專利名稱：發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒的全基因序列及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒學(xué)、分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種新的發(fā)熱伴血小板減 少綜合征病毒的全基因序列及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
布尼亞病毒是球形、有包膜和分節(jié)段負鏈RNA病毒。因首先從烏干達西部的布尼 亞韋拉分離到該科的代表種-布尼亞韋拉病毒而得名。布尼亞韋拉病毒直徑90 100納 米，從包膜伸出許多糖蛋白突起，內(nèi)有3個螺旋對稱的核殼，分別含大(L)、中(M)、小(S) 3 個RNA節(jié)段，其中L和M為負鏈RNA，分別編碼病毒的多聚酶(RNA依賴的RNA多聚酶，RdRP)、 糖蛋白(&1和Ge) ；S片段為雙義RNA，編碼核蛋白(NP)和非結(jié)構(gòu)蛋白(Nk)。根據(jù)血清學(xué) 和生物化學(xué)分析，已確定有5個屬，即布尼亞病毒屬、白蛉病毒屬、漢坦病毒屬、內(nèi)羅病毒屬 和烏庫病毒屬，分別包含145、30、6、27和7個血清型。另有22個病毒被認為是本科的可能 成員。布尼亞病毒的自然感染見于許多脊椎動物和節(jié)肢動物(蚊、蜱、白蛉等)，可感染 小鼠，并能在一些哺乳類、鳥類和蚊細胞培養(yǎng)中生長；對人可引起類似流感或登革熱的疾 病、出血熱(立夫特谷熱和克里米亞-剛果出血熱等)及腦炎(加利福尼亞腦炎)。有蚊媒、 蜱媒、白蛉媒三種傳播類型。有些病毒在其節(jié)肢動物媒介中，可經(jīng)卵、交配或胚胎期傳播。近年來，在我國河南、湖北、山東、江蘇、遼寧等地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了發(fā)熱伴血小板減少為 主要臨床表現(xiàn)的感染性病例，少數(shù)重癥患者因多臟器損害，救治無效死亡。目前，這類患者 病因尚不明確。該類病例臨床表現(xiàn)為急性發(fā)熱起病，多數(shù)患者伴有乏力、納差、惡心、嘔吐、 腹痛、腹瀉等癥狀，部分患者出現(xiàn)黑便、牙齦出血、皮膚瘀點或瘀斑、眼結(jié)膜充血等出血癥 狀。絕大部分患者臨床檢查的結(jié)果為白細胞降低，血小板減少，部分患者谷丙/谷草轉(zhuǎn)氨酶 升高，尿蛋白呈陽性。為進一步明確該病的臨床及流行病學(xué)特征，探索病因和防治手段，在 湖北、山東、河南、江蘇、遼寧等省部分地區(qū)開展監(jiān)測工作。在對病原一無所知的情況下，通 過非序列依賴的核酸擴增、病毒分離、核酸檢測包括熒光定量PCR(Real-time PCR)和套式 PCR、血清學(xué)檢測等方法對上述地區(qū)的感染性病例進行病毒篩檢和分離，同時進行病毒基因 組學(xué)研究，對了解病毒來源、進化過程及分子流行病學(xué)有重要意義，同時也為疾病鑒別診斷 以及疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)，具有巨大的經(jīng)濟和社會效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒，以及以湖北分離株 HB29為代表的全基因序列及其氨基酸序列。本發(fā)明的另一目的是提供該發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒的全基因序列及其編 碼的蛋白在制備預(yù)防或治療由發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒所致傳染病的藥物、疫苗或診 斷試劑中的應(yīng)用。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒，該病毒基因組編碼I)a、SEQ ID No. 4所示氨基酸序列組成的蛋白，或b、SEQ ID No. 4所示氨基酸序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的由a 所述蛋白衍生的具有同等功能的蛋白；例如在非活性區(qū)段，將第479位的V替換為I，不會 影響蛋白的功能。II) C、SEQ ID No. 5所示氨基酸序列組成的蛋白，或d、SEQ ID No. 5所示氨基酸序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的由c 所述蛋白衍生的具有同等功能的蛋白；例如在非活性區(qū)段，將第13位的L替換為F，不會影 響蛋白的功能。III) e、SEQ ID No. 6所示氨基酸序列組成的蛋白，或f、SEQ ID No. 6所示氨基酸序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的由e 所述蛋白衍生的具有同等功能的蛋白；例如在非活性區(qū)段，將第156位的A替換為T，不會 影響蛋白的功能。IV) g, SEQ ID No. 7所示氨基酸序列組成的蛋白，或h、SEQ ID No. 7所示氨基酸序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的由g 所述蛋白衍生的具有同等功能的蛋白；例如在非活性區(qū)段，將第144位的R替換為Q，不會 影響蛋白的功能。前述的病毒，該病毒基因組包括SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示 的核苷酸序列，或與SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列同源性 在95%以上的核苷酸序列。本發(fā)明還提供前述發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒產(chǎn)生的多聚酶(RdRP)、糖蛋白 (&1和Ge)、核蛋白(NP)或非結(jié)構(gòu)蛋白(Nk)。本發(fā)明還提供編碼前述多聚酶、糖蛋白、核蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白的基因。本發(fā)明還提供含有前述多聚酶、糖蛋白、核蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因的載體。本發(fā)明還提供含有上述載體的宿主細胞。本發(fā)明進一步提供前述發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒，該病毒基因組編碼的多聚 酶、糖蛋白、核蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白，編碼多聚酶、糖蛋白、核蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白的基因，含有 多聚酶、糖蛋白、核蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因的載體或含有所述載體的宿主細胞在制備 預(yù)防或治療由發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒所致傳染病的藥物或疫苗中的應(yīng)用。另外，本發(fā)明提供用于檢測發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒的特異性引物和/或探 針。根據(jù)所述病毒的基因組序列設(shè)計用于檢測該病毒的特異性引物，經(jīng)RT-PCR后檢測擴增 產(chǎn)物，可以通過凝膠電泳、測序等方式進行檢測，引物序列一般為18 36個堿基的寡核苷 酸鏈，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過相關(guān)生物軟件和在線工具進行設(shè)計。根據(jù)所述病毒的基因 組序列，還可以設(shè)計相關(guān)特異性探針，針對RNA或DNA進行檢測，并可結(jié)合基因芯片技術(shù)進 行檢測，探針一般為20 50個核苷酸。一種較佳的方式是通過熒光定量RT-PCR進行檢測， 包括特異性引物及相應(yīng)的熒光探針。優(yōu)選地，所述引物和探針包括I)L-F-3 5’ -AGTCTAGGTCATCTGATCCGTTC/TAG-3 ’ ；L-R-3 :5’ -TGTAAGTTCGCCCTTTGTCCAT-3，；
L-探針-3:5，-CAATGACAGACGCCTTCCATGGTAATAGGG-3，；和 / 或II)M-F-3 :5， -AAGAAGTGGCTGTTCATCATTATTG-3，；M-R-3 :5， -GCCTTAAGGACATTGGTGAGTA-3，；M-探針-3:5，-TCATCCTCCTTGGATATGCAGGCCTCA-3，；和 / 或III)S-F-3 5，-GGGTCCCTGAAGGAGTTGTAAA-3，；S-R-3 :5， -TGCCTTCACCAAGACTATCAATGT-3，；S-探針-3:5，-TTCTGTCTTGCTGGCTCCGCGC-3，。本發(fā)明還提供含有上述引物和/或探針的檢測試劑盒。本發(fā)明從湖北、山東、河南、江蘇、遼寧等地以發(fā)熱伴血小板減少為主要臨床表現(xiàn) 的感染性病例中分離獲得病毒(結(jié)合該病毒感染所導(dǎo)致的臨床癥狀故命名為新的發(fā)熱伴 血小板減少綜合征病毒)，并進一步獲得該病毒的基因全系列。具體地說，本發(fā)明的技術(shù) 方案是通過病毒分離培養(yǎng)，核酸檢測包括熒光定量PCR (Real-time PCR)和套式PCR，血清 學(xué)檢測對上述感染性病例進行了病毒篩查檢測、分離和鑒定，同時利用SISPA(核酸序列 非依賴單引物擴增法)對湖北、山東、河南、江蘇、遼寧等省份病例標本進行擴增；根據(jù)最 初由序列非依賴單引物擴增(SISPA)得到的序列設(shè)計引物，進行目的基因的PCR擴增，進 行PCR產(chǎn)物純化并測序，最終獲得以湖北病毒株HB^為代表共11株發(fā)熱伴血小板減少綜 合征病毒的全部基因組序列。通過序列分析發(fā)現(xiàn)，該病毒屬于布尼亞病毒科，包括三個基 因片段L、M和S，分別表達病毒的多聚酶、糖蛋白(&1和Ge)和核蛋白(NP)及非結(jié)構(gòu)蛋白 (Nk)，并且三個片段均在白蛉病毒屬這一分支上，但與該屬的其他病毒距離較遠，因此屬 于全新的布尼亞病毒科白蛉病毒屬；此外，這11株病毒的序列高度同源L片段的同源性在 95. 9-99. 8%, M片段的同源性在95. 3-99. 6%, S片段的同源性在95. 2-99. 7%。借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點及有益效果(1)本發(fā)明首次闡明了以發(fā)熱伴血小板減少為主要臨床表現(xiàn)的一種新的布尼亞病 毒科白蛉病毒屬的全基因組序列，以及各結(jié)構(gòu)基因、調(diào)控基因和各自編碼的蛋白。(2)由發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒各主要基因及其編碼的蛋白研制的核酸診斷 和血清學(xué)診斷試劑可分別用于該類新的發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒感染的鑒別診斷以 及基因及工程疫苗的研制，具有巨大的經(jīng)濟和社會效益。(3)本發(fā)明基于對湖北分離株HB^全基因序列的測定，有助于進一步了解與該病 毒增殖及重要調(diào)控功能有關(guān)的基因結(jié)構(gòu)和功能，研究其分子生理機制以及侵染宿主的關(guān)鍵 點，尋找病毒致死基因或細胞受體，通過基因或基因轉(zhuǎn)化制成核酸或蛋白類生物制劑，形成 治療該類病毒性傳染病的有效手段。(4)本發(fā)明涉及的發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(湖北分離株HB^)的三個片段 均在白蛉病毒屬這一分支上，但與該屬的其他病毒距離較遠。L片段編碼的氨基酸與其他的 白蛉病毒的同源性為32-33 %，M片段編碼的糖蛋白的同源性在20-36 %，S片段編碼的Nk 的同源性較低，在11. 2-16.0%，因此本發(fā)明涉及的發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒為全新的 布尼亞病毒科白蛉病毒屬。(5)本發(fā)明還涉及用于該類新的發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒檢測的特異性引物 和探針。根據(jù)已測定的11株病毒全基因序列，分別比對11株病毒的L、M、S序列，界定其保 守區(qū)，利用I^rimer express軟件設(shè)計分別針對三個片段的引物和Taq man探針，通過多重
5Real-time PCR或套式PCR對感染性病例進行擴增，結(jié)果針對L、Μ、S片段的引物和探針均 顯示出較好的特異性。(6)本發(fā)明還可用來研制血清學(xué)鑒別診斷試劑。根據(jù)發(fā)熱伴血小板減少綜合征病 毒(ΗΒ29)全基因序列分析結(jié)果，三個基因片段L、M和S分別表達病毒的多聚酶、糖蛋白(&1 和Ge)和核蛋白及非結(jié)構(gòu)蛋白(Nk)。可以分別構(gòu)建表達核蛋白基因的原核表達系統(tǒng)和真 核表達系統(tǒng)。表達核蛋白基因的原核表達系統(tǒng)以原核表達質(zhì)粒pET30a系列質(zhì)粒為載體，設(shè)計 酶切位點，將目的基因通過常規(guī)的PCR方法擴增后，克隆到pET30a系列質(zhì)粒中，以大腸桿菌 BL21為宿主菌，0. 1-1. OmMIPTG作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達重組蛋白，可得到分子量為約27KD的 目的蛋白。表達產(chǎn)物經(jīng)離子交換層析、親和層析和分子篩等方法純化后可用于制備血清學(xué) 診斷試劑或基因工程亞單位疫苗。另一方面，還可以分別構(gòu)建表達核蛋白基因和糖蛋白基因的真核表達系統(tǒng)，以真 核表達載體PCDNA3系列質(zhì)?；蚶ハx-桿狀病毒表達載體pACUW51質(zhì)粒為載體，設(shè)計好酶 切位點，將目的基因通過常規(guī)的PCR方法擴增后，克隆到表達載體中，轉(zhuǎn)染相應(yīng)細胞株如 ^3T，sf9細胞，使其在細胞中成功表達后，將表達陽性的細胞制備成抗原片，通過間接免疫 熒光(IFA)對病人血清進行檢測。此外，本發(fā)明的發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(HB29)全基因序列可用于構(gòu)建該 種新病毒感染性分子克隆?？蓪﹃栃缘母腥拘苑肿涌寺∵M行基因改造，用刪除或人工誘變 方法使毒力基因失活，從而得到非致病的感染性分子克隆，從而獲得毒力減弱的毒株，用于 減毒疫苗株或顆粒疫苗的研制。


圖1為本發(fā)明較佳實施例新型發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒的分離鑒定結(jié)果，A 代表免疫熒光檢測顯示病毒感染細胞與病人血清反應(yīng)呈陽性；B代表電鏡下觀察到的病毒 形態(tài)。圖2為本發(fā)明較佳實施例新型發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒L基因片段進化樹。圖3為本發(fā)明較佳實施例新型發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒M基因片段進化樹。圖4為本發(fā)明較佳實施例新型發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒S基因片段進化樹。圖5為本發(fā)明較佳實施例多重Real-time PCR檢測病人血清擴增結(jié)果示意圖。圖6為本發(fā)明表達HB^株的核蛋白(NP)，全長糖蛋白(G)，糖蛋白(Ge)的重組桿 狀病毒感染Sf9昆蟲細胞制成的抗原片與病人血清反應(yīng)的結(jié)果示意圖。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手 段。實施例1病毒分離自2004年以來，浙江、江蘇、安徽、山東、河南和湖北等省相繼發(fā)現(xiàn)并報告發(fā)熱伴 血小板減少為主要表現(xiàn)的感染性疾病病例，其中少數(shù)嚴重患者發(fā)展為多臟器損害，甚至死亡，2010年5月以來國家⑶C病毒病所自山東、湖北、河南、江蘇、安徽和遼寧等6個省份采 集197份具有類似癥狀患者血清標本。采用常規(guī)組織培養(yǎng)法，對來源于上述6個省份的197份標本分別進行病毒分離 檢測。將IOOyL的病人血清用DMEM 1 10稀釋至lml，接種至25cm2培養(yǎng)瓶vero細胞 (Greiner Β ο-One)中，37°C吸附1小時，補加4ml DMEM維持液(含2%胎牛血清及1000 單位/mL青霉素和鏈霉素)，將培養(yǎng)瓶置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察是否出現(xiàn) 細胞病變(CPE)，培養(yǎng)7-10天后，將培養(yǎng)上清凍存于-80°C，取Iml傳代，以表4所列引物探 針進行多重RT-PCR檢測細胞上清病毒核酸的方法監(jiān)控病毒的復(fù)制情況，未接種病毒的正 常細胞培養(yǎng)上清也同時進行收集和PCR檢測，另外，將不同病毒感染時間的細胞固定制作 抗原片，使用恢復(fù)期的病人血清進行免疫熒光試驗來監(jiān)控病毒的復(fù)制情況。結(jié)果表明，本發(fā)明從6個省份的197份病人血清中分離獲得包括HB^在內(nèi)的共11 株病毒，病毒分離過程中將病人血清接種于vero細胞培養(yǎng)7-10天后細胞病變不明顯。如 圖1所示，以HB^分離株為代表，免疫熒光檢測顯示病毒感染細胞與病人血清反應(yīng)呈陽性 (A)；經(jīng)電鏡檢查，新分離的布尼亞病毒顆粒呈粗糙圓球形，平均直徑80-100nm，有致密的 包膜及細的表面突起(B)。實施例2序列非依賴單引物擴增(SISPA)血清中病毒核酸的擴增是根據(jù)Allander等Q001)的方法并進行了一些改動。首 先對2010年獲得的第一份患者急性期血清標本HB^進行處理140μ L的血清用PBS (ρΗ 7. 4)進行兩倍稀釋，10，OOOg離心10分鐘去除細胞碎片，并以孔徑為0. 2 μ m的濾膜去除細 胞團塊或細菌，然后在血清中加入14U DNA酶(Ambion)，20U benzonase核酸酶(Novagen) 和20U RNA酶(!Iomega)，緩沖液使用IXDNA酶緩沖液(Ambion)，37 °C消化2小時去除 非病毒(無病毒顆粒保護)的核酸。采用病毒RNA分離試劑盒(Qiagen)，根據(jù)說明書從 280 μ L稀釋后的血清中提取RNA以40 μ L無RNase的水洗脫。第一鏈cDNA的合成向 13 μ L純化RNA中加入2 μ L 10 μ M隨機引物(!Iomega)得到15 μ L的混合物，70°C加熱 10分鐘，4°C放置5分鐘以解開RNA的二級結(jié)構(gòu)，然后加入30U AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(ftOmega)， 加水至終體積為25 μ L，于37°C反應(yīng)1小時。第二鏈CDNA的合成取20 μ L的第一鏈產(chǎn) 物，加入2. 5Χ第二鏈cDNA反應(yīng)緩沖液40 μ L，牛血清白蛋白(lmg/ml) 5 μ L，E. coli DNA聚 合酶 I 23u (Promega)，RNase H Iu (Promega)，加水至終體積為 100 μ L, 14°C孵育 2 小時 后，于70°C加熱10分鐘滅活DNA聚合酶I，再加入2OT4 DNA聚合酶(Promega)，于37°C反 應(yīng)10分鐘，加入10 μ L 200mMEDTA終止反應(yīng)，使用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)對 其進行純化，純化后的產(chǎn)物加入磷酸化的平端接頭E19 (5’ -AGCAATTCCGTTGCTGTCG-3’ )和 E12(5’ -pCGACAGCAACGG-3’)，16°C連接4小時，以連接產(chǎn)物為模板，寡核苷酸E19為引物進 行擴增，反應(yīng)條件為 940C，3min ；94°C，30s, 55°C，Imin, 72°C，2min, 40 個循環(huán)，72°C，IOmin。 PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后呈彌散條帶，2-500bp，500-1000bp及大于IOOObp的彌散帶分別用 Qiagen試劑盒回收并克隆至pGEM T-easy載體(ftOmega)，人工挑選576個克隆并測序。得到的序列通過 blast (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/)進行同源性分 析，每個序列通過搜索標準非冗余數(shù)據(jù)庫以及數(shù)據(jù)庫的高通量基因組序列，氨基酸序列通 過blastp進行同源性分析。結(jié)果表明對576個克隆的測序結(jié)果進行分析，先去掉兩端引物序列，對得到的核苷酸序列進行blast分析，分析結(jié)果顯示90%的克隆為人類基因組序列，還有一小部分為 非培養(yǎng)細菌，少數(shù)為比對不出任何信息的未知序列；對這部分未知序列進一步進行氨基酸 的比對分析，在推斷其氨基酸序列時，用六種可能的讀碼框來推斷其氨基酸序列，對得到的 所有氨基酸序列在Genbank的數(shù)據(jù)庫中進行蛋白比對。15個克隆得到有用的信息，其中11 個克隆的氨基酸序列與白蛉病毒的L蛋白有一定的相似性，克隆E2-31、E2-117編碼相同 的氨基酸，其編碼的氨基酸位點在Uukuniemi病毒(NP_941973. 1)L蛋白的453-604區(qū)間， E2-91 的位點在其 1357-15 區(qū)間，E2-79在其(1366-1526)區(qū)間，E2-174在其(1373-1542) 區(qū)間，E2-9、E2-12、E2-120、E2-86編碼相同的氨基酸，位點在其1805-1978之間，E1-65在 其(2025-2096)區(qū)間，E1-16 與 iToscana 病毒(ACM92008. 1) 1127-1237 區(qū)間相似；15 個克隆 中有2個克隆與白蛉病毒糖蛋白(GP)的部分氨基酸序列相似E2-25與Rift Valley熱病 毒 gb|ABD38829. 1 的 667-873 區(qū)間相似，E2-123 與 Punta iToro 病毒(gb |ABD92923. 11)的 1081-1246區(qū)間相似；另外有兩個克隆與白蛉病毒的S片段編碼的氨基酸有相似性E2-20 與Punique病毒(gb |ACZ43796. 11)編碼的NSs蛋白110-206區(qū)間有相似性(表1)。這些數(shù)據(jù)均表明該病毒與白蛉病毒較接近，但相似度較低(BLAST的E值范圍在 1. 4 4X 10_23之間)，表明該病毒可能為白蛉病毒屬的一個新亞型。表ISISPA方法發(fā)現(xiàn)的類白嶺病屬基因組序列及其定位
0063
權(quán)利要求
1.發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒，該病毒基因組編碼I)a, SEQ ID No. 4所示氨基酸序列組成的蛋白，或b、SEQ ID No. 4所示氨基酸序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的由a所 述蛋白衍生的具有同等功能的蛋白；II)c, SEQ ID No. 5所示氨基酸序列組成的蛋白，或d、SEQ ID No. 5所示氨基酸序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的由c所 述蛋白衍生的具有同等功能的蛋白；IIDe, SEQ ID No. 6所示氨基酸序列組成的蛋白，或f> SEQ ID No. 6所示氨基酸序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的由e所 述蛋白衍生的具有同等功能的蛋白；以及III)g> SEQ ID No. 7所示氨基酸序列組成的蛋白，或h、SEQ ID No. 7所示氨基酸序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的由g所 述蛋白衍生的具有同等功能的蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的病毒，其特征在于，該病毒基因組包括SEQID NO. 1、SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 3 所示的核苷酸序列，或與 SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 3 所示的核苷酸序列同源性在95 %以上的核苷酸序列。
3.權(quán)利要求1或2所述病毒的基因組。
4.權(quán)利要求1或2所述發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒產(chǎn)生的多聚酶、糖蛋白、核蛋白或 非結(jié)構(gòu)蛋白。
5.編碼權(quán)利要求4所述多聚酶、糖蛋白、核蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白的基因。
6.含有權(quán)利要求5所述基因的載體。
7.含有權(quán)利要求6所述載體的宿主細胞。
8.權(quán)利要求1或2所述病毒，權(quán)利要求4所述多聚酶、糖蛋白、核蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白，權(quán) 利要求5所述的基因，權(quán)利要求6所述的載體或權(quán)利要求7所述的宿主細胞在制備預(yù)防或 治療由發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒所致傳染病的藥物或疫苗及診斷試劑中的應(yīng)用。
9.用于檢測權(quán)利要求1或2所述病毒的引物和/或探針。
10.如權(quán)利要求9所述的引物和探針，包括I)L-F-3:5’ -AGTCTAGGTCATCTGATCCGTTC/TAG-3，；L-R-3 :5’ -TGTAAGTTCGCCCTTTGTCCAT-3，；L-探針-3 :5，-CAATGACAGACGCCTTCCATGGTAATAGGG-3，；和 / 或II)M-F-3:5’ -AAGAAGTGGCTGTTCATCATTATTG-3，；M-R-3 :5’ -GCCTTAAGGACATTGGTGAGTA-3’ ；M-探針-3 :5，-TCATCCTCCTTGGATATGCAGGCCTCA-3，；和 / 或III)S-F-3:5’ -GGGTCCCTGAAGGAGTTGTAAA-3’ ；S-R-3 :5’ -TGCCTTCACCAAGACTATCAATGT-3’ ；S-探針-3 :5，-TTCTGTCTTGCTGGCTCCGCGC-3，；
11.含有權(quán)利要求9所述引物和/或探針的檢測試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒，以及以湖北分離株HB29為代表的全基因序列、其編碼蛋白的氨基酸序列及應(yīng)用。對該病毒的全基因序列進行同源性分析，該病毒屬于布尼亞病毒科，包括三個基因片段L、M和S，分別表達病毒的多聚酶、糖蛋白(Gn和Gc)和核蛋白(NP)及非結(jié)構(gòu)蛋白(NSs)，并且三個片段均在白蛉病毒屬這一分支上，但與該屬的其他病毒距離較遠。可將本發(fā)明涉及的病毒全基因序列及其編碼的蛋白用于研制預(yù)防和治療由發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒所致傳染病的藥物、疫苗或診斷試劑。
文檔編號A61K38/43GK102070704SQ201010566058
公開日2011年5月25日 申請日期2010年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月17日
發(fā)明者盧靜, 孫麗娜, 孫玉蘭, 張全福, 曲靖, 李川, 李建東, 李德新, 梁米芳, 蕪為 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所