專利名稱：T細(xì)胞免疫原基因ti及其在口蹄疫蛋白亞單位疫苗和滅活疫苗中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獸醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其是一種T細(xì)胞免疫原基因TI及其在口蹄疫蛋白亞單位疫苗和滅活疫苗中應(yīng)用。
背景技術(shù)：
口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease, Fffl))是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一種急性、熱性、高度接觸傳染性的動(dòng)物疫病。主要侵染豬、牛、羊等偶蹄動(dòng)物，被國際獸疫局列為必須通報(bào)的烈性傳染病。該病傳播途徑多、傳播速度快，曾多次在世界范圍發(fā)生大流行。FMDV 是小 RNA 病毒科(Picornaviridae)，口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)的成員該病毒有七個(gè)血清型，分別為0、A、C、Asia 1、SATl、SAT2、SAT3，每個(gè)血清型又可產(chǎn)生很多基因亞型，血清型之間無交叉保護(hù)反應(yīng)。FMDV的核酸為單股正鏈的RNA分子，基因組全長約 8500個(gè)堿基，只含有一個(gè)大的開放閱讀框，表達(dá)產(chǎn)生的聚蛋白逐級裂解產(chǎn)生病毒的結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4)和非結(jié)構(gòu)蛋白(Lab，2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)，結(jié)構(gòu)蛋白組裝產(chǎn)生病毒的衣殼結(jié)構(gòu)。病毒衣殼蛋白是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的主要免疫原，而結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白均含有誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的T細(xì)胞抗原表位。早期通過單抗與免疫逃逸突變株的序列分析研究表明，在0型FMDV(OlBFS)至少存在5個(gè)功能獨(dú)立的中和性抗原表位，組成抗原位點(diǎn)的區(qū)段主要包括VPl的G-H環(huán)以及其 C端氨基酸，VP2上的31，70 73，75和77位氨基酸，VPl的B-C環(huán)上的43和44位點(diǎn)氨基酸；VP3上的58位氨基酸，VPl 149位氨基酸(Crowther et al. ,1993)等參與構(gòu)成五個(gè)中和表位。這5個(gè)中和表位除了位點(diǎn)1為線性表位外，其余均為構(gòu)象表位。利用合成肽免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和牛的試驗(yàn)似乎證明位點(diǎn)1是最優(yōu)勢的抗原表位，但是有的試驗(yàn)結(jié)果顯示疫苗免疫后針對位點(diǎn)2的抗體應(yīng)答水平高于位點(diǎn)1 (Samuel，1997)；其中針對G-H環(huán)位點(diǎn)的免疫顯然是最重要的，因?yàn)椴煌逍筒《?，在G-H環(huán)附近的變異幅度最大，而且G-H環(huán)是病毒結(jié)合細(xì)胞受體的部位(Grubman and Baxt, 2004) 0 T細(xì)胞表位對于誘導(dǎo)產(chǎn)生更高水平的中和抗體、盡早的清除病毒具有重要的作用，Cooke and Westover(2008)綜合分析了不同血清型病毒抗原位點(diǎn)區(qū)域的差異，結(jié)果顯示B-細(xì)胞與T-細(xì)胞抗原位點(diǎn)區(qū)域顯示出很明顯的血清型特征，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在FMDV的結(jié)構(gòu)蛋白以及非結(jié)構(gòu)蛋白3A與3D上均存在T-細(xì)胞表位，有些 T-細(xì)胞表位在血清型間比較保守，有些在毒株之間差異較大；其中VP4，VP1，3A，3D蛋白中均含有保守的T細(xì)胞表位，這些表位可能更易被宿主細(xì)胞表達(dá)的MHC分子識別，因而在分子疫苗設(shè)計(jì)中受到更多的關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種T細(xì)胞免疫原基因TI及其在口蹄疫蛋白亞單位疫苗和滅活疫苗中應(yīng)用。一種T細(xì)胞免疫原基因Tl，其具有SEQ ID NO=I的核苷酸序列。
進(jìn)一步的，其具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列。T細(xì)胞免疫原基因TI在口蹄疫蛋白亞單位疫苗和滅活疫苗中應(yīng)用。結(jié)果顯示，與滅活疫苗或OA-VPl單獨(dú)免疫組相比，添加TI抗原后滅活疫苗或 OA-VPl免疫組小鼠均能產(chǎn)生高水平的特異性中和抗體(P < 0. 5)；且⑶4+T細(xì)胞數(shù)量顯著增多(P < 0. 01)，IFN- γ產(chǎn)生水平顯著升高(P < 0. 01)。說明TI抗原具有很好的誘導(dǎo)特異性體液與細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用，是一種很好的免疫增效劑，可作為口蹄疫蛋白亞單位疫苗和滅活疫苗中的一種有效成份，以提高疫苗的免疫效果。本發(fā)明設(shè)計(jì)并合成了包含兩個(gè)通用T細(xì)胞表位與來自口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白的多個(gè)細(xì)胞表位的串聯(lián)表達(dá)基因，以期這種表達(dá)產(chǎn)物能夠作為一種T細(xì)胞免疫原，用于蛋白亞單位疫苗和滅活疫苗，提高疫苗免疫后保護(hù)性中和抗體的水平和免疫持續(xù)期。在本發(fā)明中，設(shè)計(jì)并串聯(lián)表達(dá)了 0和Asia 1兩個(gè)型的VPl結(jié)構(gòu)蛋白，用作蛋白亞單位疫苗的雛形來驗(yàn)證所表達(dá)T細(xì)胞免疫原的免疫增效作用。在小鼠體內(nèi)的初步免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，所表達(dá)的T細(xì)胞免疫原具有很好的免疫增效作用，有望用于發(fā)明口蹄疫蛋白亞單位疫苗或作為滅活疫苗中的免疫增效成份，來提高傳統(tǒng)疫苗的免疫效果。本發(fā)明也為口蹄疫疫苗發(fā)明提供了一種新的思路。


圖1為表達(dá)蛋白TI的SDS-PAGE檢測.M為蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1為未誘導(dǎo)TI對照，2為誘導(dǎo)后TI表達(dá)產(chǎn)物，3為TI誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)上清，4為TI誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的沉淀，5和 6為純化后的TI表達(dá)產(chǎn)物；圖2為表達(dá)蛋白OA-VPl的SDS-PAGE檢測.M為蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1為未誘導(dǎo) OA-VPl對照，2為誘導(dǎo)后OA-VPl表達(dá)產(chǎn)物，3為OA-VPl誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)上清，4為OA-VPl誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的沉淀，5為透析濃縮后的OA-VPl表達(dá)產(chǎn)物.；圖3為免疫小鼠血清0型FMDV中和抗體效價(jià)測定；圖4為免疫小鼠血清Asial型FMDV中和抗體效價(jià)測定；圖5為各組小鼠脾⑶4+T細(xì)胞和⑶8+T細(xì)胞亞群數(shù)量流式檢測結(jié)果.A F分別為1 6組，G為對照組.Q2區(qū)顯示⑶4+T細(xì)胞數(shù)，Q2-1區(qū)顯示⑶8+T細(xì)胞數(shù)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。1材料與方法1.1 試劑Ni-NTA His · Bind Resins 購自 Novagen 公司；脂多糖(LPS)購自 Sigma 公司； RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清購自GIBCO公司；青霉素、鏈霉素混合雙抗購自晶美公司；小鼠淋巴細(xì)胞分離液(EZ-S印TM MouselX)購自達(dá)科為公司；IgG^i-FITC，IgGl-PerCP，CD4-PE， IgG2a-PE, CD3-PerCP, CD8-FITC 購自美國 BD 公司；Mo μ se IFN- y ELISA Kit II 檢測試劑盒購自美國BD公司。1. 2T細(xì)胞免疫原的設(shè)計(jì)與表達(dá)
設(shè)計(jì)并合成了 T細(xì)胞免疫原基因TI 其由口蹄疫病毒VP1、VP4、3A、3D蛋白共11 個(gè)T細(xì)胞表位基因，麻疹病毒的泛T細(xì)胞表位基因以及來自耶爾森氏菌屬的侵襲素基因組成的串聯(lián)編碼基因，各表位之間以兩個(gè)甘氨酸相連，核苷酸序列為SEQ ID NO 1 :CCATGGCCA AGTTCGTGGCTGCTTGGACCCTGAAAGCTGCTGCTGGCGGCTCCATCATCAACAACTACTACATGCAGCAGTACCAG AACAGCATGGGGGGCACACAGAACAACGATTGGTTCTCCAAGCTGGCCTCCAGCGCTTTCAGCGGACTGTTTGGAGG AGGAAGGACCCTGCCTACATCCTTCAACTACGGAGGAAGGAGGCAGCACACCGACGTGAGCTTTGGCGGAGCCGCCA TCGAGTTCTTTGAAGGGATGGTGCACGATTCCATCAAAGGAGGAGTGGACGTGCTGCCAGTGGAGCACATCCTGTAC ACAAGGATGATGATCGGCAGATTCTGCGGAGGGGTGGTGGCCAGCGACTACGATCTGGACTTCGAAGCCCTGAAGCC CCACTTTAAATCCCTGGGACAGACCATCACACCAGCCGACAAGAGCGGCGGAACCGCCAAATCCAAGAAATTCCCCA GCTACACCGCCACAIACCAGTTTTGA ；其蛋白序列為SEQ ID NO 2 AKFVAAffTLKAAA (通用 T 細(xì)胞表位)-GG-VP4(2C1_34)-GG-VP4(62_81)-GG-VP1 (157_165)-GG_VP ι (26-34) -GG-3A(21_35) -GG-3D(182_201)-GG-3D(342-37i)"GG-TAKSKKFPSYTATYQF (Invasin)，即MAKFVAAWTLKAAAGGSIINNYYMQQYQNSMGGTQNNDWFSKLASSAFSGLFGGGRTLPTSFNYGGRR QHTDVSFGGAAIEFFEGMVHDSIKGGVDVLPVEHILYTRMMIGRFCGGVVASDYDLDFEALKPHFKSLGQTITPAD
KSGGTAKSKKFPSYTATYQF各組成蛋白序列及功能見表1。表1融合蛋白TI的序列及功能
Protein and sequence Promiscuous T helper (Th) cell epitopes AKFYAAWTLKAAAi'51
VP4
Function
a promiscuous T helper (Th) site for broad immunogenicity in multiple species
權(quán)利要求
1.一種τ細(xì)胞免疫原基因Tl，其特征在于，其具有SEQ ID NO :1的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的T細(xì)胞免疫原基因Tl，其特征在于，其具有SEQID NO :2的氨基酸序列。
3.T細(xì)胞免疫原基因TI在口蹄疫蛋白亞單位疫苗和滅活疫苗中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種包含口蹄疫病毒VP1，VP4，3A和3D蛋白上多個(gè)T細(xì)胞表位與兩個(gè)通用T細(xì)胞表位的T細(xì)胞免疫原，命名為TI，其具有SEQID NO1的核苷酸序列；同時(shí)表達(dá)了O和Asia 1兩個(gè)血清型口蹄疫病毒VP1蛋白的串聯(lián)編碼基因，表達(dá)產(chǎn)物命名為OA-VP1。TI抗原具有很好的誘導(dǎo)特異性體液與細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用，是一種很好的免疫增效劑，可作為口蹄疫蛋白亞單位疫苗和滅活疫苗中的一種有效成份，以提高疫苗的免疫效果。
文檔編號A61K48/00GK102168088SQ20101060158
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月23日
發(fā)明者劉在新, 盧曾軍, 孫普, 曹軼梅, 李冬 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所