并可能具有發(fā)生免疫應(yīng)答從而排斥被移植組織的風(fēng)險的對象的情形中。這個方面可以通過在外泌體中摻入免疫抑制因子來實現(xiàn)。這樣的免疫抑制因子可以是但不限于例如LMP-1、CTLA-4、PD1或其任何混合物。然而，應(yīng)該清楚地理解，本發(fā)明可以使用任何能夠起到免疫抑制因子作用的因子。在本發(fā)明的其他方面下提到和討論的細節(jié)和詳情，在經(jīng)必要修改后適用于這一方面。本發(fā)明還涉及用于在對象中治療疾病或病癥的外泌體(例如其組合物)。疾病或病癥可以是例如癌癥、任何自體免疫疾病、移植情況下的療法、過敏癥或根據(jù)本文中的描述經(jīng)必要修改后需要免疫抑制或免疫刺激的任何病癥。本發(fā)明是基于由Epstein-Barr病毒轉(zhuǎn)化的B細胞(EBTB細胞)所釋放的外泌體 (EBTB外泌體)通過⑶21靶向天然B細胞這一見解。該見解得到下述發(fā)現(xiàn)的支持，即EBTB 細胞外泌體與天然B細胞之間的相互作用被抗⑶21抗體有效阻斷，表明在⑶21與EBV糖蛋白gp350或針對⑶21的其他配體例如⑶23、C3b、C3d或α -干擾素之間存在相互作用。 可用于本發(fā)明的其他配體是例如 BAFF、APRIL、EBV gp350/220 (gp350 (470t)), CD23、C3b、 iC3b、C3d、IFN-α?？梢栽O(shè)想，能夠與B細胞受體結(jié)合的任何配體都可用于本發(fā)明。B-細胞受體可以是但不限于⑶21，但是也可以是天然B-細胞上的其他受體，例如⑶19、⑶21、 CD 20、CD 23、CD79、BAFF-R、TACI、BCMA、IFN-R。因此，本發(fā)明可以被看作向外泌體的外部提供了能夠與天然B-細胞結(jié)合的配體，并隨后將摻入在外泌體中的一種或多種抗原轉(zhuǎn)移。 因此，該出人意料和意外的發(fā)現(xiàn)提供了所述一種或多種抗原的更有效的轉(zhuǎn)移，并因此提供了更有效和特異的免疫應(yīng)答。重要的是，因為外泌體靶向B-細胞而不是T-細胞，因此與直接刺激T-細胞的情況相比，產(chǎn)生了更強的T-細胞應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明，可以在實驗室中對EBTB外泌體進行工程化改造以更改它們的功能效應(yīng)，例如通過用EBV轉(zhuǎn)化B細胞。工程化EBTB外泌體對天然B細胞的特異性靶向，增強了其治療有效性。此外，B細胞的EBV轉(zhuǎn)化提供了不受限制的外泌體來源。因此，根據(jù)本發(fā)明，公開了帶有天然B細胞靶向蛋白和腫瘤抗原的EBTB細胞；所述 EBTB細胞能夠釋放攜帶天然B細胞靶向蛋白和腫瘤抗原的EBTB外泌體。根據(jù)本發(fā)明，還公開了攜帶天然B細胞靶向蛋白和腫瘤抗原的EBTB外泌體。根據(jù)本發(fā)明，還公開了攜帶天然B細胞靶向蛋白和例如腫瘤抗原或來自感染性抗原(病毒、細菌或分枝桿菌)的抗原的樹突狀細胞(DC)外泌體。本發(fā)明的外泌體可以荷載并攜帶單個腫瘤抗原或多個腫瘤抗原。在本申請中，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”打算是指當(dāng)EBV (Epstein-Barr病毒)感染B-淋巴細胞時，作為其結(jié)果最終出現(xiàn)了能夠無限生長的類淋巴母細胞系。這些細胞系的生長轉(zhuǎn)化是病毒蛋白表達的結(jié)果。得到的細胞系有時被稱為永生化細胞系。在本申請中，“抗原”打算是指能夠在對象中引發(fā)免疫應(yīng)答的任何物質(zhì)。因此，抗原可以是但不限于例如病毒抗原、細菌抗原、分枝桿菌抗原、腫瘤抗原或?qū)ο蟮拿庖呦到y(tǒng)對其作出應(yīng)答的任何物質(zhì)，例如在移植期間或過敏反應(yīng)中或自體免疫期間所遇到的抗原。在本申請中，“腫瘤抗原”或“癌抗原”，該表述還包含“腫瘤相關(guān)抗原”，是天然或合成的肽，其所給藥的生物體針對其形成抗體或抗原特異性T細胞應(yīng)答。具體來說，腫瘤抗原是能夠被抗原呈遞細胞(APC)、特別是B細胞、EBTB細胞或樹突狀細胞(DC)呈遞的天然或合成的肽。然而，本發(fā)明的腫瘤抗原可以但不是必須被抗原呈遞細胞加工和呈遞才能執(zhí)行其抗原效應(yīng)。本發(fā)明的EBTB外泌體或DC外泌體可以間接或直接荷載腫瘤抗原。間接荷載包含將EBTB細胞或樹突狀細胞與腫瘤抗原在促進所述一種或多種抗原被細胞攝取的條件下進行培養(yǎng)，并使載有抗原的細胞釋放載有抗原的外泌體。直接荷載包含將EBTB外泌體或DC 外泌體與腫瘤抗原在促進腫瘤抗原被外泌體攝取的條件下、特別是包含改變PH的條件下進行接觸。根據(jù)本發(fā)明，還公開了本發(fā)明的EBTB細胞和EBTB外泌體、樹突狀細胞和DC外泌體在癌癥治療中的應(yīng)用。EBTB外泌體當(dāng)配備B細胞靶向蛋白時，能夠特異性靶向天然B細胞。對于這種B 細胞靶向來說特別有用的蛋白是但不限于gp350、CD23、C;3b、CD19和C3d。根據(jù)本發(fā)明，從采自患者循環(huán)的血液分離天然B細胞，用EBV轉(zhuǎn)化成EBTB細胞并進行培養(yǎng)。用癌抗原荷載培養(yǎng)的EBTB細胞。回收從載有癌抗原的EBTB細胞釋放的EBTB 外泌體。通過這種方式，產(chǎn)生了載有癌抗原的許多(大量)EBTB外泌體，足以進行患者有效的癌癥治療。本發(fā)明的載有癌抗原的EBTB外泌體攜帶CD21結(jié)合蛋白?；蛘?，可以使用從采自患者之外其他人的循環(huán)的血液中分離的天然B細胞，只要那些B細胞與待治療患者的B細胞免疫學(xué)相容即可。因此，本發(fā)明的方法包含使用自體和異體B細胞。對于本發(fā)明的呈遞自身/自體或異體抗原的天然B細胞和通過用EBV感染從它們獲得的EBTB細胞來說，優(yōu)選將其在培養(yǎng)物中擴增/增殖至少2周的時間，例如至少3周、例如4周、例如5周、例如6周、例如7周、例如8周、例如至少3個月、例如至少4個月、例如至少5個月、例如至少6個月或以上，以提供足以治療患者的大量外泌體。根據(jù)本發(fā)明，EBTB 外泌體所包含的參與免疫抑制的因子例如LMP-I，可以在給藥于患者之前通過例如Fab-片段分子進行中和。根據(jù)本發(fā)明，公開了由⑶40/IL-4刺激的B細胞(“⑶40刺激的B細胞”)釋放的外泌體。⑶40刺激的B細胞系的長期培養(yǎng)物公開在MWiesner等，(2008)，通過⑶40連接使人類 B 細胞條件性永生化(Conditional Immortalization of Human B cells by CD40Ligation)，Plos ONE 3(1) :el464. Doi : 10. 1371/journal, pone. 0001464 中。CD40 朿Ij 激的B細胞系和從這樣的B細胞釋放的外泌體，具有與ETBT細胞系和ETBT外泌體類似的用途。具體來說，它們可以荷載腫瘤抗原并用于T細胞和/或B細胞活化。本發(fā)明的腫瘤抗原是可以被B細胞包括EBTB細胞、或樹突狀細胞、或被相應(yīng)的內(nèi)體呈遞的抗原。在本申請中，“腫瘤抗原”包含表達在腫瘤細胞表面上的抗原、其抗原活性片段，特別是包含8至12個氨基酸殘基或15至M個氨基酸殘基并能夠刺激T細胞的腫瘤抗原肽片段。術(shù)語“腫瘤抗原”還包含能夠刺激B細胞而不呈遞在抗原呈遞細胞表面上的較大的肽或蛋白。這樣的較大的腫瘤抗原肽或蛋白可以采用腫瘤細胞裂解物的形式有利地用于本發(fā)明中，例如在US 2007/0134275A1中所描述的腫瘤細胞裂解物。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的腫瘤抗原選自ERBB2(HER2)、BIRC5(存活素)、 CEACAM5 (CEA)、WDRK46 (BING4)、BAGE (BAGEl)、CSAG2 (TRAG-3)、DCT (TRP-2)、MAGED4、 GAGE1、GAGE2、GAGE3、GAGE4、GAGE5、GAGE6、GAGE7、GAGE8、IL13RA2 (白介素 13 受體 α 2)、 MAGEAl、MAGEA2、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA6、MAGEA9、MAGEAl0、MAGEA12、MAGEBl、MAGEB2、 MAGEC2、ΤΡ53、TYR(酪氨酸酶)、TYRPl (TRP-I)、SAGEl (SAGE)、SYCPl (H0M-TES-14/SCP1)、 SSX2 (H0M-MEL-40)、SSX4、KRAS、PRAME、NRAS、ACTN4 ( α -輔肌動蛋白-4)、CTNNB 1、CASP8 (胱天蛋白酶-8)、CDC27、CDK4、EEF2、FNl (纖連蛋白)、HSPAlB(Hisp70)、LPGATl (KIAA0205)、 MEl (蘋果酸酶)、HHAT(MART-2)、TRAPPC1 (MUM-2)、MUM3、MYOlB (1 類非常規(guī)肌球蛋白基因)、PAPOLG (neo-PAP)、0S9、PTPRK (受體樣蛋白酪氨酸磷酸酶κ )、TPIl (磷酸丙糖異構(gòu)酶)、ADFP(adiophilin)、AFP(甲胎蛋白)、AIM2、ANXA2 (膜聯(lián)蛋白 II)、ART4(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白)、CLCA2、CPSFl (CPSF)、PPIB(親環(huán)蛋白 B)、EPHA2、EPHA3、FGF5(成纖維細胞生長因子5)、CA9(碳酸酐酶9)、TERT OiTERT)、MGAT5 (GNT-V ；N-乙酰葡萄糖氨基轉(zhuǎn)移酶V)、 CEL (腸羧酸酯酶)、F4. 2、CAN (CAN-蛋白)、ETV6 (TELl)、BIRC7 (livin/ML-IAP)、CSFl (巨噬細胞集落刺激因子)、OGT、MUCl (粘蛋白)、MUC2、MUMU CTAGlA(NY-ES0-1 ；LAGE-2)、 CTAG2 (NY-ES0-0RF2 ；LAGE-1)、CTAG (CAMEL)、MRPL28 (黑素瘤抗原 pl5)、FOLHl (前列腺特異性膜抗原)、RAGE、SFMBTl (腎遍在蛋白 1)、KAAGl (RU2AS)、SARTl、TSPYLl (SART-2)、 SART3、S0X10、TRG、WTU TACSTD1 (Ep-CAM)、SILV (Pmel 17 ；gplOO)、SCGB2A2 (乳腺球蛋白 A)、MC1R、MLANA (MART-1 ；Melan-A)、GPR143 (OAl)、0CA2 (P 多肽)、KLK3 (PSA ；前列腺特異性抗原)、SUPT7L (ART-I)、ARTCl、BRAF, CASP5(胱天蛋白酶-5)、尿溶蛋白、CDKN2A、 UBXD5 (C0A-1)、EFTUD2 (延伸因子 Tu，含 GTP 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，nSNRPll6)、GPNMB、NFYC、PRDX5 (過氧化物氧還蛋白幻、ZUBRl (RBAF600)、SIRT2、SNRPDU HERV-K-MEL, CXorf61 (KK-LC-I)、 CCDCl 10 (KM-HN-I)、VENTXP1 (NA88A)、前列腺膜特異性抗原、SPA17(精子蛋白 17)、KLK4、 ANKRD30A (NY-BRl)、RAB38 (NY-MEL-I)、CCNDl (周期蛋白 Dl)、CYPlBl (P4501B1)、MDM2、 MMP2(基質(zhì)金屬蛋白酶-2)、畸胎癌衍生的生長因子(CRIPT0-1)、ZNF395 (PBF ；乳頭瘤病毒結(jié)合因子)、RNF43、SCRNl (分離蛋白 1)、STEAPl (STEAP)、707_AP、TGFBR2 (IIB 型 TGF-β 受體)、P)(DNL(MG50)、AKAP13(淋巴細胞白血病急變癌基因(Lbc)癌蛋白)、PRTN3 (蛋白酶3)、 PSCA (前列腺干細胞抗原)、RHAMM (CD 168)、ACPP (前列腺酸性磷酸酶)、ACRBP (0Y-TES-1)、 LCK,RCVRN (恢復(fù)蛋白)、RPS2(核糖體蛋白S2)、RPL10A (核糖體蛋白LlOa)、SLC45A3(前列腺蛋白)、BCL2L1 (Bcl-xL) ,DKKl (dickkopf-1)、ENAH (人 mena 蛋白)、CSPG4 (黑素瘤相關(guān)的硫酸軟骨素蛋白聚糖；MSCP)、RGS5、BCR(裂點簇區(qū))、BCR-ABL、ABL-BCR、DEK (DEK癌基因)、 DEK-CAN、ETV6-AML1、LDLR-FUT, NPMI-ALKU PML-RARA, SYT-SSXU SYT-SSX2、FLT3 (FLTl)、 ABLl (原癌基因酪氨酸蛋白激酶)、AML1 (AML)、LDLR(低密度脂類受體)、FUT1 (⑶P-L-巖藻糖)、NPM1 (NPM)、ALK、PML1 (早幼粒細胞性白血??；PML) ,RARA (RARA α )、SYT、SSXl、MSLN(間皮素)、UBE2V1 (遍在蛋白接合的酶變體 Kua)、HNRPL、WHSC2、EIF4EBP1、WNK2、0AS3、BCL_2、MCLl、CTSH (組織蛋白酶 H)、ABCC3(多藥抗性相關(guān)蛋白 3 ；MPR3)、BST2 (HM1. 24)、MTOE8(乳脂球膜蛋白BA46 ；乳凝集素)、TPBG(5T4瘤胎抗原)、FMOD(纖調(diào)蛋白)、XAGEl (XAGE抗原)、RPSA(瘤胎Ag未成熟的層粘連蛋白受體；0FA-ILR)、COTLl (肌動蛋白輔助蛋白樣 1)、CALR3 (CRT2)、PA2G4 (ErbB3-結(jié)合蛋白 1)、EZH2(zeste 同源物的 polycomb 類蛋白增強子2)、FMNLl (白細胞中的形成素相關(guān)蛋白1)、HPSE(乙酰肝素酶)、APC、UBE2A、BCAP31、 T0P2A、T0P2B、ITGB8、RPAU ABI2、CCNI, CDC2、SEPT2、STATU LRPU ADAMl7, JUP, DDRU ITPR2、HMOXl (血紅素加氧酶 _1 ；H0-1)、TPM4 (原肌球蛋白 _4)、BAAT、DNAJC8、TAPBP、 LGALS3BP (Mac-2結(jié)合蛋白)、PAGE4、PAK2 (P21活化的絲氨酸激酶2)、CDKNlA(周期蛋白依賴性激酶抑制因子1A)、PTHLH(甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白；PTHrP)、S0X2、SOXlU TRPM8 (可能的前列腺特異性蛋白瞬時受體-P8)、TYMS (胸苷酸合酶)、ATIC (5 ‘-氨基咪唑_4_氨甲酰-l-β -d-核糖核苷酸甲?；D(zhuǎn)移酶/次黃核苷酸酶)、PGKl (磷酸甘油酸激酶1)、 S0X4、T0R3A(ATP依賴性干擾素響應(yīng)性；ADIR)、TRGC2 (T-細胞受體、可變閱讀框蛋白； TARP)、BTBD2 (含BTB結(jié)構(gòu)域蛋白2) ,SLBP (harpin結(jié)合蛋白)、EGFR (表皮生長因子受體)、 IER3(立即早期響應(yīng)基因X-I ；IEX-1)、TTK(TTK蛋白激酶)、LY6K(淋巴細胞抗原B復(fù)合物基因座K)、IGF2BP3(胰島素樣生長因子(IGF)-II mRNA結(jié)合蛋白3 ;IMP_3)、GPC3 (磷脂酰肌醇蛋白聚糖 _3)、SLC35A4, HSMD (HMSD-v 編碼的 mHA)、H3F3A, ALDH1A1、MFI2, MMP14、 SDCBP、PARP12、MET(c-Met 蛋白)、CCNB1 (周期蛋白 Bi)、PAX3_FKHR、PAX3、F0X01 (FKHR)、遍在蛋白-KH0X-B6、IFI27 JB-1、KIAA0136、骨粘連蛋白、僅有 F-盒的蛋白 21、ILF3、UBP3、 BRAP-2、H+-ATPase、K008-1、MAIAP、基因 AS、BR-1、BR-2、KIAA0603、TPR、N0R-90、N-CAM (神經(jīng)元細胞黏附分子)、Lewis Y糖抗原、Ep-CAM(表皮細胞黏附分子)、MUC-I蛋白、36P6D5、 唾液酰基 Tn 糖抗原、Globo H 糖、CA 125、CA19-9, CA 15-3, TAG-72、Her2/Neu 受體、p97、 CD20、CD21、WT1基因的表達產(chǎn)物。其他有用的腫瘤相關(guān)抗原描述在例如DeVita等主編的《癌癥的生物治療》 (Biological Therapy of Cancer)第二版，第 3章腫瘤藥劑的生物學(xué)(Biology of Tumor Agents), Lippincott Comp. 1995 中?？捎糜诒景l(fā)明的鱗狀上皮細胞癌抗原公開在US 2007/0009501A1中。其他腫瘤相關(guān)抗原公開在美國專禾Ij No. 7，524，930、7，427，660、7，408，037、 7，432，354,7, 232，887、7425607、7，084239 中。根據(jù)本發(fā)明，公開了編碼本發(fā)明的腫瘤抗原肽的多核苷酸。優(yōu)選該多核苷酸包含在能夠編碼可以用蛋白酶從中切割出腫瘤抗原肽的融合蛋白產(chǎn)物的多核苷酸內(nèi)。編碼融合蛋白的多核苷酸可用于對本發(fā)明的天然B細胞、樹突狀細胞或EBTB細胞進行遺傳修飾，以使細胞表達融合蛋白并將其轉(zhuǎn)化成本發(fā)明的腫瘤抗原肽。因此，遺傳修飾的細胞能夠釋放在其表面上帶有本發(fā)明的腫瘤抗原肽的外泌體。然而，也有技術(shù)用于生產(chǎn)在胞質(zhì)溶膠中帶有抗原的外泌體。根據(jù)本發(fā)明，公開了通過引發(fā)針對展示在患者癌細胞上的抗原的免疫應(yīng)答，治療個人的癌癥的方法，所述方法包含(a)提供來自個人的外周血樣品；(b)從樣品分離B細胞；(c)用EB病毒(EBV)感染分離的B細胞；
(d)將感染的B細胞轉(zhuǎn)化至潛伏期，但此時表達gp350 ；(e)將EBV轉(zhuǎn)化的B細胞在癌抗原存在下進行培養(yǎng)；(f)收獲從EBV轉(zhuǎn)化的B細胞釋放的外泌體；(g)向患者給藥收獲到的外泌體以弓丨發(fā)所述免疫應(yīng)答?；蛘?，代替或附加于將EBV轉(zhuǎn)化的B細胞在癌抗原存在下進行培養(yǎng)，方法包含將收獲到的外泌體與癌抗原相接觸以產(chǎn)生載有癌抗原的外泌體。根據(jù)本發(fā)明，還公開了通過引發(fā)針對展示在患者癌細胞上的抗原的免疫應(yīng)答，治療個人的癌癥的方法，所述方法包含(a)提供來自個人的外周血樣品；(b)從樣品分離單核細胞；(c)將單核細胞培養(yǎng)至不成熟的樹突狀細胞；(d)修飾不成熟的樹突狀細胞以表達CD21結(jié)合性部分；(e)將修飾過的不成熟樹突狀細胞與癌抗原相接觸，以將它們轉(zhuǎn)化成載有癌抗原的成熟樹突狀細胞；(f)收獲從成熟樹突狀細胞釋放的載有癌抗原的樹突狀細胞外泌體；(g)向患者給藥載有癌抗原的樹突狀細胞外泌體以弓I發(fā)所述免疫應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明，還公開了通過引發(fā)針對展示在患者癌細胞上的抗原的免疫應(yīng)答，在治療個人的癌癥的方法，所述方法包含(a)提供來自個人的外周血樣品；(b)從樣品分離B細胞；培養(yǎng)B細胞；(c)對B細胞進行修飾以表達⑶21結(jié)合部分；(d)將修飾的表達CD21結(jié)合部分的B細胞與癌抗原相接觸；(e)收獲從與癌抗原接觸過的修飾的B細胞釋放的載有癌抗原的外泌體；(f)向患者給藥載有癌抗原的B細胞外泌體以引發(fā)所述免疫應(yīng)答?；蛘?，代替或附加于將修飾的B細胞與癌抗原相接觸，方法包含將收獲到的外泌體與癌抗原相接觸以產(chǎn)生載有癌抗原的外泌體。在本發(fā)明的治療癌癥的方法中，優(yōu)選CD21結(jié)合蛋白質(zhì)部分包含下列一種或幾種 gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t))、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN- α。根據(jù)本發(fā)明，還公開了 通過本發(fā)明的方法獲得或可以獲得的外泌體；生產(chǎn)外泌體的方法；包含外泌體的癌癥疫苗；被外泌體在體外刺激過的T細胞；包含CD21結(jié)合部分、 特別是選自 gp:350、EBVgp350/220 (gp350 (470t))、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN- α 的 CD21 結(jié)合組成部分的B-細胞或樹突狀細胞(DC)外泌體。本發(fā)明不限于特定癌癥類型的治療。但是，它優(yōu)選應(yīng)用于選自乳腺癌、膀胱癌、皮膚癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、甲狀腺癌、頭頸癌、黑素瘤的癌癥的治療?，F(xiàn)在，將通過參考多個優(yōu)選實施方案對本發(fā)明進行更詳細描述，其中一些優(yōu)選實施方案顯示在多個附圖中。


圖1的圖顯示了 EBV轉(zhuǎn)化的B細胞外泌體(EBTB-exo)和伯基特氏(Burkitt' s)淋巴瘤細胞系的外泌體(BJAB)與天然B細胞的附著，包括通過抗⑶18抗體和抗⑶21抗體以及通過相應(yīng)的同種型對照抗體來阻斷相互作用；圖h、2b的圖顯示了在來自三個供體的外周血單核細胞(PBMC)中，外泌體陽性細胞的DC-外泌體百分率(對于PBMC為平均值+s. d.)，在1小時和4小時時通過流式細胞術(shù)測量為PKH67+信號；圖3的圖顯示了在來自三個供體的外周血單核細胞(PBMC)中，外泌體陽性細胞的 EBV-外泌體百分率(對于PBMC為平均值+s. d.)，在4小時時通過流式細胞術(shù)測量為PKH67+信號。圖4 =PBMC中的外泌體靶特異性亞群。將PKH67染色的(A，D)DC_、(B、Ε) LCLl-和 (C，F(xiàn))乳汁-外泌體與來自健康獻血者的PBMC溫育1小時(A-C, η = 9)和4小時(D-F, η =8)。每切105個PBMC添加10 μ g外泌體。作為背景對照，使用了平行離心的PKH67染料沉淀物，其顯示出低至不可檢測的熒光(數(shù)據(jù)未顯示)。通過以4色流式細胞術(shù)對每個樣品收集IO4個事件來測量外泌體的結(jié)合。數(shù)據(jù)表示成每個亞群體的細胞中PKH67+細胞的百分率。條表示平均值。不同獻血者用個體符號標(biāo)明。圖5 外泌體主要被單核細胞內(nèi)化，然而它們與B細胞的細胞膜結(jié)合。將PBMC與 PKH67染色的(A) DC-、(B) LCLl-和(C)乳汁-外泌體(每5x10s個PBMC 10 μ g外泌體)溫育4小時，然后進行抗⑶14或抗⑶19抗體染色，隨后用Alexa Fluor 546標(biāo)記，顯現(xiàn)為紅色。細胞通過共聚焦激光掃描顯微術(shù)進行分析。作為背景對照，使用了平行離心的PKH67 染料沉淀物，其顯示出不可檢測的熒光(數(shù)據(jù)未顯示)。標(biāo)尺條表示ΙΟμπι。顯示了 PBMC 圖像作為兩個實驗中的一個代表性實驗。(D) ImageStream分析顯示HLA-DR+CD14+細胞主要內(nèi)化外泌體。作為實例，繪制了 ΡΚΗ67+乳汁外泌體(每切105個PBMC IOyg外泌體)與 HLA-DR+⑶14+細胞相互作用4小時后的直方圖。顯示了帶有表面(< 0)或內(nèi)部(> 0) 外泌體的細胞的合成圖像，HLA-DR(粉紅色)，⑶14 (橙色)和ΡΚΗ67+外泌體(綠色)。在左下圖像中顯示了對應(yīng)于ΙΟμπι的條。結(jié)果顯示為使用不同獻血者的兩個實驗中的一個代表性實驗。每個樣品收集了至少IO4個總事件。(E)在插入的表中顯示了與HLA-DR+⑶14+ 細胞結(jié)合的外泌體的百分率以及具有內(nèi)化外泌體的細胞的百分率，后者通過內(nèi)化特點來計算。使用內(nèi)化特點分析了兩千個事件。圖6 源于LCLl的外泌體與B細胞之間的接合是不依賴于溫度的。將PBMC與來自DC、EBV轉(zhuǎn)化的B細胞或乳汁的PKH67標(biāo)記的外泌體在37°C或4°C下溫育1或4小時，并如圖1中所述進行分析。條表示每個HLA-DR+細胞亞群中外泌體陽性細胞的百分率，其通過流式細胞術(shù)測量為PKH67+信號。顯示了來自三個不同供體的PBMC的平均值和s. d.。圖7 =B細胞與源于EBV轉(zhuǎn)化的B細胞的外泌體之間的相互作用由⑶21與gp350 之間的相互作用介導(dǎo)。將PBMC培養(yǎng)物用抗CD21抗體、抗CD18抗體或同種型匹配的對照QO μ g/ml)進行處理，然后加入LCLl-外泌體㈧或BJAB-外泌體(B) 4小時。(C)將 LCLl-外泌體與來自72A1小鼠雜交瘤的抗gp350上清液(總體積的30% )、抗⑶23抗體 (30 μ g/ml)或同種型匹配的對照進行預(yù)溫育，然后添加到純化的B細胞中4小時。代表性的流式細胞術(shù)點圖，包括百分率數(shù)字，顯示了 LCLl-外泌體與用同種型對照(上部)或抗 gp350mAb (下部)處理過的B細胞結(jié)合。按照圖1中所述進行分析。顯示了來自三個不同供體的PBMC的平均值和s. d. (A-C)。(D)流式細胞術(shù)直方圖顯示了 BJAB細胞(灰色)與LCLl細胞(黑線)相比，gp350的細胞外和細胞內(nèi)表達。分析了一萬個細胞。(E)使用針對 LMPl、gp350、⑶81和HLA-DR的抗體(下圖)通過免疫印跡來分析來自于LCLl-和BJAB-外泌體制備物的蔗糖梯度級分的沉淀物。每種級分的密度通過折光率測量來確定。顯示了三個實驗中的一個代表性實驗。圖8 外泌體信號源于外泌體而不是病毒粒子。(A)為了調(diào)查外泌體制備物中感染性EBV的存在，向臍帶血單核細胞(CBMC)添加來自于BJAB和LCLl上清液(SN)的IOOOOxg 沉淀物以及外泌體制備物(lOOOOOxg)，并在33天后通過3H-胸腺嘧啶的摻入監(jiān)測LCL的生長暈。將來自產(chǎn)EBV的B95-8細胞的上清液用作陽性對照，單獨的細胞培養(yǎng)基作為陰性對照。在一個CBMC供體中測試來自三種不同BJAB和LCLl上清液制備物的IOOOOxg沉淀物。在5個不同CBMC供體中測試了 5種不同的BJAB和LCLl外泌體制備物，顯示的是平均值。(B)與B細胞表面結(jié)合的外泌體的代表性圖像。(C)TEM圖像顯示了通過負染色處理過的LCLl外泌體制備物。(B和C)中的箭頭指示外泌體。(D)在免疫EM中，向LCLl外泌體制備物加入針對⑶63 (箭頭1)和HLA-DR (箭頭2)的mAb，并分別通過IOnm和15nm的金接合的第二抗體進行檢測。(E)來自LCLl-外泌體、BJAB-外泌體和EBV的制備物中粒度分布的NanoSight測量。數(shù)據(jù)被顯示成平均值(n = 3)，并歸一化至1以進行尺寸比較。圖9 從OVA脈沖過的骨髓DC培養(yǎng)物的上清液制備外泌體(OVAExo)。為了將C3d 連接到OVAExo上，將接頭BS3與C3d混合，然后溫育30分鐘。通過凝膠過濾除去未反應(yīng)的試劑，并向外泌體(C3d0VAEXO)加入含有C3d的洗脫物。反應(yīng)使用甘氨酸進行穩(wěn)定化。將連接有C3d的Ova外泌體與抗⑶9乳膠珠溫育過夜。然后將外泌體用分別與PE或FITC接合的㈧抗II類MHC或⑶抗C3d抗體標(biāo)記，并通過FACS進行分析。圖10 從OVA脈沖過的骨髓DC培養(yǎng)物的上清液制備外泌體(OVAExo)。為了將C3d 連接到OVAExo上，將接頭BS3與C3d混合，然后溫育30分鐘。通過凝膠過濾除去未反應(yīng)的試劑，并向外泌體(C3d0VAEXO)加入含有C3d的洗脫物。反應(yīng)使用甘氨酸進行穩(wěn)定化。對于體外增殖測定來說，將OVA TCR轉(zhuǎn)基因脾細胞(D011. 10)用cfse標(biāo)記，并與OVAExo或 C3d0VAExo在37°C下共溫育5天。通過流式細胞術(shù)分析增殖細胞中Cfse的稀釋度。結(jié)果顯示為總脾細胞中增殖細胞的％。圖11 從OVA脈沖過的骨髓DC培養(yǎng)物的上清液制備外泌體(OVAExo)。為了將C3d 連接到OVAExo上，將接頭BS3與C3d混合，然后溫育30分鐘。通過凝膠過濾除去未反應(yīng)的試劑，并向外泌體加入含有C3d的洗脫物。反應(yīng)使用甘氨酸進行穩(wěn)定化。用25微克OVAexo或C3d0VAExo注射BALB/c小鼠，并在3天后在FACS中分析脾細胞。圖12 為了將C3d連接到OVAExo上，將接頭BS3與C3d混合，然后溫育30分鐘。 通過凝膠過濾除去未反應(yīng)的試劑，并向外泌體加入含有C3d的洗脫物。反應(yīng)使用甘氨酸進行穩(wěn)定化。將D011. 100VA轉(zhuǎn)基因脾細胞過繼轉(zhuǎn)移到BALB/c小鼠，然后在第二天用25微克 OVAexo或C3d0VAExo進行注射，并在3天后在FACS中分析脾細胞。圖13:將CFSE標(biāo)記的OT-I脾細胞轉(zhuǎn)移到野生型C57BL/6小鼠，然后在第二天用間接荷載OVA的外泌體(Exo-OVA)或直接荷載CD80VA肽的外泌體(Exo-SIIN)或?qū)φ?(Exo-BSA)進行注射。在5天后通過對OVA特異性⑶8+細胞的增殖進行FACS，來分析脾細胞的CFSE稀釋度。圖14 圖14A顯示了小鼠的免疫接種日程安排，其中將T-細胞注射到小鼠中， 一天后給藥外泌體，在其4天后測量免疫應(yīng)答。圖14B顯示了使用直接荷載的外泌體 (Pep-Εχο)、間接荷載的外泌體(OVA-exo)、未荷載的外泌體(Exo)的免疫應(yīng)答。背景是PBS。 KJ1-26是特異性識別D011. IOtg TCR的單克隆抗體。在下面的實驗部分中，作為指導(dǎo)給出了說明件實施例。這㈣實施例不應(yīng)以仵何方式被解釋為限制。實驗部分外泌體與天然B細胞和外周血單核細胞的相互作用從人類Epstein-Barr病毒轉(zhuǎn)化的B細胞系(EBTB細胞系)和EBV—伯基特氏淋巴瘤細胞系(BJAB細胞系)的培養(yǎng)上清液分離外泌體。對外泌體與天然B細胞(圖la、 lb)和PBMC培養(yǎng)物中的不同細胞(圖h，2b)的黏附性進行比較。將外泌體用通用膜染料PKH67直接染色(Morelli AE等，樹突狀細胞對外泌體的胞吞作用、細胞內(nèi)分揀和加工 (Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells), Blood 2004，104 :3257-3266)。為了觀察外泌體在用PKH67染色后是否保留其結(jié)構(gòu)，將它們與抗II類MHC磁珠結(jié)合(Clayt0n，A等，基于免疫磁性分離和流式細胞術(shù)分析源于抗原呈遞細胞的夕卜泌體(Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry),J Immunol Methods 2001， 247 :163-174)。流式細胞術(shù)分析顯示，含有發(fā)綠色熒光的II類MHC的囊泡已被捕獲到珠子上，并且透射電子顯微術(shù)(TEM)顯示出具有完整脂質(zhì)雙層的納米囊泡，表明PKH67標(biāo)記不干擾外泌體形態(tài)。然后將不同外泌體與天然B細胞或人類PBMC共溫育4小時，并通過多色流式細胞術(shù)進行分析。在與外泌體溫育之前，用抗⑶18或抗⑶21抗體(20yg/ml)處理天然 B細胞。每個樣品分析一萬個細胞。B細胞外泌體與B細胞之間的相互作用很大程度上不依賴能量，因此更可能通過黏附分子或表面受體介導(dǎo)。EBTB外泌體表達B細胞受體，所述受體與不同形式的黏附分子、例如ICAM-I和整合蛋白一起(Clayton A等，源自B細胞的外泌體的黏附和信號傳導(dǎo) 整合蛋白的作用(Adhesion and signaling by B cell-derived exosomes :the role of integrins)，F(xiàn)aseb J 2004，18 :977-979)，可能介導(dǎo)觀察到的EBTB外泌體的強烈的B細胞偏好性。然而，替代地或此外，黏附效應(yīng)可能由受到在EBTB外泌體表面上表達的EBV轉(zhuǎn)化所上調(diào)的殘留EBV蛋白或其他蛋白介導(dǎo)。為了調(diào)查EBTB外泌體的B細胞靶向是與其他B細胞外泌體類似還是EBTB外泌體特異性的、gp350的可能參與，將EBTB外泌體的B細胞結(jié)合能力與來自EBV—伯基特氏淋巴瘤 B細胞系BJAB27的外泌體(BJAB外泌體)的結(jié)合能力進行比較。發(fā)現(xiàn)BJAB外泌體與EBTB 外泌體相比，確實以低得多的程度與天然B-細胞結(jié)合，表明EBV參與結(jié)合(圖3)。為了揭示結(jié)合的特異性，嘗試了用抗⑶21抗體阻斷⑶21。發(fā)現(xiàn)抗⑶21抗體有效地阻斷EBTB外泌體與天然B細胞之間的相互作用。這表明B細胞與EBTB外泌體之間的結(jié)合由天然B細胞上的受體⑶21與EBTB外泌體上的配體、可能是gp350或⑶23之間的相互作用引起。為了排除其他整合蛋白例如 LFA-I (CDlla/CD 18) ,Mac-I (CDllb/CD18)和 pl50, 95 (CDllc/CD18) 參與結(jié)合，通過抗CD18抗體阻斷了這些整合蛋白。然而，正如圖3所證實的，這種阻斷不影
24響EBTB外泌體與天然B細胞之間的相互作用。因此，⑶21似乎對B細胞/B細胞外泌體結(jié)合來說是必不可少的。通過確定B細胞結(jié)合的PKH67染色囊泡確實是外泌體而不是EBV粒子，排除了 EBV 粒子保留在EBTB細胞系中的可能性，進而排除了它們污染外泌體制備物的風(fēng)險。通過TEM 對來自EBV+B細胞的外泌體制備物和來自外泌體與B細胞共同培養(yǎng)物的樣品進行了仔細檢查。在外泌體中和B細胞上都沒能檢測到病毒粒子(數(shù)據(jù)未顯示)。盡管已知不同細胞類型產(chǎn)生的外泌體的表型反映出它們的細胞來源，但來自不同細胞類型的外泌體在它們的細胞靶向中有何不同的問題仍有待闡明。已發(fā)現(xiàn)，不論來源如何，這些天然外泌體似乎在人類外周血中具有同樣的主要靶、即HLA—DR+CD14+細胞，它們表現(xiàn)出被該細胞主動吞噬。然而，已發(fā)現(xiàn)EBTB外泌體產(chǎn)生了特異性從HLA_DR+CD14+細胞向天然B細胞改變的外泌體。這一點通過將來自一種EBV—B細胞系、即BJAB細胞系的外泌體 (BJAB外泌體)與來自一種EBV+B細胞系、即EBTB細胞系的外泌體(EBTB外泌體)進行比較而得到證實。EBTB外泌體與天然B細胞之間的高相互作用可以被抗⑶21抗體有效阻斷， 但是不能被抗CD18抗體阻斷。這種被靶向的B細胞相互通訊的新機制也可以反映EBV感染個體的體內(nèi)情況。它可能在針對EBV的長期免疫保護中具有重要作用。方法
外泌體來源。將來自Karolinska大學(xué)醫(yī)院血庫的健康獻血者的白細胞層用于夕卜周血單核細胞(PBMC)的 Ficoll Paque (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala,^ 典)分離。EB病毒(EBV)轉(zhuǎn)化的B細胞系來自奧地利維也納的維也納醫(yī)科大學(xué)(Medical University of Vienna)的Barbara Bohle博士的善意饋贈。EBV陰性淋巴瘤B細胞系BJAB Jfeg Michael Kar Is son, Karolinska Institutet 白勺 ；i；㈣貝曾。外泌體分離。使用差速離心從細胞培養(yǎng)上清液(B細胞系)分離外泌體，首先以 300xg離心10分鐘以除去細胞，然后3，OOOxg離心20分鐘，再以10，OOOxg在4°C下超速離心 30 分鐘(Ti45 轉(zhuǎn)頭，在 Optima L-100XP 超速離心機中，Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)以從上清液中排除可能的細胞碎片。以100，OOOxg超速離心70分鐘沉淀外泌體， 隨后將其在PBS中清洗，重復(fù)最后一次超速離心。在最后一次清洗后立即將沉淀的外泌體重懸浮在小體積PBS中，并使用BioRad Dc測定(BioRad，Hercules, CA, USA)按照制造商的說明書測定蛋白濃度。使用同樣量的來自四種外泌體來源的每一種的蛋白。外周血單核細胞與外泌體的共培養(yǎng)。使用來自健康獻血者的白細胞層作為新鮮分離的 PBMC 的來源。在 Ficoll Hypaque (Amersham Pharmacia Biotech AB)上按照制造商的說明書分離細胞。將殘留的紅細胞用ACK裂解緩沖液裂解5分鐘(0. 15M NH4CiaOmM KHCO3,0. ImM Na2EDTA, pH 7. 2)。在 6ml 試管中，在 37°C下將 PBMC 在 CCM 中與 PKH67+ 外泌體以10 μ g/5xl05個細胞溫育4小時。一些實驗在4°C下進行。外泌體染色。使用用于通用膜標(biāo)記的綠色熒光染料PKH67 (Sigma Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA)對外泌體進行染色。通過以100，OOOxg離心70分鐘(NVT90轉(zhuǎn)頭， Beckman Coulter)將外泌體從PBS轉(zhuǎn)移到稀釋劑C (Sigma)溶液中。將PKH67染色劑稀釋成與外泌體樣品相同體積的4μΜ h儲用液(300μg/mL，在稀釋劑C中)，將儲用液在小的0. 2μπι注射器濾器中過濾以除去由染色劑形成的可能聚集物。然后將外泌體樣品在與 ΡΚΗ67儲用溶液1 1混合時通過0.2nm注射器濾器，并允許在室溫下染色5分鐘，然后用1 % BSA終止1分鐘。然后將外泌體用CCM清洗，并如上所述在NVT90轉(zhuǎn)頭中離心。仔細漂洗沉淀物以除去未結(jié)合的PKH67染色劑。初步顯微鏡分析顯示，形成的外泌體在染色后聚集(數(shù)據(jù)未顯示)，因此將其重新懸浮在CCM中，通過小體積0. 2 μ m注射器濾器過濾，然后立即添加到細胞中。作為對照，將同樣濃度的PKH67平行離心，以產(chǎn)生用于可能沉淀的未結(jié)合染色劑的背景對照。PKH67染色的外泌體與PBMC的共培養(yǎng)。在37°C以及在溫度研究期間的4°C下，將預(yù)先過濾過的PKH67染色的外泌體添加到PBMC中1小時和4小時。每切105個PBMC加入 10 μ g外泌體。作為背景對照，使用了平行離心的PKH67染料沉淀物。透射電子顯微術(shù)(TEM)。將外泌體捕獲在抗II類HLA磁珠上(Clayton，A等， 基于免疫磁性分離和流式細胞術(shù)分析源于抗原呈遞細胞的外泌體(Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry), J Immunol Methods 2001,247:163-174)。將珠子在 4°C下，在含有 0. IM 蔗糖和3mM CaCl2、pH為7.4的0. IM 二甲胂酸鈉緩沖液所含的2%戊二醛中固定過夜，離心得到沉淀物。將沉淀物在含有3mM CaCl2WpH 7. 4的0. 15M 二甲胂酸鈉緩沖液中漂洗，然后在 4°C下，在含有1.5mM CaCl2WpH 7. 4的0. 07M 二甲胂酸鈉緩沖液包含的2%四氧化鋨中后固定2小時，在乙醇、然后在丙酮中脫水，并包埋在LX-112中(Ladd，Burlington，Vermont， USA)。將切片用乙酸雙氧鈾、然后用檸檬酸鉛形成反差，并在Tecnai 10透射電子顯微鏡 (i^i，Acht，荷蘭)中在80kV下檢查。數(shù)字圖像通過Mega View III數(shù)字相機捕獲(Soft Imaging System, GmbH, Miinster,德國)。流式細胞術(shù)。使用兩個不同的小鼠單克隆(m)抗體組對PBMC進行染色“APC”抗 HLA-DR(II類MHC)PECy5、抗⑶14TE和抗⑶19太平洋藍(或PE-德克薩斯紅)抗體，以及 “T 細胞，，抗 CD8APC (或 PECy5)、抗 CD4PE 和 CD3 太平洋藍(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)抗體。首先在FSC/SSC中對淋巴細胞/單核細胞進行門選(gated)。對于APC組來說，首先門選HUTDR+⑶14+和HUTDR+⑶14一群體。然后在HLADR+⑶14—細胞中門選⑶19+ 細胞。對于T細胞組來說，直接從淋巴細胞/單核細胞門中選出⑶3+CD4+對⑶3+⑶8+群體。 對于每個亞群來說，在不含外泌體的樣品上設(shè)置相應(yīng)的PKH67+門。樣品在FACSAria流式細胞儀(BD Biosciences)上運行。在從每個個體收集數(shù)據(jù)之前制作單染色細胞的補償對照，并通過用于分析獲取的數(shù)據(jù)的FACSDiva(BD Biosciences)軟件自動計算補償。在淋巴細胞/單核細胞門中，每個樣品收集10，000個事件。激光掃描共聚焦顯微術(shù)(CLSM)。在與PKH67+外泌體在4°C或37°C下溫育4小時后，將PBMC在4%甲醛中固定15分鐘。染色使用抗⑶3、抗⑶14或抗⑶19mAb (BD Biosciences)，按照制造商的說明書進行，然后用PBS清洗。使用Alexa Fluor 546標(biāo)記的山羊抗小鼠mAb第二抗體(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)進行檢測。在細胞離心涂片后，將載片用90%甘油固定。在裝備有一個氬氣和兩個HeNe激光器的CLSM(TCS SP2 ； Leica Microsystems，Mannheim，德國)上獲取熒光圖像。PKH67用488-nm激光線激發(fā)，并檢測波長區(qū)域490-530nm內(nèi)的光。Alexa546通過M3_nm激光線激發(fā)，并檢測580_700nm區(qū)域內(nèi)的光。圖像流分析。按照對于流式細胞術(shù)所述，對外泌體染色并與PBMC共培養(yǎng)。將細胞在Imag必tream 多光譜成像流式細胞儀上運行，并使用IDEAS 圖像分析軟件(AmnisCorporation, Seattle, WA，USA)分析圖像。在每個樣品中收集10000個事件，并使用單染色補償對照在逐個像素的基礎(chǔ)上補償通道圖像之間的熒光。按照FACS的原理進行門選。使用內(nèi)化特點測量PKH67熒光的細胞定位。內(nèi)化特點被定義為細胞內(nèi)強度與整個細胞強度的比率。分值越高，細胞內(nèi)強度的濃度越大。細胞的內(nèi)部由與細胞膜相適配的掩膜的侵蝕所界定。該特征不隨細胞大小而變，并可以適應(yīng)于集中的亮區(qū)和小的暗斑。將比率作圖到對數(shù)標(biāo)尺上，以將動態(tài)范圍增加至{-inf，inf}之間的值。主要帶有內(nèi)部熒光的細胞具有正分值，而顯示出很少內(nèi)化的細胞具有負分值。阻斷測定法。將PBMC(IOVml)與針對CD18(克隆MEM48)、CD21 (克隆B-E5)的 mAb或同種型匹配的Ab (20 μ g/ml ；Nordic BioSite, Taby,瑞典)，在室溫下、在細胞培養(yǎng)基中共溫育30分鐘，在用PBS清洗后，以1(^8/切105個細胞加入外泌體，在371溫育1 或4小時。按照以前的描述進行FACS分析。將LCLl-外泌體用抗⑶23抗體(克隆9P25， 30 μ g/ml, Beckman Coulter)或用來自產(chǎn)gp350/250中和mAb 72A1的小鼠雜交瘤培養(yǎng)物 (DSMZjraunsctiweig，德國)的上清液(總體積的30%)進行處理。使用無關(guān)的同種型對照或雜交瘤上清液作為對照。在室溫下在細胞培養(yǎng)基中30分鐘后，向B細胞加入預(yù)處理過的LCLl-外泌體(10μβ/2.切105個細胞)4小時，然后執(zhí)行FACS分析。B細胞使用B細胞分離試劑盒II (Miltenyi Biotech)從PBMC分離。細胞內(nèi)流式細胞術(shù)染色。在室溫下，將LCLl-和BJAB細胞(5xl04)用4%甲醛固定5分鐘。在用PBS清洗三次后，將細胞在室溫下、在皂苷溶液中溫育10分鐘。通過添加來自小鼠雜交瘤培養(yǎng)物的上清液，將細胞在室溫下用抗gp350/250的第一 mAb 72A1染色 1小時。在用皂苷溶液進行兩次清洗步驟后，將細胞與Alexa Fluor 488 (Invitrogen, CA, USA)第二抗體在室溫下溫育45分鐘，清洗并通過流式細胞術(shù)進行分析。蔗糖梯度。按照以前的描述(5)，通過蔗糖梯度收集外泌體制備物級分。將它們直接荷載到抗II類MHC的Dynabead(Dynal，Oslo，挪威)上用于流式細胞術(shù)分析，或通過在 4°C下以200000xg離心35分鐘進行沉淀，用于免疫印跡分析。免疫印跡分析。通過SDS-PAGE (12% )分離每種沉淀的外泌體級分，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上(Millipore, MA, USA)。將膜用針對 LMPl (克隆 CS. 1. 4 ；DakoCytomation)、 gp350(克隆 2L10，Millipore, MA, USA)、CD81 (克隆 H-121，Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)或 HLA-DR(克隆 TAL. 1B5, DakoCytomation, Glostrup，丹麥)的 mAb，按照制造商的說明書進行染色。使用ECL Advance Western Blotting檢測試劑盒對膜進行可視化，并在 Hyperfilm(GE Healthcare，Uppsala，瑞典)上曝光。臍帶血轉(zhuǎn)化測定法。對從Karolinska大學(xué)醫(yī)院獲得并得到當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會批準的肝素化臍帶血樣品進行Ficoll I^que密度離心。將一百萬個臍帶血單核細胞(CBMC)與來自BJAB或LCLl上清液的IOOOOxg沉淀物或與Myg BJAB或LCLl外泌體制備物在加濕的37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中溫育1. 5小時。對CBMC進行清洗，并以IO6個細胞/mL重懸浮在完全RPMI中，并以每孔2xl05個細胞/200 μ L 一式五份接種在96孔板中。作為用于EBV誘導(dǎo)的細胞轉(zhuǎn)化的陽性對照，將CBMC暴露于含有Β95-8病毒的上清液。將培養(yǎng)基用作陰性對照。每周用新鮮培養(yǎng)基供給CBMC。在第33天，通過視覺看見典型的細胞聚集體并通過胸腺嘧啶摻入測定對轉(zhuǎn)化進行記錄。向培養(yǎng)物添加IyCi 3Η-胸腺嘧啶(GE Healthcare)并溫育16小時。將CBMC收獲在玻璃纖維濾器上，并在閃爍計數(shù)器(1205Betaplate，Wallac)中測量放射活性。NanoSight。通過使用裝備有快速視頻捕獲和粒子追蹤軟件的NanoSight LMlO系統(tǒng)(NanoSight Ltd.，Amesbury, UK)測量布朗運動速率，來分析外泌體制備物中的尺寸分布。用作對照的EBV(B95-8毒株)是Kerstin !^alk博士(微生物學(xué)、腫瘤和細胞生物學(xué)部 (Department of Microbiology,Tumour and Cell Biology) ,Karolinska Institutet)白勺善意饋贈。在用NanoSight進行分析之前，將EBV在56°C下熱失活20分鐘。統(tǒng)計分析。利用GraphPad Prism軟件4. 03版，使用Wilcoxon配對檢驗來比較組之間的差異。P-值低于0.05被認為是顯著的。EBV感染的B細胞系的產(chǎn)生。通過本發(fā)明的方法，從被選擇進行治療的黑素瘤癌癥患者或從免疫相容獻血者獲得的外周血(50ml)中分離包含B細胞的單核細胞懸液。按照由 Tosato 和 Cohen 設(shè)計的方案(Curr Protoc Immunol 2007,7. 22. 1-7. 22. 4)，從該懸液制備EBV感染的B細胞系(EBTB細胞系)。EBTB外泌體的分離。基本上按照前面對于來自天然B細胞的外泌體的描述，從 EBTB細胞系分離EBTB外泌體。EBTB外泌體荷載。通過修改N Chaput等(外泌體作為強有力的無細胞肽基疫苗.II :CpG佐劑中的外泌體高效引發(fā)導(dǎo)致腫瘤排斥的天然Tcl淋巴細胞(Exosomes as potent cell-free peptide—based vaccine. II. Exosomes in CpG adjuvants efficiently prime native Tc 1 lymphocytes leading to tumor rejection)， J Immunol 2004, 172 :2137-2146)和D H Hsu等(作為腫瘤疫苗的外泌體通過直接荷載抗原性肽提高效能(Exosomes as a tumor vaccine enhancing potency through direct loading of antigenic peptides), J Immunol 2003，26 :2137-2364)的方法，將分離到的 EBTB 外泌體用I類和II類MHC肽或癌抗原肽荷載。載有抗原的ETBT外泌體的純化。通過B. Escudier等(使用源于自體樹突狀細胞(DC)的外泌體對轉(zhuǎn)移黑素瘤患者進行免疫接種1期臨床試驗的結(jié)果(Vaccination of metastatic melanoma patients with autologous dendritic(DC)derived-exosomes : results of the first phase I clinical trial), J Translat Med 2005,3:10)的方法純化載有抗原的EBTB外泌體。體外⑶-40/IL-4刺激的B細胞系外泌體。使用來自Karolinska大學(xué)醫(yī)院血庫的健康獻血者的白細胞層，進行外周血單核細胞(PBMC)的Ficoll I3aque分離(Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala，瑞典)。建立三個平行的各約1 · IO5個PBMC的培養(yǎng)物， 并按照同上Wiesner等的方案進行刺激。將其中兩個細胞系維持70天，而第三個細胞系在約3周后終止增殖。發(fā)現(xiàn)兩個長期CD40刺激的B細胞系不含EBV感染的淋巴母細胞和其他細胞類型。以與上面對于ETBT外泌體所述相同的方式，從兩個細胞培養(yǎng)物之一的上清液中分離外泌體。按照對ETBT外泌體的描述，將分離的外泌體荷載腫瘤抗原并純化。結(jié)果源于人類DC和乳汁的外泌體靶向單核細胞，而LCLl外泌體優(yōu)選B細胞為了闡明不同外泌體與免疫細胞的結(jié)合，我們對從人類單核細胞來源的DC、EBV 轉(zhuǎn)化的類淋巴母細胞B細胞系(LCLl)和從人類乳汁分離的外泌體在它們與PBMC的黏附性方面進行了比較。將外泌體用可以通過流式細胞術(shù)檢測的綠色熒光膜染料PKH67染色。為了了解外泌體是否正確標(biāo)記以及它們的結(jié)構(gòu)在用PKH67染色后是否保留，將外泌體與磁性抗II類MHC珠子結(jié)合。流式細胞術(shù)分析顯示，發(fā)綠色熒光的含有II類MHC的囊泡已被捕獲到珠子上，并且TEM顯示出具有完整脂雙層的納米囊泡，表明PKH67標(biāo)記不干擾外泌體形態(tài)。然后將不同外泌體與PBMC共溫育1或4小時，并通過多色流式細胞術(shù)分析，以評估外泌體與細胞的結(jié)合模式。在1小時后，源于DC的外泌體主要與單核細胞相互作用 (HLADR+CD14+ ；平均 46% )，而只有 17%與 B 細胞(HLAT)R+CD 14TD19+ ；圖 4A)結(jié)合。相反， LCLl外泌體顯示出相反的結(jié)合模式，對B細胞具有強偏好性。在1小時時，63%的B細胞對LCLl外泌體陽性，而平均只有17%的單核細胞與這些外泌體結(jié)合(圖4B)。在共溫育4 小時后，每種細胞群體中外泌體陽性細胞的百分率普遍增加，但是對不同細胞群體的不同結(jié)合模式仍然存在(圖4D-F)。在共溫育1小時后，乳汁外泌體相互作用通常低(圖4C)。 然而，在4小時時，55%的單核細胞和18%的B細胞與乳汁外泌體結(jié)合(圖4C)，類似于DC 外泌體在1小時時的模式。以前我們發(fā)現(xiàn)，與來自其他外泌體類型的沉淀物相比，乳汁外泌體制備物中外泌囊泡的含量相對于外泌體沉淀物中的總蛋白量較低。因此，當(dāng)將乳汁外泌體的量增加5倍(50 μ g/5xl05個PBMC)時，在1小時時乳汁外泌體的相互作用水平達到與單核細胞為64%和與B細胞為的平均值(n = 3，數(shù)據(jù)未顯示)。這些水平與當(dāng)與 10 μ g/5xl05個PBMC的DC外泌體溫育時在1小時時觀察到的水平相當(dāng)，表明乳汁外泌體制備物與其他外泌體制備物相比，存在較高的非外泌蛋白量。盡管T細胞占PBMC的大部分(在我們的研究中在70%左右)，但在4小時后，少于8%的⑶4+或⑶8+T細胞顯示出與任何外泌體的結(jié)合(圖4)。在對⑶4+與⑶8+T細胞相比的偏好性上，不同外泌體類型中沒有觀察到一致的差異。外泌體主要與B細胞的細胞膜結(jié)合但不被單核細胞內(nèi)化接下來，我們想知道外泌體在不同細胞類型中的定位。我們將PKH67標(biāo)記的外泌體與PBMC共溫育，并通過激光共聚焦掃描顯微術(shù)(CLSM)分析外泌體結(jié)合。一般來說，在1 小時時，沒有檢測到或只能檢測到微弱的與細胞結(jié)合的外泌體信號(數(shù)據(jù)未顯示)，這可能是由于CLSM與流式細胞術(shù)相比較低的檢測水平。在4小時后，DC外泌體主要被單核細胞 (CD14+)內(nèi)化，并以較低的程度被B細胞(CD19+)內(nèi)化，所述B細胞往往具有細胞膜結(jié)合的外泌體(圖5A)。相反，LCLl外泌體以較高程度與B細胞相互作用，并且主要定位于細胞膜(圖5B)。單核細胞對LCLlB-細胞外泌體顯示出較弱信號(圖5B)?？偟膩碚f，正如在流式細胞術(shù)中所看到的，乳汁外泌體顯示出弱信號，并且被檢測為在單核細胞中內(nèi)化或與B 細胞的細胞膜結(jié)合(圖5C)。在其中外泌體與CD3+T細胞之間發(fā)生相互作用的少數(shù)情況下 (50個細胞中約一個)，外泌體主要定位于細胞膜附近或與其相接觸(數(shù)據(jù)未顯示)。因此， 這些CLSM數(shù)據(jù)與我們的流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)相一致，顯示出來自EBV轉(zhuǎn)化的B細胞的外泌體傾向性靶向B細胞，而源于DC的外泌體更多地與單核細胞結(jié)合。然而，這些結(jié)果也表明，外泌體與不同細胞類型差異相互作用，其中外泌體大多數(shù)保持與B細胞和T細胞的細胞膜結(jié)合， 但是被單核細胞內(nèi)化。為了通過其他技術(shù)方法驗證不同外泌體與免疫細胞的結(jié)合和定位，我們決定探查圖像流系統(tǒng)(Imag必tream system)。該系統(tǒng)是流式細胞儀和熒光顯微鏡相組合，其以非常高的速率自動捕獲通過流式細胞儀的每個細胞的多光譜圖像，并能對每個樣品的大量細胞進行基于圖像的分析。使用內(nèi)化特點，我們分辨出具有表面結(jié)合的外泌體、內(nèi)化的外泌體或兩者的單核細胞(HLA—DR+CD14+)(中間；圖5D)。由于技術(shù)原因，沒有獲得B細胞數(shù)據(jù)，但是接收到的單核細胞數(shù)據(jù)與我們的常規(guī)流式細胞術(shù)和CLSM數(shù)據(jù)一致。圖像流顯示出DC和乳汁外泌體傾向性地與單核細胞結(jié)合，而LCLl外泌體不會如此(圖5E)。此外，觀察到大部分單核細胞已內(nèi)化各種外泌體，加強了我們以前的發(fā)現(xiàn)(圖5E)。由此，我們也顯示了這種方法對于在大量細胞中定量外泌體的定位是可行的。源于LCLl的外泌體與B細胞之間的結(jié)合是不依賴于溫度的為了調(diào)查不同外泌體與PBMC的結(jié)合是受體介導(dǎo)的還是依賴于主動內(nèi)化，我們將 PKH67+外泌體與PBMC在4°C和37°C下共培養(yǎng)。對于所有三種外泌體類型來說，當(dāng)溫育在 4°C下執(zhí)行1小時和4小時時，與單核細胞的結(jié)合降低(圖6A-F)，表明被這種細胞類型主動地、可能是胞吞性地攝取。DC (圖6A和D)乳汁外泌體(圖6C和F)與B細胞的結(jié)合在冷條件下也同樣減小。相反，在4°C下，在這兩個時間點時，觀察到LCLl外泌體和B細胞之間的相互作用僅僅略微降低(圖6B和E)。因此，LCLl外泌體與B細胞之間的相互作用主要是溫度不依賴性的，并因此更可能通過黏附分子或表面受體介導(dǎo)，所以我們開始進一步剖析這種相互作用。源于LCLl的外泌體與B細胞之間的結(jié)合依賴于B細胞上表達的⑶21B細胞表達細胞表面受體例如人類補體受體2 (CD21)，其與不同模式的黏附分子例如 ICAM-I 或整合蛋白例如 LFA-l(CDlla/CD18)、Mac-l(CDllb/CD18)或 pl50，95 (CDllc/ CD18) 一起，可以介導(dǎo)觀察到的B-細胞外泌體的B細胞強偏好性。為了揭示外泌體結(jié)合的特異性，在與外泌體溫育之前，向PBMC添加針對⑶21或⑶18的mAb。LCLl外泌體與外周血B細胞之間的相互作用可以被抗CD21抗體高效阻斷，然而使用抗CD18抗體沒有觀察到阻斷效應(yīng)(圖7A).為了闡明所觀察到的B-細胞靶向是否依賴于B細胞的EBV轉(zhuǎn)化，我們與來自于 EBV陰性B細胞系BJAB的外泌體進行了比較。結(jié)果顯示，與LCLl外泌體相比，BJAB外泌體與B細胞結(jié)合的程度低10倍，表明EBV來源的或誘導(dǎo)的蛋白參與了結(jié)合(圖7B)。合在一起，這些數(shù)據(jù)表明LCLl外泌體與B細胞之間的結(jié)合依賴于與CD21的相互作用，而不依賴于 LFA-UMac-I或pl50，95，并說明了 B-細胞外泌體的選擇性靶向，其對源于EBV轉(zhuǎn)化的B細胞的外泌體來說是特異性的。LCLl-外泌體上的gp350介導(dǎo)與B細胞的結(jié)合接下來，我們打算闡明參與⑶21在B細胞上的結(jié)合的外泌體配體。⑶21的已知配體包括IgE的低親和性受體(⑶23) ,EBV包膜糖蛋白gp350和補體因子C3d。已經(jīng)顯示，從 B細胞和巨噬細胞釋放的外泌體含有C3片段，但是因為在我們的所有細胞培養(yǎng)中使用了熱失活的胎牛血清(FCS)，因此C3d不可能在這里造成差異。在我們的LCLl外泌體上檢測到在EBV轉(zhuǎn)化的B-細胞系上高表達的⑶23，但是在BJAB外泌體上沒有檢測到。EBV糖蛋白 gp350是對于病毒與B細胞附著來說關(guān)鍵的裂解蛋白，但到目前為止尚未顯示其存在于外泌體上。因此，gp350和⑶23是我們最先調(diào)查其參與外泌體-B-細胞相互作用的可能性的候選物。這些配體被抗gp350/220或抗⑶23抗體阻斷。當(dāng)阻斷gp350時，LCLl外泌體與 B細胞的結(jié)合顯著降低，但有趣的是，當(dāng)CD23被阻斷時沒有觀察到外泌體結(jié)合的降低(圖 7C)。該觀察表明LCLl外泌體表面上存在gp350，并且是這種EBV蛋白而不是⑶23介導(dǎo)外泌體結(jié)合。作為對照我們還添加了非中和性抗gp350mAM2L 10)，其不阻斷外泌體結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)，加強了 gp350通過中和mAb(72Al)特異性阻斷這一見解。通過流式細胞術(shù)分析證實了 gp350在LCLl細胞中的存在(圖7D)，對于外泌體來說通過免疫印跡在蔗糖梯度中證實，其中g(shù)p350與HLA-DR和⑶81共定位(圖7E)。這些標(biāo)志物也與以前在外泌體上發(fā)現(xiàn)的EBV編碼的潛伏膜蛋白1 (LMPl)部分共定位。正如所預(yù)期的，gp350或LMPl都沒有在 BJAB外泌體中檢測到(圖7E)。外泌體信號源自于外泌體而不是病毒粒子gp350在LCLl細胞和外泌體兩者上的表達提出了我們的一些LCLl細胞是否處于 EBV生命周期的裂解階段的問題，這將意味著EBV也可能作為游離病毒粒子駐留在EBV轉(zhuǎn)化的B-細胞培養(yǎng)物中。因此，存在著病毒粒子可能污染我們的外泌體制備物并從而在我們的實驗中給出外泌體假陽性信號的可能性。在初步實驗中，我們通過PCR檢測病毒DNA，然而，DNA的存在不總是對應(yīng)于完整病毒粒子的存在。因此，使用了更靈敏的臍帶血測定法來調(diào)查感染性EBV病毒粒子的存在，并使用TEM和免疫EM分析來檢測我們的外泌體制備物中的EBV粒子。向臍帶血單核細胞(CBMC)添加來自BJAB和LCLl上清液的IOOOOxg沉淀物 (在外泌體分離程序期間的中間離心步驟中獲得)以及外泌體制備物，以監(jiān)測EBV轉(zhuǎn)化的初級B細胞的生長暈(圖8A)。將來自于已確立的產(chǎn)EBV狨猴B-類淋巴母細胞系(B95-8)的上清液用作陽性對照。當(dāng)通過3H-胸腺嘧啶摻入法定量時，添加來自BJAB上清液的合并的 IOOOOxg沉淀物不誘導(dǎo)LCL的生長暈。此外，培養(yǎng)物的目測檢查沒有顯示出轉(zhuǎn)化的B細胞的任何典型的聚集體。相反，向CBMC添加來自于LCLl上清液的合并的IOOOOxg沉淀物誘導(dǎo)了 LCL的生長暈，表明LCLl細胞產(chǎn)生感染性病毒粒子。該發(fā)現(xiàn)與觀察到的gp350在LCLl細胞上的細胞表面表達相一致(圖7D)，表明LCLl細胞處于裂解性的病毒生產(chǎn)階段。然而，在向CBMC添加來自BJAB和LCLl上清液的外泌體制備物(IOOOOOxg)后，沒有觀察到LCL的生長暈，表明在我們的LCLl外泌體制備物中不存在感染性EBV。因此，所有由LCLl生產(chǎn)的病毒粒子在IOOOOxg離心步驟期間被沉淀下來。此外，我們通過TEM和免疫EM調(diào)查了來自 LCLl細胞的外泌體制備物是否含有任何多形EBV粒子，其是皰疹病毒的普遍特征。與初級 B細胞附著的外泌體(圖8B)或單獨的外泌體制備物(圖8C和D)都沒有揭示出在感染性 EBV(200nm)或裸露的高密度病毒衣殼的尺寸范圍內(nèi)的任何EBV粒子。只觀察到約IOOnm的囊泡，其中大部分標(biāo)記有指示外泌體的CD63和HLA-DR(圖8C)。這些結(jié)果也與我們使用免疫印跡的發(fā)現(xiàn)相一致，在免疫印跡中g(shù)p350與HLA-DR和⑶81共定位(圖7E)。通過納米粒子示蹤分析(NTA ；NanoSight)進一步調(diào)查了尺寸分布。這種方法定量地證實了 LCLl-和 BJAB-外泌體制備物中的尺寸范圍平均約為lOOnm，與最大超過150nm的EBV(圖8E)相比較小，進一步支持了在我們的外泌體制備物中不存在病毒粒子。討論已經(jīng)了解，不同細胞類型產(chǎn)生的外泌體具有主要反映其細胞來源的表型。在這里， 我們考察外泌體通訊途徑的另一面，并證實了所測試的來自MDDC和乳汁兩者的外泌體在人類外周血中似乎具有相同的主要靶，即單核細胞。到達單核細胞時，外泌體似乎被主動吞入，可能是通過吞噬作用，吞噬作用最近也被證明是外泌體被其他吞噬細胞例如巨噬細胞攝取的機制。然而，這還顯示了如果外泌體產(chǎn)生細胞攜帶病原體特異性分子，外泌體靶向單核細胞的選擇性可能變化，在這里我們通過比較來自于EBV陰性(BJAB)與EBV陽性B-細胞系(LCLl)的外泌體證實了這一點。源于LCLl的外泌體主要靶向B細胞，但是對于BJAB外泌體來說沒有觀察到這一點。LCLl外泌體與B細胞之間的相互作用被針對B細胞上的 ⑶21或針對外泌體上的gp350的抗體有效阻斷，但是不被抗⑶18或抗⑶23抗體阻斷，證實了 EBV的參與。盡管⑶23在LCLl上比在BJAB上更豐富，但抗⑶23抗體對細胞-外泌體相互作用沒有影響，其原因可能是由于⑶23與⑶21之間的相互作用與gp350-⑶21相互作用相比親和性較低。這表明對于外泌體在體外的快速(1小時)結(jié)合來說，需要非常高的分子親和性，其在體內(nèi)可能甚至更加重要。盡管已知DC和B-細胞外泌體展示與表達在例如T細胞上的LFA-I結(jié)合的細胞內(nèi)黏附分子(ICAM)-1，但各種外泌體與T細胞的相互作用相當(dāng)?shù)?不到8%的T細胞對外泌體陽性)。我們讓LCLl外泌體上具有g(shù)p350這一觀察提出了下述問題，即我們是否在我們的外泌體制備物中具有感染性和/或多形EBV粒子，其可能造成了在B細胞上觀察到的PKH67 信號。EBV與⑶21的結(jié)合早已確立。通過使用靈敏的臍帶血轉(zhuǎn)化測定法以及TEM分析(圖 8B-D)，我們沒有發(fā)現(xiàn)在我們的外泌體制備物中存在病毒粒子的任何證據(jù)。因此，看來像是通過離心從樣品中清除了病毒粒子，因此我們認為病毒粒子應(yīng)該不可能造成在B細胞上觀察到的熒光信號。我們的關(guān)于靶B細胞通過帶有g(shù)p350的外泌體進行相互通訊的新發(fā)現(xiàn)，可能也反映了體內(nèi)的情形。帶有Gp350的外泌體可能在EBV的無癥狀攜帶者中分泌，并且我們推測外泌體與未感染B細胞的結(jié)合可能降低了病毒粒子結(jié)合的效率，并因此通過阻斷EBV進入受體CD21降低了感染的效率。在本研究中，我們還觀察到EBV轉(zhuǎn)化的B細胞與EBV陰性B 細胞相比似乎生產(chǎn)更多外泌體，正如作為蛋白濃度所測量到的。這可能也反映了體內(nèi)的情形，在體內(nèi)大量外泌體可能有助于控制EBV感染的擴散。或者，誘導(dǎo)外泌體生產(chǎn)和gp350的外泌體表達，可能有助于EBV的免疫調(diào)節(jié)潛力。我們的發(fā)現(xiàn)還提示了如何對外泌體進行工程化改造，例如通過誘導(dǎo)gp350的表達來重新引導(dǎo)它們向B細胞的細胞靶向，這可以增加它們的治療用途。在80年代已經(jīng)提出了 B細胞在產(chǎn)生完整的T-細胞應(yīng)答中的作用。此外，B細胞在實現(xiàn)長期T-細胞免疫力中特別重要，并且最近我們顯示了外泌體需要活化的B細胞的支持才能在體內(nèi)產(chǎn)生抗原特異性 T-細胞應(yīng)答。因此，通過在癌癥疫苗中靶向B細胞，可以打破耐受性，并可能實現(xiàn)持續(xù)更長時間的T細胞免疫力。此外，CD21不僅被B細胞表達，而且也被濾泡樹突狀細胞(FDC)表達。這暗示表面結(jié)合有g(shù)p350的外泌體在體內(nèi)可能也靶向FDC，從而在體內(nèi)增強可能的免疫活化和記憶。總而言之，本發(fā)明人顯示了在乳汁中發(fā)現(xiàn)的由人類單核細胞來源的DC和EBV陰性 B細胞所產(chǎn)生的外泌體，不與B細胞優(yōu)先結(jié)合。相反，它們主要靶向主動吞入外泌體的單核細胞，正如對于乳汁和DC外泌體所證實的。然而，如果B細胞帶有處于裂解階段的EBV，那么產(chǎn)生的外泌體將它們的偏好性從單核細胞向B細胞改變，由此外泌體結(jié)合的gp350與B 細胞上的EBV進入受體CD21結(jié)合。源于EBV轉(zhuǎn)化的B細胞的外泌體可能在EBV感染期間在減少B細胞所攝取的病毒中具有作用。此外，靶向B細胞的外泌體可能有效地誘導(dǎo)細胞和體液兩種類型的長期免疫應(yīng)答，因此它們應(yīng)該被視為癌癥和炎性疾病治療中的潛在工具。臨床方案載有抗原的ETBT外泌體或載有抗原的DC外泌體或載有抗原的CD40刺激的B細胞外泌體向癌癥患者的給藥，可以按照B Escudier等，同上，所描述的來進行。模型研究根據(jù)本發(fā)明，外泌體上源于EBV的糖蛋白gp350在體外通過⑶21特異性靶向人類 B細胞。本發(fā)明的發(fā)明人也在小鼠模型中觀察到B細胞活化是載有OVA(卵清蛋白)的外泌體誘導(dǎo)的強的T細胞應(yīng)答所需要的。因此，模型研究旨在測試使用帶有g(shù)p350的外泌體通過CD21靶向B細胞是否能夠在體外和體內(nèi)促進B細胞活化并誘導(dǎo)T細胞應(yīng)答。因為gp350 由于立體位阻不結(jié)合小鼠CD21，因此在鼠類系統(tǒng)中使用了替代模型。C3d是補體因子C3的35kDa蛋白酶抗性片段，并在補體活化期間產(chǎn)生。大量研究顯示C3d可以用作分子佐劑，這是因為B細胞上的⑶21結(jié)合帶有C3d標(biāo)簽的抗原，其引起 BCR與CD19的交聯(lián)，從而降低了 B細胞活化的閾值，也放大了信號的幅度。CD21使得用3 個C3d拷貝進行人工標(biāo)簽的模型抗原在未修飾抗原的最低免疫原性劑量的0. 001%的濃度下具有免疫原性。C3d的作用可以概述如下 通過C3d標(biāo)簽化將抗原靶向⑶21 (CR2)，導(dǎo)致在所有B細胞和FDC中抗原加工和抗原呈遞的增加·⑶21與BCR之間的交聯(lián)導(dǎo)致抗原特異性B細胞的完全活化 帶有C3d標(biāo)簽的抗原在脾臟中被FDC捕獲并與細胞表面保持長時間結(jié)合，產(chǎn)生并維持記憶性B細胞 通過與抗原形成多體或通過起到蛋白載體的作用，C3d能夠增加抗原的體內(nèi)生命跨度模型研究的實驗程序BMDC 培養(yǎng)在IL-4和10% GM-CSF調(diào)制的培養(yǎng)基(Ag8653/X63克隆)存在下，從骨髓干細胞產(chǎn)生BMDC(骨髓樹突狀細胞)。在第6天，用新鮮培養(yǎng)基替換50%的培養(yǎng)上清液。為了在外泌體上荷載0VA，在第6天時向DC培養(yǎng)物添加300 μ g OVA蛋白并溫育過夜，隨后清洗一次， 然后向培養(yǎng)物添加LPS。在48小時后，通過超速離心從培養(yǎng)物上清液純化外泌體(OVAExo)。從DC (樹突狀細胞)培養(yǎng)上清液制備外泌體將培養(yǎng)上清液以3. OOOXg、然后以10. OOOXg進行30分鐘離心。在100. OOOXg下離心2小時將外泌體沉淀，并通過100. OOOXg離心進行清洗。將沉淀的外泌體溶解在PBS中。 通過DC蛋白測定法(Biorad)測量蛋白質(zhì)含量。通過FACS對外泌體進行表型分析將10微克外泌體與10 μ 1事先用抗⑶9抗體包被的乙醛/硫酸酯乳膠珠在室溫 (RT)下旋轉(zhuǎn)過夜(ON)進行溫育。通過Iml IOOmM甘氨酸(Sigma)停止反應(yīng)。將含有外泌體的珠子用特異性針對^1-21((1、009、0054、0080、0081、0086、03(1(80 Biosciences, San Jose, CA, USA)的FITC或PE接合的抗體組和相應(yīng)的同種型匹配的抗體進行標(biāo)記。將C3d 連接到 OVAExo 上為了將C3d連接到OVAExo上，將接頭BS3與C3d混合，然后溫育30分鐘。通過凝膠過濾移除未反應(yīng)的試劑，并將含有C3d-BS3的洗脫物添加到外泌體中O^dOVAExo)。反應(yīng)
使用甘氨酸穩(wěn)定化。D011. 10⑶4+T細胞分離和體外T細胞增殖測定
33
將D011. 10脾細胞用5 μ M CFSE (羧基熒光素琥珀酰亞胺基酯)在37°C下染色15 分鐘。通過添加冷的PBS/10% FCS來終止標(biāo)記。然后將細胞在PBS中清洗3次，并以IxlO6 個細胞/ml的濃度與P印-Exo、OVA-Exo和相應(yīng)的對照共同培養(yǎng)，然后在37°C下在含有5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中溫育5天。體內(nèi)T細胞增殖測定在第0天，將來自D011. 10小鼠的脾細胞以5. 5xl06個細胞/小鼠通過靜脈過繼性轉(zhuǎn)移到BALB/c小鼠。在第1天，使用C3d0VAExo、OVAExo或相應(yīng)的PBS對照靜脈內(nèi)免疫接種小鼠。在第4天，將小鼠處死，并將脾細胞用抗CD3-APC與特異性針對OVA TCR的抗 CD4-PE、抗KJH6+-FITC抗體一起進行染色，并通過FACS評估KJH6+-細胞的數(shù)量。也使用抗⑶69和抗⑶25抗體通過FACS檢查淋巴細胞的早期活化。通過ELISA測定血清抗體水平為了測定特異性抗體應(yīng)答，將微量滴定板用10yg/ml OVA蛋白包被并溫育過夜， 然后與血清的連續(xù)稀釋液溫育過夜。通過在室溫下與堿性磷酸酶接合的特異性針對小鼠μ 和Y同種型的山羊免疫球蛋白溫育2小時，來測定反應(yīng)性抗體的同種型。在室溫下用對硝基苯基磷酸二鈉進行顯色，并通過ELISA讀出器在不同時間點測量405nm處的吸光度。通常，出于治療目的，通過吸附ELISA根據(jù)II類MHC分子的量評估每種方法產(chǎn)生的外泌體的量。通過計算出與Raji細胞和未成熟的第7天MDDC結(jié)合的II類MHC分子的總數(shù)量分別為每個細胞約1. 0和5. 5xl06個II類MHC分子，對吸附ELISA測定法進行評估。 炎性刺激物誘導(dǎo)II類MHC復(fù)合物在樹突狀細胞上的積累。GMP過程允許收獲約切1014個外泌體II類MHC分子。結(jié)論總的來說，這些結(jié)果顯示，在鼠類系統(tǒng)中，在體內(nèi)，與C3d結(jié)合的外泌體與不含C3d 的外泌體相比，更有效地通過活化天然B-細胞誘導(dǎo)T細胞應(yīng)答。這提示在人類中，靶向與 C3d相同分子的表達gp350的外泌體與不表達gp350的外泌體相比，也將通過B-細胞的抗原呈遞更有效地誘導(dǎo)T細胞應(yīng)答。在本發(fā)明的描述及其優(yōu)選實施方案中提到的所有現(xiàn)有技術(shù)文獻在此引為參考。在具體實施方案中，本發(fā)明還涉及下列項1. 一種通過引發(fā)針對患者癌細胞上展示的抗原的免疫應(yīng)答來治療個人的癌癥的方法，所述方法包含(a)提供來自所述個人的外周血樣品；(b)從樣品分離B細胞；(c)用EB病毒(EBV)感染分離到的B細胞；(d)將感染的B細胞轉(zhuǎn)化至潛伏期；(e)在癌抗原存在下培養(yǎng)EBV轉(zhuǎn)化的B細胞；(f)收獲從EBV轉(zhuǎn)化的B細胞釋放的外泌體；(g)向患者給藥收獲到的外泌體以弓丨發(fā)所述免疫應(yīng)答。2. 一種通過引發(fā)針對患者癌細胞上展示的抗原的免疫應(yīng)答來治療個人的癌癥的方法，所述方法包含(a)提供來自所述個人的外周血樣品；
(b)從樣品分離B細胞；(c)用EB病毒(EBV)感染分離到的B細胞；(d)將感染的B細胞轉(zhuǎn)化至潛伏期；(e)培養(yǎng)EBV轉(zhuǎn)化的B細胞；(f)收獲從EBV轉(zhuǎn)化的B細胞釋放的外泌體；(g)將收獲的外泌體與癌抗原接觸以產(chǎn)生載有癌抗原的外泌體；(h)向患者給藥載有癌抗原的外泌體以弓丨發(fā)所述免疫應(yīng)答。3.第1或2項的方法，其包含中和在外泌體上的潛伏膜蛋白1 (LMP-I)。4.第3項的方法，其中所述中和劑包含F(xiàn)ab-片段分子。5. 一種通過引發(fā)針對患者癌細胞上展示的抗原的免疫應(yīng)答來治療個人的癌癥的方法，所述方法包含(a)提供來自所述個人的外周血樣品；(b)從樣品分離單核細胞；(c)將單核細胞培養(yǎng)至未成熟的樹突狀細胞；(d)修飾未成熟的樹突狀細胞以表達CD21結(jié)合性部分；(e)將修飾過的未成熟樹突狀細胞與癌抗原相接觸以將它們轉(zhuǎn)化成載有癌抗原的成熟的樹突狀細胞；(f)收獲從成熟的樹突狀細胞釋放的載有癌抗原的樹突狀細胞外泌體；(g)向患者給藥所述載有癌抗原的樹突狀細胞外泌體以弓I發(fā)所述免疫應(yīng)答。6.第5項的方法，其中⑶21結(jié)合性蛋白部分包含下列一種或幾種gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t))、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN- α。7. 一種通過引發(fā)針對患者癌細胞上展示的抗原的免疫應(yīng)答來治療個人的癌癥的方法，所述方法包含(a)提供來自所述個人的外周血樣品；(b)從樣品分離B細胞；(c)培養(yǎng)B細胞；(d)修飾B細胞以表達⑶21結(jié)合性部分；(e)將修飾過的表達⑶21結(jié)合性部分的B細胞與癌抗原相接觸；(f)收獲從接觸過癌抗原的修飾B細胞釋放的載有癌抗原的外泌體；(g)向患者給藥載有癌抗原的B細胞外泌體以引發(fā)所述免疫應(yīng)答。8.第7項的方法，其中⑶21結(jié)合性蛋白部分包含下列一種或幾種gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t))、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN- α。9. 一種通過引發(fā)針對患者癌細胞上展示的抗原的免疫應(yīng)答來治療個人的癌癥的方法，所述方法包含(a)提供來自所述個人的外周血樣品；(b)從樣品分離B細胞；(c)培養(yǎng)B細胞；(d)修飾B細胞以表達⑶21結(jié)合性部分；(e)收獲從表達⑶21結(jié)合性部分的B細胞釋放的外泌體；
(f)將收獲的外泌體與癌抗原相接觸以產(chǎn)生載有癌抗原的外泌體；(g)向患者給藥載有癌抗原的B細胞外泌體以引發(fā)所述免疫應(yīng)答。10.第9項的方法，其中⑶21結(jié)合性蛋白部分包含下列一種或幾種gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t))、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN- α。11. 一種用于生產(chǎn)載有癌抗原的外泌體的方法，所述方法包含下述任何步驟第1 項的步驟(a)至步驟(f)；第2項的步驟(a)至步驟(g)；第5項的步驟(a)至步驟(f)；第 7項的步驟(a)至步驟(f)；第9項的步驟(a)至步驟⑴。12. 一種通過第11項的方法獲得或可以獲得的外泌體。13. 一種癌癥疫苗，其包含第12項的外泌體。14. 一種被第12項的外泌體在體外進行刺激的T細胞。15. 一種B-細胞或樹突狀細胞(DC)外泌體，其包含⑶21結(jié)合性部分。16.第15項的外泌體，其中CD21結(jié)合性部分選自gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t))、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN- α。
權(quán)利要求
1.一種用于生產(chǎn)特異性免疫調(diào)節(jié)性外泌體的方法，所述方法包含下列步驟(i)用適合的手段轉(zhuǎn)化B-細胞至潛伏期，例如用EB病毒感染所述B-細胞，從而表達能夠與天然B-細胞受體結(jié)合的一個或多個部分； ( )培養(yǎng)(i)中的轉(zhuǎn)化的B-細胞；(iii)收獲從(ii)中轉(zhuǎn)化的B-細胞釋放的外泌體，其中所述外泌體包含能夠與天然 B-細胞結(jié)合的一個或多個部分；并且其中所述外泌體直接和/或間接地荷載一種或多種抗原和/或免疫抑制因子。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法任選還包含中和外泌體上的潛伏膜蛋白 1(LMP-I)。
3.權(quán)利要求2的方法，其中LMP-I的中和使用Fab-片段分子來實現(xiàn)。
4.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述一種或多種B-細胞受體是例如CD19、CD 21、CD 20、CD 23、CD 79、BAFF-R、TACI、BCMA、IFN-R。
5.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中能夠與B-細胞受體結(jié)合的部分是例如BAFF、 APRIL、gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t)), CD23, C3b, iC3b、C3d、IFN-α 中的一種或多種，或其混合物。
6.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述一種或多種抗原選自例如一種或多種癌抗原、一種或多種病毒抗原、一種或多種細菌抗原、一種或多種免疫抑制因子或其任何組合。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述一種或多種癌抗原是表達在腫瘤細胞表面上的一種或多種抗原或其抗原活性片段、包含8至12個氨基酸殘基或15至M個氨基酸殘基的能夠刺激T細胞的腫瘤抗原肽片段、腫瘤細胞裂解物或其混合物。
8.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中通過將轉(zhuǎn)化的B-細胞在一種或多種抗原和/或一種或多種免疫抑制因子存在下共同培養(yǎng)來進行間接荷載。
9.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中通過將收獲的外泌體與一種或多種抗原和/或一種或多種免疫抑制因子相接觸，通過例如改變介質(zhì)的PH或與一種或多種抗原和/或一種或多種免疫抑制因子化學(xué)交聯(lián)來進行直接荷載。
10.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述一種或多種抗原是自體抗原和/或異體抗原。
11.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述一種或多種抗原是例如1種以上抗原，例如 2種以上抗原，例如3種以上抗原，例如4種以上抗原，例如5種以上抗原，例如6種以上抗原。
12.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中轉(zhuǎn)化的細胞被培養(yǎng)例如至少2天，例如3天、例如 4天、例如5天、例如6天、例如1周、例如2周、例如至少3周、例如4周、例如5周、例如6 周、例如7周、例如8周、例如至少3個月、例如至少4個月、例如至少5個月、例如至少6個月的時段。
13.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中每2天、例如每3天、例如每4天、例如每5天、例如每6天、例如每7天收獲外泌體。
14.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中在例如約48個小時的EBTB細胞培養(yǎng)時段中，夕卜泌體的產(chǎn)量為例如至少約0. 2 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞、例如至少約0. 3 μ g外泌體 / 一百萬個EBTB細胞、例如至少約0. 4 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞、例如至少約0. 5μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞、例如至少約0. 6 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞、例如至少約0. 7 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞、例如至少約0. 8 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞、 例如至少約0. 9 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞、例如至少約l.Oyg外泌體/ 一百萬個 EBTB細胞、例如至少約1. 5 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞、例如至少約2. 0 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞、例如至少約2. 5 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞、例如至少約3. 0 μ g 外泌體/ 一百萬個EBTB細胞、例如至少約5. 0 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞或例如至少約10. 0 μ g外泌體/ 一百萬個EBTB細胞。
15.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述外泌體通過例如超速離心或差速離心或其任何組合來收獲和收集，并隨后收集沉淀的外泌體，任選用適合的介質(zhì)清洗收集到的沉淀外泌體。
16.一種藥物組合物，其包含免疫調(diào)節(jié)性外泌體，其中所述外泌體帶有能夠與天然 B-細胞受體結(jié)合的一個或多個部分，并且還包含一種或多種抗原和/或一種或多種免疫抑制因子或其混合物。
17.權(quán)利要求16的藥物組合物，其中B-細胞受體是⑶19、⑶21、⑶20、⑶23、⑶ 79、BAFF-R、TACI、BCMA、IFN-R0
18.權(quán)利要求16-17任一項的藥物組合物，其中能夠與天然B-細胞受體結(jié)合的一個或多個部分選自例如 BAFF、APRIL、gp;350、EBVgp;350/220 (gp350 (470t))、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN-α或其混合物。
19.權(quán)利要求16-18任一項的藥物組合物，其中所述一種或多種抗原選自一種或多種癌抗原、一種或多種病毒抗原、一種或多種細菌抗原、一種或多種免疫抑制因子或其任何組合。
20.權(quán)利要求19的藥物組合物，其中所述一種或多種癌抗原選自表達在腫瘤細胞表面上的一種或多種抗原或其抗原活性片段、包含8至12個氨基酸殘基或15至M個氨基酸殘基的能夠刺激T細胞的腫瘤抗原肽片段、腫瘤細胞裂解物或其任何混合物。
21.權(quán)利要求16-20任一項的藥物組合物，其中所述一種或多種抗原是自體抗原或異體抗原。
22.權(quán)利要求16-21任一項的藥物組合物，其中所述一種或多種抗原是例如1種以上抗原，例如2種以上抗原，例如3種以上抗原，例如4種以上抗原，例如5種以上抗原，例如 6種以上抗原。
23.權(quán)利要求16-22任一項的藥物組合物，其中所述一種或多種抗原任選與一種或多種免疫抑制因子組合。
24.權(quán)利要求16-23任一項的藥物組合物，其還包含與血液具有相同滲漲度的等滲介質(zhì)。
25.權(quán)利要求16- 任一項的藥物組合物，其還包含一種或多種防止外泌體聚集的物質(zhì)。
26.權(quán)利要求16-25任一項的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含生理鹽水(NS)，其是約 0. 91% w/vNaCl、約 300m0sm/L 的溶液。
27.權(quán)利要求1616任一項的藥物組合物，其還包含最高3%的人血清白蛋白，例如最高2%的人血清白蛋白或最高的人血清白蛋白。
28.權(quán)利要求16-27任一項的藥物組合物，其中所述組合物包含從至少約0.1 μ g外泌體/ml介質(zhì)起的范圍，例如至少約0. 2 μ g外泌體/ml介質(zhì)、例如至少約0. 3 μ g外泌體/ml 介質(zhì)、例如至少約0. 4 μ g外泌體/ml介質(zhì)、例如至少約0. 5 μ g外泌體/ml介質(zhì)、例如至少約0. 6 μ g外泌體/ml介質(zhì)、例如至少約0. 7 μ g外泌體/ml介質(zhì)、例如至少約0. 8 μ g外泌體/ml介質(zhì)、例如至少約0. 9 μ g外泌體/ml介質(zhì)、例如至少約l.Oyg外泌體/ml介質(zhì)、例如至少約1. 5 μ g外泌體/ml介質(zhì)、例如至少約2. 0 μ g外泌體/ml介質(zhì)、例如至少約2. 5 μ g 外泌體/ml介質(zhì)、例如至少約3. 0 μ g外泌體/ml介質(zhì)、例如至少約5. 0 μ g外泌體/ml介質(zhì)或例如至少約10. 0 μ g外泌體/ml介質(zhì)或例如至少15. 0 μ g外泌體/ml介質(zhì)或例如至少 20. Oyg外泌體/ml介質(zhì)。
29.一種藥物組合物，其包含可以通過權(quán)利要求1-15任一項中限定的方法獲得的外泌體。
30.一種外泌體，其包含能夠與天然B-細胞的受體結(jié)合的至少一種部分或因子、蛋白質(zhì)、肽片段。
31.權(quán)利要求30的外泌體，其中B-細胞受體是例如⑶19、⑶21、⑶20、⑶23、⑶79、 BAFF-R、TACI、BCMA、IFN-R0
32.權(quán)利要求30-31任一項的外泌體，其中能夠與天然B-細胞的受體結(jié)合的部分或因子或蛋白質(zhì)或肽片段是例如 BAFF、APRIL、gp;350、raV gp350/220 (gp350 (470t)) XD23,C3b, iC3b,C3d, IFN-α或其任何混合物。
33.權(quán)利要求30-32任一項的外泌體，其還包含一種或多種抗原。
34.權(quán)利要求30-33任一項的外泌體，其中所述一種或多種抗原是內(nèi)源/自體抗原或外源/異體抗原，或其任何混合物。
35.權(quán)利要求30-34任一項的外泌體，其中所述一種或多種抗原是免疫刺激性或免疫抑制性的抗原，或其組合。
36.權(quán)利要求30-35任一項的外泌體，其中所述一種或多種抗原具有任何來源，例如病毒、細菌、腫瘤抗原。
37.權(quán)利要求36的外泌體，其中所述一種或多種腫瘤抗原選自表達在腫瘤細胞表面上的一種或多種抗原或其抗原活性片段、包含8至12個氨基酸殘基或15至M個氨基酸殘基的能夠刺激T細胞的腫瘤抗原肽片段、腫瘤細胞裂解物或其任何混合物。
38.權(quán)利要求30-37任一項的外泌體，其中所述外泌體包含1種以上抗原，例如2種以上不同抗原，例如3種以上不同抗原，例如4種以上不同抗原，例如5種以上不同抗原，例如 6種以上不同抗原。
39.權(quán)利要求30-38任一項的外泌體，其中免疫抑制因子是例如LMP-l、CTLA-4、PDl或其任何混合物。
40.一種可以如權(quán)利要求1-15任一項中所限定獲得的外泌體。
41.權(quán)利要求30-39任一項的外泌體，其用于藥物。
42.一種對需要治療的對象進行治療的方法，所述方法包含(i)從所述對象獲取生物樣品，例如血樣(ii)從⑴中的所述樣品收集B-細胞(iii)通過適合手段例如病毒，轉(zhuǎn)化在(ii)中收集的B-細胞，從而使所述B-細胞表達能夠與天然B-細胞受體結(jié)合的蛋白或配體 (iv)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的B-細胞 (ν)收集從(iv)中轉(zhuǎn)化的B-細胞分泌的外泌體 (vi)將(ν)中的外泌體轉(zhuǎn)移回到對象中，并且其中所述外泌體直接和/或間接荷載一種或多種抗原和/或免疫抑制因子。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述方法任選還包含中和外泌體上的潛伏膜蛋白 1(LMP-I)。
44.權(quán)利要求43的方法，其中LMP-I的中和使用Fab-片段分子來實現(xiàn)。
45.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中B-細胞受體是⑶19、⑶21、⑶20、⑶23、⑶ 79, BAFF-R, TACI、BCMA、IFN-R 中的一種或多種。
46.權(quán)利要求42-45任一項的方法，其中能夠與B-細胞受體結(jié)合的部分是BAFF、 APRIL、gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t)), CD23, C3b, iC3b、C3d、IFN-α 中的一種或多種，或其任何混合物。
47.權(quán)利要求42-46任一項的方法，其中所述一種或多種抗原選自例如一種或多種癌抗原、一種或多種病毒抗原、一種或多種細菌抗原、一種或多種免疫抑制因子或其任何組I=I ο
48.權(quán)利要求42-47任一項的方法，其中所述一種或多種癌抗原是表達在腫瘤細胞表面上的一種或多種抗原或其抗原活性片段、包含8至12個氨基酸殘基或15至M個氨基酸殘基的能夠刺激T細胞的腫瘤抗原肽片段、腫瘤細胞裂解物或其混合物。
49.權(quán)利要求42-48任一項的方法，其中通過將轉(zhuǎn)化的B-細胞在一種或多種抗原和/ 或一種或多種免疫抑制因子存在下進行共同培養(yǎng)來進行間接荷載。
50.權(quán)利要求42-49任一項的方法，其中通過將收獲的外泌體與一種或多種抗原和/或一種或多種免疫抑制因子相接觸，通過例如改變介質(zhì)的PH或與一種或多種抗原和/或一種或多種免疫抑制因子化學(xué)交聯(lián)來進行直接荷載。
51.權(quán)利要求42-50任一項的方法，其中所述一種或多種抗原是自體抗原或異體抗原。
52.權(quán)利要求42-51任一項的方法，其中所述一種或多種抗原是例如1種以上抗原，例如2種以上抗原，例如3種以上抗原，例如4種以上抗原，例如5種以上抗原，例如6種以上抗原。
53.權(quán)利要求42-52任一項的方法，其中所述一種或多種抗原任選與一種或多種免疫抑制因子組合。
54.權(quán)利要求42-53任一項的方法，其中轉(zhuǎn)化的細胞被培養(yǎng)例如至少2天，例如3天、例如4天、例如5天、例如6天、例如1周、例如2周、例如至少3周、例如4周、例如5周、例如 6周、例如7周、例如8周、例如至少3個月、例如至少4個月、例如至少5個月、例如至少6 個月的時段。
55.權(quán)利要求42巧4任一項的方法，其中從對象收集的樣品是例如血樣如外周血、骨髓樣品或從對象的淋巴系統(tǒng)抽取的樣品，或其任何混合物。
56.權(quán)利要求42-55任一項的方法，其中外泌體經(jīng)例如腸胃外給藥，例如靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、骨內(nèi)、鞘內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥。
57.權(quán)利要求42-56任一項的方法，其中外泌體作為單劑或多劑給藥。
58.權(quán)利要求42-57任一項的方法，其中外泌體在約20秒例如約30秒、例如約40秒、 例如約1分鐘、或者在1至2小時以上例如3小時以上、例如4小時以上、例如5小時以上、 例如6小時以上的時間跨度內(nèi)輸注或注射。
59.權(quán)利要求42-58任一項的方法，其中外泌體以至少0.lmg/kg、例如至少0. 2mg/kg, 例如至少0. 3mg/kg、例如至少0. 4mg/kg、例如至少0. 5mg/kg、例如至少0. 75mg/kg、例如至少0. 9mg/kg、例如至少1. Omg/kg、例如至少3. Omg/kg、例如至少5. Omg/kg、例如至少7. Omg/ kg、例如至少10. Omg/kg、例如至少15. Omg/kg的劑量給藥。
60.權(quán)利要求42-59任一項的方法，其中取決于疾病的嚴重性，治療方法可以執(zhí)行一次或重復(fù)執(zhí)行。
61.權(quán)利要求42-60任一項的方法，其中所述治療補充有用于例如癌癥、自體免疫疾病的任何其他相關(guān)治療，移植、過敏癥期間或病毒或細菌感染期間的治療。
62.權(quán)利要求42-61任一項的方法，其中所述方法被用于治療乳腺癌、膀胱癌、皮膚癌、 前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、甲狀腺癌、胃癌、頭頸癌或黑素瘤，或其任何組合。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種治療患者癌癥的方法，所述方法包含將從患者收集的B細胞通過用EB病毒感染進行永生化，將細胞轉(zhuǎn)化至潛伏期，在癌抗原存在下培養(yǎng)細胞，收集從細胞釋放的外泌體，以及向患者給藥外泌體?；蛘?，收獲到的外泌體載有癌抗原。
文檔編號A61K39/00GK102470167SQ201080030052
公開日2012年5月23日 申請日期2010年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月2日
發(fā)明者蘇珊·嘉伯里爾松 申請人:Ith免疫治療控股公司