專利名稱：抗腫瘤組合物及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及腫瘤治療領域，尤其涉及一種抗腫瘤組合物及其制備方法。
背景技術：
大頭金蠅(Chrysomyia megacephala)，別名紅頭蒼蠅，是節(jié)肢動物門有顎亞門昆 蟲綱有翅亞綱雙翅目麗蠅科金蠅亞科昆蟲的一種。它食物轉化率高，生長速度快，繁殖力 高，產(chǎn)卵期長，其蟲體的蛋白質含量高，飼養(yǎng)條件和養(yǎng)殖設備相對簡單，有利于大規(guī)模生產(chǎn)。大頭金蠅是一種完全變態(tài)的昆蟲，生活史包括卵一幼蟲一蛹一成蠅4個階段。大 頭金蠅卵為淡黃色，呈香蕉型，長度約一毫米，一克卵大約有7000粒。幼蟲呈錐形，前端尖， 后端鈍圓，有明顯的體節(jié)，體長為13 16毫米，一克幼蟲約有15條，在適宜的溫度環(huán)境下， 成熟幼蟲1 2天就可以成蛹，蛹經(jīng)過5天左右，即可羽化出成蟲。成蟲體長8 11毫米， 金屬綠色，身被灰色，復眼紅色。CN101032525A公開了 一種從蠅蛆提取分離具有體外抗腫瘤作用的有效組分，該組 份從外源物質誘導的蠅蛆中提取、分離獲得，具有抑制人原髓細胞白血病HL-60和人肺腺 癌A549細胞增殖生長的作用，當受試物濃度為250MG/ML時，外源物質誘導的蠅蛆干粉及其 不飽和脂肪酸體外抑制人原髓細胞白血病HL-60增殖生長的效果分別為25. 5 %與96. 2 %， 抑制人肺腺癌A549細胞增殖生長的效果分別為26. 8%與97. 0%。該組合物由不飽和脂肪 酸組成，未明確予以定量，成分復雜，保存過程中易氧化，對其進行活性測試的劑量較大，療 效欠佳。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種抗腫瘤組合物，該組合物對多種腫瘤細胞均有較強的抑制活 性。一種抗腫瘤組合物，由氨基酸序列在NCBI (美國國立生物技術信息中心)數(shù)據(jù) 庫中登錄號分別為 Gi 2148169、Gi 114236、Gi 8101742、Gi2148175、Gi 157674463、Gi 505529,Gi 157690694,Gi 116248322、Gil56603504、Gi 8980621 的蛋白 a、蛋白 b、蛋白 c、 蛋白d、蛋白e、蛋白f、蛋白g、蛋白h、蛋白i、蛋白j組成。優(yōu)選的，所述的抗腫瘤組合物重量百分比組成為蛋白a 20 25%、蛋白b 20 25%、蛋白c 1 5%、蛋白d 15 20%、蛋白e 5 10%、蛋白f 10 15%、蛋白g 10 15%、蛋白h 1 5%、蛋白il 5%、蛋白j 1 5%。更優(yōu)選的，所述的抗腫瘤組合物重量百分比組成為蛋白a 20 22%、蛋白b 20 22%、蛋白c 2 5%、蛋白d 15 18%、蛋白e 5 7%、蛋白Π0 12%、蛋白g 10 12%、蛋白h 1 3%、蛋白i 1 3%、蛋白j 1 3%。最優(yōu)選的，所述的抗腫瘤組合物重量百分比組成為蛋白a 21. 97%、蛋白b 21.59%、蛋白 c 3. 88%、蛋白 d 17. %、蛋白 e 5. 85%、蛋白 Π0. 82%、蛋白 g 10. 95%, 蛋白 h 2. 19%、蛋白 i 2. 74%、蛋白 j 2. 75%。
本發(fā)明還提供了一種上述抗腫瘤組合物的制備方法，包括(1)將大頭金蠅消毒后馴化2代以上，得到種蠅；(2)培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)酵3 5小時后，將種蠅放入培養(yǎng)箱內(nèi)產(chǎn)卵，控制培養(yǎng) 箱內(nèi)氨氣濃度為50 200ppm，卵孵化后，控制培養(yǎng)箱內(nèi)溫度沈 35°C，氨氣濃度為500 lOOOppm，繼續(xù)培養(yǎng)M 120小時；(3)將幼蟲清洗干凈，冷凍干燥、粉碎，溶于水中，在1 15°C浸提30 40小時， 10000轉/分下離心5分鐘，取上清液并進行超濾，去除原料粉末中分子量低于8000KD的組 分，即為成品。卵孵化前，培養(yǎng)箱內(nèi)一氧化碳濃度小于30ppm，氧氣濃度20 50ppm，二氧化碳濃 度 3000 6000ppm。卵孵化后，培養(yǎng)箱內(nèi)一氧化碳濃度小于lOppm。所述的培養(yǎng)基為青蛙肉、家禽肉、家畜肉、家畜內(nèi)臟和淡水魚肉中的一種或多種， 這些基料易獲得，成本低廉。所述培養(yǎng)基可以選用以下幾種配方(1)10 60%的淡水魚肉、20 70%豬內(nèi)臟和10 50%的青蛙肉；(2)30 70%的豬內(nèi)臟和30 70%的青蛙肉；(3) 10 50%的豬肉和10 50%淡水魚肉及10 50%雞肉；(4)20 60%的牛肉和30 70%青蛙肉；(5)30 70%的羊肉、10 50%淡水魚肉及20 60%豬內(nèi)臟。本發(fā)明組合物對多種癌細胞均有抑制作用，制備方法簡單，具有較好的市場化前
旦
ο
具體實施例方式實施例1馴化野生大頭金蠅取自然界的大頭金蠅，為避免野生種類的帶菌傳病之嫌，經(jīng)過高猛酸鉀消毒處理 后，進行2 3代隔離飼養(yǎng)，然后在接近自然的養(yǎng)蠅房內(nèi)養(yǎng)殖馴化，經(jīng)過四代后，種蠅馴化完 成，得到種蠅。如來年不再馴化種蠅，就需要保存種蠅。保種的方法為在9 10月份秋末時，把 蠅蛹放入密封容器內(nèi)，置于溫度為5 10°C的冷藏室內(nèi)，在該溫度下蛹不會死亡也不會孵 化，來年室外溫度上升到22°C以上時，取出放進蠅房即可孵化。實施例2培養(yǎng)幼蟲將20千克培養(yǎng)基(60%的淡水魚肉、30%豬內(nèi)臟和10%的青蛙肉)置于培養(yǎng)箱 內(nèi)。培養(yǎng)箱體積0. 14立方米，制作材料可使用金屬、塑料、木材、水泥、復合材料等，形狀為 長方體或正方體，頂面設有一個可調(diào)節(jié)大小的通氣孔。當培養(yǎng)基開始發(fā)酵后，將種蠅的卵放 在培養(yǎng)基的表面，并控制培養(yǎng)箱內(nèi)氨氣濃度在50 200ppm，一氧化碳濃度小于30ppm，氧氣 濃度20 21ppm，二氧化碳濃度3000 6000ppm，培養(yǎng)大概6個小時左右，卵開始孵化。接著把通氣孔孔徑減小，增加氨氣濃度至500 lOOOppm，一氧化碳濃度降低小于 lOppm，繼續(xù)培養(yǎng)100小時，得到幼蟲。整個過程中，不再加入新鮮的培養(yǎng)基，當氣體濃度超 出上述范圍，則將通氣孔增大，調(diào)整到上述范圍內(nèi)。
實施例3后處理首先把收集的蠅幼蟲活體放置在60目尼龍篩網(wǎng)制成的無蓋網(wǎng)箱內(nèi)，用清水沖洗。 30分鐘沖洗一次，連續(xù)沖洗四次以上，此方法能將幼蟲體內(nèi)的污物徹底清洗干凈，真空冷凍 干燥至含水量10%以下。取出存放于密封容器內(nèi)，在1 4°C的環(huán)境下保存即可。將凍干物粉碎至80目，以水為溶媒，將粉碎物與水按1 10的重量比混合，在溫 度10°c下浸泡35小時，取出后用離心機分離，離心轉速為10000轉/min，離心時間為5分 鐘，取上清液，在_35°C以下，低溫冷凍干燥成含水量小于8%，得到的為結晶狀產(chǎn)物，大致 占幼蟲總重量的25 觀％。實施例4分離純化蛋白質將結晶狀產(chǎn)物復溶于水配置成重量百分比濃度為50%的溶液，利用分子超濾系統(tǒng) (法國militon生產(chǎn))進行超濾，超濾系統(tǒng)參數(shù)設置篩選范圍8000 80000DK ；壓差為2 個大氣壓；流速500ml/小時；將分子量低于8000DK的小分子物質去除，收集截留物溶于 水，-45°C真空干燥。實施例5定性定量(1)取適量實施例4的凍干物樣品，加入裂解液(8M Urea, 1 OmMDTT, 150mM Tris) 約lml，超聲(80W)裂解，全過程在冰上完成。離心，12，000g，45分鐘，取上清。(2)取上清液使用Bio-fcid protein assay reagent定量，分裝成IOug每管，置于 500ul離心管中，低溫保存(-800C )。(3)電泳上樣 20ug，SDS-PAGE 為 12. 5% 的膠(15mA/ 膠 30min，30mA/ 膠至溴酚藍 離膠下沿0. 5cm)。(4)染色考染，分析泳道內(nèi)條帶的光密度掃描值，計算各條帶中蛋白質的含量。(5)在膠上切下蛋白點，加入8μ 1 IOng/μ 1胰蛋白酶(Trypsin，Roche，美國) 進行膠內(nèi)消化，然后置于4°C冰箱放置40min使膠片完全吸收酶液，再補加10 μ 1 25mM碳 酸氫銨緩沖液(pH 8.0)，于37°C溫育12h，膠內(nèi)蛋白質被酶解成肽段混合物。在上述肽段 混合物中加入30-50 μ 1 5% TFA(Merk公司，德國)于40°C提取上述酶切肽段1小時一 次，再用相同體積的50 % CAN和2. 5 % TFA(Merk公司，德國)溶液于30°C提取1小時一 次，最后用25μ1 CAMFischer公司，美國)超聲提取一次，合并3次提取液。真空干燥， 然后用4μ 1 0. 5%三氟乙酸溶解，將0. 6μ 1溶解物用基質輔助激光解吸離子化飛行質譜 (MALDI-T0F-MS)分析，獲得肽質量指紋(P印tide Mass Fingerprint,PMF)圖譜，比對得到
每個蛋白的序列、相對分子質量，具體如下表所示
權利要求
1.一種抗腫瘤組合物，由氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中登錄號分別為Gi 2148169、Gi 114236,Gi 8101742,Gi 2148175,Gi 157674463、Gi505529、Gi 157690694,Gi 116248322、 Gi 156603504,Gi 8980621的蛋白a、蛋白b、蛋白C、蛋白d、蛋白e、蛋白f、蛋白g、蛋白h、 蛋白i、蛋白j組成。
2.根據(jù)權利要求1所述的抗腫瘤組合物，其特征在于，重量百分比組成為蛋白a 20 25%、蛋白b 20 25%、蛋白c 1 5%、蛋白d 15 20%、蛋白e 5 10%、蛋白 f 10 15%、蛋白g 10 15%、蛋白h 1 5%、蛋白i 1 5%、蛋白j 1 5%。
3.根據(jù)權利要求2所述的抗腫瘤組合物，其特征在于，重量百分比組成為蛋白a 20 22%、蛋白b 20 22%、蛋白c 2 5%、蛋白d 15 18%、蛋白e 5 7%、蛋白f 10 12%、蛋白g 10 12%、蛋白h 1 3%、蛋白i 1 3%、蛋白j 1 3%。
4.根據(jù)權利要求3所述的抗腫瘤組合物，其特征在于，重量百分比組成為蛋白a 21.97%、蛋白 b 21.59%、蛋白 c 3. 88%、蛋白 d 17. %、蛋白 e 5. 85%、蛋白 f 10. 82%, 蛋白 g 10. 95%、蛋白 h 2. 19%、蛋白 i 2. 74%、蛋白 j 2. 75%。
5.一種權利要求1所述的抗腫瘤組合物的制備方法，包括(1)將大頭金蠅消毒后馴化2代以上，得到種蠅；(2)培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)酵3 5小時后，將種蠅放入培養(yǎng)箱內(nèi)產(chǎn)卵，控制培養(yǎng)箱 內(nèi)氨氣濃度為50 200ppm，卵孵化后，控制培養(yǎng)箱內(nèi)溫度沈 35°C，氨氣濃度為500 lOOOppm，繼續(xù)培養(yǎng)M 120小時；(3)將幼蟲清洗干凈，冷凍干燥、粉碎，溶于水中，在1 15°C浸提30 40小時，10000 轉/分下離心5分鐘，取上清液并進行超濾，去除原料粉末中分子量低于8000KD的組分，即 為成品。
6.根據(jù)權利要求5所述的制備方法，其特征在于卵孵化前，培養(yǎng)箱內(nèi)一氧化碳濃度小 于30ppm，氧氣濃度20 21ppm，二氧化碳濃度3000 6000ppm。
7.根據(jù)權利要求5所述的制備方法，其特征在于卵孵化后，培養(yǎng)箱內(nèi)一氧化碳濃度小 于 IOppm0
8.根據(jù)權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基為青蛙肉、家禽肉、家 畜肉、家畜內(nèi)臟和淡水魚肉中的一種或多種。
9.根據(jù)權利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)基重量配比為10 60%的淡水魚肉、20 70%豬內(nèi)臟和10 50%的青蛙肉。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗腫瘤組合物及其制備方法，該組合物由氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中登錄號分別為Gi 2148169、Gi 114236、Gi 8101742、Gi 2148175、Gi 157674463、Gi 505529、Gi 157690694、Gi 116248322、Gi 156603504、Gi 8980621的蛋白a、蛋白b、蛋白c、蛋白d、蛋白e、蛋白f、蛋白g、蛋白h、蛋白i、蛋白j組成。本發(fā)明組合物對多種癌細胞均有抑制作用，制備方法簡單，具有較好的市場化前景。
文檔編號A61K38/51GK102078601SQ201010601168
公開日2011年6月1日 申請日期2010年12月23日 優(yōu)先權日2010年12月23日
發(fā)明者王正華 申請人:浙江千年春生物技術有限公司